JPH0881501A - 酸性多糖 - Google Patents

酸性多糖

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JPH0881501A
JPH0881501A JP6073784A JP7378494A JPH0881501A JP H0881501 A JPH0881501 A JP H0881501A JP 6073784 A JP6073784 A JP 6073784A JP 7378494 A JP7378494 A JP 7378494A JP H0881501 A JPH0881501 A JP H0881501A
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polysaccharide
acidic polysaccharide
aureobasidium
culturing
genus
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Noboru Fujii
昇 藤井
Genichi Kadota
元一 門田
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AGAWAMURA
SOFUI KK
TODOROKIGUMI KK
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AGAWAMURA
SOFUI KK
TODOROKIGUMI KK
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08BPOLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof

Abstract

(57)【要約】 【目的及び効果】 毒性を有せず、飼料添加発育促進、
廃水処理剤および食品に応用できる酸性多糖を提供す
る。 【構成】 土壌中より分離したAureobasidium sp. (オ
ーレオバシジウム属)に属する酸性多糖生産菌を培養す
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は土壌中から分離したAure
obasidium sp. (オーレオバシジウム属)を用いた新規
な酸性多糖の生産方法およびこの酸性多糖を用いた食品
添加剤、飼料添加剤、廃水処理剤等に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来に
おいても例えば黒色菌科のデマチューム(Dematium)属
に属する凝集活性物質産生菌を培養して得られる凝集活
性物質の生産方法、これを用いた廃水の凝集処理方法な
どが特公昭58-47159号公報および特公昭59-7518 号公報
等によって知られているが、本発明はこれらに開示され
た微生物とは別個の微生物を用いて新規な酸性多糖を生
産する方法およびこの酸性多糖を用いた食品添加剤、飼
料添加剤、廃水処理剤等を提供するものである。
【0003】
【課題を解決するための手段】本発明で用いられる微生
物は生工研菌寄番号No.P−14228号(FERMP
−14228)の菌であり、本発明のこの菌は土壌中か
ら分離したAureobasidium sp. (オーレオバシジウム
属)に属する菌であり、本発明の新規な多糖を生産する
菌である。以下にその菌学的特徴を説明すると次の通り
である。
【0004】本高分子多糖を生産する本菌の菌学的特徴 土壌中より分離した本菌はポテトデキストロース寒天
(日水KK製)斜面培地上、25℃、24時間培養でColony
(コロニー)は表面平滑淡灰白色となり、48時間で点々
と淡黒色となり、Colony周辺は糸状様発育で、次第に酵
母様発育し、72時間でColony表面は点々と淡暗黒色とな
り全面淡暗黒色となる。平板培養上、放射状に菌糸様発
育で、次第に黒色となる。ポテトデキストロース液体培
地では液面に点々と黒色のColonyが発育し、培養液は浸
盪すると粘稠性を示す。管底に菌体の沈殿が見られる。
【0005】顕微鏡観察によると培養24時間で細胞は糸
状様、菌体の周縁に粘質様物質が形成される。細胞の巾
は 1.0〜2.5 ミクロンで、菌体のところどころに隔壁が
みられ、時間を経過すると、この隔壁は、点々と切れ
て、それぞれ分節細胞になる。また糸状細胞の側壁から
酵母様の出芽分生子が形成される。その形状は卵形で大
きさは4〜7×3〜4ミクロンである。時として中には
大きい卵球形の褐色厚膜胞子様細胞も形成される。また
長連鎖状のものも見られる。
【0006】発育温度は20〜25℃で、最適温度は25℃、
発育可能温度は5〜40℃、最適pHはpH5〜6であ
る。グルコース、フラクトース、ガラクトースなどのヘ
キソース、スクロースなどの二糖類並びにデンプンを分
解し、いずれの炭素源でも培養液は粘稠になる。また、
特有の芳香を有する。以上の菌学的特徴からAureobasid
ium 属の菌株とした。
【0007】本菌による多糖の生産 本菌をそのまま培養すると黒色となるが、培養時にビタ
ミンEと乳化剤としてレシチンを含んだ培地に培養する
と無添加にくらべて、淡黒灰白色となり、黒色化を抑制
され、顕著な粘性培養液が得られる。即ち、本菌の生産
培地組成は蔗糖1%、米糠 0.2%、レシチン 0.2%、ビ
タミンE 0.2%、水 100ml、pH 5.2で、この培養液を
1kg/cm2 の高圧蒸気殺菌して、本菌を接種し、ジャフ
ァーメンターで25℃、 0.5ml/min、100rpm、72時間、通
気攪拌培養後、1kg/cm2 、15分間、高圧蒸気殺菌し、
10000rpmで15分間遠心分離して上澄液(多糖)を得る。
【0008】この培養上澄液は顕著な粘性を有する。こ
の多糖含有培養液を2倍容のエタノーを添加しながら攪
拌すると多糖の凝集反応がおこり、多糖を回収し、凍結
乾燥すると対糖55%の多糖が得られる。培地を表1に示
した。
【0009】
【表1】
【0010】分析試料の多糖の精製 ジャーファーメンターで72時間の培養液を 8000rpmで15
分間遠心分離して、上澄液をSevag 法で処理し、脂質お
よびタンパク質等を除去した。即ちクロロホルム:ブタ
ノール=5:1の混液を培養液に対して10%量添加し、
24時間攪拌した。次に12000rpm、15分間遠心分離して菌
体を除去し、上澄液を回収した。この操作を3回反復し
た。
【0011】次にこの培養液に2倍容のエタノールを加
えると多糖が凝集沈殿する。この凝集物(多糖)を濾過
してエタノールを除き蒸留水に水冷しながら攪拌してよ
く溶解し、再び3倍容のエタノールを加えて凝集させ、
70℃、1時間放置して、色素を除去し、この凝集物を10
000rpm、15分間遠心分離した。この操作を反復した。こ
の凝集物を蒸留水に再度溶解し、セタブロンを凝集物1
mgに対して3mgの割合で添加し沈殿を形成させた。この
物質を蒸留水で充分洗浄し、1NのMgSO4で再溶解
させた。この溶液に3倍容のエタノールで沈殿を行い、
これをエタノールで充分洗浄した。この沈殿を蒸留水に
溶解し、セルロースチューブ透析膜で2日間流水中で透
析した後、更に1日間蒸留水中で透析を行い、透析内液
を凍結乾燥し精製多糖を得た。多糖の収量は 3.5mg/ml
である。
【0012】本物質の物理的並びに化学的性質 1) 相対粘度 精製多糖の 0.1%溶液についてオストワルド粘度計で測
定した。比較対照としてデキストランおよびデンプンの
0.1%溶液を用いた。これらの測定結果を表2に示す
が、本発明多糖はこれら比較多糖の3倍以上の高粘度で
ある。
【0013】
【表2】
【0014】2) 構成単糖の同定 精製多糖をアルジトールアセテート化法によって、即ち
本多糖を加水分解し、単糖となし、水素化ホウ素ナトリ
ウムで還元し相当するアルジトールアセテートにする。
これを無水酢酸とピリジンでアセチル化し、アルジトー
ルアセテート誘導体とし、アルジトールアセテート誘導
体をガスクロマトグラムにとり、イノシトールを基準に
各ピークの相対保持時間を割り出した。
【0015】標準試料の各単糖の相対保持時間と試料の
それと比較して構成糖の同定を行った。即ち島津ガスク
ロマトグラフィGC−8APFを使用。カラムはECN
SS−Mを充填したガラスカラム管(3.2mmφ×2m)を
使用した。カラム温度は 190℃、一定、注入口温度 300
℃で窒素をキャリヤーガスとして、圧力 2.0kgf/cm2
使用した。
【0016】図1および図2のガスクロマトグラムより
図2のpeak 1' は図1と比較するとグルコースであると
推定した。
【0017】次に表3、4の結果から単糖の含量を求め
95.5%で本多糖はグルコースのみで構成されるホモグル
カンである。
【0018】
【表3】
【0019】
【表4】
【0020】
【表5】
【0021】3) 多糖の構造解析 箱守法によるメチル化とGC−MSの組合せにより結合
位置の決定を行った。更に核磁気共鳴(NMR)分析に
より、アノマー解析を行い結合様式を決定した。また多
糖のメチル化を確認するため赤外線吸収スペクトルを用
いた。
【0022】多糖試料を乾固して作ったKBR法のIR
スペクトルの図3、またメチル化多糖のKRSセル法の
IRスペクトルの図4を比較すると図3のスペクトルに
は3400cm-1付近に強い吸収域があり、図4にはそれが認
められず2890cm-1に強い吸収域がありメチル化により多
糖中の水酸基が消失し、メチル基が出現したことであ
る。
【0023】赤外吸収スペクトルで糖質の特徴を示す吸
収域は 730〜960 cm-1であり、Type1を示すと思われる
吸収が図3には 907cm-1に図4には 903cm-1に確認され
た。Type 2を示すと思われる吸収が図3には 840cm
-1に、図4には 858cm-1に認められた。Type 3を示すと
思われる吸収が図3には 760cm-1に、図4には確認され
なかった。
【0024】以上のことから本多糖の配向性はα型であ
る。また図3にはOH伸縮を示す2950cm-1の吸収、CO
伸縮を示す1730cm-1の吸収、そしてカルボキシレートの
存在を示すと考えられる1650cm-1と1420cm-1の吸収が認
められた。また多糖をメチル化すると図4に示す様に29
50cm-1と1650cm-1の吸収の消失と1730cm-1の吸収の大幅
の増加があり、このことから多糖中にエステル基を介し
てカルボン酸あるいはウロン酸が存在する。
【0025】次にマススペクトルの解析から表5に示す
様にPeak Aは 2,3,4,6−Me4 −Gであった。これはC
lのみに結合があるグルコースであることから非還元末
端基であることがわかる。また、Peak Bは 2,3,6−Me
3 −Gであった。これは1,4結合を示す。Peak Cは
2,4−Me2 −Gであり、1,3,6結合を示す。また
ピーク面積比の百分率ではPeak Aは13.4%、Peak Bは75
%、Peak Cは 11.62%であった。このことから本多糖は
1,4結合を主体に3と6の位置より分岐のある多分岐
性の多糖であることが判明した。
【0026】更にIRおよびNMRの解析から(図5,
6,7,8に示した)図9に示す様に96.5cmにClのピ
ークから結合様式はα型で本多糖のアノマー炭素の配向
性はαであることを確認した。以上から、本多糖はα型
で、主鎖は1,4結合で、3と6の位置に分岐をもつホ
モグルカンである。
【0027】4) 有機酸の定性 赤外吸収スペクトルから本多糖には有機酸がエステル結
合を介して含まれていると推定されたのでペーパークロ
マトグラフィで有機酸を検索した。
【0028】即ち、精製多糖溶液を3%NaOHでpH
10.0に調整し、80℃の湯浴中で1時間振盪し、冷却後70
%エタノール沈殿を行い10000rpm、15分間遠心分離して
上澄液を得、陽イオン交換樹脂アンバーライトIR− 1
20Bを加えて3時間以上放置、脱塩した。ガラス繊維濾
紙GD−120で吸引濾過し、濾液を40℃、エバポレー
ターで、減圧乾固した。これを水溶液としてペーパーク
ロマトグラフィに供した。展開剤として0.85Mのギ酸を
含むブタノール溶液(1:1)の混液の上層液を用い、
コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸を標準物質とし
てスポットし、展開、乾燥後発色剤として0.05%BPB
アルコール液で発色させ、リンゴ酸、クエン酸、不明酸
を検出した。以上から本多糖は酸性多糖とした。
【0029】毒性試験 1) マウスによる急性毒性試験 本多糖を1群5匹のマウスに腹腔内投与および皮下注射
では異常は認められない。
【0030】2) マウスへの経口投与の亜急性試験 本多糖を1群5匹のマウスに体重あたり 0.1ml胃ゾンデ
で強制投与し、異常は認められない。
【0031】本多糖添加飼料による鯉の飼育試験 1) 多糖添加飼料の製造 市販の鯉養殖用飼料と本多糖を1:1及び1:2の重量
の割合で配合して、乾燥してミキサーで粉砕したもので
ある。
【0032】2) 多糖添加飼料の鯉への給餌方法 鯉の12週齢から22週齢にわたって10週間飼育した。鯉を
57リットル容水槽に多糖添加飼料区と多糖無添加飼料区
共20匹になる様に無作為に分配し、多糖添加飼料区20匹
には1匹当りの1日の多糖摂取量が平均体重の 0.2%に
なる様に多糖添加飼料を与えた。即ち、体重10gに対し
0.01gを与えた。従って平均体重(g)×0.001 ×20
(匹)を1日の量とし、その与え方は朝の給餌の時に多
糖添加飼料を与え、夕方の給餌の時には無添加飼料を食
べるだけ与えた。多糖無添加飼料の給餌も同様な方法で
与えた。期間中の給餌量は毎週1回天秤で20匹、同時に
体重を測定し、その結果から平均をとり次週の多糖添加
飼料の給餌量とした。
【0033】3) 多糖添加飼料の体重増加への効果 12週齢から22週齢にわたって本多糖添加飼料区と多糖無
添加飼料区の体重への促進効果は図10に示したように多
糖添加飼料区は22週齢では 0.9gに対して、多糖無添加
区は 0.7gであり、多糖添加飼料区が 0.2gの体重増加
効果がある。
【0034】
【発明の効果】本発明のAureobasidium sp. (オーレオ
バシジウム属)に属する酸性多糖生産菌を培養して得ら
れる酸性多糖は凝集活性を有すると共に毒性を有せず、
飼料に添加して発育促進に有効であること、廃水処理剤
および食品添加剤としても有用であることが認めれられ
た。
【図面の簡単な説明】
【図1】標準のアルジトールアセテートのクロマトグラ
フを示す。
【図2】本発明の多糖のアルジトールアセテートのクロ
マトグラフを示す。
【図3】本発明の未処理多糖の赤外吸収スペクトルを示
す。
【図4】本発明のメチル化多糖の赤外吸収スペクトルを
示す。
【図5】本発明の多糖のメチル化アルジトールアセテー
トの全イオンモニターを示す。
【図6】本発明多糖ピークAのメチル化アルジトールア
セテートのマスフラグメントグラムを示す。
【図7】本発明多糖ピークBのメチル化アルジトールア
セテートのマスフラグメントグラムを示す。
【図8】本発明多糖ピークCのメチル化アルジトールア
テセートのマスフラグメントグラムを示す。
【図9】本発明のメチル化多糖のNMRスペクトルを示
す。
【図10】本発明多糖 0.1%含有の飼料で飼育した魚の
平均体重増加量を示す線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:645)

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 Aureobasidium sp. (オーレオバシジウ
    ム属)に属する酸性多糖生産菌を培養することを特徴と
    する酸性多糖の生産方法。
  2. 【請求項2】 Aureobasidium sp. (オーレオバシジウ
    ム属)に属する酸性多糖生産菌をレシチンとビタミンE
    を添加した培地に培養することを特徴とする高粘稠の酸
    性多糖の生産方法。
  3. 【請求項3】 Aureobasidium sp. (オーレオバシジウ
    ム属)に属する酸性多糖生産菌を培養して得られる新規
    な酸性多糖。
  4. 【請求項4】 α−1,4結合を有し、クエン酸、リン
    ゴ酸その他の有機酸などのカルボン酸を含有する請求項
    3記載の酸性多糖。
  5. 【請求項5】 Aureobasidium sp. (オーレオバシジウ
    ム属)に属する酸性多糖生産菌を培養して得られる酸性
    多糖を有効成分とした飼料添加発育促進剤。
  6. 【請求項6】 Aureobasidium sp. (オーレオバシジウ
    ム属)に属する酸性多糖生産菌を培養して得られる酸性
    多糖を有効成分とする廃水処理剤。
  7. 【請求項7】 Aureobasidium sp. (オーレオバシジウ
    ム属)に属する酸性多糖生産菌を培養して得られる酸性
    多糖を有効成分とする食品添加剤。
JP6073784A 1994-03-22 1994-03-22 酸性多糖 Pending JPH0881501A (ja)

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