CN117384879B - 一种适应茶汁体系的耐酸单宁酶制备方法 - Google Patents
一种适应茶汁体系的耐酸单宁酶制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种适应茶汁体系的耐酸单宁酶制备方法，属于食品酶工程技术领域。本发明一方面提供了一种高产单宁酶乳酸菌Lactiplantibacillus plantarum AT29在制备适应茶汁体系的耐酸单宁酶中的应用，另一方面提供了该菌种在单宁酶生产中的制备方法。本发明提供的单宁酶制备方法以茶加工副产物为主要原料，获得的单宁酶能够很好地耐受酸性的茶汁体系且对茶叶儿茶素水解专一性较强。本发明提供的技术方案，具有生产成本低、酶的耐酸性和专一性强等优势。
Description
技术领域
本发明属于食品酶工程技术领域，具体涉及一种适应茶汁体系的耐酸单宁酶制备方法。
背景技术
单宁酶的全称是单宁酯酰水解酶(EC3.1.1.20)，它可水解没食子酸单宁、复合单宁等化合物中的酯键和缩酚羧基，生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶被广泛应用于食品饮料、饲料等行业中。在茶饮料加工中，单宁酶不仅可有效改善其外观色泽与储藏过程中产生的浑浊问题，而且还能脱苦降涩、提升滋味品质。然而，由于茶汁体系属于复杂的酸性环境，目前适用于该体系的单宁酶非常少，严重制约了单宁酶在茶饮料加工中的应用。
现有的技术公开了一些单宁酶的制备技术方案。申请号为CN201910717292.3、CN202011283991.0、CN202110163981.1、CN202011540884.1、CN202110158146.9的对比文件分别公开了以黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、黄柄曲霉、产黄青霉、杂色曲霉为生产菌株制备单宁酶，这些都是霉菌。根据公开文件“单宁酶产生菌的筛选、发酵优化及酶的纯化研究”中统计，以霉菌制备的单宁酶最适pH在5.0-6.0。而茶汁反应体系的pH一般都低于5.0，这使得这些霉菌来源的单宁酶往往难以适应这种酸性环境，其催化效率大幅度下降。申请号为CN202211063187.0的对比文件公开了对茶叶儿茶素亲和性较强的单宁酶，但其生产菌株是黑曲霉，在酸性的茶汁体系里，催化活性也受到了较大的影响。
酸茶是一种由乳酸菌和酵母等微生物发酵而成的茶叶。在酸茶发酵过程中，微生物不仅分泌许多可以降解茶叶儿茶素的生物酶，而且形成大量有机酸。因此，从中其中可能存在微生物能够生产适应酸性茶汁体系且对茶叶儿茶素水解专一性较强的单宁酶。
因此，本发明以酸茶中筛选出高产单宁酶乳酸菌作为生产菌株，以低档的茶片、白砂糖和无机盐为原料，制备适应茶汁体系的耐酸单宁酶。本发明提供的单宁酶制备方法具有生产成本低、酶的耐酸性和专一性强等优势。
发明内容
针对现有技术中单宁酶无法耐受茶汁酸性环境、对茶叶儿茶素专一性水解不强等问题，本发明设计提供了一种适应茶汁体系的耐酸单宁酶的制备方法的技术方案。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明一方面提供了高产单宁酶乳酸菌(Lactiplantibacillus plantarum)AT29在制备适应茶汁体系的耐酸单宁酶中的应用，所述高产单宁酶乳酸菌的保藏编号为CCTCCNO: M 20221899。
本发明另一方面提供了一种适应茶汁体系的耐酸单宁酶制备方法，其以高产单宁酶乳酸菌(Lactiplantibacillus plantarum)AT29为生产菌株对含有茶汁的发酵培养基进行发酵，得到单宁酶酶液。
进一步，所述含有茶汁的发酵培养基通过以下步骤得到：
将茶片粉碎后过50目筛，获得茶片粉末；
将茶片粉末和水按8：100的比例混合，在90℃下浸提30min，滤去茶渣获得茶汁；
在茶汁中加入2％白砂糖，0.3％ NaNO3，0.1％ K2HPO4和0.05％ MgSO4·7H2O，然后在121℃下灭菌15min，获得含有茶汁的发酵培养基。
进一步，所述乳酸菌在发酵培养基中的接种量为4％。
进一步，所述发酵条件为37℃下培养48h。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
以酸茶来源的高产单宁酶乳酸菌Lactiplantibacillus plantarum AT29作为生产菌株，以低档的茶片、白砂糖和无机盐为原料，制备适应酸性茶汁体系且对茶叶儿茶素水解专一性较强的单宁酶。本发明提供的单宁酶制备方法具有生产成本低、酶的耐酸性和专一性强等优势。
附图说明
图1为实施例1中乳酸菌的分离纯化图；
图2为实施例1中乳酸菌在初筛培养基上的生长情况图；
图3为实施例2中乳酸菌的16S rDNA测序PCR扩增序列电泳图；
图4为乳酸菌Lactiplantibacillus plantarum AT29的革兰氏染色图；
图5为单宁酶在不同pH下的相对酶活。
具体实施方式
为了使本发明更容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。而这些实施例仅为了说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
乳酸菌的分离纯化：取含活性菌的酸茶在制品10g，加入到装有90mL无菌生理盐水的摇瓶中，充分振荡均匀，得到稀释度为10-1的菌液，然后依次梯度稀释至10-5。取各梯度的稀释液0.2mL涂布于MRS分离培养基上，置于37℃培养箱中培养1～2d。挑取平板上具有圆形，突起，不透明，表面光滑典型特征的菌落(图1)，划线分离3次以上，在显微镜下进行观察，筛选出细胞呈杆状的菌株，获得125株菌。
乳酸菌初筛：将上述分离出的菌株接种于初筛培养基中，该初筛培养基以单宁酸为唯一碳源，并以溴酚蓝为指示剂，若菌株能够分解利用培养基中的单宁酸，则分解单宁酸产生的产物没食子酸会使培养基中的溴酚蓝由蓝紫色变为黄色，同时没食子酸也会在空气中被氧化为黄绿色。在37℃培养箱倒置培养72h。当筛选的菌种不能产单宁酶或只能产很低的单宁酶时，在初筛培养基上不能生长且培养基几乎不变色(图2左侧)；能在初筛培养基上长出菌落且变色明显的菌株(图2右侧)，则能利用单宁酸作为唯一碳源生长，可能具有产单宁酶的能力，以此筛选出56株菌进行下一步筛选。
乳酸菌复筛：将初筛获得的乳酸菌进行活化，按2％的接种量将活化的菌液接种入产酶培养基，置于37℃培养箱培养48h。离心收集发酵上清液，测定单宁酶活性，获得产单宁酶能力最强的菌种1株，产酶量为266U/L。
MRS培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，葡萄糖20，牛肉膏10，K2HPO4 2，柠檬酸二铵2，乙酸钠5，吐温-80 5，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O0.25，pH值6.2～6.4。
初筛培养基(g/L)：单宁酸10，NaNO3 3；K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，溴酚蓝0.04，琼脂15；调pH 5.0。
产酶培养基(g/L)：单宁酸20，蔗糖10，NaNO3 3，K2HPO4 1，KCl 0.5，MgSO4·7H2O0.5。
实施例2
委托上海派生诺生物有限公司对实施案例1中筛选出的产单宁酶能力最强的菌株进行16S rDNA测序。以序列5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3为引物，进行PCR扩增，获得扩增序列进行电泳分析，如图3所示。对PCR扩增序列进行解析，结果如SEQ ID NO.1所示。将测序结果去除引物序列后在美国国立生物技术信息中心(nationalcenter for biotechnologyinformation，NCBI)的GenBank数据库中进行Blast比对。鉴定为Lactiplantibacillus plantarum，命名为Lactiplantibacillus plantarum AT29。将其保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏日期：2022年12月08日，保藏号为：CCTCC NO: M 20221899。
实施例3
种子液活化：将超低温保藏的乳酸菌Lactiplantibacillus plantarum AT29(图4)按0.1％的接种量接入MRS培养基，在37℃下培养24h，获得活化的乳酸菌。
发酵培养基制备：将茶片粉碎后过50目筛，获得茶片粉末；将茶片粉末和水按8：100的比例混合，在90℃下浸提30分钟，滤去茶渣获得茶汁。在茶汁中加入2％白砂糖，0.3％NaNO3，0.1％ K2HPO4和0.05％ MgSO4·7H2O，然后在121℃下灭菌15分钟，获得发酵培养基。
发酵制备酶液：将活化的乳酸菌按4％的接种量接入步骤1所述的发酵培养基，在37℃下培养48h。将发酵液离心获得上清液即为单宁酶酶液。
MRS培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，葡萄糖20，牛肉膏10，K2HPO4 2，柠檬酸二铵2，乙酸钠5，吐温-80 5，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O0.25，pH值6.2～6.4。
实施例4
单宁酶活性测定：将酶液稀释合适倍数；取0.25mL稀释后的酶液加入10mL离心管，在30℃下预热5min；加入0.25mL底物溶液(0.01M没食子酸甲酯溶解于pH5.5、50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)，混匀后在30℃下准确反应5min；加入0.3mL指示剂(0.667％绕丹宁溶解于甲醇)，混匀后在30℃下准确反应5min；加入0.2mL终止液(0.5N KOH溶液)，再加入4mL水，混匀，静置10min；在520nm下测定吸光度。
标准曲线绘制：配制40-260uM的没食子酸标准液，取0.5mL各浓度的没食子酸液，分别加入0.3mL甲醇绕丹宁溶液，30℃保温5min，再加入0.2mL KOH，最后加入水4mL，30度静置10min。在520nm下测定吸光值。将没食子酸浓度和对应吸光值进行线性拟合，绘制标准曲线。
经标准曲线计算，得到样品酶液反应后产生的没食子酸浓度，将反应体系中每分钟释放1μmol没食子酸所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。
由此得出乳酸菌Lactiplantibacillus plantarum AT29按实施例3所述方法制备的酶液中单宁酶活性为334U/L。
实施例5
以商业化的单宁酶作为对照组(CK)，用上述乳酸菌Lactiplantibacillusplantarum AT29制备的单宁酶为实验组(AT29)，比较两者在不同pH下的酶活。定义pH5.5时的相对酶活为100％，将两种单宁酶在不同pH下的相对酶活与对应pH作图(图5)。由图可知，CK组在pH5.5以下的条件下其相对酶活随pH下降快速下降，在pH3时，相对酶活仅为28.5％；而AT29组在pH5.5以下的条件下其相对酶活随pH下降变化不大，在pH3时，相对酶活还有88.6％。这说明商业化的单宁酶在酸性条件下催化活性大幅度下降，而以乳酸菌Lactiplantibacillus plantarum AT29制备的单宁酶在酸性条件下仍有较高的催化活性。
Claims (5)
1.高产单宁酶乳酸菌（Lactiplantibacillus plantarum）AT29在制备适应茶汁体系的耐酸单宁酶中的应用，所述高产单宁酶乳酸菌的保藏编号为CCTCC M 20221899。
2.一种适应茶汁体系的耐酸单宁酶制备方法，其特征在于以高产单宁酶乳酸菌（Lactiplantibacillus plantarum）AT29为生产菌株在含有茶汁的发酵培养基进行发酵，得到单宁酶酶液，所述高产单宁酶乳酸菌的保藏编号为CCTCC M 20221899。
3.如权利要求2所述的一种适应茶汁体系的耐酸单宁酶制备方法，其特征在于所述含有茶汁的发酵培养基通过以下步骤得到：
将茶片粉碎后过50目筛，获得茶片粉末；
将茶片粉末和水按8：100的比例混合，在90 ℃下浸提30min，滤去茶渣获得茶汁；
在茶汁中加入2%白砂糖，0.3% NaNO3，0.1% K2HPO4和0.05% MgSO4·7H2O，然后在121℃下灭菌15min，获得含有茶汁的发酵培养基。
4.如权利要求2所述的一种适应茶汁体系的耐酸单宁酶制备方法，其特征在于所述乳酸菌在发酵培养基中的接种量为4%。
5.如权利要求2所述的一种适应茶汁体系的耐酸单宁酶制备方法，其特征在于所述发酵条件为37 ℃下培养48 h。
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