CN110373356B - 一种抑制产肠毒素大肠杆菌生长的解淀粉芽孢杆菌胞外多糖 - Google Patents

一种抑制产肠毒素大肠杆菌生长的解淀粉芽孢杆菌胞外多糖 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抑制产肠毒素大肠杆菌生长的解淀粉芽孢杆菌胞外多糖，属于生物工程技术领域。所述的胞外多糖的分子量为8005Da，由果糖和葡萄糖组成，是一种具有特殊结构的左聚糖，其分子结构具有7个特定的重复单元，重复单元含7个果糖基，以6个β‑(2,6)‑果糖基为骨架，1个β‑(1,2)‑果糖基为支链。本发明公开了解淀粉芽孢杆菌胞外多糖EPS‑JN4具有抑制产肠毒素大肠杆菌生长的作用，最低抑制浓度为5×10‑7mg多糖/CFU大肠杆菌，替代抗生素治疗大肠杆菌导致的腹泻疾病具有很好的潜力。

Description

一种抑制产肠毒素大肠杆菌生长的解淀粉芽孢杆菌胞外多糖
技术领域
本发明涉及一种抑制产肠毒素大肠杆菌生长的解淀粉芽孢杆菌胞外多糖，属于生物工程技术领域。
背景技术
对于断奶仔猪，约80％的急性腹泻被认为是由产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)引起的，其死亡率超过10％。目前，常规的治疗是添加抗生素，然而抗生素治疗是耐药菌株遗传进展的主要诱因。此外，它还会导致肠道菌群失衡和免疫系统紊乱，从而导致存活仔猪体重下降，生长不良，最终造成巨大的经济损失。因此，寻找一种安全有效的抗生素替代品对畜牧业具有重要意义。
一些糖类化合物，比如来自植物中的低聚半乳糖和乳酸菌胞外乳酸菌，能够竞争性地与ETEC细胞表面的菌毛蛋白结合，从而阻断ETEC与肠上皮细胞的结合，进而抑制ETEC的肠道定殖。然而，由于单糖组成和多糖结构的多样性，其抑制活性各不相同。然而，大多数乳酸菌胞外多糖的产量都很小，小于1g/L，因此并未引起商业开发的兴趣。相比之下，已经发现芽孢杆菌胞外多糖产量较高，但遗憾的是，它还没有被证明可以作为ETEC的抗粘附剂。而且，从治疗的角度需要，这种替代抗生素的胞外多糖需要有一定的抑菌能力，抑制ETEC的生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抑制产肠毒素大肠杆菌生长的多糖及其应用。
本发明技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JN4，保藏编号为CCTCC NO:M 2019206，已于2019年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明的第二个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌的代谢物。
在本发明的一种实施方式中，所述代谢物包括但不限于胞外多糖。
在本发明的一种实施方式中，所述代谢物按下述方式制备：(1)将所述解淀粉芽孢杆菌在LB斜面活化、扩大培养；
(2)将步骤(1)制得的扩培菌株接种至发酵培养基中，37℃，200r/min培养48～72h，获得含有解淀粉芽孢杆菌胞外多糖的发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的发酵培养基组分如下：蔗糖80～100g，胰蛋白胨8～10g，酵母提取物4～6g，氯化钠8～10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的发酵培养基组分如下：蔗糖100g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述胞外多糖经过分离纯化，所述分离纯化具体是：将解淀粉芽孢杆菌的发酵液离心，收集上清液，用乙醇沉淀，收集沉淀，出去蛋白，得到粗糖液；将粗糖液经过凝胶层析分离，并经过冷冻干燥，获得纯化后的胞外多糖。
在本发明的一种实施方式中，所述分离纯化具体包括如下步骤：
(1)将发酵液离心，收集上清液；
(2)将步骤(1)制得的上清液超滤浓缩至原体积的1/2，得浓缩液，然后向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，经醇沉后，离心，收集沉淀；
(3)将步骤(2)收集的沉淀用水溶解，加入1/4体积的seveage试剂去除蛋白质，制得粗糖溶液；
(4)将步骤(3)制得的粗糖溶液通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱获得酸性多糖分级，再经过Sepharose CL-6B凝胶层析柱分离，收集多糖分级；
(5)将步骤(4)制得的胞外多糖溶液经透析真空冷冻干燥后，制得纯化的胞外多糖；
本发明的第三个目的是提供一种多糖，其具有下述结构式：
Figure BDA0002149095560000021
该多糖的分子量约为8005Da，由果糖和葡萄糖组成，是一种具有特殊结构的左聚糖，其分子结构具有7个特定的重复单元，重复单元含7个果糖基，以6个β-(2,6)-果糖基为骨架，1个β-(1,2)-果糖基为支链。
本发明的第四个目的是提供含有所述多糖的组合物。
本发明还要求保护所述多糖在抑制产肠毒素的大肠杆菌生长方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述多糖的有效浓度≥5×10-7mg多糖/CFU大肠杆菌。
本发明还要求保护所述多糖在制备缓解或治疗肠毒素引起的腹泻、肠炎或肠道感染的药物方面的应用。
有益效果：本发明的解淀粉芽孢杆菌具有抑制产肠毒素大肠杆菌生长的作用，其生产的胞外多糖对ETEC的最低抑制浓度为5×10-7mg多糖/CFU大肠杆菌，具有替代抗生素治疗大肠杆菌导致的腹泻疾病的很好的潜力。本发明的解淀粉芽孢杆菌JN4可耐受浓度为9％的NaCl溶液，并可在人工模拟胃液(pH 3.0)中存活3h，在模拟肠液(pH 8.0)中存活至少8h，且存活率可达到94％以上，可作为替代抗生素的肠道益生菌剂，具有重要的应用潜力。
生物材料保藏
一株解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JN4，保藏编号为CCTCC NO:M 2019206，已于2019年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
附图说明
图1为分别是胞外多糖的1H(图1A)和13C核磁共振谱(图1B)。
图2为胞外多糖的1H/1H COSY相关谱，1H/13C HSQC相关谱和1H/13C HMBC相关谱。
图3是胞外多糖抑制ETEC的应用实验；
图4为EPS对大肠杆菌作用的电镜图；A为添加低分子量左聚糖的大肠杆菌；B为未添加低分子量左聚糖的对照。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明技术方案作进一步说明，但此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
本发明的解淀粉芽孢杆菌筛选自健康仔猪肠道。
(1)将菌种保藏号为的解淀粉芽孢杆菌在LB斜面活化、扩大培养；
(2)将步骤(1)制得的扩培菌株接种至发酵培养基中，37℃，200r/min培养48～72h，获得含有解淀粉芽孢杆菌胞外多糖的发酵液；
(3)将步骤(2)制得的液体发酵液离心，收集上清液；
(4)将步骤(3)制得的上清液超滤浓缩至原体积的1/2，得浓缩液，然后向浓缩液中加入三倍体积的无水乙醇，经醇沉后，离心，收集沉淀；
(5)将步骤(4)收集的沉淀用水溶解，加入1/4体积的seveage试剂去除蛋白质，制得粗糖溶液；
(6)将步骤(5)制得的粗糖溶液通过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱柱获得酸性多糖分级，再经过Sepharose CL-6B凝胶层析柱分离，收集多糖分级；
(7)将步骤(6)制得的胞外多糖溶液经透析真空冷冻干燥后，制得纯化的胞外多糖；
所述步骤(2)中的发酵培养基组分如下：蔗糖100g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。
通过高效凝胶过滤色谱(HPGFC)确定平均分子量为8005Da，胞外多糖经0.2M的三氟乙酸水解0.5h制成单糖溶液，通过高效阴离子交换色谱检测多糖由果糖和葡萄糖以约36.1:1的摩尔比例组成，多糖的结构分析通过傅里叶红外光谱、甲基化分析和核磁共振进行。
将EPS-JN4与KBr按1:100的比例混合，然后通过疏散将其接地并压入薄板中。使用Nexus 470FTIR分光光度计记录EPS-JN4在4000-400cm-1范围内的红外光谱(IR)。EPS-JN4进行甲基化，水解和乙酰化作用，采用配备毛细管柱(30m×0.25mm,0.25μm)的Trace 1310-ISQ GC-MS测定，升温程序为从160℃到210℃2℃/min，然后5℃/分钟到240℃。EPS-JN4样品直接溶解(10毫克/毫升)在D2O进行核磁共振分析(500.13MHz1H NMR和125.75MHz的13CNMR)。
EPS-JN4的1H NMR谱图(图1A)表明环质子区中有7个主要质子信号(3.5-4.2ppm)，但在端基质子区域没有信号(4.2-5.5ppm)，这主要由于EPS-JN4中的果糖。13C NMR谱显示了EPS-JN4在62-107ppm范围内的化学位移(图1B)。根据文献报道，在62.4，106.7，78.8，77.4，82.9，66.0ppm左右的信号分别归因于C-1，C-2，C-3，C-4，C-5和C-6。C-6，C-2和C-4的低场特征信号和C原子的相对间距与左聚糖相似而不是菊粉，表明EPS-JN4是一个左聚糖。HMBC光谱(图2A)中C2/H6在δ(106.7/3.83)和δ106.0/3.87的交叉峰证实了β-(2→6)键的存在。此外，C3在0.4ppm低场区产生的信号可用于区分具有支链的左聚糖和线性的左聚糖，结果表明EPS-JN4是含支链左聚糖，该区域信号没有低到足以省略，表明存在大量分支。2D NMR用分析EPS-JN4重复单元中的糖单元的化学位移(表1)。COSY光谱(图2B)中H3/H4，H4/H5，H5/H6a，H5/H6b，H6a/H6b和H1a/H1b之间的交叉峰显示出了与左聚糖的相似性。H6a和H6b之间通过氧的屏蔽作用产生化学位移的差异可以区分左聚糖和菊粉，结果表明EPS-JN4为左聚糖。HSQC谱(图2C)表明质子碳原子之间的直接C-H相关性。C2和任何其他H之间没有交叉峰，这证实了其四元异头碳特征。H5/C5的两个交叉峰(δ3.89/82.9和δ3.93/82.9)是特异性的，表明左聚糖具有两种类型的连接方式，分别为→6)-β-D-Fruf-(2→和→1,2)-β-D-Fruf-(6→。H6a/C6和H6b/C6的两个交叉峰以及其余交叉峰包括H1a/C1，H1b/C1，H3/C3和H4/C4也符合左聚糖的数据。
实施例2
人工模拟胃肠液需新鲜配制：采用PBS分别配制浓度为3g/L、pH 3.0的胃蛋白酶和1g/LpH 8.0胰蛋白酶，将配制好的溶液分别用0.22μm滤膜过滤，制得模拟胃液和模拟肠液。
将解淀粉芽孢杆菌JN4孢子以生理盐水重悬，按照1×109CFU/mL的终浓度加入至模拟胃液(pH 3.0)中，在37℃培养3h，每h检测活菌数。3h后，取模拟胃液(pH 3.0)中的培养液1ml加入至9ml的模拟肠液(pH 8.0)中，充分混匀，在37℃培养8h，每2h测定活菌数。
结果表明，解淀粉芽孢杆菌JN4在人工模拟胃液(pH 3.0)中可存活3h，并且存活率大于90％。解淀粉芽孢杆菌JN4在模拟肠液(pH 8.0)中可存活至少8h，且存活率可达到94％以上。
实施例3
取对数生长期的解淀粉芽孢杆菌JN4孢子，以终浓度1×106CFU/mL的接种量分别接入到NaCl质量分数为0％、2％、4％、6％、7％、8％、9％的发酵培养基(配制方法同实施例1)中，充分混合均匀，在37℃下培养24h后测定其菌液OD600值。
结果表明，在NaCl浓度为9％时解淀粉芽孢杆菌存活率仍达到85％以上，说明解淀粉芽孢杆菌JN4对NaCl具有较强的耐受能力。
实施例4
胞外多糖对产肠毒素大肠杆菌生长抑制活性的检测：将500μL大肠杆菌细胞(菌体量为2×107CFU)与同样体积的低分子量左聚糖EPS-JN4(浓度20毫克/毫升)在37℃混合孵化5分钟，接种至到LB培养基(2％,v/v)，每2h检测OD600直到增长结束。随着大肠杆菌细胞的生长，EPS-JN4在初始阶段表现出明显的抑制作用，经镜检发现，对照组的大肠杆菌表面光滑(图4B)，添加低分子量左聚糖EPS-JN4的环境下大肠杆菌表面粗糙(图4A)，低分子量左聚糖EPS-JN4通过粘附在大肠杆菌细胞表面，而不是直接杀死细菌，从而抑制或延缓了大肠杆菌的生长。值得注意的是，这种抑制作用可以与其他益生菌结合，在未来预防或控制ETEC引起的腹泻，是一种很有前途的治疗策略。此外，还可用于替代抗生素实现靶向治疗。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）JN4，保藏编号为CCTCC NO: M 2019206，已于2019年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
2.一种制备权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的胞外多糖的方法，其特征在于，将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌接种至发酵培养基中，35~37℃培养48～72 h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还对培养获得的发酵液进行分离纯化；所述分离纯化具体是：将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的发酵液离心，收集上清液，用乙醇沉淀，收集沉淀，除去蛋白，得到粗糖液；将粗糖液经过凝胶层析分离，并经过冷冻干燥，获得纯化后的胞外多糖。
4.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在制备缓解或治疗大肠杆菌产生的肠毒素引起的腹泻、肠炎或肠道感染的药物方面的应用。
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Gene cloning, characterization, and heterologous expression of levansucrase from Bacillus amyloliquefaciens;Dina Rairakhwada等;《Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology》;20091116;第37卷;第195-204页，参见全文 *
New Levan-Type Exopolysaccharide from Bacillus amyloliquefaciens as an Antiadhesive Agent against Enterotoxigenic Escherichia coli;Guolin Cai等;《Journal of Agricultural and Food Chemistry》;20190627;第67卷(第28期);第8029-8034页，参见第8029页右栏第2段-第8030页左栏第2段、第8030页右栏第2段-第8033页右栏第1段、图1-4、表1、参考文献13 *
高产抑制大肠杆菌血凝性的胞外多糖的解淀粉芽孢杆菌;蔡国林等;《食品与发酵工程》;20190331;第45卷(第5期);第14-17页，参见摘要、第15页左栏第1段、第15页右栏第4段-第17页左栏第3段 *

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