JP2003250588A - タンナーゼ、その遺伝子及びタンナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 下記の理化学的性質：至適pH範囲：7.0
〜7.5；熱安定性：65℃、10分間で約80％以上の残存活
性；至適温度範囲：60℃〜80℃；を有し、中性pHでよく
作用する新規タンナーゼ、該タンナーゼ活性を有する蛋
白質をコードする新規タンナーゼ遺伝子、該遺伝子がベ
クターＤＮＡに組み込まれた組み換え体DNA、並びにア
スペルギルス属に属し、該組み換え体ＤＮＡを含有する
微生物、又は該タンナーゼ生産能を有する微生物を培地
に培養し、得られる培養物からタンナーゼを採取するこ
とを特徴とするタンナーゼの製造法。 【効果】 本発明により、熱安定性に優れ、高温でよく
反応するタンナーゼ、及び中性pH域でよく反応するタン
ナーゼの製法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、タンナーゼ活性を
有する蛋白質(以下、タンナーゼという)、その遺伝子及
びタンナーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】タンナーゼ（タンニンアシルヒドロラー
ゼ、EC3.1.1.20）は、タンニン酸等のデプシド結合を有
するタンニンを加水分解し、例えば、m-ジ没食子酸（2
分子の没食子酸がデプシド結合したタンニン酸の一種）
を加水分解して2分子の没食子酸を生じる反応を触媒す
る。食品工業においてタンナーゼは、紅茶のクリームダ
ウン防止剤あるいはビール製造時の清澄化等に使用され
る有用な酵素である。

【０００３】従来、タンニンを分解できる各種自然界に
存在する微生物又は植物の葉等から、タンナーゼ活性が
報告されている。例えば、アスペルギルス属［アスペル
ギルス・オリゼ（非特許文献１参照）、アスペルギルス
・ニガー (非特許文献２参照)、アスペルギルス・フラ
バス (非特許文献３参照)、アスペルギルス・ジャポニ
カス（非特許文献３参照）］、ペニシリウム属［ペニシ
リウム sp. (非特許文献４参照)］、カンジダ属(非特許
文献５参照)、ストレプトコッカス・ボヴィス (非特許
文献６参照)、バチルス・リケニフォルミス (非特許文
献７参照)、ラクトバチルス属(非特許文献８参照)、ク
レブシエラ・ニューモニエ、コリネバクテリウム sp.
(非特許文献９参照J)、ヨーロッパナラ（Quercus robu
r, syn. Q. pedunculate）の葉(非特許文献10参照)等に
由来するタンナーゼが知られている。

【０００４】従来公知で、諸性質が明らかにされている
数種のタンナーゼは、いずれも反応至適温度範囲を40℃
付近の中温域に有し、その熱安定性の程度は60℃を越え
る高温では失活するというものである。また反応至適pH
範囲は、ほとんど全てに共通して弱酸性域、特にpH5.0
〜5.5付近である。それ以外のタンナーゼは、活性が確
認されているものの、タンナーゼの単離及びその詳細な
酵素化学的性質の報告はない。すなわち、従来のタンナ
ーゼは、酵素化学的性質からみたバリエーションが極め
て少ないものであった。

【０００５】工業的にタンナーゼを量産するための方法
としては、アスペルギルス属に属するタンナーゼ生産菌
を培地に培養し、培養物からタンナーゼを採取する方
法、例えば、特許文献1及び２等が知られている。この
方法により製造された酵素は各種用途に使用可能である
が、当然ながら製造されるタンナーゼは、従来知られた
タンナーゼの酵素化学的性質を共通的に有するものであ
った。

【０００６】

【特許文献１】特公昭56-8584号公報

【特許文献２】特公平7-79687号公報

【０００７】

【非特許文献１】Agric. Biol. Chem. 36, 1553, 1972

【非特許文献２】J. Biol. Chem. 14, 159, 1913

【非特許文献３】Leather Sci., 24, 8, 1977

【非特許文献４】Leather Chem., 11, 93, 1965

【非特許文献５】Agric. Biol. Chem. 40, p.79-85

【非特許文献６】Appl. Environ. Microbiol., 56, p.8
29-831

【非特許文献７】J. Basic Microbiol., 40(4), p.223-
232, 2000

【非特許文献８】Appl. Environ. Microbiol., Vol. 6
6, No. 7, p. 3093-3097, 2000

【非特許文献９】J. Ferment. Technol., Vol. 61, No.
1, p. 55-59, 1983

【非特許文献10】Phytochemistry. Vol. 45, No. 8, p.
1555-1560, 1997

【非特許文献11】J. Basic Microbiol., 41(6), p.313-
318, 2001

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、タンナー
ゼ、その遺伝子及びタンナーゼの製造法を提供すること
を目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、鋭
意検討の結果、従来報告されていた各種タンナーゼとは
酵素化学的性質が顕著に異なる新規なタンナーゼを見出
し、タンナーゼ遺伝子を単離することに成功し、更に、
このタンナーゼ遺伝子を含有する微生物又は該タンナー
ゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養
物からタンナーゼを採取することに成功し、本発明を完
成した。

【００１０】すなわち、本発明は、 １．以下の(a)又は(b)のタンナーゼ活性を有する蛋白
質、(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白
質(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1もし
くは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換された
アミノ酸配列からなる蛋白質 ２．配列番号1で表されるアミノ酸配列と65％以上の配
列相同性を示すアミノ酸配列を有する蛋白質であり、か
つタンナーゼ活性を有する蛋白質、

【００１１】３．下記の理化学的性質を有し、タンナー
ゼ活性を有する蛋白質。 i）作用：タンニン酸等のデプシド結合を有するタンニ
ンを加水分解する。 ii）至適pH及び安定pH範囲：至適pHはpH7.0〜pH7.5であ
り、安定pH範囲は30℃、80分間処理でpH2.5〜pH7.5であ
る。 iii）熱安定性：クエン酸緩衝液（pH5.5）中、65℃で10
分間処理後の残存活性は80％以上である。 iv）至適温度範囲：クエン酸緩衝液（pH5.5）中、60℃
〜80℃である、

【００１２】４．上記１、２又は３に記載のタンナーゼ
活性を有する蛋白質生産能を有する微生物を培地に培養
し、得られる培養物からタンナーゼを採取することを特
徴とする前記蛋白質の製造法、 ５．以下の(a)又は(b)のタンナーゼ活性を有する蛋白質
をコードするタンナーゼ遺伝子、(a)配列番号1で表され
るアミノ酸配列からなる蛋白質(b)配列番号1で表される
アミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が、付
加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなる蛋白
質

【００１３】６．配列番号1で表されるアミノ酸配列と6
5％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有する蛋白
質であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質をコード
するタンナーゼ遺伝子、 ７．以下の(a)又は(b)のＤＮＡからなるタンナーゼ活性
を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子、(a)配
列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ(b)配列番
号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基
配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡ

【００１４】８． 上記５、６又は７記載のタンナーゼ
遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮ
Ａ、 ９． アスペルギルス属に属し、上記８記載の組み換え
体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、得られる培
養物からタンナーゼ活性を有する蛋白質を採取すること
を特徴とする前記蛋白質の製造法、である。なお、本明
細書において、配列番号１で表されるアミノ酸配列及び
配列番号２で表される塩基配列は、先の出願2001-40326
1号（出願日2001年12月27日）の明細書における配列番
号29158及び29157とそれぞれ同一である。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明は、発酵、醸造、酵素生産等に利用される
アスペルギルス属に属する微生物（麹菌）において、従
来知られているタンナーゼ遺伝子と異なる塩基配列を有
する遺伝子を同定し、該遺伝子を含む組み換えベクター
をアスペルギルス属に属する微生物に導入することによ
り、従来知られているタンナーゼと比較して熱安定性に
優れ、至適温度・至適pHが高温・中性域にあるタンナー
ゼを生産することに成功したものである。本発明のタン
ナーゼは、従来知られているタンナーゼがその酵素学的
性質ゆえに利用できなかった分野にも利用可能であると
考えられる。

【００１６】〔１〕本発明の新規タンナーゼ 特定の実施形態においては、本発明のタンナーゼ（以
下、文脈により「本酵素」という。）は、以下の理化学
的性質を有する。 (1)作用：タンニン酸等のデプシド結合を有するタンニ
ンを加水分解する。（反応例：ジ没食子酸 ＋ H₂O →
2没食子酸） (2)至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：本酵素の至適ｐＨは、
後述する測定法1で用いる緩衝液のｐＨを変化させ、各
ｐＨにおける活性を測定して求めた。その結果は、図１
に示す通りであり、本酵素の至適ｐＨはｐＨ6.5〜8.0、
特にｐＨ7.0〜7.5付近である。又、安定ｐＨ範囲は、使
用する酵素液を、ｐＨ1.5〜10.0の範囲において、30℃
で80分間処理した後、残存活性を測定法１により測定し
て求めた。その結果は図２に示す通りであり、本酵素の
安定ｐＨ範囲はｐＨ2.5〜7.5である。

【００１７】(3)熱安定性：クエン酸緩衝液（ｐＨ5.5）
中、各温度で10分間処理後の残存活性を測定法1に従っ
て調べた。その結果は図4に示す通りであり、本酵素
は、60℃まで安定であり、それを越えると徐々に失活し
始め、80℃の熱処理でほぼ完全に失活する。各温度での
残存活性は65℃で82％、70℃で63％、75℃で18％であ
る。 (4)至適温度範囲：本酵素の至適温度は、後記の測定法1
において、反応時の温度を変化させ、各温度における活
性を測定して求めた。その結果は図3に示す通りであ
り、本酵素の至適温度は60℃〜80℃である。 (5)ｐＨ、温度等による失活の条件：本酵素はクエン酸
緩衝液（ｐＨ5.5）中、30℃で80分間の処理では、前記
の如くｐＨ2.5〜7.5で安定であり、それより酸性側及び
アルカリ性側では失活が見られ、ｐＨ2.0以下及びｐＨ
8.0以上では20％以上失活する(活性測定は、測定法１に
従った)。

【００１８】(6)基質特異性：タンニン酸、メチルガレ
ート、エチルガレート、プロピルガレートに対して作用
する。 また、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレー
トに対して作用する。これらの基質は、例えば、アスペ
ルギルス・オリゼ由来酵素等の公知のタンナーゼで作用
が確認されており、本酵素においても作用が確認された
ものである。タンニン類には極めて多くの種類があるた
め、公知のタンナーゼについても、上記基質以外のタン
ニンに対する基質特異性は明らかでないのと同様に、上
記基質以外のその他のタンニン類に対しても本酵素が作
用しうる可能性を含んでいる。 (7)分子量：ゲル濾過法により測定した結果、分子量約2
5万、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定
した結果、分子量9万〜10万であり、糖鎖を有する。

【００１９】本酵素と従来公知のタンナーゼとの理化学
的性質の相違点を、表１に示す。尚、酵素Ａは、アスペ
ルギルス・オリゼ由来（キッコーマン社酵素カタログ記
載）、酵素Ｂは、アスペルギルス・アクレアタス由来
(非特許文献11参照)、酵素Ｃは、バチルス・リケニフォ
ルミス由来((非特許文献７参照)、及び酵素Ｄは、ヨー
ロッパナラの葉(非特許文献10参照)由来のタンナーゼを
意味する。

【００２０】

【表１】

【００２１】本発明のタンナーゼは本明細書記載の理化
学的性質を有する限り、その由来により限定されるもの
ではないが、好ましくは微生物由来の蛋白質であり、更
に好ましくは糸状菌由来の蛋白質であり、更に好ましく
はアスペルギルス属に属する糸状菌由来の蛋白質であ
り、最も好ましくは黄麹菌（アスペルギルス・オリゼ、
アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ）由
来の蛋白質である。更に、本発明のタンナーゼは遺伝子
組換え技術により得られるタンナーゼも含むものであ
る。

【００２２】特定の実施形態においては、本発明のタン
ナーゼ活性を有する蛋白質は配列番号１に表されるアミ
ノ酸配列からなる蛋白質である。しかしながら、本発明
のタンナーゼ活性を有する蛋白質はタンナーゼ活性を有
する限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる
蛋白質に限定されるものではない。すなわち、本発明の
タンナーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号１で表され
るアミノ酸配列において１若しくは複数（好ましくは２
〜５０個、より好ましくは２〜１０個、より好ましくは
数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸
配列からなり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であ
り得る。ここで、「１もしくは複数のアミノ酸が付加、
欠失もしくは置換されたアミノ酸配列」とあるのは、目
的とするタンナーゼ活性が得られる限り、配列番号１で
表されるアミノ酸配列が、該アミノ酸配列とは異なる配
列に付加されてもよく、又、該アミノ酸配列の一部が欠
失又は置換されてもよいことを意味する。例えば、配列
番号１で表されるアミノ酸配列の第１番目のメチオニン
が欠失しても、本発明の目的とする熱安定性に優れ、高
温・中性域で良く反応するタンナーゼ活性が得られる限
り、かかる欠失した配列も本発明に含まれることを意味
する。

【００２３】また、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋
白質は、配列番号１で表わされる全アミノ酸配列の30％
以上を占める連続するアミノ酸配列領域と65％以上、好
ましくは70％以上、更に好ましくは80％以上の配列相同
性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片
であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得
る。更には、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質
は、配列番号１で表わされる全アミノ酸配列の60％以上
を占める連続するアミノ酸配列領域と65％以上、好まし
くは70％以上、さらに好ましくは80％以上の配列相同性
を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片で
あり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得る。

【００２４】更に、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋
白質は、配列番号１で表わされる全アミノ酸配列の90％
以上を占める連続するアミノ酸配列領域と65％以上、好
ましくは70％以上、更に好ましくは80％以上の配列相同
性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片
であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得
る。次に、本酵素の力価の測定法について説明する。本
酵素の活性測定は、下記の測定法１に従って行なった。
尚、30℃においてタンニン酸中のエステル結合を、１分
間に１μmol加水分解する酵素量を、１単位（Ｕ）とす
る。

【００２５】〔測定法１〕アグリカルチュアル・バイオ
ロジカル・ケミストリー（31巻、513頁〜518頁、1967
年）に記載の方法を一部改変して本酵素の力価を測定す
る。すなわち、タンニン酸（ジ没食子酸）のエステル結
合が加水分解される度合を、310nmの吸光度減少を分光
光学的に測定することにより算出する。

【００２６】具体的には、1.0 ml の基質溶液〔0.35％
タンニン酸(ジ没食子酸)を含有する50mM クエン酸緩衝
液（ｐＨ5.5）〕を30℃、5分間平衡化し、適宜希釈した
タンナーゼ溶液0.25mlを加え、30℃、15分間反応させ
る。次いで5.0mlの90％エタノールを混合して反応を停
止後、この溶液を0.25ml採取して別の試験管に移し、5.
0mlの90％エタノールを混合して希釈を行なう。次いで3
10nm における吸光度変化を、分光光度計（U-2001, 日
立社製）を用いて測定する。酵素の代わりに緩衝液を加
えて同様に測定したものをブランク値とし、ブランク値
との測定値の差を酵素反応量とする。

【００２７】〔２〕本発明の新規タンナーゼ遺伝子 特定の実施形態においては、本発明のタンナーゼ遺伝子
は上記理化学的性質を有する蛋白質をコードするタンナ
ーゼ遺伝子であり得る。更には、特定の実施形態におい
ては、本発明のタンナーゼ遺伝子は配列番号２で表され
る塩基配列からなるタンナーゼ遺伝子であり得る。しか
しながら、タンナーゼ活性を有する蛋白質をコードする
限り、配列番号２で表される塩基配列からなるタンナー
ゼ遺伝子に限定されるものではない。すなわち、本発明
のタンナーゼ遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列
からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタン
ナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝
子であり得る。

【００２８】ストリンジェントな条件とは、特異的なハ
イブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグ
ナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリ
ダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さ
によって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼー
ションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変
えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハ
イブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合に
は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げると
共に、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異
性を上げることができる。また、特異的なハイブリッド
のシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼー
ション及び洗浄の温度を下げると共に、必要により洗浄
の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化さ
せることができる。このような最適化は、本技術分野の
研究者が容易に行ない得るものである。

【００２９】ストリンジェントな条件の具体例として
は、例えば、プローブとしてDNAプローブを用い、ハイ
ブリダイゼーションは、5 ×SSC 、1.0 %(W/V)核酸ハイ
ブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・
マンハイム社製）、0.1 %(W/V)N-ラウロイルサルコシ
ン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩（８〜１６時間程度）で
行なう。洗浄は、0.1〜0.5×SSC、0.1%(W/V)SDS、好ま
しくは0.1×SSC 、0.1%(W/V)SDSを用い、15分間、2回行
なう。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行なう温度
は、55℃以上、好ましくは60℃以上、更に好ましくは65
℃以上、最も好ましくは68℃以上である。

【００３０】また、本発明のタンナーゼ遺伝子は、配列
番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと70%以上、
好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上の配列相同
性を示し、かつタンナーゼの機能を有する蛋白質をコー
ドするタンナーゼ遺伝子であり得る。

【００３１】上記のアミノ酸配列又は塩基配列の解析に
おいて、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列
相同性を決定するために、先ず配列は、比較に最適な状
態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入
れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適
化を行なう。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は
塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、
第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基
が存在する場合、それらの配列は、その部位において同
一である。２つの配列における配列相同性は、配列間で
の同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）
数に対する百分率で示される。

【００３２】上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列又
は塩基配列における配列相同性は、Karlin 及び Altsch
ulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:226
4-2268, 1990及びProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873
-5877, 1993)により決定される。このようなアルゴリズ
ムを用いたBLASTプログラムがAltschul等によって開発
された(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。更に、Gap
ped BLASTはBLASTより感度よく配列相同性を決定するプ
ログラムである(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 19
97)。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対
し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検
索するために用いられる。これらは、例えば、米国Nati
onal Center for Biotechnology Informationのインタ
ーネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。

【００３３】ただし、上記BLASTソフトウェアで有意な
配列相同性を示す配列が見つからない場合には、更に高
感度なFASTAソフトウェア（W.R. Pearson and D.J. Lip
man,Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988）を
用いて配列相同性を示す配列をデータベースから検索す
ることもできる。FASTAソフトウェアは、例えば、ゲノ
ムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パ
ラメーターは、デフォルト値を用いる。例えば、塩基配
列についての検索を行なう場合は、データベースにnr-n
tを用い、ktup値は6を用いる。

【００３４】上記の各方法は、主にデータベース中から
配列相同性を示す配列を検索するために用いられるが、
個別の配列の配列相同性を決定する手段として、本発明
では、Genetyx Mac Ver（トウエア開発社）のホモロジ
ー解析を用いることができる。この方法は、高速、かつ
高感度な方法として多用されているLipman-Pearson法(S
cience, 227:1435-1441, 1985)に基づくものである。塩
基配列の配列相同性を解析する際は、可能であれば蛋白
質をコードしている領域（CDS又はORF）を用いる。パラ
メーターとしては、Unit Size to compare = 2 , Pick
up Location =5とし、結果を％表示させる。最も高いポ
イントを示したアラインメントの配列相同性を結果とし
て用いるが、問い合わせ配列の30%以上、50%以上、又は
70%以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に
相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配
列間の配列相同性を示す値としては用いない。例えば、
数塩基／残基程度の完全一致領域があったとしても、そ
れは偶然の結果に過ぎない可能性が高く、また、全体の
数％程度の長さにおける一致では、特定の機能モチーフ
が含まれていたとしても、全体として同じ機能を果たす
と考えることは困難である。

【００３５】〔３〕微生物を用いた本酵素の生産 本酵素を製造するために使用される微生物としては、本
酵素の生産能を有する限り、遺伝子組換えの有無に関わ
らず、いかなる微生物を使用してもよく、好ましくは糸
状菌、更に好ましくはアスペルギルス属に属する糸状菌
が使用される。具体的には、例えば、アスペルギルス・
オリゼ RIB40(ATCC 42149)等を挙げることができる。ま
た、該菌株の変異株を用いることも可能である。該菌株
の変異株を得る方法としては、例えば、ラジオアイソト
ープ、紫外線、ニトロソグアニジン等を用いて原株に突
然変異を起こさせる方法を用いることができる。

【００３６】当然のことながら、本酵素の生産に使用す
る微生物は、本酵素の生産能を有すると同時に、例えば
従来のタンナーゼの生産能を兼ね備えたものであっても
よい。そのような微生物としては、本来両方のタンナー
ゼの生産能を兼ね備えたものや、本来ある種のタンナー
ゼの生産能を有する微生物に、別種のタンナーゼをコー
ドする遺伝子を導入して複数種のタンナーゼの生産能を
兼ね備えさせたものが含まれる。複数種のタンナーゼの
生産能を兼ね備えた微生物を、各種の培養条件下で培養
することによって、目的に応じ、各タンナーゼの生産比
率を任意に変化させて酵素生産させることも可能であ
る。

【００３７】上記の微生物を培地に培養し、得られる培
養物から本酵素を採取する。培養法は、通常の固体培養
法でもよく、液体培養法を採用することが好ましい。培
地は、微生物を培養する通常の培地、すなわち炭素源、
窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有す
るものであれば、合成培地又は天然培地のいずれでも使
用できる。

【００３８】炭素源としては、資化可能な炭素化合物、
例えば、グルコース、マルトース、デンプン加水分解
物、グリセリン、フラクトース、糖蜜等が使用される。
又、窒素源としては、利用可能な窒素化合物、例えば、
酵母エキス、ペプトン、ソイトン、肉エキス、コーンス
チープリカー、大豆粉、大豆もしくは小麦ふすま侵出
液、アミノ酸、硫安、硝酸アンモニウム等が使用され
る。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化マンガン、硫酸第一鉄、リン酸第一カリウム、リン
酸第二カリウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等の
種々の塩類、ビタミン類、消泡剤等が使用される。これ
らの培地成分は、単独で、又は適宜組み合わせて用いる
ことができる。

【００３９】微生物の培養は、使用する微生物の性質及
び培地の形状に応じて通気撹拌培養、振盪培養、静置培
養等を適宜選択し、培地の初発ｐＨを６〜７程度に調整
した後、25〜35℃、好ましくは30℃前後で24〜140時
間、好ましくは60〜100時間行えばよい。培養終了後、
培養物より本酵素を採取するためには、通常の酵素採取
手段を用いることができる。すなわち、酵素が菌体外部
に放出される場合には、濾過又は遠心分離等により菌体
を分離して、酵素液を含む培養液を回収することができ
る。また酵素が菌体内部に存在する場合には、超音波破
砕機、フレンチプレス、リゾチーム等の細胞壁溶解酵
素、界面活性剤等を用いて、濾過又は遠心分離等により
分離した菌体から酵素を抽出し、次いで、濾過又は遠心
分離等を用いて不溶物を除去することにより、本酵素を
含有する粗酵素液を得ることができる。

【００４０】このようにして得られた粗酵素液から、本
酵素を更に精製するには、通常の蛋白質精製法を使用す
ることができる。具体的には、例えば、硫安塩析法、有
機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、電気泳動法等を単独で、又は適宜組み合わせて用い
ることができる。

【００４１】〔４〕遺伝子工学的手法による本酵素遺伝
子のクローニング及び本酵素の生産 以下に、本をコードする遺伝子（以下、文脈により「ta
n遺伝子」という）を含むＤＮＡが挿入された組み換え
体ＤＮＡにより宿主細胞を形質転換又は形質導入し、得
られた組み換え微生物を用いて本酵素を生産する方法に
ついて詳細に説明する。

【００４２】１．tan遺伝子のクローニング tan遺伝子を含むＤＮＡは、染色体ＤＮＡ、又はｃＤＮ
Ａ由来の野生型遺伝子をクローニングすることにより得
られる。又、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型としてポ
リメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）を行なう
ことにより該遺伝子を増幅することもできる。更には化
学合成法を用いて該遺伝子を構築することも可能であ
る。以下、アスペルギルス属に属する微生物の染色体Ｄ
ＮＡを鋳型にPCRによりtan遺伝子をクローニングする方
法を例にとり、tan遺伝子を含むＤＮＡの単離法につい
て説明する。

【００４３】PCR法によるtan遺伝子の増幅に鋳型ＤＮＡ
として用いる染色体ＤＮＡは、本発明のタンナーゼ遺伝
子を有する微生物由来であればいかなる微生物由来の染
色体ＤＮＡでも用いることができる。これらの微生物と
して、例えば、アスペルギルス・オリゼRIB40(ATCC 421
49)株等が挙げられる。プライマーとしては、tan遺伝子
を含むDNA断片の増幅が可能であればいかなる配列のプ
ライマーを用いてもよい。その例としては、配列番号
３、４で表されるプライマー等が挙げられる。

【００４４】PCR反応に用いるＤＮＡポリメラーゼとし
ては、例えば、TaKaRa Ex Taq（タカラバイオ株式会社
製）、KOD DNA Polymerase（東洋紡績株式会社製）等を
用いることが可能であるが、PCR反応時における増幅ミ
スの割合が低いKOD DNA Polymerase（東洋紡績株式会社
製）等を用いることが好ましい。

【００４５】PCRの反応条件は、上記染色体ＤＮＡ、プ
ライマー、ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、ta
n遺伝子を含む特異的増幅産物を得ることができればい
ずれの反応条件を用いてもよい。その例としては、実施
例１記載のPCR反応条件等が挙げられる。また、本発明
のタンナーゼ遺伝子を有する微生物から染色体ＤＮＡを
抽出する方法としては、公知のいずれの方法も使用でき
る。その例としては、飯村等の方法〔Agric. Biol. che
m. 323-328, 51 (1987)〕等が挙げられる。

【００４６】上記染色体ＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて、上記反応条件でPCRを実施するこ
とにより約1.8kb特異的増幅産物を得ることができる。
該増幅産物の塩基配列は、染色体上の本発明のタンナー
ゼ遺伝子の塩基配列と同様の配列を有していることが期
待される。しかしながら、場合によってはPCR反応中の
増幅ミスにより、染色体上の本発明のタンナーゼ遺伝子
の塩基配列と異なる塩基を有していることがあり、増幅
ミスの有無を確認する必要がある。PCR反応中の増幅ミ
スの確認は、複数の増幅産物のシークエンスを行なうこ
とにより以下の通り実施することができる。

【００４７】個別のチューブを用いてPCRを行なうこと
により得られた複数の増幅産物を、適当な制限酵素で処
理・精製後、あるいは無処理で、ベクターＤＮＡ、例え
ば、プラスミドpUC18（タカラバイオ株式会社製）、pUC
118（タカラバイオ株式会社製）、温度感受性バクテリ
オファージ（特開昭58-212781 号公報、FERM BP-133
等）の適当な制限酵素ゼ部位に挿入して組み換え体ＤＮ
Ａを作成し、該組み換え体ＤＮＡを用いて、宿主細胞、
例えば、大腸菌JM109（タカラバイオ株式会社製）を形
質転換する。得られた形質転換体に含まれる組み換え体
ＤＮＡを、QIAGENPlasmid Mini Kit（フナコシ社製）等
を用いて精製する。

【００４８】このようにして得られた組み換え体ＤＮＡ
に挿入されている各増幅産物の塩基配列の決定は、ジデ
オキシ法(Methods in Enzymology,101,20-78,1983）等
により行なうことができる。シークエンスを行なった各
増幅産物の塩基配列のうち、全ての塩基について、対応
する他の増幅産物の塩基と高い相同性を有している塩基
配列を、染色体上の本発明のタンナーゼ遺伝子の塩基配
列と同様の配列とみなすことができ、該塩基配列を有す
る増幅産物をtan遺伝子を含むＤＮＡとすることができ
る。該塩基配列を配列番号２に、配列番号２に示した塩
基配列に基づいて確定した本発明の新規タンナーゼのア
ミノ酸配列を配列番号１に示す。

【００４９】２．組み換え体ＤＮＡの構築と組み換え微
生物の取得 本酵素を得るためには、tan遺伝子を含む組み換え体Ｄ
ＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡにより形質転換され、
本酵素を生産し得る組み換え微生物を取得する必要があ
る。以下に、tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡの構築
と、該組換え体ＤＮＡを用いた微生物の形質転換方法に
ついて説明する。

【００５０】形質転換に宿主として用いる微生物として
は、tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡによる形質転換
により、本酵素を生産することができる微生物であれば
いかなる微生物も用いることができるが、好ましくは糸
状菌、更に好ましくはアスペルギルス属に属する微生
物、更に好ましくは黄麹菌、最も好ましくは、アスペル
ギルス・オリゼが挙げられる。

【００５１】tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡの構築
に用いるベクターＤＮＡは、宿主細胞を形質転換する機
能例えば、薬剤耐性、栄養要求性等のマーカー遺伝子、
及び、宿主細胞で機能し得るプロモーター、ターミネー
ター等のtan遺伝子の発現に必要な機能を有している限
りいかなるベクターＤＮＡも使用することができる。但
し、tan遺伝子の発現に必要な機能については、挿入す
るtan遺伝子を含むＤＮＡ断片が、その機能を有してい
る場合は必ずしも必要ではない。又、co-transformatio
n法により形質転換を行なう場合には、ベクターＤＮＡ
上に必ずしもマーカー遺伝子を有する必要はない。

【００５２】tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡは、PCR
増幅ミスがないことを確認したtan遺伝子を含む増幅産
物を上記ベクターＤＮＡとtan遺伝子の発現が可能な形
で結合することにより構築することができる。すなわ
ち、シークエンスに用いたtan遺伝子を含むプラスミド
より、適当な制限酵素、例えば、EcoRＩ及びSmaＩで切
り出したtan遺伝子を含むDNA断片を、実施例２記載のpA
P等のベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位、例えば、E
coRＩ-SmaＩ部位にtan遺伝子の発現が可能な形で挿入す
ることにより構築することができるる。

【００５３】tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを用い
て微生物を形質転換する方法は、宿主として用いる微生
物及びtan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡに用いたマー
カー遺伝子により異なるが、公知の方法を適宜用いるこ
とができる。例えば、宿主としてアスペルギルス・オリ
ゼniaD^-株を用い、マーカーとしてアスペルギルス・オ
リゼ由来のniaD遺伝子を用いる場合は、〔Mol.Gen.Gene
t (1989)218:99-104〕記載の方法を、宿主としてアスペ
ルギルス・オリゼargB^-株を用い、マーカーとしてアス
ペルギルス・オリゼ由来のargB遺伝子を用いる場合は、
〔Biosci.Biotechnol.Biochem.,64(4),816-827,2000〕
記載の方法を用いることができる。

【００５４】３．組み換え微生物による本酵素の生産 上記tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを保有する組み
換え微生物を培養すれば、本酵素を生産することができ
る。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培
養法を採用することが好ましい。

【００５５】組み換え微生物を培養する培地としては、
例えば、酵母エキス、ペプトン、ソイトン、肉エキス、
コーンスティープリカー又は大豆もしくは小麦ふすまの
浸出液等から選ばれる１種以上の窒素源に、リン酸二水
素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄又は硫酸マンガン等の無機
塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビ
タミン、tan遺伝子を発現させるプロモーターを誘導す
るための基質等を適宜添加したものが用いられる。

【００５６】培地の初発ｐＨは６〜７に調節するのが適
当である。培養は、25〜35℃、好ましくは30℃前後で60
〜100時間、通気撹拌培養、振盪培養、静置培養等によ
り行なうことが好ましい。培養終了後、培養物より本酵
素を採取するには、通常の酵素採取手段を用いることが
できる。すなわち、酵素が菌体外部に放出される場合に
は、濾過又は遠心分離等により菌体を分離して、酵素液
を含む培養液を粗酵素液として回収する。また酵素が菌
体内部に存在する場合には、超音波破砕機、フレンチプ
レス、リゾチーム等の細胞壁溶解酵素、界面活性剤等を
用いて、濾過又は遠心分離等により分離した菌体から酵
素を抽出し、次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶
物を除去することにより、本酵素を含有する粗酵素液を
得ることができる。本発明では、このようにして得られ
た粗酵素液をそのままタンナーゼ標品としてもよく、以
下の精製手法によりさらに純度を高めてもよい。

【００５７】上記の粗酵素液から、本酵素を更に精製す
るには、通常のタンパク質精製法を使用することができ
る。具体的には、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン
交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲ
ルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等が、
単独又は適宜組み合わせて用いられる。

【００５８】本酵素は、広範な安定ｐＨ範囲並びに優れ
た熱安定性をともに兼ね備えている。従って、本酵素
は、例えば、試薬、食品加工用助剤として利用する場合
に、ｐＨ又は温度等の使用環境が変化したときの影響を
受けにくく、安定性に優れている点で、公知のタンナー
ゼよりも優れている。また本酵素は、至適pH範囲が公知
のものより中性域に存在しており、公知のタンナーゼで
は充分な作用効果が期待できなかったpH域における新た
な用途、利用できる食品のバリエーションを提供するこ
とが期待される。

【００５９】例えば、弱酸性域でよく作用する公知のタ
ンナーゼは、このpH領域に含まれる緑茶あるいは紅茶、
また果汁等の飲料に対して使用する際には、反応至適pH
付近で反応するため好適であった一方で、野菜汁や、抽
出後に色調を強めるため中性付近までpH調整されたウー
ロン茶には、反応至適pHを外れていることから、活性が
顕著に低下し、充分な効果を示せないか、必要な効果を
得るためには多量の酵素を使用しなければならない、あ
るいは酵素処理のために一時的にpHを変える処理工程を
必要とする等の問題を抱えていた。このようなpH領域の
飲料・食品に対して本発明のタンナーゼを使用すれば、
反応至適pH付近で反応するため、迅速に、より少量の酵
素使用で、充分な効果をあげることが可能となる。

【００６０】更に本酵素は、失活を起こす温度及び至適
温度範囲が公知のタンナーゼより高温域に存在してお
り、食品加工等に使用するにあたり、加熱工程との共存
がより容易であるという点でも、公知のタンナーゼでは
行なえない使用法のバリエーションを提供する。例え
ば、茶飲料等は製法上、茶葉を熱湯抽出して製造する
が、この茶抽出液にタンナーゼを作用させたい場合、公
知のタンナーゼでは、酵素が熱失活しない温度まで充分
に茶抽出液の温度を下げる必要があった。この点で、本
発明の熱安定性に優れ、高温・中性域で良く反応するタ
ンナーゼを使用する場合には、茶抽出液の温度を下げる
工程を大幅に短縮するあるいは省くことが可能になる。

【００６１】本発明のタンナーゼは、60℃〜80℃という
高温で好適に作用するので、熱水抽出工程中に、抽出を
行ないながら、酵素反応を行なわせることも可能にな
る。このことは、抽出及び酵素反応の２工程を1工程で
済ませることにつながり、効率よい生産に寄与する。ま
た、タンナーゼの作用の中に、茶抽出物中のタンニンを
分解して沈澱や混濁を防止する効果があるが、抽出しな
がら酵素反応を進めることにより、沈澱・混濁を除去し
つつ、より高濃度の茶抽出を実現することも可能にな
る。なお、本発明のタンナーゼは、実用上高い熱安定性
を有しつつも、通常の飲料製造で広く用いられる加熱殺
菌条件、例えば、達温95℃等の条件で、迅速に完全に失
活するため、製造工程中、失活のために特別の加熱工程
を組み入れる必要を生じない。

【００６２】

【実施例】次に、本発明を実施例により更に具体的に説
明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限
定されるものではない。

【００６３】〔実施例１〕 アスペルギルス・オリゼtan遺伝子の取得 アスペルギルス・オリゼ RIB40株(ATCC 42149)の胞子を
YPD培地100 mlに植菌し、温度30℃で一晩振盪培養し
た。その後、飯村〔Argric. Biol. Chem. 323-328, 51
(1987)〕の方法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、このゲ
ノムＤＮＡ断片を鋳型として、アスペルギルス・オリゼ
のゲノムデータベースを参考に作成した下記のプライマ
ーを用いてPCRを行なった。 5'-cttggaattctctcgaataaaaatgagg-3' （配列番号 3） 5'-ctaaatacccgggctatgacatgacattc-3' （配列番号4
） PCR反応は、KOD DNA Polymerase (東洋紡績株式会社製)
を使用し、PTC-200 DNA Engine(MJ Research社製)によ
り行なった。反応液の組成は以下の通りである。

【００６４】（試薬：使用量） H₂O：36μl 10×Reaction Buffer #1：5μl 2 mMdNTP Mix：5μl 20μMプライマー2種類：各1μl 鋳型 (ＤＮＡ 0.5μg)：1μl KOD DNA Polymerase：1μl 合計液量：50μl

【００６５】上記の反応液50μlを0.2 ml反応チューブ
中で混合してＤＮＡサーマルサイクラーにセットし、以
下のような温度設定によりPCRを行なった。PCRにより得
られた約1.8kbの増幅産物をエタノール沈殿処理後、Eco
RI及びSmaIで消化した。 95℃、2分 ：1サイクル 95℃、30秒、 58℃、30秒 72℃、2分30秒 ：30サイ
クル 72℃、3分 ：1サイクル。

【００６６】EcoRI及びSmaI消化後の上記増幅産物をEco
RI及びSmaIで消化後、精製したプラスミドpUC18のEcoRI
-SmaI部位に連結し、大腸菌JM109(ATCC 53323)の形質転
換及びクローニングを行なった。目的のＤＮＡ断片を有
する大腸菌６クローンからプラスミドを調製し、クロー
ニングしたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。各ＤＮＡ
断片の塩基配列を比較し、PCR増幅時の増幅ミスを含ま
ないと思われる増幅産物を含むプラスミドをpUCtan-4と
した。pUCtan-4に挿入されたPCR増幅産物の塩基配列を
配列番号２に示す。

【００６７】〔実施例２〕 麹菌発現ベクターの構築 アスペルギルス・オリゼのアミラーゼプロモーターを有
する発現ベクタープラスミドpMAR5(Biosci. Biotech. B
iochem., 56:1674-1675, 1992)のマーカー遺伝子である
argB遺伝子を、アスペルギルス・オリゼのpyrG遺伝子と
交換したプラスミドを作成した。pMAR5を制限酵素SphI
で消化し、末端平滑化処理後、更にSalIで消化し、0.7%
アガロースゲルで電気泳動し、約４kbの断片を回収し
た。

【００６８】一方、ppyrG-26(特開2001-46053号公報記
載)をBamHIで消化し、末端平滑化処理後、更に、SalIで
消化し、0.7%アガロースゲルで電気泳動し、pyrG遺伝子
を含む約2.2kbのＤＮＡ断片を回収した。これらの断片
をライゲーションし、そのベクターにより大腸菌JM109
株を形質転換した。得られたプラスミドをpAPとした。
このプラスミドは、pyrG遺伝子を選択マーカーとして有
し、アミラーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネータ
ーの間にEcoRI-SmaIサイトを有する発現ベクターであ
り、EcoRI-SmaIサイトにプロモーターと同じ方向で遺伝
子のORFを組み込み、麹菌を形質転換することにより、
アミラーゼ遺伝子プロモーターの制御下で目的の遺伝子
を発現することができるものである。

【００６９】pUCtan-4をEcoRI-SmaIで消化後、クローニ
ングしたＤＮＡ断片を単離、精製し、pAPのEcoRI-SmaI
部位に連結したのち大腸菌JM109の形質転換を行なっ
た。得られた形質転換体より回収したプラスミドのう
ち、pAPのEcoRI-SmaI部位にクローニングしたＤＮＡ断
片が目的通りに連結されたプラスミドをpAPtan-4とし
た。

【００７０】〔実施例３〕 麹菌形質転換体の取得 アスペルギルス・オリゼ RIB40株(ATCC 42149)から特開
2001-46053号公報記載方法で取得したpyrG欠損株をpAPt
an-4で形質転換した。形質転換法は、プロトプラスト化
した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用
いる方法（Mol.Gen. Genet., 218:99-104, 1989）によ
って行なった。pAPtan-4を3μg用いて形質転換し、最少
培地で形質転換体を選択したところ、約100個のコロニ
ーを得た。

【００７１】2％デキストリン、1％ポリペプトン、0.5
％ KH₂PO₄、0.05 ％MgSO₄を含むアミラーゼプロモータ
ー誘導培地（pH6.0）50mlに、上記各形質転換体の分生
子約10⁶個を接種し、温度30℃、50時間、振盪培養し
た。培養後の上清をUltrafree-MC（MILLIPORE社製）に
かけ、菌体を完全に除去した後、各濾過液3μlをタンナ
ーゼ活性アッセイプレート（0.2％ NH₄H₂PO₄、0.2％ KH
₂PO₄、0.1％ MgSO₄、1％ Glucose、1％ Tannic acid、2
％ agar、pH7.5）に滴下した。30℃で48時間静置培養し
た後、滴下した培養上清による培地中のタンニン酸の分
解が観察された形質転換体RIB40tan-2株を選択した。該
形質転換株、アスペルギルス・オリゼ （RIB40tan-2）
は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ
ンターにFERM BP-8180として寄託されている。

【００７２】〔実施例４〕 組み換え微生物による本酵素の生産 (1) 種菌（胞子懸濁液）の調製 上記方法により作製した組み換え麹菌アスペルギルス・
オリゼ（RIB40tan-2）を、マルツ寒天培地（純正化学社
製）上で30℃、7日間培養した。得られたコロニー上に
形成された胞子を、スキムミルク溶液（10％スキムミル
ク、5％サッカロース、1％グルタミン酸ナトリウム）で
掻き取り、約10⁷個/mlの胞子懸濁液を調製して凍結保存
した。

【００７３】(2) 微生物の培養 酵素生産用培地（4％デキストリン、2％ポリペプトン、
1％酵母エキス、0.5％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄、ｐＨ6.0）
400mlを入れた2000ml容三角フラスコ5個に、アスペルギ
ルス・オリゼ(RIB40tan-2)の胞子懸濁液0.8mlを植菌
し、30℃で60時間振盪培養した後、濾紙濾過により菌体
を除去し、培養液約1.8Ｌを得た。

【００７４】(3)タンナーゼの精製 得られた培養液に硫安を添加し、飽和硫安濃度60％〜10
0％で回収される沈澱を緩衝液A［30％飽和硫安含有20mM
酢酸緩衝液（ｐＨ5.0）］にて溶解し、約130mlの酵素
溶液を得た。次いで、該酵素溶液を、緩衝液Aで平衡化
したフェニル-セファロースCL-4Bカラムに供した。カラ
ムを緩衝液Aで洗浄した後、30%〜0％の飽和硫安含有20m
M 酢酸緩衝液（ｐＨ5.0）の直線濃度勾配法により吸着
画分を溶出した。溶出液を分取し、各画分のタンナーゼ
活性を測定法１に従って調べた。タンナーゼ活性を有す
る画分を、セントリコン−30（アミコン社製）を用いて
限外濃縮・透析し、硫安を除去した。

【００７５】濃縮処理後の活性画分の一部を、0.1M NaC
l含有20mM酢酸緩衝液pH5.5にて平衡化したTSK-gelG3000
SWXL（東ソー社製）を用いたゲル濾過ＨＰＬＣに供し、
溶出液を280nmの吸光度でモニターし、分取画分の活性
を測定した。その結果、本酵素がシングルピークとなる
までに精製されていることを確認した。標準分子量マー
カーの溶出位置から推定された本酵素の分子量は約25万
であった。

【００７６】また上記の方法により得られた活性画分の
一部を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供
した。泳動終了後にゲルの染色を行ない、本酵素が単一
バンドとなるまでに精製されていることを確認した。本
酵素のバンドはブロードになり、公知のタンナーゼ、例
えば、アスペルギルス・オリゼ由来の酵素と同様に、糖
鎖を有していることが確認された。分子量は約9〜10万
であった。また、本酵素液の一部をN-グリコシダーゼ
（グリコペプチダーゼＦ、タカラバイオ株式会社製）を
用いて処理し、糖鎖を除去したものを同様にＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動に供したものでは、ブロ
ードなバンドは消失し、代わって分子量約6万のシャー
プな単一バンドが確認された。このことより、糖鎖のつ
かない本酵素蛋白質のサブユニット分子量は約6万であ
ることが確認され、この分子量は、本発明中に開示した
遺伝子の配列から算出される大きさと一致していた。

【００７７】(4)タンナーゼの酵素化学的性質 本酵素と公知タンナーゼとの比較結果は、前記表１に示
す通りである。表１から明らかなように、本酵素は、至
適ｐＨ範囲がいずれの公知酵素よりも中性側にあり、中
性条件下で良好に作用する。至適温度は公知酵素が中温
域から上限60℃であるのに対し、60℃〜80℃と、顕著に
高温域で良好に作用する。安定ｐＨ範囲は酸性域から弱
アルカリ性に渡っており、広範囲である。そして、熱安
定性についても、65℃で82％、70℃で63％、75℃で18％
の活性を保持し、熱安定性に優れている。公知酵素はい
ずれも至適pHが弱酸性域にあり、本酵素が良好に作用す
る中性pH域での反応性は低い。

【００７８】アスペルギルス・オリゼ由来の酵素（酵素
Ａ）及びヨーロッパナラ由来の酵素（酵素Ｄ)の至適温
度は40℃及び35℃〜40℃である。これらは中温域で良好
に反応する一方、本酵素が良好に作用する高温域では反
応性が顕著に低い。同時に、このような高温では活性が
大きく低下するため、高温域では実用に供することがで
きない。

【００７９】アスペルギルス・アクレアタス由来の酵素
（酵素Ｂ）及びバチルス・リケニフォルミス由来の酵素
（酵素Ｃ）の至適温度は、やや高温域の50℃〜60℃にあ
り、アスペルギルス・オリゼ由来の酵素（酵素Ａ）ある
いはヨーロッパナラ由来の酵素（酵素Ｄ)よりは高温域
で使用することができる。しかし、茶飲料の熱抽出等に
想定される、より高温域での使用は困難である。最も熱
安定性の高いアスペルギルス・アクレアタス由来の酵素
（酵素Ｂ）の細胞内酵素も、70℃で活性の70％を失うた
めである。また、その他の公知酵素同様に、至適pHは弱
酸性域にあり、本酵素が良好に作用する中性pH域での反
応性は低く、中性域で使用したい場合には、多量の酵素
を使用しなければならない。更に重要なこととして、公
知の全ての酵素は中性域での安定性に問題があるため、
中性域で反応中に迅速に失活を起こし、目的の反応を完
了することができなくなる恐れを有している。

【００８０】上述のように本酵素は、至適pH及び至適温
度範囲が公知の各種タンナーゼと異なっていることか
ら、異なる用途、使用場面を提供し、特に公知酵素では
効果を上げにくかった中性条件及び高温条件下の使用に
おいて特に優れていることは明らかである。更に、本酵
素は、本酵素自身の至適pH及び至適温度範囲を外れた、
例えば、公知酵素の至適pHである弱酸性条件及び公知酵
素の至適温度範囲である中温域条件下においても、実用
上充分な活性を有しているという点で、従来、公知酵素
が用いられる場面においても、充分に使用可能である。

【００８１】例えば、本酵素は60℃〜80℃でほぼ100％
の活性を示すのに対し、40℃で50％、45℃で75％、50℃
で80％の活性を示す。これは、本酵素が中温域から高温
域まで広範な温度範囲で良好に反応できることを示す。
また、本酵素はpH7.0〜7.5で100％の活性を示すのに対
し、pH5.0でも38％、pH6.0では60％の活性を示す。これ
は、本酵素が弱酸性域においても実質的に良好に反応で
きることを示す。一方、公知のアスペルギルス・オリゼ
由来の酵素（酵素Ａ）では60℃以上で酵素活性はなく、
またpH7.0での活性は至適pH5.5の時の20％に過ぎない。
このことから、本酵素は、その汎用性においても、公知
酵素より優れている。即ち、これら各種の公知酵素に対
し、本酵素は、各種食品加工の実際の使用工程中に利用
するにあたり、優れている、また、公知酵素では好適に
使用できなかった新たな使用場面を提供するものと考え
られる。

【００８２】以上より、本酵素は、試薬あるいは食品加
工等の用途に利用する場合に、ｐＨ又は温度等の試験環
境が変化したときの影響を受けにくく、その取扱いが容
易で利用しやすいと考えられることから、公知のタンナ
ーゼよりも優れているといえる。更に、汎用性が高く、
公知のタンナーゼでは使用しにくかった新たな用途・使
用工程に対しでも好適に使用することができ、タンナー
ゼの実用化のバリエーション化に貢献するものであると
いえる。

【００８３】

【発明の効果】本発明により、熱安定性に優れ、高温・
中性域で良く反応するタンナーゼ及び該タンナーゼをコ
ードする遺伝子が提供され、また、本酵素を効率よく大
量に生産することができる。本酵素は熱安定性に優れ、
中性域でよく作用し、また高温下でよく作用するとい
う、新規な酵素化学的性質を有しているため、試薬、食
品加工を始めとする各種産業分野において好適に使用で
きる。

【００８４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology National Institute of Technology and Evaluation National Research Institute of Brewing <120> A TANNASE,A TANNASE GENE AND A PROCESS FOR PRODUCING TANNASE <130> P02-0650 <150> JP 2001-403261 <151> 2001-12-27 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 573 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae RIB 40 <400> 1 Met Arg Ser Ala Leu Asn Ile Leu Ala Gly Ala Ala Thr Leu Thr Val 1 5 10 15 Ala Gln Ala Ala Ser Leu Ser Asp Val Cys Thr Asn Ser His Val Lys 20 25 30 Ser Ala Leu Pro Ser Ile Asp Leu Ile Asn Gly Leu Val Ile Asp Pro 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Thr Asn Ala Val Tyr Asn Ala Ser Thr Pro Gly Gly 50 55 60 Asp Tyr Phe Pro Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Phe Cys Asn Val Thr Leu 65 70 75 80 Thr Tyr Ala His Pro Gly Arg Asn Asp Arg Val His Leu Lys Leu Trp 85 90 95 Met Pro Ala Pro Asp Gln Phe Gln Asn Arg Trp Leu Ser Thr Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Phe Ala Ile Asn His Asp Glu Gln Gln Leu Pro Gly Gly Val 115 120 125 Gln Tyr Gly Ala Ala Ala Gly Ile Thr Asp Gly Gly Phe Gly Ser Phe 130 135 140 Tyr Thr Gln Phe Asp Gln Val Phe Leu Leu Ala Asn Gly Thr Ile Asn 145 150 155 160 Tyr Glu Ala Leu Tyr Met Phe Gly Tyr Gln Ala His His Glu Leu Ser 165 170 175 Val Ile Gly Lys Ala Leu Thr Lys Asn Phe Tyr Gly Thr Gly Asp Ala 180 185 190 Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Gln Gly Cys Ser Glu Gly Gly Arg Glu Gly 195 200 205 Phe Ser Gln Val Gln Arg Phe Gln Glu Phe Asp Gly Ala Val Ile Gly 210 215 220 Ala Pro Ala Leu Arg Tyr Gly Gln Gln Gln Ala Asn His Leu Tyr Gly 225 230 235 240 Asn Leu Val Glu His Thr Leu Lys Tyr Tyr Pro Pro Pro Cys Glu Leu 245 250 255 Glu Lys Ile Val Asn Leu Thr Ile Thr Ala Cys Asp Arg Leu Asp Gly 260 265 270 Arg Ser Asp Gly Val Val Ser Arg Thr Asp Leu Cys Lys Leu His Phe 275 280 285 Asn Ile Asn Ser Thr Ile Gly Ala Pro Tyr Ser Cys Pro Ala Ser Thr 290 295 300 Thr Thr Thr Gly Thr Thr Pro Ala Gln Asn Gly Thr Val Ser Ala Leu 305 310 315 320 Gly Ala Ala Ala Ala Arg Lys Met Leu Asp Gly Leu Arg Thr Leu Asp 325 330 335 Ser Arg Arg Ala Tyr Ile Phe Tyr Gln Pro Ser Ala Thr Phe Asp Asp 340 345 350 Ala Gln Thr Lys Tyr Asn Pro Glu Thr Lys Gln Phe Glu Leu Glu Val 355 360 365 Ser Ala Tyr Ala Ala Glu Trp Ile Pro Arg Phe Leu Gln Leu Gln Asn 370 375 380 Tyr Thr Leu Ser Ser Leu Glu Asn Val Thr Tyr Asp Thr Leu Lys Asp 385 390 395 400 Trp Met Glu Leu Gly Trp Gln Arg Tyr Glu Asp Val Leu Gln Thr Thr 405 410 415 Trp Pro Asp Leu Thr Pro Phe Gln Ser Ala Gly Gly Lys Val Leu His 420 425 430 Tyr His Gly Glu Ser Asp Pro Ser Ile Pro Ala Gly Ser Ser Val His 435 440 445 Tyr His Glu Ser Val Arg Lys Thr Met Tyr Pro Asn Met Ser Phe Asn 450 455 460 Glu Ser Asn Gln Ala Leu Asn Glu Trp Asn Arg Leu Phe Leu Val Pro 465 470 475 480 Gly Ala Ala His Cys Ala Ser Ser Thr Asp Gln Pro Asn Gly Pro Phe 485 490 495 Pro Gln Ala Thr Leu Lys Thr Leu Ile Glu Trp Val Glu Asn Ser Ile 500 505 510 Val Pro Glu Thr Leu Asn Gly Thr Val Leu Asp Gly Asp His Lys Gly 515 520 525 Glu Gln Gln Gln Ile Cys Ala Trp Pro Leu Arg Pro Leu Trp Thr Glu 530 535 540 Asn Gly Thr Val Met Asn Cys Val Tyr Asp Gln Ala Ser Leu Asp Thr 545 550 555 560 Trp Asp Tyr Glu Phe Asp Ala Tyr Arg Ile Pro Leu Tyr 565 570 <210> 2 <211> 1754 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae RIB 40 <400> 2 tctctcgaat aaaaatgagg tcggcgctaa acatcctcgc gggagcagcc actctcacag 60 tggcacaggc tgctagcctt agcgatgttt gcacgaacag ccatgtcaag tcggctctgc 120 cctccattga cctcatcaat ggtcttgtaa ttgatccatc ttctattacc accaatgccg 180 tctacaatgc ttccaccccc ggaggtgact acttcccagc agcatccgcc tatgatttct 240 gcaacgtgac tctcacgtac gcccaccctg gacgcaatga tcgagttcat cttaaattat 300 ggatgccagc tccagaccag ttccaaaacc ggtggctatc cactggtgga ggtggttttg 360 cgatcaatca cgacgaacag cagcttccgg gtggtgttca atatggcgcc gcggctggca 420 tcactgacgg aggtttcggc agcttttaca cccagtttga ccaagtattc ctgctggcca 480 atggcacgat caactatgaa gcactttata tgtttggcta ccaggcgcac catgagctga 540 gtgtcatcgg aaaggctttg acaaagaact tttatggcac gggagacgca aaactgtatg 600 cctattggca gggatgctcc gagggtggtc gcgagggatt cagccaggtg cagcgatttc 660 aggagttcga cggcgcagtg atcggcgccc ctgcccttcg gtatggccaa caacaggcca 720 accatctgta tggaaacttg gttgagcata cactcaagta ctaccctccg ccctgtgaat 780 tggagaagat cgttaatttg accattacgg catgcgatcg cctggatgga aggtcggacg 840 gtgtggtgtc gcggaccgac ctgtgcaagc tgcatttcaa tatcaattca acgattggag 900 caccctactc ctgcccagcc tcaacgacaa caactggtac aaccccggcg cagaacggaa 960 ccgtgtctgc gctcggtgca gcagcagcca ggaagatgtt agatggcctt cgcacccttg 1020 acagccgtcg ggcctatatc ttctaccagc cttccgccac cttcgatgat gcgcaaacga 1080 aatataaccc cgaaaccaag caattcgaac tcgaggtctc tgcctatgcc gccgaatgga 1140 tcccccgctt cctgcagcta cagaattaca ctctatcttc cctggaaaac gtaacatacg 1200 acaccttaaa agactggatg gaacttggat ggcagcgcta cgaagacgtc ctgcagacca 1260 catggcccga tttaactcct ttccagtccg cgggtggaaa ggtgcttcac taccatggtg 1320 aatcggatcc aagtattccg gctggatcct cggtacacta tcatgagtct gttcgtaaga 1380 ctatgtaccc caacatgtct ttcaacgaaa gtaaccaggc gttgaatgag tggaaccgct 1440 tattcttggt ccccggcgcc gcgcactgcg cctccagtac cgatcaaccc aatggcccct 1500 tcccccaggc aactctcaag acgctcatcg aatgggtcga aaatagtatt gttccagaaa 1560 ctttgaatgg tacggtgctg gacggtgatc acaagggtga acagcagcag atctgcgctt 1620 ggcccttgcg tcccttatgg acagagaacg gcaccgttat gaactgtgtg tacgaccagg 1680 cttccttgga cacctgggac tatgaatttg atgcctatcg cattcctcta tactaaaagg 1740 aatgtcatgt cata 1754 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Aspergillus oryzae RIB 40 <400> 3 cttggaattc tctcgaataa aaatgagg 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Aspergillus oryzae RIB 40 <400> 4 ctaaataccc gggctatgac atgacattc 29

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の至適pH範囲を示す図。

【図２】本酵素の安定pH範囲を示す図。

【図３】本酵素の至適温度範囲を示す図。

【図４】本酵素の熱安定性範囲を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 町田 雅之 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所 つくばセンター内 (72)発明者 阿部 敬悦 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所 つくばセンター内 (72)発明者 五味 勝也 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所 つくばセンター内 (72)発明者 浅井 潔 東京都江東区青海２−41−６ 独立行政法 人産業技術総合研究所 臨海副都心センタ ー内 (72)発明者 佐野 元昭 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所 つくばセンター内 (72)発明者 金 大心 東京都江東区青海２−41−６ 独立行政法 人産業技術総合研究所 臨海副都心センタ ー内 (72)発明者 長崎 英樹 東京都江東区青海２−41−６ 独立行政法 人産業技術総合研究所 臨海副都心センタ ー内 (72)発明者 細山 哲 東京都渋谷区西原２−49−10 独立行政法 人製品評価技術基盤機構内 (72)発明者 秋田 修 広島県東広島市鏡山三丁目７番１号 独立 行政法人酒類総合研究所内 (72)発明者 小笠原 直毅 奈良県生駒市高山町8916−５ 奈良先端科 学技術大学大学院 バイオサイエンス研究 科内 (72)発明者 久原 哲 福岡県福岡市東区箱崎６−10−１ 九州大 学農学研究院 遺伝子資源工学部門内 (72)発明者 荒井 あゆみ 千葉県野田市野田250番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 小山 泰二 千葉県野田市野田250番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 畑本 修 千葉県野田市野田399番地 財団法人 野 田産業科学研究所内 (72)発明者 増田 力 千葉県野田市野田399番地 財団法人 野 田産業科学研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA11 BA11 CA04 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 GA11 HA03 4B050 CC01 CC03 DD03 FF04 FF09 FF11 FF12 FF14 LL02 LL03

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)又は(b)のタンナーゼ活性を有
   する蛋白質。 (a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質 (b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1もしく
   は複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたア
   ミノ酸配列からなる蛋白質
2. 【請求項２】 配列番号1で表されるアミノ酸配列と65
   ％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有する蛋白質
   であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質。
3. 【請求項３】 下記の理化学的性質を有し、タンナーゼ
   活性を有する蛋白質。 i）作用：タンニン酸等のデプシド結合を有するタンニ
   ンを加水分解する。 ii）至適pH及び安定pH範囲：至適pHはpH7.0〜pH7.5であ
   り、安定pH範囲は30℃、80分間処理でpH2.5〜pH7.5であ
   る。 iii）熱安定性：クエン酸緩衝液（pH5.5）中、65℃で10
   分間処理後の残存活性は80％以上である。 iv）至適温度範囲：クエン酸緩衝液（pH5.5）中、60℃
   〜80℃である。
4. 【請求項４】 請求項１、２又は３に記載のタンナーゼ
   活性を有する蛋白質生産能を有する微生物を培地に培養
   し、得られる培養物からタンナーゼを採取することを特
   徴とする前記蛋白質の製造法。
5. 【請求項５】 以下の(a)又は(b)のタンナーゼ活性を有
   する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子。 (a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質 (b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1もしく
   は複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたア
   ミノ酸配列からなる蛋白質
6. 【請求項６】 配列番号1で表されるアミノ酸配列と65
   ％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有する蛋白質
   であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードす
   るタンナーゼ遺伝子。
7. 【請求項７】 以下の(a)又は(b)のＤＮＡからなるタン
   ナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝
   子。 (a)配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ (b)配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相
   補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条
   件下でハイブリダイズし、かつタンナーゼ活性を有する
   蛋白質をコードするＤＮＡ
8. 【請求項８】 請求項５、６又は７記載のタンナーゼ遺
   伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮ
   Ａ。
9. 【請求項９】 アスペルギルス属に属し、請求項８記載
   の組み換え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、
   得られる培養物からタンナーゼ活性を有する蛋白質を採
   取することを特徴とする前記蛋白質の製造法。