CN106967645B - 一株高产单宁酶的嗜酸乳杆菌及其在防治仔猪腹泻中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产单宁酶的嗜酸乳杆菌，其为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)BLCC2‑0111，已于2017年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2017098。本发明还公开了由该嗜酸乳杆菌在中药组方培养基中发酵制备而成的中药益生菌制剂；所述中药组方培养基由蒲公英、乌梅和五味子组成，所述蒲公英、乌梅和五味子的质量比为(5‑7)：(1‑2)：1。本发明的嗜酸乳杆菌产单宁酶的水平可达70.1U/mL以上，由该菌株发酵制备的中药益生菌制剂对于仔猪腹泻具有很好的防治效果。

Description

一株高产单宁酶的嗜酸乳杆菌及其在防治仔猪腹泻中的应用

技术领域

本发明涉及一株高产单宁酶的嗜酸乳杆菌及其在防治仔猪腹泻中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

单宁酶全称单宁酰基水解酶，属于诱导型胞外酶，可高效、专一、定向裂解单宁中的酯键、缩酚键和糖苷键。单宁酶可以作为脱除单宁成分的添加剂，用于茶、葡萄酒、啤酒及果汁饮料的生产。另外，单宁酶可将五倍子单宁降解为没食子酸(GA)。通过单宁酶水解单宁生产没食子酸，与化学方法相比具有产率高、反应条件温和、生成的污染物少等优点，符合绿色化工生产的要求。采用酶法生产没食子酸的关键在于获得具有高产酶能力的菌株，目前关于产单宁酶菌株分离、筛选及培养条件优化已有不少报道，包括从植物的茎叶组织、土壤等来源分离产单宁酶真菌，以及通过固体或液体发酵的方法对菌株进行发酵培养的研究。但要获得酶活力高、稳定性好、适于工业化生产的菌株，仍需不断进行高酶活菌株的筛选和培养条件的优化工作。现有报道的能够产单宁酶的菌株主要有曲霉属、青霉属、根霉属和毛酶属菌等，但还未见有嗜酸乳杆菌产单宁酶的报道。

由产肠毒素大肠杆菌(ETEC)引起的仔猪大肠杆菌性腹泻是一种发病率和死亡率极高的传染病，给养猪行业带来巨大的经济损失。在众多血清型中，K88流行最为广泛。该病的治疗主要依赖抗生素，但长期滥用抗生素造成病原菌耐药性的增强。而普通疫苗及基因工程苗因菌型差异或保护面窄的原因而不能起到有效的预防作用，免疫效果往往不够理想。

中草药、微生态制剂无副作用、无残留，在目前针对肠毒素大肠杆菌引起的仔猪腹泻的研究中越来越引起人们的重视。中草药治疗疾病在我国已有几千年的历史，中草药含有的各种有效成分，对病原体有直接抑制或杀灭作用，目前临床上已经有中药用于治疗仔猪的大肠杆菌性腹泻的报道。但中草药因为自身的成分复杂，有效成分或部位不完全清晰，目前的使用方法大多还局限于传统的炮制工艺，对药物的有效成分的利用率较低。因此，寻求一种安全、高效、绿色且不产生抗性的新的治疗方法尤为重要。

随着现代技术的发展，发酵法在中草药的研究上是越来越广泛，大量的研究证明，微生物定向发酵中药，具有提高中药药效，产生新成分等优势，已经成为中药发酵研究的新方向。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株高产单宁酶的嗜酸乳杆菌及其在防治仔猪腹泻中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一株高产单宁酶的嗜酸乳杆菌，其为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)BLCC2-0111，已于2017年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2017098。

该菌株是从泰安市蛋鸡场蛋鸡肠道内容物中分离得到的，菌株的生理生化特征为：菌落在MRS培养基上呈圆形，边缘光滑，表面凸起，乳白色或微带黄色，直径约0.5mm、呈杆状，革兰氏阳性，不产芽孢，无鞭毛，不运动，能发酵果糖、蔗糖及葡萄糖，不液化明胶，接触酶阴性，最适pH值为5.5-6.4，最适生长温度为35℃～38℃。

本发明的第二方面，提供一种菌剂，其活性成分为上述嗜酸乳杆菌的发酵产物。

本发明还提供上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：发酵上述的嗜酸乳杆菌，得到发酵产物。

上述制备方法中，发酵采用的发酵培养基的组成为：2.0％葡萄糖、0.2％柠檬酸铵、0.5％乙酸钠、0.5％磷酸氢二钾、0.02％硫酸锰、0.05％硫酸锰、1.0％蛋白胨、0.5％酵母膏、0.1％土温-80、1.5％琼脂粉，均为质量百分数，调pH至6.0。

上述制备方法中，发酵的条件为：35-40℃，恒温培养20-28h；优选的，发酵的条件为37℃，恒温培养24h。

本发明的第三方面，提供上述嗜酸乳杆菌和/或菌剂在制备单宁酶中的应用。

进一步的，本发明还提供上述嗜酸乳杆菌和/或菌剂在制备防治仔猪腹泻的中药益生菌制剂中的应用。

本发明的第四方面，提供一种防治仔猪腹泻的中药益生菌制剂。

本发明的防治仔猪腹泻的中药益生菌制剂，由上述的嗜酸乳杆菌在中药组方培养基中发酵而成；

所述中药组方培养基由蒲公英、乌梅和五味子组成，所述蒲公英、乌梅和五味子的质量比为(5-7)：(1-2)：1。

优选的，所述蒲公英、乌梅和五味子的质量比为6：1：1。

本发明的第五方面，提供上述中药益生菌制剂的制备方法，步骤如下：

(1)将蒲公英、乌梅和五味子粉碎，用MRS液体培养基溶解，灭菌，作为中药组方培养基；

(2)无菌条件下将嗜酸乳杆菌的种子液接种至步骤(1)的中药组方培养基中，发酵培养，即制备得到中药益生菌制剂。

步骤(2)中，所述嗜酸乳杆菌的种子液的接种量为3-5％(体积比)；优选为4％。

步骤(2)中，发酵培养的条件为：pH5-6(优选为5.5)，37℃培养24h。

本发明的有益效果：

本发明首次筛选分离得到一株高产单宁酶的嗜酸乳杆菌，该菌株产单宁酶的水平可达70.1U/mL以上。

而且，本发明的嗜酸乳杆菌属于乳酸菌，而乳酸菌作为益生素中应用最广的菌种，能有效调控宿主胃肠道微生物区系平衡，预防及早期治疗一些由特定病原菌感染引起的疾病，因此，相比于现有技术中已报道的能够产单宁酶的其他菌株，本发明的高产单宁酶的嗜酸乳杆菌可以更加安全的应用于防治腹泻的中药益生菌制剂的制备。

附图说明

图1：不同发酵时间胞外单宁酶活力和活菌数的变化；

图2：有机酸的混标色谱图；

图3：各组有机酸色谱叠加图；

图4：小鼠攻毒后精神状态及临床表现；

图5：不同时间点各组小鼠血清IFN-γ水平；

图6：不同时间点各组小鼠血清IL-4水平；

图7：不同时间点各组小鼠血清IFN-γ/IL-4变化。

具体实施方式

正如背景技术所介绍的，为获得酶活力高、稳定性好、适于工业化生产的产单宁酶的菌株，需要不断进行高酶活菌株的筛选和培养条件的优化工作，基于此，本申请提出了一株高产单宁酶的嗜酸乳杆菌及其在防治仔猪腹泻中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。

实施例1：菌株的筛选与鉴定

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品：泰安市蛋鸡场蛋鸡肠道内容物。

1.1.2主要试剂：单宁、没食子酸购于sigma；绕丹宁、没食子酸丙酯(PG)，购于源叶生物；KOH溶液，购于天津市致远化学试剂有限公司；NaCl、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇，购于天津市凯通化学试剂有限公司。

1.1.3培养基：MRS培养基；单宁酶液体培养基：MRS液体培养基中添加1％的单宁酸，pH5.0，121℃灭菌20min。

1.2方法

1.2.1菌株的筛选

(1)菌株的分离纯化

将采集自泰安市蛋鸡场蛋鸡肠道内容物的样品稀释至适当浓度后，涂布于MRS固体培养平板上，37℃恒温培养24h后，观察菌落的生长情况，挑取单菌落，将分离到的菌进行反复划线分离纯化，纯化的菌株于MRS固体斜面培养基保存。

(2)产单宁酶菌株的筛选

将分离到的菌株接种在含有1％的单宁酸的MRS液体培养基内，置于37℃恒温箱培养24h，得到含单宁酶液体培养基质，离心取上清，即为粗酶液，进行酶活力测定。酶活力的测定采用保玉心的绕丹宁法(参考文献：一种胞外单宁酶的活力检测方法，精细化工，2008)。粗酶液和底物没食子酸丙酯反应得到的产物与绕丹宁结合，在KOH的存在下形成有色团物质，利用紫外可见光分光光度计测得吸光值来测定各株菌产物的酶活，得到产单宁酶水平较高的菌株，作为目标菌株。

1.2.2菌株生理生化特性及分子生物学鉴定

(1)生理生化特性

挑选单个菌落进行革兰氏染色镜检观察。对革兰氏阳性菌落进行生化鉴定，包括触酶试验、葡萄糖试验、果糖试验、蔗糖试验、V.P试验、明胶水解试验，具体方法参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行。

(2)16S rDNA的扩增与序列分析

目的菌株接种于新鲜的MRS液体培养基中培养24h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为细菌16S rDNA通用引物(F：5′-CGGCAACGAGCGCAACCC-3′；R：5′-CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC-3′)，PCR反应体系(50μL)为:Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等，购于天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。

2结果

2.1产单宁酶菌株的分离与筛选

泰安市蛋鸡场蛋鸡肠道内容物共分离得到21种菌株，通过产单宁酶菌株液体发酵筛选，得到5株具有产单宁酶活力的菌株，其中1株菌株的产单宁酶酶活力相对较高，编号为0111，结果见表1。

表1测定菌株液体发酵产单宁酶活力结果

2.2菌株鉴定

2.2.1菌落形态及染色结果

挑取菌株0111纯培养物接种于MRS固体培养基，37℃培养24h后，观察其菌落形态呈圆形，边缘光滑，表面凸起，乳白色或微带黄色，菌体为革兰氏阳性，直径约0.5mm、呈杆状，不产芽孢，无鞭毛，不运动。

2.2.2菌株生化鉴定结果

对菌株0111进行一系列的生化反应，结果得出该菌能发酵果糖、蔗糖及葡萄糖，不液化明胶，接触酶阴性，与嗜酸乳杆菌菌种特性描述一致，结果见表2。

表2菌株0111的生化鉴定结果

注：“+”表示阳性或能利用；“－”表示阴性或不能利用。

2.2.3菌株0111的16S rDNA鉴定结果

结合革兰氏染色结果及生化鉴定结果，对菌株0111进一步进行分子生物学鉴定。以提取的总DNA产物作为模板，用PCR方法扩增，经1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察，发现被检菌株特异性条带大小约为1500bp，与预期的扩增片段大小相符，说明PCR反应成功扩增出了目的片段。

对0111菌株16S rDNA序列进行测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示。

将测序结果与GenBank中细菌16S rDNA序列进行BLAST比对，发现0111菌株与NR_113638.1、NR_117062.1、NR_117812.1和NR_043182.1同源性高达99％，菌株0111被鉴定为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。

3结论

从蛋鸡肠道内容物中分离筛选出了一株产单宁酶性能较好的菌株0111。该菌株发酵液的单宁酶酶活达到了70.1U/mL。

4.菌株0111的保藏

上述获得的嗜酸乳杆菌0111，已于2017年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为：武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M 2017098。

实施例2：拮抗产肠毒素大肠杆菌K88的中药及益生菌的体外筛选

1材料与方法

1.1材料和试剂

1.1.1试验器材

JJ300型电子天平、SW-CJ-2F型超净工作台、THZ-C恒温振荡器、DHP-9082电热恒温培养箱、MEK--63 18K型光电全自动血液分析仪、TGL-16B台式离心机。

1.1.2中草药

白头翁，黄柏，乌梅，黄连，白术，五倍子，金银花，蒲公英，板蓝根，秦皮，黄芪，连翘，茯苓，党参，大青叶，柴胡，石榴皮，马齿苋，穿心莲。以上19种中药均购于山东泰安市永春堂药业有限公司永欣药店。

1.1.3菌株

致病菌株：产肠毒素大肠杆菌K88菌株，购自中国兽药监察所。

益生菌株：来源于山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院的优质乳酸菌菌种，编号分别为0001植物乳杆菌、0003干酪乳杆菌、0012屎肠球菌、0015植物乳杆菌、0020植物乳杆菌、0031鼠李糖乳杆菌、0038鼠李糖乳杆菌及本发明实施例1筛选分离得到的嗜酸乳杆菌0111。

1.1.4培养基

大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)，胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)，MRS固体培养基，均为青岛海博生物技术有限公司产品，琼脂粉为北京索莱宝科技有限公司产品。MRS液体培养基：2.0％葡萄糖、0.2％柠檬酸铵、0.5％乙酸钠、0.5％磷酸氢二钾、0.02％硫酸锰、0.05％硫酸锰、1.0％蛋白胨、0.5％酵母膏、0.1％土温-80。

1.1.5试剂

单宁、没食子酸购于sigma；绕丹宁、没食子酸丙酯(PG)，购于源叶生物；KOH溶液，购于天津市致远化学试剂有限公司；NaCl、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇，购于天津市凯通化学试剂有限公司。

1.2试验方法

1.2.1中药水提液制备

单味中药水提液制备：采用常规的煎煮法进行，最后将药液浓缩，使药液中生药含量为1g/mL，4℃冰箱保存备用。

1.2.2益生菌菌液制备

接种环挑取固体斜面菌种，之字划线接种于新的MRS固体斜面，活化菌种。活化的菌种接种于MRS液体培养基(液体培养基的组成为：2.0％葡萄糖、0.2％柠檬酸铵、0.5％乙酸钠、0.5％磷酸氢二钾、0.02％硫酸锰、0.05％硫酸锰、1.0％蛋白胨、0.5％酵母膏、0.1％土温-80)内，摇菌，备用。

1.2.3中药与益生菌抑菌试验

参照文献采用牛津杯法进行测定。抑菌效果判定标准按《中药药理学》介绍标准即：抑菌圈直径≥20mm为极敏，15mm～19mm为高敏，10mm～14mm为中敏，10mm以下为低敏。

1.2.4不同乳酸菌产单宁酶活力的对比

对上述1.1.3所述的8种乳酸菌，在相同的培养条件下进行产单宁酶能力的测定。

1.2.4.1标准曲线绘制

配制一系列浓度的没食子酸标准溶液(40-200μmoL/L)。取标准溶液与0.3mL甲醇绕丹宁溶液(0.667％，w/v)混合，30℃水浴5min，然后加入0.2mL的KOH溶液(0.5M)，再于30℃水浴5min。加入4mL蒸馏水进行稀释，30℃保温10min。缓冲液代替标准液作为空白对照，于520nm处测定吸光值(A₅₂₀)。以没食子酸含量(μmoL/L)为横坐标，A₅₂₀为纵坐标绘制标准曲线。

在520nm处，没食子酸(40-200μmol/L)与吸光值呈线性相关，其线性回归方程为y＝0.0018x+0.0035(R²＝0.9973)。

1.2.4.2单宁酶酶活力测定方法

酶活力的测定采用保玉心的绕丹宁法。该法以没食子酸丙酯(PG)作为反应的底物，单宁酶分解PG产生的没食子酸可与绕丹宁在碱性条件下形成红色复合物，该复合物在520nm处有最大吸收，据此可通过测定A₅₂₀的变化量来计算反应生成的没食子酸的量，从而计算酶活力。

1.2.5乳酸菌发酵产单宁酶活力与活菌数的相关性测定

1.2.5.1乳酸菌活菌计数：采用梯度稀释方法，进行活菌计数。

1.2.5.2乳酸菌发酵过程中不同时间点单宁酶活力测定

乳酸菌发酵过程中，在不同的时间点采样，测定单宁酶活力，测定方法同1.2.4.2。

2结果

2.1单味中药对产肠毒素大肠杆菌K88的抑菌试验结果

试验共19味中药，对产肠毒素大肠杆菌K88有抑菌作用的中药共5种，分别为乌梅、五倍子、党参、石榴皮、蒲公英，其抑菌圈直径大小如表3：

表3中药对产肠毒素大肠杆菌K88抑菌试验结果

由表3可以看出，不同单味中药水提液对产肠毒素大肠杆菌K88产生的抑菌作用不同。其中乌梅、五倍子、石榴皮、蒲公英抑菌效果为极敏，党参为高敏。

结论：乌梅、五倍子、石榴皮、蒲公英可作为后续试验材料。

2.2乳酸菌对产肠毒素大肠杆菌K88的抑菌试验结果

表4乳酸菌对产肠毒素大肠杆菌K88抑菌试验结果

由表4可以看出，除乳酸菌0012对产肠毒素大肠杆菌K88无抑菌作用外，其余各株乳酸菌均有抑菌作用，菌株0015和嗜酸乳杆菌0111的抑菌效果较好。

2.3不同乳酸菌产单宁酶活力对比结果

表5不同乳酸菌单宁酶活力对比结果

注：表中‘--’代表未检测到单宁酶活力。

由表5可以看出：嗜酸乳杆菌0111产单宁酶活力明显高于其他菌株。而且与目前文献报道的其他种类的产单宁酶的菌株相比，嗜酸乳杆菌0111产单宁酶的活力也更为突出。

2.4乳酸菌发酵产单宁酶活力与活菌数的相关性测定

测定乳酸菌0111发酵24h内单宁酶活力及乳酸菌活菌数，结果见表6和图1。

表6乳酸菌发酵24h内单宁酶活力及乳酸菌活菌数

由表6和图1可知，乳酸菌0111在7h进入对数生长期，12h进入平稳期，此时单宁酶活力也达到了75.876U/mL。说明单宁酶活力的变化与乳酸菌的活菌数成正相关。

实施例3：中药及益生菌免疫增强作用的动物体内筛选试验

1材料与方法

1.1材料和试剂

试验器材：本实施例所用的试验器材同本发明实施例2。

中草药：本发明实施例2所筛选出的抑菌效果较好的4味中草药(乌梅、石榴皮、蒲公英、五倍子)，及玉屏风散(黄芪、白术、防风)，中草药均购于山东泰安市永春堂药业有限公司永欣药店。

益生菌株：嗜酸乳杆菌0111(本发明实施例1筛选得到)、植物乳杆菌0015(山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院提供)。

试验动物：昆明小鼠160只，体重18-20g，雌雄各半，购自山东泰邦生物集团动物饲养中心。

试剂：注射用环磷酰胺(Cy)，为山西普德药业股份有限公司产品。

1.2试验方法

1.2.1中药水提液制备

单味中药水提液制备：采用常规的煎煮法进行，最后将药液浓缩，使药液中生药含量为1g/mL，4℃冰箱保存备用。

复方中药水提液制备：玉屏风散(YPF)，选自《中国药典》，按照黄芪：白术：防风为3:1:1比例配制，制备方法同单味中药水提液制备。

1.2.2益生菌菌液制备：同本发明实施例2中“1.2.2”。

1.2.3动物试验给药方法及给药量

采用饮水给药，即将一定量的中药浓缩液加入到小鼠的饮水瓶中，让其自由饮用，每天晚上给药，给药期间正常采食，次日替换清水。每只小鼠的给药量按照小鼠的体表面积折算动物的等效剂量的2倍计算。

1.2.4动物分组及处理：

160只小鼠于购买后预饲2天，第3天随机分组，共分为16组，每组10只小鼠，称量记录每组小鼠的初始体重。第1组灌胃生理盐水作为对照组，第2、3、4、5、6组分别为玉屏风、五倍子、乌梅、石榴皮、蒲公英组，7、8组分别为乳酸菌0015组、嗜酸乳杆菌0111组。每组小鼠按照表格对应的数据灌胃给药，连续给药1周；1+组为免疫抑制对照组，灌胃生理盐水，第2+、3+、4+、5+、6+、7+、8+组小鼠给药方式和给药量同本实施例中“1.2.3”，从喂药的第3d起，每组开始以75mg/kg体重的剂量腹腔注射环磷酰胺，每隔一天注射一次，共注射4次，注射期间正常给药，直至停止注射环磷酰胺的第2d，眼球采血处死。

表7试验分组及处理方式

1.3指标测定

分组后称量小鼠初始体重，试验结束时称量末体重，计算增重率；试验结束后眼球采血处死，血液用于血常规WBC、RBC、HCT、MCH、MCV检测，血清用于sIgA、IgG检测；摘取肝、脾、胸腺，计算脏器指数。

1.4数据处理

应用统计软件SPSS10.0进行分析，所有数据用均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2结果

2.1中药及乳酸菌对小鼠体重的影响

中药及乳酸菌对正常小鼠体重的影响，结果见表8。

表8中药及乳酸菌对正常小鼠体重的影响

由表8可知，对于正常组小鼠，各组小鼠末体重差异不显著(P>0.05)。除石榴皮外，其他各中药及益生菌组均可不同程度的提高小鼠的平均增重率，蒲公英组增重率为54％，与经典方剂玉屏风组更接近。乳酸菌以0111较高，增重率为51.29％。

结论：蒲公英与嗜酸乳杆菌0111在提高小鼠增重率方面效果较优。

2.2中药及乳酸菌对免疫抑制小鼠体重的影响

中药及乳酸菌对免疫抑制小鼠体重的影响结果见表9。

表9中药及乳酸菌对Cy所致的免疫抑制小鼠体重的影响

由表9可知，对于免疫抑制组小鼠，各组平均增重率均低于对照组。乌梅与0111平均增重率均高于玉屏风对照组。

2.3中药及乳酸菌对正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫器官的影响

中药及乳酸菌对正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫器官的影响结果见表10和表11。

表10中药及乳酸菌对正常小鼠免疫器官的影响

由表10可知，对于正常小鼠，各中药及乳酸菌组脾脏指数、胸腺指数、肝脏指数相比于生理盐水对照组略有增加或减少，但均差异不显著(P>0.05)。说明各中药和益生菌对正常小鼠的免疫器官指数影响较小。

表11中药及乳酸菌对Cy所致免疫抑制小鼠免疫器官的影响

对于免疫抑制组小鼠，各组的脾脏指数、胸腺指数及肝脏指数与对照组和玉屏风组相比差异不显著(P>0.05)，其中五倍子、乌梅、蒲公英、嗜酸乳杆菌0111组的脾脏指数、胸腺指数及肝脏指数均高生理盐水对照组，说明五倍子、乌梅、蒲公英、嗜酸乳杆菌0111在一定程度上可以解除小鼠的免疫抑制反应。

2.4中药及乳酸菌对小鼠血液指标的影响

中药及乳酸菌对小鼠血液指标的影响结果见表12-表13。

表12中药及乳酸菌对正常小鼠血常规的影响

由表12可知，正常小鼠灌胃中药和益生菌，血液中白细胞数目及血红蛋白均有所降低，但差异不显著；红细胞数目也呈下降趋势，2-7组与对照差异不显著，8组(嗜酸乳杆菌0111)与对照差异显著；平均红细胞体积均有所升高，但差异不显著；除了嗜酸乳杆菌0111的平均红细胞血红蛋白含量与对照差异显著，其他各组均差异不显著；各组的红细胞压积与对照差异不显著。结果表明，正常小鼠灌胃中药和乳酸菌，会一定程度上降低小鼠的白细胞数目及红细胞数目，但影响不大。

表13中药及乳酸菌对免疫抑制小鼠血常规的影响

由表12与表13可知：免疫抑制组(1+)与非免疫抑制组(1)相比，白细胞数目、红细胞数目、血红蛋白量均显著降低，平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量、红细胞压积变化不显著；对于免疫抑制小鼠，灌胃不同的中药及益生菌，能够不同程度的提高血液中白细胞数目、红细胞数目及血红蛋白；降低平均红细胞体积，且五倍子组(3+)与对照组(1+)差异显著；灌胃中药会降低平均红细胞血红蛋白含量，对红细胞压积影响不大。结果表明，注射免疫抑制剂，会明显造成血液中白细胞数目、红细胞数目及血红蛋白含量减少，而灌胃中药及益生菌，会不同程度上调上述指标，从而解除免疫抑制反应。综合考虑，乌梅、石榴皮、蒲公英、乳酸菌0111效果较优。

2.5中药及乳酸菌对小鼠血清免疫球蛋白的影响

中药及乳酸菌对小鼠血清免疫球蛋白的影响结果见表14。

表14中药及乳酸菌对小鼠血清免疫球蛋白的影响

由表14可知：与对照相比，非免疫抑制组与免疫抑制组小鼠，盲肠粘膜sIgA含量与血清中IgG含量均有不同程度的升高。对非免疫抑制组小鼠，五倍子、石榴皮与乳酸菌0111与对照组(1)差异显著；对免疫抑制组小鼠，五倍子、乌梅、乳酸菌0111与对照组(1+)差异显著。结果表明，灌胃中药及乳酸菌能够上调小鼠肠粘膜及血清中免疫球蛋白的含量(sIgA、IgG)。其中，五倍子及乳酸菌0111能够提高小鼠血清中IgG含量，增强免疫力。

结论：综合分析上述各项指标，中药乌梅、五倍子、蒲公英及嗜酸乳杆菌0111(本发明实施例1中筛选得到)对小鼠的免疫增强效果较优。

实施例4：中药益生菌制剂的制备条件优化

1试验材料

1.1中药：蒲公英、乌梅、五倍子，购于山东泰安市永春堂药业有限公司永欣药店。

1.2供试菌株：产肠毒素大肠杆菌K88菌株，购自中国兽药监察所。

嗜酸乳杆菌0111，为本发明实施例1筛选分离得到。

1.3培养基：大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)，胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)，均为青岛海博生物技术有限公司产品，琼脂粉为北京索莱宝科技有限公司产品。

2试验方法

2.1嗜酸乳杆菌0111种子液制备

将本实施例“1.2”中已低温保藏的供试菌株进行斜面培养，挑取新的嗜酸乳杆菌0111接种于100mL乳酸菌液体培养基中活化，制备新鲜活化的种子液，4℃冷藏备用。

2.2中药基础培养基制备各味药材烘干，用小型粉碎机磨成粉末状，过80目筛，之后用MRS液体培养基配成一定质量浓度的中药溶液，灭菌备用，作为中药基础培养基。

2.3嗜酸乳杆菌0111发酵中药条件的优化

菌株发酵条件的摸索，包括最佳中药组方摸索、最佳接种量摸索、最佳初始pH摸索。

2.3.1最佳中药组方摸索：在无菌条件下，将“2.1”制备的嗜酸乳杆菌0111种子液分别按照体积比4％的接种量，分别接入蒲公英：乌梅：五倍子配比为2:1:1、6:1:1、7:2:1、8:1:1的基础培养基中，37℃，静置培养24h。采用平板计数的方法进行活菌计数。

2.3.2最佳接种量摸索：在无菌条件下，将“2.1”制备的嗜酸乳杆菌0111种子液分别按照体积比2％、4％、8％的接种量，分别接入到由“2.3.1”得出的最佳中药组方培养基中，37℃，静置培养24h。采用平板计数的方法进行活菌计数。

2.3.3最佳发酵初始pH摸索：在无菌条件下，将“2.1”制备的嗜酸乳杆菌0111种子液按照2.3.2得出的最佳接种量，分别接入到“2.3.1”得出的最佳中药组方培养基中，用0.5N NaOH和0.5N HCl将培养基pH值分别调为不调整、6.5、7、7.5，37℃，静置培养24h。采用平板计数的方法进行活菌计数。

3试验结果

3.1最佳中药组方摸索

表15中药组方对嗜酸乳杆菌0111活菌数的影响(10⁹cfu·mL^-1)

由表15可知：在蒲公英：乌梅：五倍子＝6:1:1时，嗜酸乳杆菌0111活菌数最高，菌株生长性能最好。

3.2最佳接种量摸索

表16接种量对嗜酸乳杆菌0111活菌数的影响(10⁹cfu·mL^-1)

由表16可知；在接种量为4％条件下，嗜酸乳杆菌0111活菌数最高，菌株生长性能最好。

3.3最佳发酵初始pH摸索

表17初始pH对嗜酸乳杆菌0111活菌数的影响(10⁸cfu·mL^-1)

由表17可知：在蒲公英：乌梅：五倍子＝6:1:1(质量比)，接种量为4％(体积分数)，培养温度为37℃条件下，pH5.5左右(不调整)时，嗜酸乳杆菌0111活菌数最高，菌株生长性能最好。

4.小结：

中药益生菌制剂的优选的制备条件为：

(1)将蒲公英、乌梅和五味子干燥，粉碎，过80目筛，用MRS液体培养基溶解(每8g的中药组方用100mL MRS液体培养基溶解)，灭菌，作为中药组方培养基；中药组方培养基中蒲公英、乌梅和五味子的质量比为6：1：1。

(2)无菌条件下将嗜酸乳杆菌0111的种子液按4％的接种量接种至步骤(1)的中药组方培养基中，发酵培养，发酵培养条件为pH5.5左右(不调整)，37℃培养24h，制备得到中药益生菌制剂。

实施例5：中药益生菌制剂中有效成分的含量测定

嗜酸乳杆菌0111发酵对中药益生菌制剂中有机酸(草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸)含量的影响

1材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：岛津LC-20AT型高效液相色谱仪(SIL-20A自动进样器，SPD-20A紫外检测器，CTO-20A柱温箱，DGU-20A3真空脱气机，CTO-10ASVP柱温箱，LC-20AT溶液传输单元)；超纯水仪器；

试剂：甲醇(色谱纯，天津市凯通化学试剂有限公司)、磷酸(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)、磷酸二氢铵(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)，超纯水。

对照品：草酸(上海源叶生物科技有限公司，批号B20132)、酒石酸(上海源叶生物科技有限公司，批号B25642)、苹果酸(上海源叶生物科技有限公司，批号B20937)、乳酸(上海源叶生物科技有限公司，批号B21929)、乙酸(上海源叶生物科技有限公司，批号B25615)、柠檬酸(上海源叶生物科技有限公司，批号B20461)、琥珀酸(上海源叶生物科技有限公司，批号B20534)。

1.2测定方法

1.2.1色谱条件

色谱柱：InterSustain C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：20mM磷酸二氢铵缓冲液(pH2.3)-甲醇(98：2)；流速：0.6mg/mL；检测波长：210nm；柱温：28℃；进样量：20μL。

1.2.2溶液配制

嗜酸乳杆菌0111菌液组:96mL乳酸菌培养基接种嗜酸乳杆菌0111种子液4mL，37℃培养24h，取菌液12000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm膜2次，即为嗜酸乳杆菌0111菌液组待测液。

中药水提液组:中药蒲公英、乌梅、五倍子烘干，磨粉，过80目筛，按蒲公英、乌梅、五倍子6：1：1比例准确称取，水提40min，65℃烘干。精确称取8g烘干粉末置于100mL乳酸菌液中，超声震荡30min。12000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm膜2次，即为中药水提液组待测液。

中药益生菌组:按本发明实施例4中优选的制备条件制备中药益生菌制剂，12000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm膜2次，即为中药益生菌制剂组待测液。

1.2.3样品测定

按照供试品溶液的制备的方法制备，并按照本实施例“1.2.1色谱条件”进行含量测定。

2.结果与分析

有机酸的混标色谱图如图2所示。

各组有机酸色谱叠加图如图3所示，由图3可知，经嗜酸乳杆菌0111发酵后的中药益生菌制剂中的部分成分发生变化，测定有机酸的含量增高，或出现新峰，或峰消失。具体各组中有机酸含量的测定结果见表18。

表18各组中有机酸含量(单位：mg/mL)

由表18可知，中药益生菌组中，除苹果酸含量有所降低外，各种有机酸均有不同程度的升高，其中柠檬酸和琥珀酸含量增加较多，分别为中药水提液组的1.28和2.51倍。有机酸的含量的增加有益于动物肠道微生物群平衡，用于断奶仔猪日粮中，对仔猪的健康和生长都有积极作用。

对比例1：

(1)将蒲公英和五味子干燥，粉碎，过80目筛，用MRS液体培养基溶解(每8g的中药组方用100mL MRS液体培养基溶解)，灭菌，作为中药组方培养基；中药组方培养基中蒲公英和五味子的质量比为6：1。

(2)无菌条件下将嗜酸乳杆菌0111的种子液按4％的接种量接种至步骤(1)的中药组方培养基中，发酵培养，发酵培养条件为pH5.5左右(不调整)，37℃培养24h，制备得到中药益生菌制剂。

对比例2：

(1)将蒲公英、乌梅、五味子、党参和石榴皮干燥，粉碎，过80目筛，用MRS液体培养基溶解(每8g的中药组方用100mL MRS液体培养基溶解)，灭菌，作为中药组方培养基；中药组方培养基中蒲公英、乌梅、五味子、党参和石榴皮的质量比为6:1:1:1:1。

(2)无菌条件下将嗜酸乳杆菌0111的种子液按4％的接种量接种至步骤(1)的中药组方培养基中，发酵培养，发酵培养条件为pH5.5左右(不调整)，37℃培养24h，制备得到中药益生菌制剂。

对比例3：

(1)将蒲公英、乌梅和五味子干燥，粉碎，过80目筛，用MRS液体培养基溶解(每8g的中药组方用100mL MRS液体培养基溶解)，灭菌，作为中药组方培养基；中药组方培养基中蒲公英、乌梅和五味子的质量比为6：1：1。

(2)无菌条件下将常规的市售嗜酸乳杆菌(本对比例的嗜酸乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC20980)的种子液按4％的接种量接种至步骤(1)的中药组方培养基中，发酵培养，发酵培养条件为pH5.5左右(不调整)，37℃培养24h，制备得到中药益生菌制剂。

对比例4：

将蒲公英、乌梅和五味子干燥，粉碎，过80目筛，将蒲公英、乌梅和五味子按质量比为6：1：1混合，采用传统水提方法进行提取，浓缩至中药浓度为8g/100mL，得到中药水提液。

应用例1：中药益生菌制剂在小鼠体内的作用效果的研究

1试验材料

1.1试验小鼠

巴比西小鼠(6-8周龄)100只，雌雄各半，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2试验菌株

大肠杆菌K88菌株，购自中国兽药监察所。

2试验方法

2.1鼠粮制备

中药发酵鼠粮：采用本发明实施例4中经优化后的制备条件制备的中药益生菌制剂，进行冻干处理，将冻干粉按照10％添加量与常规鼠粮粉末混匀，成型，烘干即得。

中药水提鼠粮：中药蒲公英、乌梅、五倍子烘干，磨粉，过80目筛，按蒲公英、乌梅、五倍子6：1：1比例准确称取8g，水提40min，浓缩至100mL，冻干，冻干粉按照10％添加量与常规鼠粮粉末混匀，成型，烘干即得。

常规鼠粮：常规鼠粮粉碎后成型，烘干即得。

2.2大肠杆菌菌悬液制备

挑取保存于TSA斜面培养基的K88大肠杆菌，接种至TSB液体培养基中，37℃，培养18h，菌液离心，弃上清，加入适量生理盐水，用麦氏比浊法稀释菌悬液浓度至9×10⁸cfu/mL，即得。

2.3试验动物分组及处理

分组：100只小鼠，随机分为4组，分别为空白对照组(CK)，模型组(MX)，中药水提组(ST)，中药发酵组(FJ)，每组25只，其中10只用于腹泻指数、腹泻率等指标的统计，另15只用于断尾采血，测定细胞因子。各组小鼠置于小鼠笼，笼内铺洁净无污迹的白色滤纸，每天更换干净滤纸。

造模：模型组(MX)，中药水提组(ST)，中药发酵组(FJ)均用林可霉素(15mg/mL)和头孢曲松钠(25mg/mL)两种抗生素灌胃，0.3mL/次/只，2次/天，连续灌胃4天，第5天腹腔注射K88菌悬液0.3mL/只(2.7亿)，空白对照组不做处理。

给药：中药水提组(ST)、中药发酵组(FJ)小鼠灌胃抗生素期间分别饲喂中药水提鼠粮和中药发酵鼠粮，药量据成人用量按体表面积换算法得，给药剂量(原药)为0.4g/只/天，空白对照组及模型组(MX)小鼠灌胃抗生素期间饲喂常规鼠粮，所有小鼠自由采食及饮水。

2.4评价指标

2.4.1观察小鼠临床症状，包括小鼠的精神状态、被毛状态、大便性状等。

2.4.2统计腹泻率、腹泻指数

(1)腹泻率＝腹泻的动物数/该组动物总数×100％；

(2)腹泻指数＝稀便率×平均稀便级

稀便率：每只动物所排的稀便数与总便数之比。稀便级:表示每只动物稀便的程度，以稀便污染滤纸的直径定级，分为4级：小于1cm(1级)，1～1.9cm(2级)，2～3cm(3级)，大于3cm(4级)。平均稀便级＝所有稀便级数/稀便次数

统计时先逐个统计每一堆稀便的级数，然后将该鼠所有稀便级数相加除以稀便次数得稀便的平均级数，简称稀便级。

2.4.3细胞因子测定

以灌胃抗生素为试验第一天，取15只小鼠于灌胃前1h、腹腔注射大肠杆菌前1h、注射后2h、12h、24h、36h尾静脉采血，冷藏过夜，4000r/min，离心10min，分装血清，分别检测小鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平的表达，并计算IFN-γ/IL-4和IFN-γ/IL-10的比值。

3试验结果

3.1小鼠攻毒后精神状态及临床表现

结果见图4，由图4可以看出，攻毒2h后，空白对照组(CK)小鼠精神状态良好，无稀便；模型组(MX)、中药发酵组(FJ)、中药水提组(ST)小鼠精神沉郁，身体蜷缩，活动减少，出现稀便，其中以模型组(MX)腹泻较严重，中药发酵组(FJ)、中药水提组(ST)腹泻较轻。

3.2攻毒后不同时间各组小鼠腹泻指数

表19攻毒后不同时间段各组小鼠腹泻指数

由表19可以看出，24h前，与空白对照组(CK)相比，试验组(FJ、ST)与模型组(MX)腹泻指数差异显著(P＜0.05)，中药发酵组腹泻指数最低，模型组腹泻指数最高。24h-36h，与对照组相比，模型组(MX)与中药水提组腹泻指数差异显著(P＜0.05)，中药发酵组与对照组差异不显著。结果表明，中药发酵能降低小鼠腹泻指数。

3.3攻毒后不同时间点各组小鼠腹泻率

表20攻毒后不同时间点各组小鼠腹泻率(％)

由表20可知，攻毒后0-36h期间，MX、FJ、ST三组小鼠的腹泻率均呈现降低趋势，在36h时，FJ组腹泻率最低，ST次之，MX组最高。说明中药发酵组能够显著降低攻毒小鼠的腹泻率，对小鼠腹泻有较好的治疗作用。

3.4不同时间点各组小鼠血清IFN-γ水平

结果见表21和图5。

表21不同时间点小鼠血清IFN-γ水平

结果表明：不同时间点小鼠血清IFN-γ含量呈先下降后上升趋势。灌胃抗生素前，各组IFN-γ含量无显著性差异。灌胃抗生素4天，即攻毒大肠杆菌前，中药发酵组与对照组差异不显著，中药水提组、模型组与对照组差异显著。感染2小时，各组均低于对照组，且差异显著。感染12小时，各组均高于对照组，且差异显著。感染24h，中药发酵组与对照组差异显著，其余各组与对照组差异不显著。感染36h后各组间无显著性差异。

3.5不同时间点各组小鼠血清IL-4水平

结果见表22和图6。

表22不同时间点各组小鼠血清IL-4水平

结果表明：不同时间点小鼠血清IL-4含量呈先上升后下降趋势。中药发酵组与中药水提液组，在各个时间点与对照组相比，差异不显著。在攻毒前和攻毒后12h，模型组IL-4含量迅速上升，与对照组、中药发酵组、中药水提组差异显著。

3.6不同时间点各组小鼠血清IFN-γ/IL-4变化

结果见表23和图7。

表23不同时间点各组小鼠血清IFN-γ/IL-4变化

攻毒大肠杆菌前，即给药4d后，中药发酵组IFN-γ/IL-4更接近对照组，降低比值向Th2偏移趋势。感染24h后，给药组，特别是中药发酵组，能迅速提高IFN-γ/IL-4比值，使已经发生的Th2方向的漂移迅速恢复平衡。

4结论

在攻毒大肠杆菌前，中药发酵组能够缓解灌胃抗生素和应激造成的IFN-γ含量下降。攻毒大肠杆菌12h后，各组IFN-γ呈上升趋势，其中中药发酵组上升较快，IFN-γ恢复水平高于模型组与中药水提组。与模型组相比，给药组能降低IL-4急剧升高的趋势，变化较为平缓与对照组相当。中药发酵液和中药水提液对腹泻小鼠有一定的作用效果，且中药发酵组效果更优，能够显著降低腹泻指数和腹泻率。

应用例2：中药益生菌制剂在防治仔猪腹泻中的作用效果研究

1.材料与方法

1.1药品

本发明实施例4中在优化后的条件下制备的中药益生菌制剂；

对比例1-3制备的中药益生菌制剂，对比例4制备的中药水提液；

1.2病例来源及分组：在泰安市宁阳乡饮乡巴夫猪场采用自然发病的流行性腹泻仔猪300头，随机分为5组。

1.3病例诊断：以自然病例根据流行病学、临床症状、病理变化，实验室确诊。综合分析，进行确诊。

1.4治疗方法：按剂量和疗程饮水给药，试验1组给药本发明实施例4制备的中药益生菌制剂，试验2组给药对比例1制备的中药益生菌制剂，试验3组给药对比例2制备的中药益生菌制剂，试验4组给药对比例3制备的中药益生菌制剂；试验5组给药对比例4制备的中药水提液；每组的给药量均按2g/kg/天。一周内观察，回访并记录病情。

1.5疗效判断标准：

治愈：用药3-4次后患畜病症完全消失，精神、体温、食欲恢复正常，尿液粪便正常；

有效：用药3-4次后患畜病症基本消失，精神、体温、食欲有所改善，尿液粪便正常；

无效：用药4次后患畜病症未消失，病情恶化或死亡，尿液粪便颜色、性状不正常。

2.结果

试验结果见表24。

表24仔猪腹泻治疗效果统计

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东宝来利来生物工程股份有限公司

<120> 一株高产单宁酶的嗜酸乳杆菌及其在防治仔猪腹泻中的应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 菌株0111

<400> 1

acggctcctt cccgaaggtt aggccaccgg ctttgggcat tgcagactcc catggtgtga 60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg cgtgctgatc cgcgattact 120

agcgattcca gcttcgtgca gtcgagttgc agactgcagt ccgaactgag aacagcttta 180

agagattcgc ttgccttcgc aggcttgctc ctcgttgtac tgtccattgt agcacgtgtg 240

tagcccaggt cataaggggc atgatgactt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300

accggcagtc tcattagagt gcccaactta atgctggcaa ctaatgacaa gggttgcgct 360

cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat gcaccacctg 420

tcttagtgtc cccgaaggga actccgtatc tctacggatt gcactagatg tcaagacctg 480

gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 540

gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt 600

tagctgcagc actgagaggc ggaaacctcc caacacttag cactcatcgt ttacggcatg 660

gactaccagg gtatctaatc ctgttcgcta cccatgcttt cgagcctcag cgtcagttgc 720

agaccagaga gccgccttcg ccactggtgt tcttccatat atctacgcat tccaccgcta 780

cacatggagt tccactctcc tcttctgcac tcaagaaaaa cagtttccga tgcagttcct 840

cggttaagcc gagggctttc acatcagact tattcttccg cctgcgctcg ctttacgccc 900

aataaatccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960

cgtgactttc tggttgatta ccgtcaaata aaggccagtt actacctcta tccttcttca 1020

ccaacaacag agctttacga tccgaaaacc ttcttcactc acgcggcgtt gctccatcag 1080

actttcgtcc attgtggaag attccctact gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc 1140

tcagtcccaa tgtggccgat cagtctctca actcggctat gcatcattgc cttggtaggc 1200

cgttacccta ccaactagct aatgcaccgc ggggccatcc catagcgaca gcttacgccg 1260

ccttttataa gctgatcatg cgatctgctt tcttatccgg tattagcacc tgtttccaag 1320

tggtatccca gactatgggg caggttcccc acgtgttact cacccatccg ccgctcgcgt 1380

tcccaacgtc atcaccgaag tgaatctgtt ggttcagctc gctcgactgc atgtat 1436

Claims (10)

1.一株高产单宁酶的嗜酸乳杆菌，其为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)BLCC2-0111，已于2017年3月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2017098。

2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的嗜酸乳杆菌的发酵产物。

3.权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵权利要求1所述的嗜酸乳杆菌，得到发酵产物。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，发酵采用的发酵培养基的组成为：2.0％葡萄糖、0.2％柠檬酸铵、0.5％乙酸钠、0.5％磷酸氢二钾、0.02％硫酸锰、0.05％硫酸锰、1.0％蛋白胨、0.5％酵母膏、0.1％土温-80、1.5％琼脂粉，均为质量百分数，调pH至6.0。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，发酵的条件为：35-40℃，恒温培养20-28h。

6.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在制备单宁酶中的应用。

7.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌和/或权利要求2所述的菌剂在制备防治仔猪腹泻的中药益生菌制剂中的应用。

8.一种防治仔猪腹泻的中药益生菌制剂，其特征在于，由权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在中药组方培养基中发酵而成；

所述中药组方培养基由蒲公英、乌梅和五味子组成，所述蒲公英、乌梅和五味子的质量比为(5-7)：(1-2)：1。

9.如权利要求8所述的中药益生菌制剂，其特征在于，所述蒲公英、乌梅和五味子的质量比为6：1：1。

10.权利要求8或9所述的中药益生菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将蒲公英、乌梅和五味子粉碎，用MRS液体培养基溶解，灭菌，作为中药组方培养基；

(2)无菌条件下将嗜酸乳杆菌的种子液接种至步骤(1)的中药组方培养基中，发酵培养，即制备得到中药益生菌制剂。

Images