CN111972545B

CN111972545B - 一种富含维生素k2的发酵饲料及其生产方法

Info

Publication number: CN111972545B
Application number: CN202010841744.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡国林; 陆健; 李存; 谢莹; 李晓敏; 吴殿辉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-08-20
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2040-08-20
Also published as: CN111972545A

Abstract

本发明公开了一种富含维生素K2的发酵饲料及其生产方法，属于动物饲料和生物工程的技术领域。其以麸皮和豆粕为主要原料(98％以上)，与磷酸氢二钾和谷氨酸钠混合，通过调节水的添加量，并在解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206的微生物作用下，发酵得到饲料。发酵饲料中维生素K2含量提高了200倍以上，达到100mg/kg以上，且发酵饲料中芽孢数量达到1.0×10¹⁰CFU/g以上。本发明发酵过程易于控制，得到的产品质量稳定，制得的发酵饲料供动物食用，可提高动物的消化吸收能力，调节动物体内微生态平衡，增强动物的防病抗病能力。

Description

一种富含维生素K2的发酵饲料及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种富含维生素K2的发酵饲料及其生产方法，属于动物饲料和生物工程的技术领域。

背景技术

维生素K2是一种脂溶性的维生素，主要存在于原核生物中。在动物生长过程中，维生素K2可以增加肠道对钙的吸收与转运，抑制尿及粪便钙的排泄，逆转骨钙流失，显著促进钙平衡。此外，维生素K2作为谷氨酸γ-羧化酶的辅酶，还可以显著提高γ-羧基谷氨酸(骨钙素)的浓度。因此，维生素K2有“铀金维生素”之称，可以预防和治疗骨质疏松，提高动物的生长性能。

维生素K2主要由微生物合成，家禽的肠道虽然能合成少量的维生素K2，但远远不能满足它们的需要，尤其当生产性能提高时，其需要量也要大幅增加。如按照NRC标准，鸡在各生理阶段需要维生素K2的量都在0.5mg/kg饲料，而饲料原料的维生素K2的普遍含量在0.01-0.10mg/kg，如果不额外添加，将影响动物的生长性能和动物产品的品质。

在动物饲料中补充维生素K2添加剂是一种常见的解决饲料原料中维生素K2缺乏的有效方法。然而，尽管维生素K2在自然界广泛存在，但由于含量低、提取困难、成本较高，难以满足工业化生产需要。目前，通过微生物液体发酵合成维生素K2成为市场的首选。目前微生物发酵合成维生素K2的生产菌种主要有纳豆芽孢杆菌和黄杆菌。如：专利ZL201410472873.2采用纳豆芽孢杆菌CCTCCNO:M2014405通过优化液体发酵工艺生产维生素K2，产量为60.54mg/L同样以纳豆芽孢杆菌为出发菌株，申请号为202010315201.6的专利通过代谢工程改造技术，提高原始菌株维生素K2的产量5.78倍，达到133mg/L。而采用黄杆菌为出发菌株，专利CN 201310280268.0采用低能离子束及低温等离子体复合诱变方式选育高产菌株，经液体发酵，维生素K2产量提高200％，但并未说明具体产量，根据研究人员公开发表的文章(《辐射研究与辐射工艺学报》2015,33(4)：41-49)可以知道，其维生素K2产量在8mg/L左右。由于发酵产量偏低，导致维生素K2价格居高不下，给动物饲料行业增加一定的经济负担。

为弥补原料中维生素K2的不足，在食品行业可以通过食品原料的固态发酵提高其维生素K2的含量，比如纳豆食品，专利ZL 200710151453.4就以大豆为原料，经纳豆芽孢杆菌发酵制备获得了纳豆提取物，其维生素K2含量达到了125mg/kg；专利ZL200780036591.6则发明了以乳酸菌静息细胞培养技术的乳制品，维生素K2最高达到0.750mg/kg；申请号为202010190521.3的专利则公开了一种经纳豆芽孢杆菌发酵的果蔬泥，其维生素K2含量达到了0.485mg/kg。固态发酵中，由于原料、菌种和发酵条件的不同都会导致产品中维生素K2含量的差异，在饲料行业，目前还没有通过生物技术处理的方式制备高维生素K2的发酵饲料，用于饲料配方中平衡原料的维生素K2含量，进而提高动物的生长性能。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种制备饲料的方法，以豆粕和麸皮为原料，加入解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206，通过微生物固态发酵制备饲料。

在本发明的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206公开在申请号为CN 201910695004.9的专利中，所述解淀粉芽孢杆CCTCC NO:M 2019206能够抑制产肠毒素的大肠杆菌的生长。

在本发明的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206的添加量为5～7mL/100g。

在本发明的一种实施方式中，发酵体系中添加了磷酸氢二钾。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸氢二钾的添加量为1.8～2.6g/100g。

在本发明的一种实施方式中，发酵体系中还添加了谷氨酸钠。

在本发明的一种实施方式中，谷氨酸钠的添加量为0.15～0.3g/100g。

在本发明的一种实施方式中，在发酵前添加磷酸氢二钾和谷氨酸钠。

在本发明的一种实施方式中，按1:1～1.5(w/w)的料水比与水混合并搅拌均匀后灭菌，按接入解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206于转轴式机械搅拌罐内发酵，搅拌转速5～15r/min，通气量0.05～0.2VVM，在37±5℃下发酵，发酵7～9h后开始喷雾补水；发酵30～40h后进行低温干燥，得到饲料。

在本发明的一种实施方式中，在发酵7～8h后开始补水，补水量为每小时1～1.5mL/100mL物料重量。

本发明提供了一种提高饲料中维生素K2含量的方法，向原料中添加解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206、磷酸氢二钾和谷氨酸钠。

在本发明的一种实施方式中，将芽孢数至少为1.0×10⁸CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206，以5～7mL/100g的添加量加入。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸氢二钾和谷氨酸钠的添加量分别为1.8～2.6％和0.15～0.3％。

本发明还保护所述制备饲料的方法，或所述提高饲料中维生素K2含量的方法在制备富含维生素K2的饲料中的应用。

本发明还保护所述方法制备得到的富含有益微生物和维生素K2的饲料。

本发明的有益效果：

本发明以麸皮和豆粕为主要原料，添加部分磷酸氢二钾和谷氨酸钠，通过微生物固态发酵制备富含维生素K2的发酵饲料，其维生素K2含量比原料提高200倍，达到100mg/kg以上，芽孢数达到1.0×10¹⁰CFU/g以上。饲料中维生素K2含量丰富，且有益微生物解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206数量多，有益动物的肠道健康。

具体实施方式

饲料中维生素K2含量的测定方法：

称取样品2g于50mL离心管中，加入30mL异丙醇，充分振摇，40℃超声振荡30min，冷却，5000r/min下离心10min，上清液移入100mL棕色容量瓶中，沉淀物用异丙醇重复洗涤2次，合并上清液，用异丙醇定容，0.45μm滤膜过滤后用于HPLC分析。

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(150mm×4.6mm，5μm)；柱后锌粉还原柱：35mm×4.6mm，连接于色谱柱之后，检测器之前；柱温：25℃；流速：1.5mL/min；进样量：10μL；检测波长:激发波长243nm，发射波长为430nm；流动相：甲醇(含有二氯甲烷10％、冰醋酸0.03％、氯化锌1.5g/L、无水乙酸钠0.5g/L)。

实施例1

将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206(公开在申请号为CN 201910695004.9的专利中)，接种至LB培养基中，37℃、200r/min培养至菌浓为1.0×10⁹CFU/mL。

以麸皮60％和豆粕38％为主要原料，添加磷酸氢二钾(1.8g/100g)和谷氨酸钠(0.2g/100g)，按1:1.2(w/w)的料水比与水混合并搅拌均匀后，在温度为121℃的条件下进行灭菌20分钟，按固态基质重量接入解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206培养液5％(5mL/100g)于转轴式机械搅拌罐内发酵，搅拌转速10r/min，通气量0.1VVM，在37±5℃下发酵，发酵8h后开始喷雾补水，每小时补水量为1％物料重量；发酵36h后进行低温干燥，得到饲料，并测定饲料中的维生素K2含量。最终产品维生素K2含量为112mg/kg。

实施例2：原料中不添加谷氨酸钠

以麸皮60％和豆粕38％为主要原料，添加磷酸氢二钾(1.8g/100g)，按1:1.2(w/w)的料水比与水混合并搅拌均匀后，在温度为121℃的条件下进行灭菌20分钟，按固态基质重量接入解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206培养液5％(5mL/100g)于转轴式机械搅拌罐内发酵，搅拌转速10r/min，通气量0.1VVM，在37±5℃下发酵，发酵8h后开始喷雾补水，每小时补水量为1mL/100mL物料重量；发酵36h后进行低温干燥，制备得到饲料。最终产品维生素K2含量为88mg/kg。

实施例3：原料中不添加磷酸氢二钾

以麸皮61.8％和豆粕38％为主要原料，添加谷氨酸钠(0.2g/100g)，按1:1.2(w/w)的料水比与水混合并搅拌均匀后，在温度为121℃的条件下进行灭菌20分钟，按固态基质重量接入解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206培养液5％(5mL/100g)于转轴式机械搅拌罐内发酵，搅拌转速10r/min，通气量0.1VVM，在37±5℃下发酵，发酵8h后开始喷雾补水，每小时补水量为1％物料重量；发酵36h后进行低温干燥。最终产品维生素K2含量为72mg/kg。

实施例4：制备过程中不补水

以麸皮60％和豆粕38％为主要原料，添加磷酸氢二钾(1.8％，w/w)和谷氨酸钠(0.2％，w/w)，按1:1.2(w/w)的料水比与水混合并搅拌均匀后，在温度为121℃的条件下进行灭菌20分钟，按固态基质重量接入解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206培养液5％(5mL/100g)于转轴式机械搅拌罐内发酵，搅拌转速10r/min，通气量0.1VVM，在37±5℃下发酵36h后进行低温干燥，制备得到饲料。最终产品维生素K2含量为66mg/kg。

实施例5

以麸皮60％和豆粕38％为主要原料，添加磷酸氢二钾(2％，w/w)，按1:1.2(w/w)的料水比与水混合并搅拌均匀后，在温度为121℃的条件下进行灭菌20分钟，于转轴式机械搅拌罐内发酵，搅拌转速10r/min，通气量0.1VVM，在37±5℃下发酵，发酵8h后开始喷雾补水，每小时补水量为1％物料重量；发酵36h后进行低温干燥，制备得到饲料。最终产品维生素K2含量为0.5mg/kg。

实施例6

具体实施方式参见实施例1，区别在于，将磷酸氢二钾的添加量替换为1％、1.4％、2.2％、2.6％，制备得到饲料，并测定饲料中的维生素K2含量，结果分别为94、102、110和108mg/kg。

实施例7

具体实施方式参见实施例1，区别在于，将谷氨酸钠的添加量替换为0.1％、0.15％、0.25％、0.3％，制备得到饲料，并测定饲料中的维生素K2含量，结果为98、104、112和104mg/kg。

实施例8

具体实施方式参见实施例1，区别在于，将每小时补水量替换为0.5％物料重量、1.5％物料重量、2％物料重量、2.5％物料重量，制备得到饲料，并测定饲料中的维生素K2含量，结果为86、105、100和92mg/kg。

对比例1

具体实施方式参见实施例1，区别在于，不添加谷氨酸钠、磷酸氢二钾、不添加解淀粉芽孢杆菌JN4、不补水，制备得到饲料，并测定饲料中的维生素K2含量，结果为0.5mg/kg。

对比例2

具体实施方式参见实施例1，区别在于，将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206的接种量替换为1％、3％、7％、9％，制备得到饲料，并测定饲料中的维生素K2含量，结果为28、69、109和98mg/kg。

具体实施方式参见实施例1，区别在于，将解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2019206替换为其他的芽孢杆菌，如解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.9021(专利申请号为CN201410235025.X)、枯草芽孢杆菌168和纳豆芽孢杆菌NK1(公布于姜晓宇《纳豆芽孢杆菌发酵对辣木叶营养特性的影响》，公开日2019年1月)，制备得到饲料，并测定饲料中的维生素K2含量，结果分别为42、28和56mg/kg。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种富含维生素K2的发酵饲料的制备方法，其特征在于，以豆粕和麸皮为原料，并添加质量分数为1.8~2.6%的磷酸氢二钾和质量分数为0.15~0.3%的谷氨酸钠，然后按1:1~1.5的料水比与水混合，并搅拌均匀后灭菌，按固态基质重量加入解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO: M2019206培养液，接入量为5~7mL/100g，所述培养液的芽孢数至少为1.0×10⁸ CFU/mL，发酵30~40 h，在发酵7~8 h后开始补水，补水量为每小时1~1.5%物料重量。

2.一种提高饲料中维生素K2含量的方法，其特征在于，所述方法为，以豆粕和麸皮为原料，并添加质量分数为1.8~2.6%的磷酸氢二钾和质量分数为0.15~0.3%的谷氨酸钠，然后按1:1~1.5的料水比与水混合，并搅拌均匀后灭菌，按固态基质重量加入解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO: M 2019206培养液，接入量为5~7mL/100g，所述培养液的芽孢数至少为1.0×10⁸CFU/mL，发酵30~40 h，在发酵7~8 h后开始补水，补水量为每小时1~1.5%物料重量。

3.权利要求1或2所述方法制备的富含有益微生物和维生素K2的饲料。