CN103865835A

CN103865835A - 一株甲萘醌-7（mk-7）高产菌及其应用

Info

Publication number: CN103865835A
Application number: CN201310694798.XA
Authority: CN
Inventors: 张伟国; 钱和; 严为留
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-12-17
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2014-06-18

Abstract

本发明涉及一株在培养过程中能产生大量MK-7的解淀粉芽孢杆菌及其培养方法。菌种名称为Y-2，分类名称Bacillus amyloliquefaciens，所得菌株遗传性状稳定，产量性状稳定，适合工业推广，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2013493。本发明还公开了一种生产MK-7的方法，以5%的种子接种量，将种子液接入发酵培养基中，在温度为37℃，转速为100r/min的条件下培养2h，然后静置培养6天，维生素K2（MK-7）产量最高达到66.62mg/L。本发明所提供的MK-7高产菌株及生产方法，生产周期短，产量高，为工业化发酵生产MK-7提供了可行性。

Description

一株甲萘醌-7(MK-7)高产菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种本发明涉及一株在培养过程中能产生大量甲萘醌-7（MK-7）的解淀粉芽孢杆菌，尤其涉及一种可以产生大量MK-7的解淀粉芽孢杆菌及其生产方法，属于微生物发酵领域。

背景技术

K族维生素是人体必需的四种脂溶性维生素之一，按照来源不同可以分为K₁和K₂两种，其中K₁主要来源于植物，也称叶绿醌，K₂主要来源于微生物，也称甲萘醌。从结构上看，维生素K₂除了萘醌母环外，在C-3位置上还有一条由异戊二烯单元组成的侧链，根据异戊二烯单元个数的差异，维生素K₂共分为14种，以MK_-n表示，MK-7(甲萘醌-7)即表示侧链上含有7个异戊二烯单元的维生素K₂，其分子式为C₄₆H₆₄O₂，CAS编号为2124-57-4。

MK-7最初是日本学者从日本传统食品纳豆中发现的，随后其结构和生理功能被慢慢地发掘出来。和其他维生素K₂同系物一样，MK-7是哺乳动物产生凝血因子II、VII、IX以及X的一个非常重要的辅因子，是正常血液凝固时不可或缺的营养素。MK-7还能够活化钙化抑制基质Gla蛋白质（matrix Gla protein MGP），从而防止钙质在血管中沉淀而造成的动脉硬化。另外，MK-7能够将骨髓中的骨钙素活化，从而促进骨头的形成。在日本，关东地区居民的股颈骨折发病率要比关西地区低很多，其原因就在于两个地区饮食习惯的不同，造成前者血液中MK-7含量比后者要高很多。最近的流行病学研究表明，纳豆中的MK-7能够显著提高老年人骨头中的矿物质密度（BMD），降低老年人的髋骨骨折风险。由于细胞对MK-7的摄取比其他K族维生素都好，并且MK-7在海产油中具有超常的稳定性，而且能够抵消海产油潜在的动脉钙化诱导效应和对骨骼和软骨健康潜在的的负面影响而又不抵消海产油的抗凝效应。因此在挪威，MK-7已经作为一种优选的维生素K₂与海产油的多不饱和脂肪酸组合制成类药剂营养品，用于治疗和预防与骨、软骨和心血管系统有关的疾病。因此MK-7作为一种药品或者营养补充品，其独特的生理功能已经引起越来越多的研究人员的关注。

MK-7主要来源于纳豆，其在纳豆中含量也是所有食物中最高的，而纳豆由于其富含具有溶栓功能的纳豆激酶而闻名于世。但是纳豆本身特有的氨臭味为很多人所不能接受，这就很大程度上限制了它的应用。鉴于这个原因，很多学者开始研究利用微生物发酵法生产MK-7，其最大的优点就是通过发酵产生的MK-7是有生理活性的，而且有利于工业放大。但是从目前来看，MK-7还没能实现工业化发酵生产，其主要原因在于发酵法产量不高、发酵周期较长，原料成本较高，有鉴于此，有必要对MK-7生产菌株进行筛选优化，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产MK-7的菌株，所述菌株其分类为Bacillus amyloliquefaciens Y-2野生型（解淀粉芽孢杆菌），该菌株已于2013年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学，其保藏编号为：CCTCCNO：M2013493。

所述菌株的16SrRNA序列如Seq ID NO.1所示。

所述菌株平板单菌落为白色或微黄色，圆形；幼龄菌落半透明，24h后逐渐发白，菌落粘稠，拉长丝；培养48h，菌落直径可达到5mm以上，菌落边缘不光滑呈裂叶状，中央突起，或呈火山口状；结晶紫染色后镜检，其个体微小，长2-3μm，宽0.6-0.9μm，其中有芽孢的短杆菌占多数，芽孢呈圆形或椭圆状，不明显膨大，芽孢中生或次中生，多为两端均匀染色，静止液体培养时，在液体表面生长。

所述菌株从纳豆中分离得到。

所述玉米粉液化液是将工业玉米粉按照30%的比例（w/v）加水混匀，然后沸水浴进行糊化，再按照0.1%的比例加入高温淀粉酶沸水浴液化20min，之后用4层纱布过滤得到上清，再用水补充至原体积，即可得到所需要的玉米粉液化液，其中还原糖含量为60g/L左右。

本发明所要解决的另一技术问题是提供了一种高产MK-7的方法。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

利用解淀粉芽孢杆菌Y-2液态发酵生产MK-7，其制备方法如下：

1.菌种活化：将接有解淀粉芽孢杆菌Y-2的斜面在37℃恒温箱里培养2-3h。

2.种子液制备：将活化的菌种，用接种环挑接到50mL种子培养基中，37℃，100r/min培养10h。种子培养基配方为：玉米粉液化液1L（还原糖含量为20g/L左右），豆粕粉20g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L、K₂HPO₄0.1g/L，NaCl2.5g/L，pH为7.0-7.2,0.1MPa压力下灭菌20min。

3.发酵液制备：将培养好的种子液按5%的接种量接到发酵培养基中，在温度为37℃，转速为100r/min的条件下培养2h，然后静置培养6天。发酵培养基配方为：玉米粉液化液1L（还原糖含量为60g/L左右），豆粕粉40g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L、K₂HPO₄0.1g/L，NaCl2.5g/L，pH为7.0-7.2,0.07MPa压力下灭菌20min。

本发明的有益效果：本发明的解淀粉芽孢杆菌亚种Y-2产MK-7量高，在10mL三角瓶中MK-7产量最高可达66.62mg/L，为工业化发酵生产MK-7提供了可行性。

附图说明

图1菌株Y-2基于16SrRNA的进化树

图2菌株Y-2的代谢规律图

具体实施方式：

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1解淀粉芽孢杆菌亚种Y-2的筛选及鉴定

1.本发明提供的解淀粉芽孢杆菌亚种Y-2的筛选方法为：

取纳豆样品4颗（约0.5g）于10mL无菌生理盐水中，80℃震荡水浴10min。取100μL提取液，用适量无菌生理盐水稀释，最后取200μL的稀释液涂布于LBG固体培养基上，37℃过夜培养，分离单菌落，从中挑选出能拉丝的菌落，转接到LBG液体培养基中，37℃培养24h，检测其中的MK-7含量，从中挑选出MK-7产量最高的菌，命名为Y-2。

2.本发明提供的MK-7提取和检测方法如下：

将发酵结束后的发酵液于7000r/min离心5min，将上清和菌体分开，然后按照4:1的体积比分别加入萃取液（正己烷：异丙醇=2:1），即4体积的发酵液加入1体积的萃取液，旋涡混匀2min后离心分层，取出上层有机层。需要注意的是要将萃取液分2-3次加入，即离心取出上层有机层后再加入萃取液萃取，这样少量多次的萃取方式有助于从发酵液和菌体中完全萃取出MK-7。萃取后，将所有萃取液合并，37℃旋转减压蒸至近干，用少量正己烷溶解后完全转移至10mL离心管中，用N2吹干，再用500μL上机液（乙腈：二氯甲烷：甲醇=3:1:1）完全溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤后用HPLC分析，所用色谱柱为Zorbax SB C18column(250×4.6mm,Agilent,USA)，流动相为甲醇：二氯甲烷=9:1(v/v)，流速为1mL/min，柱温为40℃，检测波长为270nm。

3.菌株Y-2的鉴定如下：

1.）形态学鉴定：

普通琼脂营养平板划线，37℃培养10h，单菌落为白色或微黄色，圆形；幼龄菌落半透明，24h后逐渐发白，菌落粘稠，拉长丝；培养48h，菌落直径可达到5mm以上，菌落边缘不光滑呈裂叶状，中央突起，或呈火山口状；结晶紫染色后镜检，其个体微小，长2-3μm，宽0.6-0.9μm，其中有芽孢的短杆菌占多数，芽孢呈圆形或椭圆状，不明显膨大，芽孢中生或次中生，多为两端均匀染色。静止液体培养时，在液体表面生长，表明其是好氧菌。

2.）16SrRNA测序：

菌株Y-2基因组DNA的提取：参照Takara基因组抽提试剂盒的说明提取基因组DNA，具体步骤如下：挑取在LB平板上培养的Y-2单菌落，于10mLLB液体培养基中培养至对数生长期，取2mL菌液，12000r/min离心2min，收集菌体。按3mg/mL量加入溶菌酶，37℃孵育1h。取出，加入180μL的Buffer GL、20μL的Proteinase K和10μL的RNase A（10mg/mL），充分振荡混匀，于56℃水浴20min。之后加入200μL的Buffer GB，充分混匀。溶液转移至Spin Column中，12000r/min离心2min，弃滤液。将500μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12000r/min离心1min，弃滤液。再将500μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12000r/min离心1min，弃滤液。重复加入Buffer WB，12000r/min离心1min，弃滤液。将Spin Column安置于Collection Tube上，12000r/min离心2min。将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-200μL的Elution Buffer，室温静置5min。12000r/min离心2min洗脱DNA。以所提的基因组为模板，建立如下PCR反应体系：模板DNA2μL，Buffer5μL，Mg²⁺3μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTP1μL，Taq DNA Polymerase1μL，用双蒸水补齐到50μL。其中Buffer浓度为25mmol/L，Mg²⁺浓度为10mmol/L，Taq DNA Polymerase浓度为5U/mL，上游引物序列为5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物序列为5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，30个循环（94℃变性30s，45℃退火90s，72℃延伸1.5min），72℃延伸10min。PCR反应结束后取5μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪下检测，结果表明所提基因组大小约为1500bp。

菌株Y-2基于16SrRNA的进化树构建如图1所示：

实施例2

玉米粉液化液制作方法：将工业玉米粉按照30%的比例（质量体积比w/v）加水混匀，然后沸水浴进行糊化，再按照0.1%的比例加入高温淀粉酶沸水浴液化20min，之后用4层纱布过滤得到上清，再用水补充至原体积，即可得到所需要的玉米粉液化液，其中还原糖含量为60g/L左右。

发酵培养基：玉米粉液化液1L（还原糖含量为60g/L左右），豆粕粉40g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L、K₂HPO₄0.1g/L，NaCl2.5g/L，pH为7.0-7.2。

接种与培养条件：以5%的接种量，将种子液接入发酵培养基中，装液量10mL，37℃，静置培养6天。

测得MK-7含量为66.62mg/L，在此期间，OD、pH、总糖、还原糖以及MK-7的代谢规律如图2所示。

实施例3

接种与培养条件：以5%的接种量，将种子液接入发酵培养基中，装液量10mL，37℃，静置培养5天。

测得MK-7含量为62.26mg/L。

实施例4

接种与培养条件：以5%的接种量，将种子液接入发酵培养基中，装液量10mL，37℃，静置培养4天。

测得MK-7含量为48.88mg/L。

实施例5

接种与培养条件：以5%的接种量，将种子液接入发酵培养基中，装液量30mL，37℃，静置培养4天。

测得MK-7含量为47.23mg/L。

实施例6

发酵培养基：玉米粉液化液1L（还原糖含量为40g/L左右），豆粕粉40g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L、K₂HPO₄0.1g/L，NaCl2.5g/L，pH为7.0-7.2。

测得MK-7含量为54.80mg/L。

实施例7

发酵结束后将发酵液冷冻干燥，测得MK-7含量为182.88μg/g。

以上所述，仅为发明的具体实施方式。本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应当涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株甲萘醌-7高产菌株，为解淀粉芽孢杆菌亚种（Bacillus amyloliquefaciens）Y-2，于2013年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2013493。

2.根据权利要求1所述的甲萘醌-7高产菌株，其特征在于所述菌株从纳豆中分离得到。

3.根据权利要求1所述的甲萘醌-7高产菌株，其特征在于所述菌株平板单菌落为白色或微黄色，圆形；幼龄菌落半透明，24h后逐渐发白，菌落粘稠，拉长丝；培养48h，菌落直径可达到5mm以上，菌落边缘不光滑呈裂叶状，中央突起，或呈火山口状；结晶紫染色后镜检，其个体微小，长2-3μm，宽0.6-0.9μm，其中有芽孢的短杆菌占多数，芽孢呈圆形或椭圆状，不明显膨大，芽孢中生或次中生，多为两端均匀染色，静止液体培养时，在液体表面生长。

4.根据权利要求1所述的甲萘醌-7高产菌株，其特征在于所述菌株的16SrRNA序列如Seq ID NO.1所示。

5.一种应用权利要求1所述菌株生产甲萘醌-7的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将活化的菌种，用接种环挑接到50mL种子培养基中，37℃，100r/min培养10h；

2）将培养好的种子液按5%的接种量接到发酵培养基中，在温度为37℃，转速为100r/min的条件下培养2h，然后静置培养6天。

6.根据权利要求5所述的生产甲萘醌-7的方法，其特征在于所述种子培养基为：玉米粉液化液1L，豆粕粉20g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L、K₂HPO₄0.1g/L，NaCl2.5g/L，pH为7.0-7.2,0.1MPa压力下灭菌20min。

7.根据权利要求5所述的生产甲萘醌-7的方法，其特征在于所述发酵培养基为：玉米粉液化液1L，豆粕粉40g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母膏15g/L、K₂HPO₄0.1g/L，NaCl2.5g/L，pH为7.0-7.2,0.07MPa压力下灭菌20min。

8.根据权利要求6或7所述的生产甲萘醌-7的方法其特征在于所述玉米粉液化液是将工业玉米粉按照30%的比例（w/v）加水混匀，然后沸水浴进行糊化，再按照0.1%的比例加入高温淀粉酶沸水浴液化20min，之后用4层纱布过滤得到上清，再用水补充至原体积，即可得到所需要的玉米粉液化液，其中还原糖含量为60g/L左右。