CN113881604B - 一株植物乳杆菌mm89及其多糖和应用 - Google Patents

一株植物乳杆菌mm89及其多糖和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus Plantarum)MM89及其多糖和应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus Plantarum)MM89，所述植物乳杆菌MM89的保藏编号为CGMCCNo.22641。本发明所述植物乳杆菌MM89含有并且能够用于生产具有免疫刺激活性和免疫调节活性的胞外多糖。

Description

一株植物乳杆菌MM89及其多糖和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌(LactiplantibacillusPlantarum)MM89及其多糖和应用。
背景技术
母乳的成分包括抗菌化合物，母体免疫球蛋白，免疫活性细胞。因为这些成分的共同作用，母乳喂养可以保护婴儿免受各种传染病的影响。另外母乳中也富含各种益生元，可能选择性地刺激婴儿肠道中有利微生物的生长。尽管最近婴儿配方奶粉被设计成类似母乳成分，但它们与天然生物液体的差别依然很大。也因如此母乳喂养和母乳配方奶喂养婴儿之间经常被发现肠道微生物群成分有所变化不同。
很令人惊讶的是，迄今为止很少有研究从健康母亲的母乳中分离和鉴定益生菌，现在人们对人类母乳微生物学的研究主要还局限于与乳腺炎临床病例相关的病原微生物，新生儿也仍然大多很容易患上几种传染病。如果从母乳中分离出来的细菌有益人类健康，那么它们便被认为是有吸引力的益生菌，这些细菌几乎符合所有关于人类益生菌的关键标准。目前并没有一种具有免疫刺激活性和免疫调节活性的母乳益生菌产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌MM89。本发明所述植物乳杆菌MM89含有并且能够用于生产具有免疫刺激活性和免疫调节活性的胞外多糖。
本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus Plantarum)MM89，所述植物乳杆菌MM89的保藏编号为CGMCC No.22641。
本发明还提供了上述技术方案所述植物乳杆菌MM89的培养方法，包括以下步骤，将植物乳杆菌MM89在培养基中进行培养。
本发明还提供了一种植物乳杆菌MM89的胞外多糖的生产方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述植物乳杆菌MM89在含葡萄糖的培养基中进行培养，离心取上清，使用三氯乙酸沉淀蛋白质，静置，离心取上清，加入乙醇，静置，离心取沉淀，得到植物乳杆菌MM89的胞外多糖。
本发明还提供了所述生产方法生产的植物乳杆菌MM89的胞外多糖。
优选的是，所述胞外多糖为由葡萄糖和甘露糖组成的杂多糖，平均分子量为1.38×105Da。
本发明还提供了上述技术方案所述植物乳杆菌MM89或上述技术方案所述胞外多糖在制备免疫刺激剂和/或免疫调节剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述植物乳杆菌MM89或上述技术方案所述胞外多糖在制备以下至少一种药物中的应用：
(1)提高巨噬细胞吞噬功能的药物；
(2)提高酸性磷酸酶活性的药物；
(3)促进NO产生的药物；
(4)促进细胞因子产生的药物。
优选的是，所述细胞因子包括：IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α。
本发明还提供了上述技术方案所述植物乳杆菌MM89或上述技术方案胞外多糖在制备以下至少一种药物中的应用：
(A)提高淋巴细胞增殖的药物；
(B)提高脾指数的药物；
(C)提高sIgA含量的药物；
(D)提高血清细胞因子水平的药物。
优选的是，所述血清细胞因子包括：IL-2和TNF-α。
本发明提供了一株植物乳杆菌MM89。本发明利用FTIR、NMR、GC-MS和GPC对从植物乳杆菌MM89中分离得到的MM89-EPS进行了结构表征。MM89-EPS是一种以葡萄糖和甘露糖为重复糖的杂聚物，平均分子量为1.38×105Da。采用RAW264.7细胞模型和环磷酰胺诱导的小鼠免疫抑制模型评价MM89-EPS的免疫刺激活性。MM89-EPS通过提高吞噬功能、酸性磷酸酶活性、促进NO和细胞因子的产生，在细胞模型上显示出良好的免疫调节活性。体内实验结果表明，MM89-EPS可通过提高淋巴细胞增殖、脾指数、sIgA含量和血清细胞因子水平，对免疫抑制小鼠发挥免疫调节作用。MM89-EPS可作为功能性食品中有用的食品佐剂或临床免疫调节剂。
生物保藏说明
植物乳杆菌(Lactiplantibacillus Plantarum)MM89，于2021年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，单位简称为CGMCC，地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22641。
附图说明
图1为本发明提供的系统发育树图；
图2为本发明提供的植物乳杆菌MM89在37℃下0～48h的生长分析与MM89-EPS生成的动力学曲线；
图3为本发明提供的植物乳杆菌MM89-EPS的FTIR光谱结果图；
图4A为本发明提供的植物乳杆菌MM89中MM89-EPS的1H NMR谱分析图；
图4B为本发明提供的植物乳杆菌MM89中MM89-EPS的13C NMR谱分析图；
图5A为本发明提供的标准单糖和MM89-EPS的气相色谱图；
图5B为本发明提供的GPC分析测量MM89-EPS的Mw分布图；
图6A为本发明提供的MM89-EPS处理后RAW264.7细胞的活力结果图；
图6B为本发明提供的MM89-EPS处理后RAW264.7细胞的吞噬活性结果图；
图6C为本发明提供的MM89-EPS处理后RAW264.7细胞的酸性磷酸酶活性结果图；
图6D为本发明提供的MM89-EPS处理后RAW264.7细胞NO产生结果图；
图7A为本发明提供的RAW264.7细胞产生细胞因子IL-10结果图；
图7B为本发明提供的RAW264.7细胞产生细胞因子IL-6结果图；
图7C为本发明提供的RAW264.7细胞产生细胞因子IL-1β结果图；
图7D为本发明提供的RAW264.7细胞产生细胞因子TNF-α结果图；
图8A为本发明提供的免疫抑制小鼠模型脾指数图；
图8B为本发明提供的免疫抑制小鼠模型脾淋巴细胞增殖率图；
图8C为本发明提供的免疫抑制小鼠模型IgA水平图；
图9A为本发明提供的免疫抑制小鼠模型中血清细胞因子IL-2的产生水平；
图9B为本发明提供的免疫抑制小鼠模型中TNF-α的产生水平。
具体实施方式
本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus Plantarum)MM89，所述植物乳杆菌MM89的保藏编号为CGMCC No.22641。于2021年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，单位简称为CGMCC，地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号。本发明所述植物乳杆菌MM89属于乳杆菌属，形状为道路状，厌氧/微好氧，革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，在含有1％CaCO3的MRS培养基上显示出菌落周围的清晰区域。16S rRNA序列结果表明，所选分离株与植物乳杆菌种具有高序列相似性(<99％)，利用16SrRNA序列构建系统进化树表明，本发明所述菌株属于植物乳杆菌。
本发明还提供了上述技术方案所述植物乳杆菌MM89的培养方法，包括以下步骤，将植物乳杆菌MM89在培养基中进行培养。在本发明中，所述培养基优选为MRS液体培养基。在本发明中，所述培养的温度优选为35～37℃，更优选为37℃。
本发明还提供了一种植物乳杆菌MM89的胞外多糖的生产方法，包括以下步骤：
将植物乳杆菌MM89在含葡萄糖的培养基中进行培养，离心取上清，使用三氯乙酸沉淀蛋白质，静置，离心取上清，加入乙醇，静置，离心取沉淀，得到植物乳杆菌MM89的胞外多糖。
将植物乳杆菌MM89在含葡萄糖的培养基中进行培养。在本发明中，所述培养优选为厌氧条件下进行。在本发明中，所述培养的温度优选为35～37℃，更优选为37℃。在本发明中，所述培养的时间优选为30～48h，更优选为30h。本发明优选添加体积百分含量为1～4％的葡萄糖，更优选加入4％。本发明所述培养基优选为MRS液体培养基。
培养后，本发明离心取上清，使用三氯乙酸沉淀蛋白质，静置，离心取上清，加入乙醇，静置，离心取沉淀，得到植物乳杆菌MM89的胞外多糖。在本发明中，所述离心的条件优选为4℃、8000×g，10min。在本发明中，所述三氯乙酸加入后的终体积百分含量优选为4％。使用三氯乙酸后，优选在4℃静置6～12h，更优选6h。本发明加入乙醇后，优选加入至乙醇的终体积百分含量为90～95％，更优选95％。加入乙醇后，优选在4℃静置12～24h，更优选24h。本发明离心取沉淀后，优选还包括纯化的过程。在本发明中，所述纯化优选包括用DEAE-52柱对MM89-EPS粗品进行纯化，并用蒸馏水以1mL/min的流速进行洗脱。
本发明还提供了所述生产方法生产的植物乳杆菌MM89的胞外多糖。
在本发明中，所述胞外多糖为由葡萄糖和甘露糖组成的杂多糖，平均分子量为1.38×105Da。
本发明还提供了上述技术方案所述植物乳杆菌MM89或上述技术方案所述胞外多糖在制备免疫刺激剂和/或免疫调节剂中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述植物乳杆菌MM89或上述技术方案所述胞外多糖在制备提高巨噬细胞吞噬功能和/或提高酸性磷酸酶活性和/或促进NO产生和/或促进细胞因子产生的药物中的应用。在本发明中，所述细胞因子包括：IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α。
本发明还提供了上述技术方案所述植物乳杆菌MM89或上述技术方案胞外多糖在制备提高淋巴细胞增殖和/或脾指数和/或sIgA含量和/或血清细胞因子水平的药物中的应用。在本发明中，所述血清细胞因子包括：IL-2和TNF-α。
下面结合具体实施例对本发明所述的一株植物乳杆菌(LactiplantibacillusPlantarum)MM89及其多糖和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
细菌菌株的取样、分离和鉴定
在清洗乳头后采集人类母乳样本(母亲年龄在20～30岁范围内，婴儿年龄在1～60天范围内)，丢弃第一滴，并用无菌管中的无菌水清洗周围皮肤。将母乳样品放入PBS中连续稀释，并混合1％碳酸钙(w/v)涂在MRS琼脂板，之后，将板在37℃下保持72h。为了识别潜在的乳酸菌株，挑选出区域显示清晰的菌落并通过革兰氏染色、过氧化氢酶测试和显微镜检查来筛选评估。之后用16S rRNA通用引物(27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO.1)和1492R TACGGCTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO.2))对所选菌株进行PCR扩增，最后，将扩增产物送到上海生工生物技术有限公司进行测序，并通过BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)将获得的结果与NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中的序列进行比较从而来确定它们的分类，构建系统发育树。测序结果如下：
TGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAACTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACTGCAT(SEQ IDNO.3)。
结果显示，本发明分离的菌株均呈道路状、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，厌氧/微好氧；在含有1％CaCO3的MRS培养基上显示出菌落周围的清晰区域。之后16S rRNA序列结果表明，所选分离株与植物乳杆菌种具有高序列相似性(<99.93％)，利用16SrRNA序列构建了系统进化树，如图1所示，所选菌株属于植物乳杆菌，命名为MM89。
实施例2
细菌生长分析及胞外多糖定量
将植物乳杆菌MM89放入500ml MRS液体培养基中，并加入4％葡萄糖来促进MM89-EPS的产生，之后放在37℃厌氧条件下进行48h培养。在0～48h的不同时间间隔收集1ml细菌培养物，并通过pH计测定pH值。通过菌落计数法连续两次稀释测定微生物活菌数，最后测量MM89-EPS的产率。
植物乳杆菌MM89生长及MM89-EPS产量分析结果如下。植物乳杆菌MM89的生长动力学曲线、MM89-EPS产量以及不同培养时间的培养基pH值均如图2所示。结果表明，活菌数随培养时间的延长而增加，36h时达到最大值7.3log10cfu/ml，而培养基的pH值随培养时间的延长而不断下降，最终pH达到3.0。MM89-EPS在培养32h时达到最大浓度590mg/l，之后随着培养时间的延长，MM89-EPS产量下降。因此，植物乳杆菌MM89的生长与培养基pH值和不同时间的MM89-EPS产量密切相关。本发明植物乳杆菌MM89在不同的培养时间内产生不同数量的EPSS。此外，本发明还发现，人乳来源的植物乳杆菌MM89与其他来源的植物乳杆菌菌株相比，具有较高的EPSS产量，约为已报到植物乳杆菌菌株的2倍。结果表明，培养时间对植物乳杆菌MM89生长和MM89-EPS产量有影响。
MM89-EPS的提取
在37℃厌氧条件下，将植物乳杆菌MM89放入含4％葡萄糖的MRS培养基中培养24h。在此基础上，在4℃、8000×g转的条件下离心10min分离细胞得到无培养细胞的上清液(CFCS)，然后将4％浓度的三氯乙酸加入到上清液中来沉淀蛋白质，并在4℃下静置6h，然后再次离心。之后在上清液中加入预冷过的乙醇并在4℃下再放置24h。最后通过离心提取粗MM89-EPS沉淀物，将其溶解于水中进行透析48h，并冷冻干燥待进一步研究。此外，冻干前，用DEAE-52柱对MM89-EPS粗品进行纯化，并用蒸馏水以1mL/min的流速进行洗脱。
结果表明，对MM89-EPS进行提取、纯化和冻干。苯酚硫酸法测定纯化的MM89-EPS中总糖类含量为95.63±1.5％，未检测到糖醛酸和硫酸的含量。此外，纯化的MM89-EPS不含核酸和蛋白质，因为紫外光谱在260nm和280nm处没有观察到吸收。
MM89-EPS的表征
FTIR分析
为了确定MM89-EPS官能团，在400～4000cm-1范围内进行FTIR分析，并在4cm-1分辨率下进行16次扫描。之后将0.5mg的MM89-EPS与100mg的KBr混合并压成颗粒状，并通过BrukerOPUS软件包进行结果分析。
FTIR分析用于表征MM89-EPS中的各种官能团(植物乳杆菌MM89-EPS的FTIR光谱结果如图3所示)。MM89-EPS的FTIR谱在3398cm-1处出现一个宽峰，这是由于多个O-H基团的伸缩振动所致。此外，该峰还表明分离得到的化合物(MM89-EPS)属于多糖基化合物。2931cm-1附近的另一个峰值是由于C-H伸缩振动。1656cm-1和1458cm-1附近的峰值是由MM90-EPS中C＝O基团的伸缩振动引起的。1126cm-1和1029cm-1附近的峰是由于C-O-C和C-O的伸缩振动所致，这最终是碳水化合物分子的特征。此外，930cm-1至813cm-1附近的吸收峰显示了碳水化合物特有的各种谱带的位置/强度。这些峰还表明存在具有β-型糖苷键的吡喃糖形式的糖。
核磁共振(NMR)分析
为了测定C13 NMR光谱，将冻干的15mg MM89-EPS溶解于1ml的D2O中，并使用BrukerAdvance 600分光仪在600MHz下进行核磁共振分析。
根据植物乳杆菌MM89中MM89-EPS的1HNMR谱(图4A)和13C NMR谱(图4B)分析图结果可知。在1HNMR谱中，在δ4.5-5.5范围内观察到异常质子信号，表明MM89-EPS主要由具有α和β吡喃糖构型的残糖组成(图4A)。此外，从δ4.0-3.0的信号可以看出，MM90-EPS具有非常复杂的结构。对MM89-EPS进行了13C NMR谱进一步表征(图4B)。MM89-EPS的13C NMR谱主要集中在60～96ppm。5个异常峰分别出现在96.5ppm、96.1ppm、94.0ppm、93.6ppm和92.2ppm。此外，在80～88ppm范围内没有信号，表明MM89-EPS中的所有糖残基都是吡喃酸酐键。此外，在66.8ppm处的峰值表明替代糖残留物的C-6。峰高在75ppm左右，表明MM89-EPS中存在支链残基。在60～75ppm附近的多个峰表明MM89-EPS中的糖残留物是C2-C6。
单糖分析
在100℃的条件下用三氟乙酸水解1mg MM89-EPS样品6h，之后用NaBH4还原并用乙酸酐吡啶1：1乙酰化。再使用氦气作为载体，通过配备有DB-225色谱柱的气相色谱-质谱联用仪以40℃/分钟的速度从50℃到220℃对所得溶液进行检测，通过保留时间与标准单糖的比较，确定单个单糖组分。
用气相色谱法测定了MM89-EPS的单糖组成。图5A为标准单糖和MM89-EPS的气相色谱图。图5A显示了检测条件下标准糖单元和MM89-EPS的气相色谱图。结果表明，MM89-EPS是由葡萄糖和甘露糖组成的杂多糖，主链以葡萄糖为主。
分子重量(Mw)的测定
分别采用装有SB-806HQ和SB-804HQ柱的凝胶渗透色谱法(GPC)测定MM89-EPS的分子重量，在25℃下通过折射率检测器和激光散射检测MM89-EPS。之后将MM89-EPS溶液注入系统，并用超纯水以1ml/min的流速进行洗脱。
分子量是影响胞外多糖生物活性的重要参数。用凝胶渗透色谱(GPC)测定了MM89-EPS的分子量，图5B为GPC分析测量MM89-EPS的Mw分布图，结果表明MM89-EPS有一个单峰，表明MM89-EPS是均一的。M89-EPS的分子量为1.38×105Da，与以前报道的植物乳杆菌EPS分子量在105～106Da一致。胞外多糖的免疫刺激活性受其分子量的影响。低分子量或负电荷的EPS可能是较强的免疫刺激因子，而分子量较高的中性EPS可能是较弱的免疫刺激因子，甚至是免疫抑制因子，本发明的EPS有中等Mw重量，这肯定是作为一个强大的免疫调节剂的原因之一。
实施例3
体外免疫调节活性
细胞培养
在37℃的条件下，将RAW264.7细胞放入富含FBS(10％)和链霉素/青霉素(1％)的DMEM培养基中培养并放置在CO2浓度为5％的潮湿环境下。将不同浓度的MM89-EPS(6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml和100μg/ml)分别溶解在DMEM培养基中并在进一步实验前两次灭菌过滤。
RAW264.7细胞活性测定
RAW264.7细胞悬液(1×106)在96孔细胞培养板中培养，并在37℃下培养过夜。之后用不同浓度的MM89-EPS(6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml)分别处理RAW264.7细胞24h，再用浓度为1μg/ml的LPS(Santa cruz sc-3535A)和DMEM培养基分别处理RAW264.7细胞作为阳性对照和阴性对照(公式(1)中的control指的是阴性对照，同理，本发明其它公式中的control均指阴性对照)。处理后，用PBS洗涤并加入100μlMTT溶液在37℃下放置4h，之后在此基础上加入DMSO溶液150μl，通过酶标仪记录OD值，并根据方程(1)测定细胞活力：
细胞活力(Cellviability，％)＝Asample/Acontrol×100 方程(1)；
其中Asample指的是加入MM89-EPS的细胞反应后OD值，Acontrol指的是阴性对照。
MM89-EPS对RAW264.7细胞活性的影响结果如下。众所周知，来自不同来源的多糖在许多生物活性中起着不同的核心作用，如抗癌活性和免疫调节活性。巨噬细胞在启动特异性防御和非特异性防御机制中起着核心作用。巨噬细胞的激活可以被认为是刺激宿主免疫系统的一个非常重要的步骤。RAW264.7细胞活力可作为细胞毒性和免疫活性激活的重要指标。因此，采用MTT法检测MM89-EPS(6.25～100μg/ml)和LPS(1.0μg/ml)作用24小时后对RAW264.7细胞的细胞毒作用，以评价MM89-EPS(6.25～100μg/ml)和LPS(1.0μg/ml)作用于RAW264.7细胞24h后细胞活力的变化。胞外多糖(6.25μg/ml和100μg/ml)和脂多糖(1.0μg/ml)处理24h后，细胞活力未见下降(图6A，MM89-EPS处理后RAW264.7细胞的活力结果图)。另一方面，MM89-EPS在12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml浓度下均能显著提高RAW264.7细胞的活力(p<0.05)，表明MM89-EPS具有促进RAW264.7细胞增殖的能力。此外，随着MM89-EPS浓度的增加，细胞存活率先升高后下降。总之，实验结果表明，MM89-EPS对RAW264.7细胞没有毒性作用，事实上，MM89-EPS具有促进RAW264.7细胞增殖的作用。MM89-EPS无细胞毒性浓度(25μg/ml和50μg/ml)用于进一步的实验。
细胞吞噬活性检测
用RAW264.7细胞研究MM89-EPS吞噬活性。将RAW264.7细胞(1×106)放入96孔细胞培养板中，在37℃下放置24h，之后将不同浓度的MM89-EPS(25μg/ml和50μg/ml)添加到细胞中，将LPS(1μg/ml)处理的RAW264.7细胞作为阳性对照，未处理的RAW264.7细胞作为阴性对照。之后分离培养基并用PBS洗涤，在每个孔中加入100μl(0.075％；m/v)的中性红，在37℃放置1h，再在每个孔中加入100μl细胞裂解液，在37℃下培养3h。最后，通过酶标仪测量540nm处的OD值，并根据方程(2)测定吞噬活性：
吞噬活性(Phagocytosis activity)＝ODsample/ODcontrol 方程(2)
其中，ODsample指的是加入MM89-EPS的细胞反应后的OD值，ODcontrol指的是阴性对照。
吞噬作用可能是巨噬细胞和中性粒细胞从宿主体内清除游离微生物和任何外来颗粒的主要机制。增强吞噬功能是活化巨噬细胞的显著特征之一。本发明用中性红摄取率计算MM89-EPS的吞噬活性，结果显示MM89-EPS处理的RAW264.7细胞的吞噬活性明显高于对照组(P<0.05)(图6B，MM89-EPS处理后RAW264.7细胞的吞噬活性)。MM89-EPS最低检测浓度(25μg/ml)时RAW264.7细胞吞噬指数为0.9，最高检测浓度(50μg/ml)时RAW264.7细胞吞噬指数为1.3，与阴性对照组(0.6)和LPS(1.0)处理的RAW264.7细胞相比，差异有统计学意义(P<0.05)。综上所述，MM89-EPS具有显著的免疫刺激活性，与阳性对照(LPS)处理的RAW264.7细胞相比，其免疫刺激活性相当或更高14倍。
酸性磷酸酶测定
检测MM89-EPS对RAW264.7细胞的酸性磷酸酶活性，RAW264.7细胞(1×106)的制备如上文所述。处理后去除培养基，加入20μl TritonX-100(1％，v/v)和160μl对硝基苯磷酸盐溶液(1mg/ml)，将反应混合物在37℃下培养2h，然后加入50μl的氢氧化钠(3.0m)终止反应，通过酶标仪测定405nm处反应混合物的OD值，酸性磷酸酶指数按方程(3)计算：
酸性磷酸酶指数(Acidphosphatase index)＝Abssample/Abscontrol 方程(3)
其中，Abssample指的是加入MM89-EPS的细胞反应后OD值，Abscontrol指的是阴性对照。
酸性磷酸酶是激活的RAW264.7细胞吞噬机制中起核心作用的一种酶。结果表明，MM89-EPS处理的RAW264.7细胞的酸性磷酸酶活性随MM89-EPS浓度的增加而升高。经50μg/ml MM89-EPS处理后，酸性磷酸酶活性达到最大值1.8，与对照组相比有显著性差异(p<0.05)(图6C，MM89-EPS处理后RAW264.7细胞的酸性磷酸酶活性)。总之，结果表明MM89-EPS具有优良的酸性磷酸酶活性。
NO产生测定
将RAW264.7细胞(1×106)接种到96孔细胞培养板中，在37℃下培养24h，然后用不同浓度(25μg/ml和50μg/ml)的MM89-EPS进行处理，之后分别以LPS(1μg/ml)处理和DMEM处理的RAW264.7细胞作为阳性对照和阴性对照。然后，根据使用说明采用Griess试剂(北京，中国)测定NO，最终通过酶标仪在540nm处测定反应混合物的OD值。
在激活的巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶的水平增加，进而通过使用分子氧和L-精氨酸作为底物来催化一氧化氮(NO)的产生。NO是一种重要的分子，在攻击病原微生物和肿瘤细胞方面具有细胞毒性作用。因此，NO的产生是判断MM89-EPS能否对活化的RAW264.7细胞发挥免疫调节作用的核心因素。MM89-EPS以剂量依赖方式刺激RAW264.7细胞产生NO(图6D，MM89-EPS处理后RAW264.7细胞NO产生)。MM89-EPS浓度为50μg/ml时，NO产量最高(37μM/L)，与对照组(16μM/L)相比，差异有统计学意义(P<0.05)。NO生成增加提示MM89-EPS激活了RAW264.7细胞的免疫调节活性。很多从植物、真菌和细菌中提取的多糖不促进NO的产生，或部分多糖有毒；本申请MM89-EPS能够刺激RAW264.7细胞产生NO，且对动物和细胞模型都是无毒的，本发明MM89-EPS具有更好的应用前景。
细胞因子分析
如上文所述制备RAW264.7细胞(1×106)，在此基础上按照使用说明采用商用ELISA试剂盒，测定细胞游离培养上清液中各种细胞因子(IL-10、IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α))的浓度。
活化的巨噬细胞分泌多种细胞因子，参与清除攻击病原体，阻断癌细胞。IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α是由刺激的巨噬细胞产生的，巨噬细胞在宿主免疫反应中起着非常重要的作用。用MM89-EPS处理RAW264.7细胞24h，ELISA法检测IL-10、IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α的表达水平。与对照组相比，经MM89-EPS处理的RAW264.7细胞中各种细胞因子(IL-10、IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α)的浓度呈剂量依赖性增加(RAW264.7细胞产生细胞因子IL-10(图7A)、IL-6(图7B)、IL-1β(图7C)和TNF-α(图7D))。在最高浓度(50μg/ml)时，IL-10、IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α的相对表达量分别为72pg/ml、30pg/ml、33pg/ml和133pg/ml，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。综上所述，该多糖可刺激活化的RAW264.7细胞产生IL-10、IL-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α，从而增强其免疫活性。此外，MM89-EPS可能通过刺激IL-10的产生而发挥抗炎作用，有待进一步研究。
实施例4
体内免疫调节活性
所有的动物模型实验都按照中国深圳大学健康科学中心研究伦理研究委员会批准的方案进行，所有动物在控制的环境中并以标准的饮食适应3天。实验选用平均体重22g的48只小鼠，随机分为6组；正常对照小鼠组，阳性对照小鼠组，模型对照小鼠组，低剂量(L-MM89-EPS)给予体重25毫克/公斤的MM89-EPS，中剂量(M-MM89-EPS)给予体重50毫克/公斤的MM89-EPS，高剂量(H-MM89-EPS)给予体重100毫克/公斤的MM89-EPS。实验小鼠组(免疫抑制小鼠)在腹腔接种剂量为80mg/kg的溶解于硫酸钠缓冲液的环磷酰胺，另一方面正常对照小鼠组接种所含等效量的柠檬酸钠缓冲液，所有小鼠在正常条件下维持3天，之后口服MM89-EPS 7天。在正常对照小鼠组(NC)中，正常小鼠注射生理盐水；模型对照小鼠组(MC)，免疫抑制小鼠用生理盐水引导；阳性对照小鼠组(PC)，免疫抑制小鼠注射剂量为40mg/kg(体重)的盐酸左旋咪唑；低剂量治疗组(L-MM89-EPS)，免疫抑制小鼠服用剂量为25mg/kg(体重)的MM89-EPS；中剂量治疗组(M-MM89-EPS)，免疫抑制小鼠服用剂量为50mg/kg(体重)的MM89-EPS；高剂量治疗组(H-MM89-EPS)，免疫抑制小鼠用剂量为100mg/kg(体重)的MM89-EPS。此外，每天测量体重、食物摄入量和饮水量。
脾脏指数测定
在第七天给药24h之后，通过颈椎脱位的方法处理小鼠并立即切除小鼠脾脏称重，最终脾脏与体重比率表示为脾脏指数(mg/g)。
MM89-EPS对脾脏指数的影响结果如下。
本发明研究了MM89-EPS对小鼠脾脏指数的影响，结果表明，模型对照小鼠组(MC)的脾脏指数较正常对照小鼠组(NC)显著降低(P<0.05)，表明环磷酰胺能使小鼠免疫系统功能减弱，从而证实了免疫抑制小鼠模型的建立成功(图8A)。L-MM89-EPS组、M-MM89-EPS组和H-MM89-EPS组小鼠的脾脏指数均显著高于模型对照小鼠组(MC)。
脾淋巴细胞的增殖
将小鼠脾淋巴细胞分离并以3×105(细胞/ml)的细胞量接种到96孔培养板中，再加入200μl浓度为2μg/ml的伴刀豆球蛋白，放置在37℃下培养72h。实验同时采用阴性对照：不加入伴刀豆球蛋白，单独在37℃下培养小鼠脾淋巴细胞72h。之后在培养板加入20μl MTT溶液继续培养4h，再加入200μl的DMS溶液溶解晶体。最终通过酶标仪测试在570nm处的OD值，并根据方程(4)测定淋巴细胞增殖速率：
淋巴细胞增殖速率(Proliferationrate，％)＝Asample-Acontrol/Asample×100 方程(4)
其中，Asample指的是加入伴刀豆球蛋白细胞反应后OD值，Acontrol指的是阴性对照。
MM89-EPS对脾淋巴细胞增殖的影响结果如下：
乳酸菌及其代谢产物，特别是胞外多糖，通过促进淋巴细胞增殖、增强巨噬细胞吞噬活性、刺激细胞因子分泌水平等途径，具有刺激免疫系统对抗病原体的能力。在本发明中，与正常对照小鼠组(NC)相比，模型对照小鼠组脾淋巴细胞增殖明显降低。结果还表明，MM89-EPS处理的小鼠的淋巴细胞增殖随着MM89-EPS浓度的增加而增加(图8B)，说明多糖无细胞毒性，这有利于其在功能性食品中的应用。此外，经L-MM89-EPS、MM89-EPS和H-MM89-EPS处理的免疫抑制小鼠与MC组相比，淋巴细胞增殖明显增强(P<0.05)。结果表明，MM89EPS能够通过促进淋巴细胞增殖来增强宿主免疫系统对入侵病原体的抵抗力。
免疫球蛋白A的测定
无菌收集所有组小鼠肠道部分(盲肠)，并在含1％BSA的1ml PBS中进行均质处理。之后离心反应混合物并收集上清液，通过使用说明采用商用的ELISA试剂盒确定肠道免疫球蛋白A的浓度。
MM89-EPS对SIgA的影响结果如下：
L-MM89-EPS和M-MM89-EPS治疗组小鼠血清sIgA水平与模型对照小鼠组比较无显著性差异(图8C)。H-MM89-EPS治疗组小鼠血清sIgA水平明显高于模型对照小鼠组。可见，大剂量(100mg/kg/体重)可提高体内sIgA含量。体内sIgA水平的升高导致粘膜免疫力的增强，从而最终减少病原微生物的感染。
血清细胞因子水平的测定
将所有小鼠组的血液收集到聚苯乙烯管中，然后在4℃条件下以4000×g的速度离心15min分离血清。离心结束后，通过使用说明采用商用的ELISA试剂盒计算IL-2和TNF-α水平。
血清细胞因子水平结果如下：
本发明对免疫抑制小鼠经MM89-EPS治疗后产生不同细胞因子的情况进行了研究，结果(图9A和图9B)表明，MM89-EPS 100mg/kg体重组小鼠血清IL-2和TNF-α水平显著升高(P<0.05)。MM89-EPS 100mg/kg组与MC组比较差异有显著性(P<0.05)，L-MM89-EPS与MC组比较差异无显著性(P>0.05)。与MC组比较，L-MM89-EPS组IL-2水平无明显变化。
结论
本发明利用FTIR、NMR、GC-MS和GPC对从植物乳杆菌MM89中分离得到的MM89-EPS进行了结构表征。采用RAW264.7细胞模型和环磷酰胺诱导的小鼠免疫抑制模型评价MM89-EPS的免疫刺激活性。MM89-EPS是一种以葡萄糖和甘露糖为重复糖的杂聚物，平均分子量为1.38×105Da。MM89-EPS通过提高吞噬功能、酸性磷酸酶活性、促进NO和细胞因子的产生，在细胞模型上显示出良好的免疫调节活性。体内实验结果表明，MM89-EPS能通过提高淋巴细胞增殖、脾指数、sIgA含量和血清细胞因子水平，对免疫抑制小鼠发挥免疫调节作用。综上所述，本发明MM89-EPS可以作为功能性食品中有用的食品佐剂或临床免疫调节剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一株植物乳杆菌MM89及其多糖和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1430
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggttcctaa aaggttaccc caccgacttt gggtgttaca aactctcatg gtgtgacggg 60
cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg attactagcg 120
attccgactt catgtaggcg agttgcagcc tacaatccga actgagaatg gctttaagag 180
attagcttac tctcgcgagt tcgcaactcg ttgtaccatc cattgtagca cgtgtgtagc 240
ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg 300
gcagtctcac cagagtgccc aacttaatgc tggcaactga taataagggt tgcgctcgtt 360
gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtatc 420
catgtccccg aagggaacgt ctaatctctt agatttgcat agtatgtcaa gacctggtaa 480
ggttcttcgc gtagcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540
attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc ggaatgctta atgcgttagc 600
tgcagcactg aagggcggaa accctccaac acttagcatt catcgtttac ggtatggact 660
accagggtat ctaatcctgt ttgctaccca tactttcgag cctcagcgtc agttacagac 720
cagacagccg ccttcgccac tggtgttctt ccatatatct acgcatttca ccgctacaca 780
tggagttcca ctgtcctctt ctgcactcaa gtttcccagt ttccgatgca cttcttcggt 840
tgagccgaag gctttcacat cagacttaaa aaaccgcctg cgctcgcttt acgcccaata 900
aatccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg 960
gctttctggt taaataccgt caatacctga acagttactc tcagatatgt tcttctttaa 1020
caacagagtt ttacgagccg aaacccttct tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt 1080
tcgtccattg tggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtttgggc cgtgtctcag 1140
tcccaatgtg gccgattacc ctctcaggtc ggctacgtat cattgccatg gtgagccgtt 1200
accccaccat ctagctaata cgccgcggga ccatccaaaa gtgatagccg aagccatctt 1260
tcaaactcgg accatgcggt ccaagttgtt atgcggtatt agcatctgtt tccaggtgtt 1320
atcccccgct tctgggcagg tttcccacgt gttactcacc agttcgccac tcactcaaat 1380
gtaaatcatg atgcaagcac caatcaatac cagagttcgt tcgactgcat 1430

Claims (10)

1.一株植物乳杆菌（Lactiplantibacillus Plantarum）MM89，其特征在于，所述植物乳杆菌MM89的保藏编号为CGMCC No.22641。
2.权利要求1所述植物乳杆菌MM89的培养方法，包括以下步骤，将植物乳杆菌MM89在培养基中进行培养。
3.一种植物乳杆菌MM89的胞外多糖的生产方法，包括以下步骤：
将权利要求1所述植物乳杆菌MM89在含葡萄糖的培养基中进行培养，离心取上清，使用三氯乙酸沉淀蛋白质，静置，离心取上清，加入乙醇，静置，离心取沉淀，得到植物乳杆菌MM89的胞外多糖。
4.权利要求3所述生产方法生产的植物乳杆菌MM89的胞外多糖。
5.权利要求1所述植物乳杆菌MM89或权利要求4所述胞外多糖在制备免疫刺激剂中的应用。
6.权利要求1所述植物乳杆菌MM89或权利要求4所述胞外多糖在制备免疫调节剂中的应用。
7.权利要求1所述植物乳杆菌MM89或权利要求4所述胞外多糖在制备以下至少一种药物中的应用：
（1）提高巨噬细胞吞噬功能的药物；
（2）提高巨噬细胞酸性磷酸酶活性的药物；
（3）促进巨噬细胞产生NO的药物。
8.权利要求1所述植物乳杆菌MM89或权利要求4所述胞外多糖在制备促进细胞因子产生的药物中的应用，所述细胞因子包括：IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α。
9.权利要求1所述植物乳杆菌MM89或权利要求4所述胞外多糖在制备以下至少一种药物中的应用：
（A）提高淋巴细胞增殖的药物；
（B）提高脾指数的药物；
（C）提高血清中sIgA含量的药物。
10.权利要求1所述植物乳杆菌MM89或权利要求4所述胞外多糖在制备提高血清细胞因子水平的药物中的应用，所述血清细胞因子包括：IL-2和TNF-α。
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