WO2007043330A1 - 組換えタンパクの製造方法 - Google Patents

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WO2007043330A1
WO2007043330A1 PCT/JP2006/319028 JP2006319028W WO2007043330A1 WO 2007043330 A1 WO2007043330 A1 WO 2007043330A1 JP 2006319028 W JP2006319028 W JP 2006319028W WO 2007043330 A1 WO2007043330 A1 WO 2007043330A1
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culture
recombinant protein
koji mold
recombinant
enzyme
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PCT/JP2006/319028
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Hiroshi Shoji
Toshikazu Sugimoto
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Asahi Breweries, Ltd.
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    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a recombinant protein, and more particularly to a method for producing a recombinant protein using a koji mold as a host.
  • Persimmon has long been used as an enzyme source when producing fermented foods and drinks.
  • koji used in the production of this fermented food or drink
  • Solid koji is obtained by a traditional production method, but is not suitable for large-scale production because of its special culture form, solid culture.
  • liquid koji which is a koji mold culture obtained by liquid culture of koji mold, can be said to be a culture form suitable for efficient production because of easy culture control.
  • Non-Patent Document 6 an example of successful production of recombinant protein by Aspergillus oryzae by solid culture using wheat bran has been reported (see Non-Patent Document 6). However, since it is a special culture form called solid culture, it can be said that it is not suitable for large-scale production.
  • liquid culture is not suitable for mass production of recombinant proteins because the amount of protein produced outside the cells is small as described above.
  • Non-Patent Document 1 Hata Y. et. A1 .: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997)
  • Non-Patent Document 2 Hata Y. et. Al .: Gene., 207, 127-134 (1998)
  • Non-Patent Document 3 Ishida H. et. Al .: J. Ferment. Bioeng "86, 301-307 (1998)
  • Non-Patent Document 4 Ishida H. et. Al: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000)
  • Non-Patent Document 5 RJ Gouka et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 47, 1-11, (1997)
  • Non-Patent Document 6 K. Tsuchiya et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 895-899 (1994) Invention Disclosure of
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a large amount of a recombinant protein by a liquid culture method using koji mold as a host, which has been considered to be unsuitable for the production of a recombinant protein. Is to provide.
  • the present inventors have already made a method for producing a liquid koji having a sufficient amount of enzyme activity (Japanese Patent Application Nos. 2004-350661, 2004-352320, 2004-352324, 2004-378453, 2005-29 0648, And JP 2003-265165 A). These methods suppress the release of nutrients derived from the raw material into the culture system by using a raw material in which all or part of the surface is at least covered with husks, and consequently are necessary. To obtain a good enzymatic activity, especially a protease, cellulose-degrading enzyme and proteolytic enzyme. According to these methods, a higher enzyme activity can be obtained than when liquid culture is performed using barley and polished rice as raw materials for shochu. As the koji mold, white koji mold, black koji mold, yellow koji mold, and koji mold can be used.
  • the transcription amount of the gene encoding an enzyme that is subject to catabolite repression increases due to the concentration of nutrients such as sugars and amino acids, and the product derived from these genes (the enzyme) is released outside the koji mold. It is speculated that it can be secreted.
  • a recombinant gonococcus was prepared by linking a gene encoding a target protein under the promoter of a gene encoding an enzyme that is subject to catabolite repression by nutrient concentrations such as sugar and amino acid, and incorporating the gene into the gonococcus. It is considered that the target recombinant protein is produced at a high yield by culturing according to the liquid koji production method.
  • the present invention according to claim 1 is a method for producing a recombinant protein using a recombinant koji mold obtained by transforming koji mold as a host.
  • Beans and / or potatoes whose surface is covered with an outer shell; Amaranthus and Z or quinua force without pretreatment such as comminution and pulverization Contains at least one selected as a culture raw material
  • the recombinant gonococcus is cultured in a liquid medium, and the recombinant protein is collected from the culture.
  • the recombinant koji mold has a gene encoding a target protein linked downstream of a promoter of a gene encoding an enzyme that is subjected to force tabolite suppression by nutrient concentrations such as sugars and amino acids.
  • the present invention according to claim 3 is the method for producing a recombinant protein according to claim 2, wherein the promoter is a promoter of a gene encoding any one of amylolytic enzyme, cellulolytic enzyme, and proteolytic enzyme. is there.
  • Neisseria gonorrhoeae grows easily, can be prepared at low cost, and does not require special culture equipment.
  • aspergillus has long been used to produce fermented foods and drinks. Because it is used, it is a safe host.
  • liquid culture of Aspergillus can be controlled more strictly than solid culture, it is a culture form suitable for efficient production!
  • the liquid medium according to the present invention comprises a cereal whose surface is entirely or partially covered with husk; beans and Z or moss whose surface is covered with husk; and pretreatment such as comminution and grinding. Do not use amaranth and Z or quinua force. Use at least one selected as a culture raw material.
  • cereals used as a culture raw material include barley, rice, wheat, buckwheat, green
  • the form of these culture raw materials requires that all or a part of the surface be covered with at least the husk, and that unfinished product or at least the husk remains on the surface of the grain. More than the whitening ratio that has been refined to the extent can be used, and brown rice, brown wheat, etc. can also be used. In addition, in the case of rice, not only brown rice, but also rice husks may be attached, or rice husks may be part of the rice.
  • the unpolished milling rate is 100%, or the unpolished milling rate is 100%, and the unmilled milling rate (100%) is used to determine the barley grain ratio (general The ratio is less than 7-8%), that is, more than 92 to 93% of the milling rate.
  • the milling rate refers to the proportion of cereals that remain after milling the cereals.
  • the milling rate of 90% means that 10% of the skin of the surface layer of the cereals is scraped off.
  • the unpolished barley is one that has been refined to such an extent that the unmilled wheat power husk remains on the surface of the grain, and includes those having a milling ratio of 90% or more.
  • the husk is the outer part of the grain that covers the surface of the grain.
  • the beans and straws used as the culture raw material include soybeans, red beans, and satsuma. Imo and the like. These culture raw materials are used for the preparation of a liquid medium in a state in which they are completely covered with the outer skin without being subjected to any processing such as cutting and pulverization, only by washing away the dirt on the outer skin.
  • heating or freezing treatment can be carried out while keeping the outer shell of beans or moss as the culture raw material.
  • amaranth used as a culture raw material is a general term for a plant belonging to the genus Huaceae, and in cereals, the content of lysine, which is one of amino acids having a high protein content, is comparable to that of soybean.
  • lysine which is one of amino acids having a high protein content
  • it is a high nutritional value grain that contains more calcium, iron, and fiber than polished rice, and its country of origin is a specific region in Latin America, India, Himalayas, and Nepal.
  • Quinua is an annual plant of the Agatha family and is cultivated mainly in the highlands of southern Peru and the Andes Mountains of western Peru and is rich in minerals, vitamins, proteins and dietary fiber.
  • the culture materials amaranth and quinua may be used alone or in combination. These are used for the preparation of liquid media without pretreatment such as comminution or grinding.
  • the above-mentioned culture raw materials are used alone or in combination of two or more for the preparation of the following liquid medium. That is, the above culture raw material is mixed with water to prepare a liquid medium. The mixing ratio of the raw materials is adjusted so that the target recombinant protein is selectively produced and accumulated in the koji mold culture.
  • barley when barley is used as a culture raw material, it is prepared in a liquid medium supplemented with 1-20% (wZvol) of barley with respect to water.
  • wZvol liquid medium supplemented with 8 to 10% (w / vol)
  • unpolished barley it is more preferable that it is prepared in a liquid medium supplemented with 8 to 10% (w / vol), and when 95% polished barley is used as a raw material.
  • brown rice excluding rice husks is used as a culture raw material, 1-20%, preferably 5-13%, more preferably 8-10% (both wZvol) of brown rice is added to water.
  • 1-20% when brown rice excluding rice husks is used as a culture raw material, 1-20%, preferably 5-13%, more preferably 8-10% (both wZvol) of brown rice is added to water.
  • beans When beans are used as a culture raw material, the beans are added in an amount of 1 to 10%, preferably 8 to 10% for soybeans and 1 to 2% for red beans (both wZvol). Prepared in a chilled liquid medium It is. In addition, when moss is used as a culture raw material, it is prepared in a liquid medium containing moss 1 to 10% (wZvol) to water.
  • amaranth when used as a culture raw material, it is added to 1.5 to 15%, preferably 2 to 10%, more preferably 2 to 8% (both wZvol) with respect to water. Prepared in a concentrated liquid medium. On the other hand, in the case of quinua, it is prepared in a liquid medium supplemented with 1.5 to 7%, preferably 2 to 6%, more preferably 2 to 4% (V, deviation is wZvol) with respect to water.
  • the optimum blending amount varies depending on the degree of whitening and type of the culture raw material used, the host strain and promoter used, the recombinant protein to be produced, etc., and may be appropriately selected.
  • the amount of culture raw material used exceeds the upper limit, the viscosity of the culture solution becomes high, the supply of oxygen and air necessary for aerobic cultivation of the recombinant koji mold becomes insufficient, and the oxygen concentration in the culture becomes low. It is not preferable because it decreases and culture becomes difficult to proceed. On the other hand, if the amount of the raw material used is less than the lower limit, the target recombinant protein will not be produced at a high rate.
  • the starch contained in the culture raw material may be gelatinized in advance before the culture.
  • the gelatinization method of the starch is not particularly limited and may be performed according to conventional methods such as a steaming method and a roasting method. In the liquid medium sterilization process described later, when heating to a temperature higher than the gelatinization temperature of starch by high-temperature high-pressure sterilization or the like, starch is gelatinized at the same time by this treatment.
  • nitrate and phosphate in combination, and more preferably, sulfate is used in combination with these.
  • sodium nitrate, potassium nitrate, or the like can be used as the nitrate, and potassium nitrate is particularly preferable.
  • potassium dihydrogen phosphate As the phosphate, potassium dihydrogen phosphate, ammonium phosphate or the like can be used, and potassium dihydrogen phosphate is particularly preferable.
  • potassium dihydrogen phosphate As sulfate, magnesium sulfate heptahydrate, iron sulfate heptahydrate, ammonium sulfate etc. can be used, especially magnesium sulfate heptahydrate Iron sulfate heptahydrate is preferred.
  • These inorganic salts can be used in combination of a plurality of types.
  • the concentration of the inorganic salt in the liquid medium in the case of using the above-described white koji mold or black koji mold is adjusted to such a level that the desired recombinant protein is selectively produced and accumulated in the koji mold culture. Is done. Specifically, 0.1 to 2.0% in the case of nitrate, preferably 0.2 to 1.5%, 0.05 to in the case of phosphate: L 0%, preferably 0.1 to 0.5%, and in the case of sulfate, 0.01 to 0.5%, preferably 0.02 to 0.1%.
  • nitrate, phosphate, and sulfate when using Aspergillus oryzae or Aspergillus sojae, it is preferable to use nitrate, phosphate, and sulfate together in a liquid medium.
  • sodium nitrate, potassium nitrate or the like can be used as the nitrate, and sodium nitrate is particularly preferable.
  • phosphate potassium dihydrogen phosphate, ammonium phosphate or the like can be used, and potassium dihydrogen phosphate is particularly preferable.
  • magnesium sulfate heptahydrate, iron sulfate heptahydrate, ammonium sulfate and the like can be used, and magnesium sulfate heptahydrate and iron sulfate heptahydrate are particularly preferable.
  • These inorganic salts can also be used in combination of multiple types.
  • the concentration of the inorganic salts in the liquid medium in the case of using the yellow koji mold is adjusted so that the target recombinant protein is selectively produced and accumulated in the koji mold culture. . Specifically, 0.1 to 2.0% in the case of nitrate, preferably 0.2 to 1.5%, 0.05 to 0% in the case of phosphate, preferably 0.1. To 0.5%, and in the case of sulfate, 0.01 to 0.5%, preferably 0.02 to 0.1%.
  • organic substances other than the above-mentioned inorganic salts, inorganic salts, and the like can be appropriately added as nutrient sources.
  • These additives are not particularly limited as long as they are generally used for culturing koji mold, but organic substances include rice bran, wheat straw, corn steep liquor, soybean meal, defatted soybean, etc., and inorganic salts.
  • Water-soluble compounds such as ammonium salt, strong rhodium salt, calcium salt and magnesium salt can be mentioned, and two or more kinds of organic substances and Z or inorganic salts may be used simultaneously.
  • the amount of these additives is not particularly limited as long as it promotes the growth of recombinant gonococci, but is about 0.1-5% (w / vol) for organic substances and 0.1-1% (for inorganic salts) It is preferable to add about w / vol) If these nutrient sources are added in excess of the upper limit, the growth of the recombinant koji mold is inhibited, which is not preferable. In addition, when the addition amount is less than the lower limit, the target recombinant tank is not mass-produced, which is also preferable.
  • the liquid medium obtained in this manner is not particularly limited in the treatment method in which sterilization treatment may be performed as necessary.
  • An example is the high-temperature and high-pressure sterilization method, which can be performed at 121 ° C for 15 minutes.
  • the recombinant koji mold After cooling the sterilized liquid medium to the culture temperature, the recombinant koji mold is inoculated into the liquid medium.
  • the recombinant koji mold in the present invention is obtained by transforming koji mold as a host and can be cultured by the culture method described later using the above liquid medium.
  • the host gonococcus used as a host is not particularly limited as long as it produces an enzyme that can be inhibited by catabolite depending on the concentration of nutrients such as sugars and amino acids.
  • Aspergillus kawachii Aspergillus niger and Aspergillus sojae Aspergillus sojae. Aspergillus niger and Aspergillus sojae.
  • the recombinant gonococcus of the present invention is obtained by introducing a gene encoding a target protein downstream of a promoter into a host gonococcus.
  • the promoter used in the present invention is preferably a promoter of an enzyme that is highly produced outside the gonococcal bacterium as long as it can express a downstream gene in the host gonococcus. More preferably, a promoter of a gene encoding an enzyme that is subject to catabolite suppression by the concentration of nutrients such as sugars and amino acids is used.
  • dalcoamylase GaA, GlaB
  • starch-degrading enzymes such as amylase (AmyB)
  • cellulose-degrading enzymes such as glucanase (EglA)
  • protein-degrading enzymes such as acidic protease (P mark A).
  • promoters of genes encoding enzymes such as
  • the recombinant koji mold is cultured using the culture raw material described above, it takes time to decompose nutrients such as sugar and amino acid in the raw material, and the release rate of the nutrient into the culture system is suppressed. To prevent catabolites from being controlled by these nutrient concentrations.
  • the promoter of the gene encoding the target enzyme is activated, the amount of transcription of the gene encoding the target tank downstream thereof is increased, and large-scale production of the target recombinant protein becomes possible. .
  • the gene encoding the target protein may be cDNA or chromosomal DNA as long as it can be expressed in the host koji mold.
  • a protein includes a glycoprotein.
  • the gene encoding the target protein is not limited to a gonococcus-derived gene, and genes derived from other species can be used as long as they are suitable for recombinant protein production using gonococcus as a host.
  • a terminator, a selection marker, or the like linked thereto can be introduced into the filamentous and koji mold of the present invention, if necessary.
  • the terminator it is preferable to use a terminator of an enzyme that is highly produced outside the koji mold as long as it functions in the koji mold of the host.
  • the transformation of a host into a koji mold is performed by a method of introducing a plasmid vector into a protoplast-infected host in the presence of PEG (Unkles et al., Mol. Gen. Genet., 218, 99- 104 (1989)).
  • Any plasmid suitable for the host koji mold may be used as the vector.
  • pPTRIDNA pPTRIIDNA (Takara Bio Inc.), etc., depending on the purpose, it is not limited to these.
  • the purified gene encoding the target protein is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and an appropriate restriction enzyme site of the vector DNA is obtained.
  • an appropriate restriction enzyme site of the vector DNA is obtained.
  • a known method such as a method of linking to a vector by inserting into a multicloning site is employed.
  • the recombinant gonococci obtained as described above can be used either in a culture with one kind of strain or in a mixed culture with two or more kinds of the same or different strains. These are vesicles There is no problem with using either mycelia or mycelium obtained by preculture, but it is preferable to use mycelia because the time required for the logarithmic growth phase is shortened. There is no particular limitation on the amount of recombinant gonococcus inoculated into the liquid medium, but if the spore is 1 X 10 4 ⁇ : LX 10 6 per ml of liquid medium, the preculture is 0 for mycelia. It is preferable to inoculate 1-10%.
  • the culture temperature of the recombinant koji mold is not particularly limited as long as it does not affect the growth, and is preferably 25 to 45 ° C, more preferably 30 to 40 ° C. If the culture temperature is low, the growth of the recombinant gonococcus is slowed, and contamination with bacteria is likely to occur.
  • the enzyme activity can be enhanced by controlling the culture temperature in accordance with the growth phase of koji mold.
  • the cell growth period from 12 to 36 hours after the start of culture is 25 to 35 ° C, preferably 28 to 33 ° C, and the subsequent enzyme production period is 35 to 45 ° C, preferably What is necessary is just to maintain at 37-42 degreeC.
  • the culture apparatus is not limited as long as it can perform liquid culture. However, since Neisseria gonorrhoeae needs to perform aerobic culture, it must be performed under aerobic conditions in which oxygen and air can be supplied into the medium. There is. Further, during the cultivation, it is preferable to stir so that the raw material, oxygen, and recombinant koji mold in the medium are uniformly distributed in the apparatus.
  • the stirring conditions and aeration amount may be appropriately selected depending on the culture apparatus, the viscosity of the medium, etc., as long as the culture environment can be maintained aerobically.
  • the target recombinant protein is highly produced in the culture.
  • the recombinant protein is then collected from the obtained koji mold culture.
  • a known technique may be used as the collection method.
  • the culture supernatant obtained by filtering, centrifuging, or the like of the culture is subjected to adsorption resin, electrophoresis, etc. as necessary. Methods of concentration and purification can be employed.
  • Example 1 Method for producing a recombinant protein using yellow koji mold as a host) (Preparation of medium)
  • composition of the liquid medium for jaundice is 98% refined barley (Australian Stirling) 2.0%, sodium nitrate 1.2%, potassium salt potassium 0.8%, potassium dihydrogen phosphate 0.4%, sulfuric acid Magnesium heptahydrate 0.2%, iron sulfate heptahydrate 0.08% (wZvol).
  • DPY medium (dextrin 2%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, potassium dihydrogen phosphate 0.5%, magnesium sulfate 0.05% (all wZvol)) was used. 20 ml of each medium was placed in an Erlenmeyer flask with ⁇ baffle and autoclaved at 121 ° C for 15 minutes.
  • a glycoprotein Der 11 which is a major allergen of Dermatoph agoides farinae using aspergillus' Olyse nitrate-utilizing mutant niaD 300 as a host by the method described in JP-A-11-75840.
  • Der fl E (-l) K H. Shoji et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61 (10), 1668), which is a DNA fragment in which the glutamic acid codon at the end is changed to a lysine codon.
  • the glaA promoter power derived from Aspergillus oryzae is linked upstream of Der fl E (-1) K DNA and the amyB terminator derived from Aspergillus oryzae is linked downstream!
  • the obtained reaction solution is passed through a strong anion exchange column (trade name: QMA, Waters) equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 6.0). Existing ⁇ -amylase was adsorbed.
  • the obtained concentrate was directly charged to a DEAE-Sephacel column (Amersham Biosciences) equilibrated with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), and 3 times the amount of 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) was added. ). Subsequently, the mature recombinant protein Der fl E (-1) K adsorbed on the column was eluted with a NaCl concentration gradient. Fractions containing the mature recombinant protein Der fl E (-1) K were detected by Western analysis using anti-Der ⁇ antibody, and high-purity fractions were collected and used as purified samples. The purity was 90% or more on SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis).
  • Protein quantification of the purified sample was performed using BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce).
  • the sugar chain of recombinant protein Der fl E (-1) K was different from that of natural Der fl, but recombinant protein Der fl E (-1) K and natural Der fl are equivalent. IgE binding ability and skin stimulating activity. Therefore, the recombinant protein can be used as an alternative to natural Der11 for antibody production and allergy treatment.
  • the composition of the medium was 98% refined barley (Australian Stirling) 2.0%, potassium nitrate 0.2%, potassium dihydrogen phosphate 0.3% (all wZvol). 100 ml of this medium was put in a Erlenmeyer flask equipped with a 500 ⁇ baffle and sterilized by autoturve at 121 ° C for 15 minutes. About 10 6 conidia of Aspergillus kawachii NBRC4308 were inoculated into 100 ml of the medium obtained above, and cultured with shaking at 37 ° C for 18 hours at lOOrpm.
  • the medium composition and culture conditions were the same as above except that 65% refined barley or 98% refined barley was used instead of 98% refined barley. Culture was performed.
  • TotalRNA preparation> The cells after completion of the culture were quickly collected and sufficiently pulverized in the presence of liquid nitrogen. From the crushed rods, otalRNA was prepared according to the protocol using a totalRNA extraction kit (RNeasy Plant mini kit, manufactured by QIAG EN).
  • cDNA was synthesized using the High-capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) according to the protocol.
  • ⁇ Quantitative real-time PCR> Using the obtained cDNA as a template, quantitative real-time PCR was performed using primers designed based on the base sequence of the target enzyme gene described below to quantify the expression level of the enzyme gene.
  • the primer used for quantitative real-time PCR was designed using Primer Express software (Applied Biosystems). Specific primer sequences are as follows. As an internal standard for comparative quantification, the H2A gene encoding histone was used.
  • gnorecore mirase gla-1 from Aspergillus kawachii: GenBank, Accession No. D0042 7)
  • This primer pair is designed to amplify the 1589th to 1780th most powerful DNA fragment in the above gla-1 (GenBank, Accession No. D00427).
  • Acid-resistant ' ⁇ -Amira A-ITasaA (derived from Aspergillus kawachii: GenBank, Accession No. A B008370)
  • Renoose primer 1044-gaatgtacctcatggtcgacgtc (SEQ ID NO: 4)
  • This primer pair is designed to amplify the 994th to 1066th strongest DNA fragment of the above asaA (GenBank, Accession No. AB008370).
  • This primer pair was designed to amplify the 1874th to 2009th strongest DNA fragment of the above amyA (GenBank, Accession No. AB109452).
  • Histone H2 A (derived from Aspergillus niger: GenBank, Accession No. Y15320) Forward primer; 289-actgaacaagctcctgggtca (SEQ ID NO: 7)
  • This primer pair was designed to amplify the 289th to 340th most powerful DNA fragment in the above H2A (GenBank, Accession No. Y15320).
  • the present invention (98% white wheat) 8.49
  • the present invention (98% white wheat) 2.89
  • the present invention (98% white wheat) 23.86
  • amyA Control 1 (98% polished white wheat ground product) 17.65
  • Aspergillus awamori NBRC4388 was cultured in the same manner as in Experimental Example 1. Thereafter, in the same manner as in Experimental Example 1, total RNA was extracted from the cells after completion of the culture, and cDNA was synthesized. Furthermore, using the obtained cDNA as a template, the expression level of the following target enzyme gene was quantified in the same manner as in Experimental Example 1.
  • the primer sequences used for quantitative real-time PCR are as follows.
  • Acidic protease pepA (derived from Aspergillus awamori: GenBank, Accession No. M3 4454)
  • This primer pair is designed to amplify the 793th to 920th DNA fragment of pepA (GenBank, Accession No. M34454).
  • the composition of the medium is 98% refined barley (Australian Stirling) 2.0%, sodium nitrate 1.2%, potassium salt potassium 0.8%, potassium dihydrogen phosphate 0.4%, mug sulfate Nesym heptahydrate 0.2%, iron sulfate heptahydrate 0.08% (both wZvol).
  • 100 ml of this medium was put in a Erlenmeyer flask equipped with a 500 ⁇ baffle and sterilized by autoturve at 121 ° C for 15 minutes.
  • About 10 6 conidia of Aspergillus oryzae RIB40 were inoculated into 100 ml of the medium obtained above and cultured with shaking at 30 ° C. for 42 hours at lOOrpm.
  • the medium composition and culture conditions were the same as above except that 65% refined barley or 98% refined barley was used instead of 98% refined barley. Culture was performed.
  • RNA was extracted from the cells after completion of the culture, and cDNA was synthesized. Furthermore, using the obtained cDNA as a template, the expression level of the following target enzyme gene was quantified in the same manner as in Experimental Example 1.
  • the primer sequences used for quantitative real-time PCR are as follows. The H4 gene encoding histone was used as an internal standard for comparative quantification.
  • gnorecore mirase glaA (derived from Aspergillus oryzae: GenBank, Accession No. D01035)
  • ⁇ -amylase amyA (derived from Aspergillus oryzae: GenBank, Accession No. AB02187 6)
  • Ginose primer 21875-gttacaccaacgacatagccctc ( ⁇ ⁇ ⁇ lj # 14)
  • This primer pair was designed to amplify the 21762th to 21897th strongest DNA fragment of the above amyA (GenBank, Accession No. AB021876).
  • Rinose primer 1187- tgaagacggagagaactattccat g (No. 16)
  • This primer pair was designed to amplify the 1137th to 121st first DNA fragment of the above-mentioned celB (GenBank, Accession No. D83732).
  • Acidic protease pepA (derived from Aspergillus oryzae: GenBank, Accession No. D 138 94)
  • Rinous primer 958— gctttcagctcgatcaacactg (Guide [J number 18)
  • This primer pair was designed to amplify the 897th to 979th strongest DNA fragment of the above pepA (GenBank, Accession No. D13894).
  • Histone H4 (derived from Aspergillus oryzae: GenBank, Accession No AB033943) Forward primer; 110-cgtgacaacatccagggtatca (SEQ ID NO: 19)
  • Reverse primer 171- tcaagcgtatctctgccatga (SEQ ID NO: 20)
  • This primer pair is designed to amplify the 110th to 191st strongest DNA fragments of the above H4 (GenBank, Accession No AB033943).
  • Neisseria gonorrhoeae has a low culture medium and does not require a special culture apparatus, so that a desired protein can be produced at low cost.
  • Koji molds that have been used for the production of fermented foods and drinks for a long time are highly likely to be used for various purposes.

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Abstract

　本発明は、麹菌を宿主として用い、液体培養法によって組換えタンパクを大量生産する方法を提供することを目的とする。 　本発明は、麹菌を宿主として形質転換させて得られた組換え麹菌を用いる組換えタンパクの製造方法において、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類；表面が外皮で覆われた豆類及び／又は芋類；並びに、細砕や粉砕などの前処理をしないアマランサス及び／又はキヌアから選ばれた少なくとも１種を培養原料として含有する液体培地で、当該組換え麹菌を培養し、培養物から組換えタンパクを採取することを特徴とする組換えタンパクの製造方法を提供する。

Description

明 細 書
組換えタンパクの製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、組換えタンパクの製造方法に関し、詳しくは麹菌を宿主とした組換えタ ンパクの製造方法に関する。
背景技術
[0002] 麹は発酵飲食品製造時の酵素源として古くから利用されてきた。この発酵飲食品 製造時に用いる麹は、従来、穀類等の表面上に麹菌を生育させた固体麹が用いら れてきた。固体麹は、伝統的な製造法で得られるものであるが、固体培養という特殊 な培養形態であるため、大規模製造に不向きである。
一方、麹菌を液体培養することにより得られる麹菌培養物である液体麹は、培養制 御が容易であることから、効率的な生産に適した培養形態であると言える。
しかし、この液体麹は、発酵飲食品の製造に必要な酵素活性が十分に得られない ことがよく知られており、これまで実製造で使用された例は少ない (非特許文献 1〜4 参照)。
[0003] ところで、麹菌は容易に増殖し、培地が安価に調製可能であり、しかも特殊な培養 装置が必要ないため、培養に力かるコストが少なくてすむ。また、古くから発酵飲食 品の製造に用いられているため、安全な宿主として認められている。したがって、麹 菌を宿主として、その麹菌由来または別の生物由来の遺伝子を組込み、当該遺伝子 を強発現させ、当該遺伝子由来の産物つまり組換えタンパクを製造することは従来 カゝら試みられて ヽる（非特許文献 5参照)。
また、小麦フスマを用いた固体培養により、麹菌による組換えタンパクの高生産に 成功した例 (非特許文献 6参照)も報告されている。ただし、固体培養という特殊な培 養形態であるため、大規模製造には不向きな方法であるといえる。
一方、液体培養では、上記のようにもともと菌体外に生産されるタンパクが少なぐ 組換えタンパクの大量生産には向かないと考えられてきた。
[0004] 非特許文献 1 : Hata Y. et. A1.： J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537(1997) 非特許文献 2 : Hata Y. et. al. : Gene.， 207, 127-134(1998)
非特許文献 3 : Ishida H. et. al. :J. Ferment. Bioeng" 86, 301-307(1998)
非特許文献 4 : Ishida H. et. al:Curr. Genet., 37, 373-379(2000)
非特許文献 5 : R. J. Goukaら、 Appl. Microbiol. BiotechnoL, 47、 1-11、 (1997) 非特許文献 6 : K. Tsuchiyaら， Biosci. Biotech. Biochem., 58, 895-899 (1994) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の目的は、上記の理由力も従来組換えタンパクの製造には不向きであると 考えられてきた、麹菌を宿主として用いる液体培養法によって、組換えタンパクを大 量生産する方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは既に、酵素活性を充分量持つ液体麹の製造方法 (特願 2004— 350 661、同 2004— 352320、同 2004— 352324、同 2004— 378453、同 2005— 29 0648、および特開 2003— 265165参照）を提案した。これらの方法は、表面の全部 又は一部が少なくとも穀皮に覆われた状態の原料を培地に使用することにより、該原 料由来の栄養分の培養系への放出を抑制し、結果的に必要な酵素活性、特にデン プン分解酵素、セルロース分解酵素およびタンパク分解酵素を得るものである。これ らの方法によれば、焼酎の原料である丸麦、精白米を原料として液体培養を行った 場合よりも、高い酵素活性が得られる。麹菌としては白麹菌、黒麹菌、黄麹菌および 紅麹菌を用いることができる。
[0007] 上記の液体麹の製造方法では、糖やアミノ酸などの栄養分濃度によりカタボライト 抑制を受ける酵素をコードする遺伝子の転写量が高まり、これら遺伝子由来の産物（ 当該酵素）が麹菌菌体外に分泌生産できると推測されている。
そこで、糖やアミノ酸などの栄養分濃度によりカタボライト抑制を受ける酵素をコード する遺伝子のプロモーター下に、目的とするタンパクをコードする遺伝子を連結し、 それを麹菌に組み込んだ組換え麹菌を作製し、上記の液体麹の製造方法に準じ培 養することにより、目的とする組換えタンパクが高生産されると考えられる。
[0008] また、組換えタンパクの製造においてもうひとつの重要なことは、翻訳された組換え タンパクが正しく宿主菌体外まで輸送されることである。単に転写量を増やしても、翻 訳された組換えタンパクが菌体内で蓄積したり、元来宿主が分泌する酵素により分解 されてしまったりすることが非常に多くある。また、宿主菌体外までの輸送途中で必要 な修飾が組換えタンパクに対して行われなければ、正しくフォールデイングされ、天 然物と等 Uヽ活性を持つタンパクは製造されな!ヽ。
これに対して上記の液体麹製造技術を応用すれば、麹菌を宿主として、より多くの 組換えタンパクが分泌生産できる可能性が高い。また、宿主麹菌が元来分泌生産し て 、る酵素と組換えタンパクとの融合タンパクとして宿主菌体外に生産させ、培養上 清に含まれる当該融合タンパクの連結部分を部位特異的プロテアーゼにて切断する ことにより、目的とする組換えタンパクを大量に得ることも可能である。
上記の知見に基づいて、本発明は完成されるに至ったのである。
[0009] すなわち、請求項 1に係る本発明は、麹菌を宿主として形質転換させて得られた組 換え麹菌を用いる組換えタンパクの製造方法において、表面の全部又は一部が少な くとも穀皮で覆われた穀類；表面が外皮で覆われた豆類及び/又は芋類；細砕や粉 砕などの前処理をしな 、アマランサス及び Z又はキヌァ力 選ばれた少なくとも 1種 を培養原料として含有する液体培地で、当該組換え麹菌を培養し、培養物から組換 えタンパクを採取することを特徴とする組換えタンパクの製造方法である。
請求項 2に係る本発明は、組換え麹菌が、糖やアミノ酸などの栄養分濃度により力 タボライト抑制を受ける酵素をコードする遺伝子のプロモーターの下流に、目的とす るタンパクをコードする遺伝子を連結したものを、宿主の麹菌に導入して得たもので ある請求項 1に記載の組換えタンパクの製造方法である。
請求項 3に係る本発明は、プロモーターが、デンプン分解酵素、セルロース分解酵 素およびタンパク分解酵素のいずれかの酵素をコードする遺伝子のプロモーターで ある請求項 2に記載の組換えタンパクの製造方法である。
発明の効果
[0010] 本発明によれば、麹菌を宿主として用い、液体培養法によって組換えタンパクを大 量生産する方法を提供することができる。麹菌は、容易に増殖し、安価に培地が調製 でき、特殊な培養装置も必要としない。また、麹菌は、古くから発酵飲食品の製造に 用いられているため、安全な宿主である。
さらに、麹菌の液体培養は固体培養に比べ厳密な培養コントロールが可能である ため、効率的な生産に適した培養形態であると!/、える。
し力も、種々の原料や麹菌株を用いることにより、多様な製造パターン選択が可能 となり、目的とする組換えタンパクの効率的、安定的な大量生産が可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 以下、本発明について具体的に説明する。
本発明における液体培地は、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀 類；表面が外皮で覆われた豆類及び Z又は芋類；並びに、細砕や粉砕などの前処 理をしないアマランサス及び Z又はキヌァ力 選ばれた少なくとも 1種を培養原料とし て含有するものを用いる。
[0012] 本発明において、培養原料として用いる穀類としては、大麦、米、小麦、そば、ヒェ
、ァヮ、キビ、コゥリヤン、トウモロコシ等を挙げることができる。これらの培養原料の形 状としては、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われていることが必要であつ て、未精白物、または少なくとも穀皮が穀粒の表面に残されている程度までに精白さ れた精白歩合以上のもの等を用いることができ、玄米、玄麦なども使用できる。また、 米の場合には、玄米はもちろんのこと、籾殻が全部付いているものでもよいし、籾殻 がー部付 、て 、るものでもよ 、。
例えば、培養原料が大麦の場合、未精白の精白歩合 100%のもの、或いは未精白 の精白歩合を 100%とし、この未精白の精白歩合（100%)から大麦の穀皮歩合 (一 般的には 7〜8%)を差し引いた割合、すなわち 92〜93%程度の精白歩合以上のも のである。
[0013] ここで、精白歩合とは穀類を精白して残った穀類の割合を言い、例えば精白歩合 9 0%とは、穀類の表層部の穀皮等を 10%削り取ることを意味する。また、本発明にお いて、玄麦とは、未精白の麦力 穀皮が穀粒の表面に残されている程度までに精白 されたものであり、精白歩合 90%以上のものを含む。また、穀皮とは、穀類の粒の表 面を覆って 、る外側部位のことを言う。
[0014] 本発明において、培養原料として用いる豆類や芋類としては、大豆、小豆、サツマ ィモ等を挙げることができる。これらの培養原料は、外皮の汚れを洗い落とすのみで 、裁断、粉砕処理などの加工は全く行なわず、外皮に完全に覆われたままの状態で 液体培地の調製に用いる。
なお、本発明においては、培養原料である豆類や芋類の外皮を保持させたまま、 加熱あるいは凍結処理を行うこともできる。
[0015] 本発明において、培養原料として用いるアマランサスは、ヒュ科ヒュ属植物の総称 で、穀類のなかでは蛋白質含量が高ぐアミノ酸の一つであるリジンの含量は大豆に 匹敵する。また、精白米に比べてもカルシウム、鉄分、繊維質を多く含む高栄養価穀 物であり、原産国は、中南米諸国、インド、ヒマラヤ、ネパールの特定地域である。一 方、キヌァは、アガサ科の一年草であり、主にペルー南部やボリビア西部のアンデス 山脈などの高地で栽培されており、ミネラル、ビタミン、蛋白質、食物繊維を豊富に含 んでいる。
培養原料のアマランサスとキヌァは、単独で用いてもよぐあるいは組み合わせて用 いてもよい。これらは、細砕や粉砕などの前処理をすることなぐ液体培地の調製に 用いる。
[0016] 上記の培養原料は、単独あるいは 2種以上を組み合わせて、以下の液体培地の調 製に用いる。すなわち、上記の培養原料は、水と混合して液体培地を調製する。原 料の配合割合は、麹菌培養物中に目的とする組換えタンパクが選択的に生成、蓄積 される程度のものに調整される。
例えば、大麦を培養原料とした場合には、水に対して大麦を l〜20% (wZvol)添 カロした液体培地に調製される。また、無精白の大麦を用いた場合には、さらに好まし くは 8〜10% (w/vol)添加した液体培地に調製され、 95%精白した大麦を原料とし た場合には、さらに好ましくは 1〜4% (w/vol)添加した液体培地に調製される。 次に、籾殻を除いた玄米を培養原料とした場合には、水に対して玄米を 1〜20%、 好ましくは 5〜13%、より好ましくは 8〜10% (いずれも wZvol)を添カ卩した液体培地 に調製される。
[0017] 豆類を培養原料とした場合には、水に対して豆類を 1〜10%、好ましくは大豆であ れば 8〜10%、小豆であれば 1〜2% (いずれも wZvol)添カ卩した液体培地に調製さ れる。また、芋類を培養原料とした場合には、水に対して芋類を l〜10% (wZvol) 添加した液体培地に調製される。
[0018] また、例えば、アマランサスを培養原料とした場合は、水に対して 1. 5〜15%、好 ましくは 2〜10%、より好ましくは 2〜8% (いずれも wZvol)を添カ卩した液体培地に 調製される。一方、キヌァの場合は、水に対して 1. 5〜7%、好ましくは 2〜6%、より 好ましくは 2〜4% (V、ずれも wZvol)を添加した液体培地に調製される。
[0019] このように、使用する培養原料の精白度や種類、使用する宿主麹菌株やプロモー ター、製造する組換えタンパク等によって、最適な配合使用量は異なるので、適宜に 選択すればよい。
培養原料の使用量が上限値を超えると、培養液の粘性が高くなり、組換え麹菌を 好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃 度が低下して、培養が進み難くなるので好ましくない。一方、該原料の使用量が下限 値に満たないと、目的とする組換えタンパクが高生産されない。
[0020] 培養原料に含まれるデンプンは、培養前にあらかじめ糊化しておいてもよい。デン プンの糊化方法については特に限定はなぐ蒸きよう法、焙炒法等常法に従って行 なえばよい。後述する液体培地の殺菌工程において、高温高圧滅菌等によりデンプ ンの糊化温度以上に加熱する場合は、この処理によりデンプンの糊化も同時に行な われる。
[0021] 本発明における液体培地には、前述の培養原料の他に栄養源として有機物、無機 塩等を添加するのが好まし 、。
たとえば、ァスペルギルス'カヮチ（Aspergillus kawachii)等の白麹菌、および、ァス ヘル3 rルス ·ァヮモリ (Aspergillus awamori)ゃァスヘル =ルス ·二 7J一 (Aspergillus nig er)等の黒麹菌を宿主として用いる場合は、硝酸塩およびリン酸塩を併用することが 好ましぐさらに好ましくは、これらと共に硫酸塩を併用する。ここで、硝酸塩としては 硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどを用いることができ、特に硝酸カリウムが好ましい。リ ン酸塩としてはリン酸 2水素カリウム、リン酸アンモ-ゥムなどを用いることができ、特に リン酸 2水素カリウムが好ましい。硫酸塩としては硫酸マグネシウム 7水和物、硫酸鉄 7水和物、硫酸アンモ-ゥムなどを用いることができ、特に硫酸マグネシウム 7水和物 、硫酸鉄 7水和物が好ましい。これらの無機塩類は、複数種を組み合わせて用いるこ とちでさる。
[0022] 上記の白麹菌や黒麹菌を用いる場合の液体培地における上記の無機塩類の濃度 は、麹菌培養物中に目的とする組換えタンパクが選択的に生成、蓄積される程度の ものに調整される。具体的には、硝酸塩の場合は 0. 1〜2. 0%、好ましくは 0. 2〜1 . 5%、リン酸塩の場合は 0. 05〜： L 0%、好ましくは 0. 1〜0. 5%、硫酸塩の場合 は 0. 01〜0. 5%、好ましくは 0. 02〜0. 1% 0ヽずれも w/vol)とする。
[0023] また、ァスペルギルス 'オリーゼ（Aspergillus oryzae)ゃァスペルギルス ·ソーャ（Asp ergillus sojae)等の黄麹菌を用いる場合は、液体培地において硝酸塩、リン酸塩およ び硫酸塩を併用することが好ましい。ここで、硝酸塩としては硝酸ナトリウム、硝酸カリ ゥムなどを用いることができ、特に硝酸ナトリウムが好ましい。リン酸塩としてはリン酸 2 水素カリウム、リン酸アンモ-ゥムなどを用いることができ、特にリン酸 2水素カリウムが 好ましい。硫酸塩としては硫酸マグネシウム 7水和物、硫酸鉄 7水和物、硫酸アンモ -ゥムなどを用いることができ、特に硫酸マグネシウム 7水和物、硫酸鉄 7水和物が好 ましい。これらの無機塩類は、複数種を組み合わせて用いることもできる。
[0024] 上記の黄麹菌を用いる場合の液体培地における上記の無機塩類の濃度は、麹菌 培養物中に目的とする組換えタンパクが選択的に生成、蓄積される程度のものに調 整される。具体的には、硝酸塩の場合は 0. 1〜2. 0%、好ましくは 0. 2〜1. 5%、リ ン酸塩の場合は 0. 05-1. 0%、好ましくは 0. 1〜0. 5%、硫酸塩の場合は 0. 01 〜0. 5%、好ましくは 0. 02〜0. 1% 0ヽずれも w/vol)とする。
[0025] 本発明における液体培地には、前述の無機塩類以外の有機物や無機塩類等も、 栄養源として適宜添加することができる。これらの添加物は麹菌の培養に一般に使 用されているものであれば特に限定はないが、有機物としては米糠、小麦麩、コーン スティープリカ一、大豆粕、脱脂大豆等を、無機塩類としてはアンモ-ゥム塩、力リウ ム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の水溶性の化合物を挙げることができ、 2種類 以上の有機物及び Z又は無機塩類を同時に使用してもよい。これらの添加量は組 換え麹菌の増殖を促進する程度であれば特に限定はないが、有機物としては 0. 1〜 5% (w/vol)程度、無機塩類としては 0. 1〜1% (w/vol)程度添加するのが好ま 、 上限値を超えてこれらの栄養源を添加した場合は、組換え麹菌の増殖を阻害する ため好ましくない。また、添加量が下限値未満である場合は、目的とする組換えタン ノ クが大量生産されな 、ため、やはり好ましくな 、。
[0026] このようにして得られる液体培地は必要に応じて滅菌処理を行なってもよぐ処理方 法には特に限定はない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、 121°Cで 15分間行なえばよい。
[0027] 滅菌した液体培地を培養温度まで冷却後、組換え麹菌を液体培地に接種する。
本発明における組換え麹菌は、麹菌を宿主として形質転換させて得られたものであ り、上記の液体培地を用いて後述する培養方法により培養できるものであればょ 、。 宿主として用いる麹菌は、糖やアミノ酸などの栄養分濃度によりカタボライト抑制を受 ける酵素を生産するものであればよぐたとえば、ァスペルギルス ·カヮチ (Aspergillus kawachii)等の白麹菌、ァスペルギルス'ァヮモリ（Aspergillus awamori)ゃァスペルギ ルス.二ガー（Aspergillus niger)等の黒麹菌、および、ァスペルギルス'オリーゼ（Asp ergillus oryzae)ゃァスペルギルス .ソーャ（Aspergillus sojae)等の黄麹菌が挙げられ る。
[0028] 本発明の組換え麹菌は、プロモーターの下流に、目的とするタンパクをコードする 遺伝子を連結したものを宿主の麹菌に導入して得られたものである。本発明で用い るプロモーターとしては、宿主の麹菌において下流の遺伝子を発現させることができ るものであれば良ぐ麹菌菌体外に高生産される酵素のプロモーターを用いることが 好ましい。さらに好ましくは、糖やアミノ酸などの栄養分濃度によりカタボライト抑制を 受ける酵素をコードする遺伝子のプロモーターを用いる。その具体例としては、ダル コアミラーゼ（GlaA、 GlaB)、 a アミラーゼ（AmyB)等のデンプン分解酵素、グルカ ナーゼ（EglA)等のセルロース分解酵素、酸性プロテアーゼ (P印 A)等のタンパク分 解酵素などの酵素をコードする遺伝子のプロモーターが挙げられる。
本発明においては、前記した培養原料を使用して組換え麹菌を培養するため、当 該原料中の糖やアミノ酸などの栄養分の分解に時間がかかり、培養系への栄養分の 放出速度が抑制されることにより、これらの栄養分濃度によりカタボライト抑制を受け る酵素をコードする遺伝子のプロモーターが活性化され、その下流の目的とするタン ノ クをコードする遺伝子の転写量が増大され、もって目的とする組換えタンパクの大 量生産が可能となるのである。
[0029] 本発明において、目的とするタンパクをコードする遺伝子とは、宿主の麹菌におい て発現可能なものであればよぐ cDNAでも染色体 DNAでもよい。本発明においてタ ンパクとは、糖タンパクをも包含するものである。目的とするタンパクをコードする遺伝 子としては、麹菌由来遺伝子に限られず、麹菌を宿主とした組換えタンパク生産に適 した遺伝子であれば、他の生物種由来の遺伝子を用いることもできる。
[0030] 本発明の糸且換え麹菌には、上記のプロモーターや目的とするタンパクをコードする 遺伝子の他に、必要に応じてターミネータ一、選択マーカーなどを連結したものを導 入することができる。ターミネータ一としては、宿主の麹菌において機能するものであ れば良ぐ麹菌菌体外に高生産される酵素のターミネータ一を用いることが好ましい
[0031] 本発明にお 、て、宿主の麹菌への形質転換は、プロトプラストィ匕した宿主に PEG存 在下でプラスミドベクターを導入する方法（Unklesら、 Mol. Gen. Genet., 218, 99-104 (1989))など通常用いられる方法で行うことができる。
ベクターに用いられるプラスミドとしては、宿主の麹菌に適したものであれば良い。 例えば、 pPTRIDNA、 pPTRIIDNA (タカラバイオ株式会社)などを用い、目的に応 じて作製すればょ 、が、これらに限定されるものではな 、。
上記ベクターに上記の目的とするタンパクをコードする遺伝子を導入するには、ま ず、精製された目的とするタンパクをコードする遺伝子を適当な制限酵素で切断し、 適当なベクター DNAの制限酵素部位またはマルチクローユングサイトに挿入すること により、ベクターに連結する方法など、周知の方法が採用される。
[0032] 上記のようにして形質転換された麹菌を、適当な選択培地を用いて培養した後、得 られたコロニーを単離することによって、目的とするタンパクをコードする遺伝子を組 み込んだ組換え麹菌を得ることができる。
[0033] 上記により得られた組換え麹菌は、 1種類の菌株による培養、又は同種若しくは異 種の 2種類以上の菌株による混合培養のどちらでも用いることができる。これらは胞 子又は前培養により得られる菌糸のどちらの形態のものを用いても問題はないが、菌 糸を用いる方が対数増殖期に要する時間が短くなるので好ましい。組換え麹菌の液 体培地への接種量には特に制限はないが、液体培地 lml当り、胞子であれば 1 X 1 04〜： L X 106個程度、菌糸であれば前培養液を 0. 1〜10%程度接種することが好ま しい。
[0034] 組換え麹菌の培養温度は、生育に影響を及ぼさな 、限りであれば特に限定はな 、 力 好ましくは 25〜45°C、より好ましくは 30〜40°Cで行なうのがよい。培養温度が低 いと組換え麹菌の増殖が遅くなるため雑菌による汚染が起きやすくなる。
なお、宿主として黄麹菌を用いた場合は、麹菌の生育フェーズに合わせた培養温 度制御を行うことにより、酵素活性を増強できる。具体的には、培養開始から 12〜36 時間後までの菌体増殖期は 25〜35°C、好ましくは 28〜33°Cとし、その後の酵素生 産期は 35〜45°C、好ましくは 37〜42°Cに維持すればよい。
[0035] 培養装置は液体培養を行なうことができるものであればよいが、麹菌は好気培養を 行なう必要があるので、酸素や空気を培地中に供給できる好気的条件下で行なう必 要がある。また、培養中は培地中の原料、酸素、及び組換え麹菌が装置内に均一に 分布するように撹拌をするのが好ましい。撹拌条件や通気量については、培養環境 を好気的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよぐ培養装置、培地の 粘度等により適宜選択すればよい。
[0036] 上記の培養法で組換え麹菌を培養することにより、目的の組換えタンパクが培養物 中に高生産される。
本発明においては、続いて得られた麹菌培養物力ゝら組換えタンパクを採取する。そ の採取方法としては周知の技術を用いればよぐたとえば、当該培養物を濾過、遠心 分離等することにより得られた培養上清を、必要に応じて吸着榭脂、電気泳動等によ り濃縮、精製する方法などが採用できる。
実施例
[0037] 以下、本発明を実施例等によってより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定 されるものではない。
[0038] 実施例 1 (黄麹菌を宿主とした組換えタンパクの製造方法） (培地の調製）
黄麹菌用液体培地の組成は、 98%精白大麦 (オーストラリア産スターリング） 2. 0 %、硝酸ナトリウム 1. 2%、塩ィ匕カリウム 0. 8%、リン酸 2水素カリウム 0. 4%、硫酸マ グネシゥム 7水和物 0. 2%、硫酸鉄 7水和物 0. 08% (いずれも wZvol)とした。
対照として、 DPY培地（デキストリン 2%、ポリペプトン 1%、酵母エキス 0. 5%、リン 酸 2水素カリウム 0. 5%、硫酸マグネシウム 0. 05% (いずれも wZvol) )を用いた。 各培地 20mlを ΙΟΟπ バッフル付三角フラスコに張り込み、 121°Cで 15分間オート クレーブ滅菌した。
[0039] (組換え麹菌）
組換え麹菌として、特開平 11— 75840号公報に記載の方法により、ァスペルギル ス 'オリーゼの硝酸塩資化変異株 niaD 300を宿主として、コナヒヨウヒダ - (Dermatoph agoides farinae)の主要アレルゲンである糖タンパク Der 11の cDNAのプロ配列におい て、 3，末端のグルタミン酸コドンをリジンコドンに変更した DNA断片である Der fl E(-l) K (H. Shojiら、 Biosci. Biotechnol. Biochem., 61 (10), 1668-1673, 1997)を糸且み込ん だ組換え麹菌 niaD300— Derfl (独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄 託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6) (旧名称:通商産業省 工業技術院微生物工業技術研究所、旧住所：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3 号）に 1997年 7月 30日付 (原寄託より 2006年 8月 28日付で国際寄託に移管）で受 託番号 FERM BP— 10667号として寄託されている。）を供試した。
なお、 niaD300— Derfl DNAにおいて、 Der fl E(- 1)K DNAの上流にはァスペル ギルス'オリーゼ由来の glaAプロモーター力 下流にはァスペルギルス'オリーゼ由来 の amyBターミネータ一が連結されて!、る。
[0040] (組換え麹菌の培養）
得られた組換え麹菌 niaD300— Derflの分生子約 106個を、上記で得られた培地 2 0 mlに植菌し、 30°Cで 24時間、 lOOrpmで振とう培養した。
[0041] (組換えタンパク Der fl E(- 1)Kの精製）
液体培養後の培養液を、 3000 X g、 4°Cで 10分間遠心分離した。培養上清に直接ェ ンドグリコシダーゼ Hf(Biolabs社）を 10 unit/mlになるよう添カ卩し、 37°Cで 3時間保温 し反応させること〖こより、糖鎖のトリミングを行った。得られた反応液を、 20 mMリン酸 緩衝液（ pH 6.0)で平衡ィ匕させておいた強陰イオン交換カラム（商品名： QMA、 Water s社）に通過させ、反応液中に多量に存在する α—アミラーゼを吸着させた。 QMA力 ラムに吸着せず素通りした画分に、リシルエンドべプチダーゼ (和光純薬工業株式会 社)を終濃度 10 g/mlになるように添加し、 Der fl E(- 1)Kプロ配列を切断した。その 後、 50 mM Tris-HCl (pH 9.0)に対して、 4°Cでー晚透析を行った。
得られた濃縮物を、 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)で平衡化した DEAE-Sephacelカラム（ アマシャム バイオサイエンス株式会社）に直接チャージし、カラムの 3倍量の 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)で洗浄した。次いで、 NaCl濃度勾配により、カラムに吸着した成熟 型組換えタンパク Der fl E(- 1)Kを溶出させた。成熟型組換えタンパク Der fl E(- 1)Kを 含む画分を、抗 Der Π抗体を用いたウェスタン解析により検出し、純度の高い画分を 集め、精製サンプルとした。精製度は SDS— PAGE (ドデシル硫酸ナトリウム—ポリア クリルアミドゲル電気泳動）上で 90%以上であった。
精製サンプルのタンパク定量は BCA Protein Assay Reagent Kit (ピアス社）を用い て行った。
[0042] (結果)組換えタンパク Der fl E(- 1)Kの収得量
DPY培地を用いた場合、換算で培地 1じ当たり 8 mg程度の成熟型組換えタンパク D er fl E(-1)Kが得られた。一方、黄麹菌用液体培地を用いた場合、換算で培地 1じ当 たり 24 mg程度の組み換えタンパク Der fl E(-1)Kが得られた。
このように、本発明によれば、従来の DPY培地を用いる方法に比べて、組換えタン ノ クが 3倍も多く製造できることが分力、つた。
なお、組換えタンパク Der fl E(- 1)Kの持つ糖鎖は、天然 Der flの糖鎖と異なるもの であったが、組換えタンパク Der fl E(- 1)Kと天然 Der flは同等の IgE結合能および皮 膚刺激活性を示した。したがって、当該組換えタンパクは、天然 Der 11の代替品として 抗体作製やアレルギー治療などに利用できる。
[0043] 実験例 1 (焼酎用白麹菌における各種酵素遺伝子のプロモーター活性測定）
白麹菌における各種酵素遺伝子のプロモーターが本発明に利用可能であることを 確認するため、これらのプロモーターの発現強度を以下の方法で測定した。 <使用菌株 > Aspergillus kawachii NBRC4308
く培養条件〉 培地の組成は 98%精白大麦 (オーストラリア産スターリング） 2. 0% 、硝酸カリウム 0. 2%、リン酸 2水素カリウム 0. 3% (いずれも wZvol)とした。この培 地 100mlを 500πバッフル付三角フラスコに張り込み、 121°Cで 15分間オートタレ ーブ滅菌した。 Aspergillus kawachii NBRC4308の分生子約 106個を、上記で得られた 培地 100 mlに植菌し、 37°Cで 18時間、 lOOrpmで振とう培養した。
また、比較対照として、 98%精白大麦の代わりに 65%精白麦もしくは 98%精白麦 •粉砕品（ともにオーストラリア産スターリング)を培地に用いたこと以外は、上記と同様 の培地組成および培養条件で培養を行った。
[0044] < TotalRNA調製 > 培養終了後の菌体をすばやく回収し、液体窒素存在下で十分 に粉砕した。粉砕した麹菌体から、 totalRNA抽出キット（RNeasy Plant mini kit, QIAG EN社製）を用いてプロトコールに従! otalRNAを調製した。
< cDNA調製 > 得られた totalRNAから、 High-capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems社製）を用いてプロトコールに従!、cDNAを合成した。
<定量リアルタイム PCR> 得られた cDNAをテンプレートとし、下記の目的酵素遺伝 子の塩基配列を基に設計したプライマーを用いた定量リアルタイム PCRを行うことに より、当該酵素遺伝子の発現量を定量した。定量リアルタイム PCRに用いたプライマ 一は、 Primer Expressソフトウェア（Applied Biosystems社製）を用いて設計した。具体 的なプライマー配列は以下の通りである。比較定量法内部標準として、ヒストンをコー ドする H2A遺伝子を用いた。
なお、リアルタイム定量 PCR試薬として SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosy stems社製）を用い、添付のプロトコールに従!、 PC R反応およびシグナル検出を行つ た。なお、 PCR反応およびシグナルの検出には ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems 社製)を用いた。
[0045] <使用遺伝子およびプライマー配列 >
(1)グノレコアミラーセ gla—1 (Aspergillus kawachii由来： GenBank, Accession No.D0042 7)
フォワードプライマー； 1589- ccagctcgacctatagcagcat (酉己歹 [J表の酉己歹 [J番号 1) リバースプライマー； 1761 -aagtctgatggcgacgagct (配列番号 2)
このプライマー対は、上記 gla- 1 (GenBank, Accession No.D00427)のうち 1589〜17 80番目力 なる DNA断片を増幅するように設計されたものである。
(2)耐酸'性 α—アミラー ITasaA (Aspergillus kawachii由来： GenBank, Accession No.A B008370)
フォワードプライマー； 994- cggcacggcagatgatc (酉己歹 U番号 3)
リノくースプライマー； 1044-gaatgtacctcatggtcgacgtc (配列番号 4)
このプライマー対は、上記 asaA (GenBank, Accession No.AB008370)のうち 994〜10 66番目力 なる DNA断片を増幅するように設計されたものである。
3) α -Ύ . ~~セ amyA (Aspergillus kawachii由来： GenBank, Accession No. AB1094 52)
フォワードプライマー； 1874- acactcctgggcacattcg (酉己歹 [J番号 5)
リバースプライマー； 1989- ttacaccaacgacatagccct (配列番号 6)
このプライマー対は、上記 amyA (GenBank, Accession No.AB109452)のうち 1874〜 2009番目力 なる DNA断片を増幅するように設計されたものである。
(4)ヒストン H2 A (Aspergillus niger由来： GenBank, Accession No. Y15320) フォワードプライマー； 289- actgaacaagctcctgggtca (配列番号 7)
リバースプライマー； 322-ccagggtggtgtcctcccc (配列番号 8)
このプライマー対は、上記 H2A (GenBank, Accession No.Y15320)のうち 289〜340 番目力 なる DNA断片を増幅するように設計されたものである。
[0046] <結果 > ヒストン H2A発現量に対する相対値として各酵素遺伝子の発現量を定量 した。結果は表 1の通り。各遺伝子とも 98%精白麦を用いた試験区 (本発明）で、対 照区よりも発現強度が上昇しており、本発明の組換えタンパク製造方法において、こ れらの酵素遺伝子のプロモーターが有効に利用可能なことが明ら力となった。
[0047] [表 1] 使用原料
本発明（98%精白麦） 8.49
gla-1 対照 1 (98%精白麦粉砕品） 3.95
対照 2 (65%精白麦） 2.35
本発明（98%精白麦） 2.89
asaA 対照 1 (98%精白麦粉砕品） 1.99
対照 2 (65%精白麦） 1.05
本発明（98%精白麦） 23.86
amyA 対照 1 (98%精白麦粉砕品） 17.65
対照 2 (65%精白麦） 14.59
[0048] 実験例 2 (焼酎用黒麹菌における酵素遺伝子のプロモーター活性測定）
黒麹菌における各種酵素遺伝子のプロモーターが本発明に利用可能であることを 確認するため、これらのプロモーターの発現強度を以下の方法で測定した。
すなわち、実験例 1と同様の方法で Aspergillus awamori NBRC4388の培養を行った 。その後、実験例 1と同様にして、培養終了後の菌体から totalRNAを抽出し、 cDNAを 合成した。さらに、得られた cDNAをテンプレートとし、実験例 1と同様に下記の目的 酵素遺伝子の発現量を定量した。定量リアルタイム PCRに用いたプライマーの配列 は以下の通りである。
[0049] <使用遺伝子およびプライマー配列 >
(1) α -アミラーゼ amyA (実験例 1に記載した amyAと同じである。 )
実験例 1と同じプライマー対 (配列番号 5、 6)を用いた。
(2)酸'性プロテアーセ pepA (Aspergillus awamori由来： GenBank, Accession No. M3 4454)
フォワードプライマー； 793-ttttgggactggcctttagct (配列表の配列番号 9) リバースプライマー； 900- ttcttcgacaccgtcaagtcc (配列番号 10)
このプライマー対は、上記 pepA (GenBank, Accession No. M34454)のうち 793〜92 0番目力 なる DNA断片を増幅するように設計されたものである。
(3)ヒストン H2A (実験例 1に記載した H2Aと同じである。 )
実験例 1と同じプライマー対 (配列番号 7、 8)を用 、た。
[0050] <結果 > ヒストン H2A発現量に対する相対値として各酵素遺伝子の発現量を定量 した。結果は表 2の通り。各遺伝子とも 98%精白麦を用いた試験区 (本発明）で、対 照区よりも発現強度が上昇しており、本発明の組換えタンパク製造方法において、こ れらの酵素遺伝子のプロモーターが有効に利用可能なことが明ら力となった。 [0051] [表 2]
Figure imgf000017_0001
[0052] 実験例 3 (清酒用黄麹菌における酵素遺伝子のプロモーター活性測定）
黄麹菌における各種酵素遺伝子のプロモーターが本発明に利用可能であることを 確認するため、これらのプロモーターの発現強度を以下の方法で測定した。
<使用菌株 > Aspergillus oryzae NRIB40
く培養条件〉 培地の組成は 98%精白大麦 (オーストラリア産スターリング） 2. 0% 、硝酸ナトリウム 1. 2%、塩ィ匕カリウム 0. 8%、リン酸 2水素カリウム 0. 4%、硫酸マグ ネシゥム 7水和物 0. 2%、硫酸鉄 7水和物 0. 08% (いずれも wZvol)とした。この培 地 100mlを 500π バッフル付三角フラスコに張り込み、 121°Cで 15分間オートタレ ーブ滅菌した。 Aspergillus oryzae RIB40の分生子約 106個を、上記で得られた培地 1 00 mlに植菌し、 30°Cで 42時間、 lOOrpmで振とう培養した。
また、比較対照として、 98%精白大麦の代わりに 65%精白麦もしくは 98%精白麦 •粉砕品（ともにオーストラリア産スターリング)を培地に用いたこと以外は、上記と同様 の培地組成および培養条件で培養を行った。
[0053] その後、実験例 1と同様にして、培養終了後の菌体から totalRNAを抽出し、 cDNAを 合成した。さらに、得られた cDNAをテンプレートとし、実験例 1と同様に下記の目的 酵素遺伝子の発現量を定量した。定量リアルタイム PCRに用いたプライマーの配列 は以下の通りである。なお、比較定量法内部標準としてヒストンをコードする H4遺伝 子を用いた。
[0054] <使用遺伝子およびプライマー配列 >
(1)グノレコアミラーセ glaA (Aspergillus oryzae由来： GenBank, Accession No. D01035 )
フォワードプライマー； 1247- cgtgcagatcgtccaaacct (配列表の配列番号 11) リバースプライマー； 1357- acttctcacggccaacaacc (配列番号 12) このプライマー対は、上記 glaA (GenBank, Accession No. D01035)のうち 1247〜13 76番目力 なる DNA断片を増幅するように設計されたものである。
(2) α—アミラーセ amyA (Aspergillus oryzae由来： GenBank, Accession No. AB02187 6)
フォワードプライマー； 21762- cactcctgggcacattcgt (配列番号 13)
ジノ ースプライマー； 21875-gttacaccaacgacatagccctc (酉己歹 lj# 14)
このプライマー対は、上記 amyA (GenBank, Accession No. AB021876)のうち 21762 〜21897番目力 なる DNA断片を増幅するように設計されたものである。
(3) j8 -グルカナーゼ celB (Aspergillus oryzae由来： GenBank, Accession No. D83732 )
フォヮ一ドプライマ一； 1137- caaactgggaatgccacaaa (配歹幡号 15)
リノ ースプライマー； 1187- tgaagacggagagaactattccat g (配歹幡号 16)
このプライマー対は、上記 celB (GenBank, Accession No. D83732)のうち 1137〜121 1番目力 なる DNA断片を増幅するように設計されたものである。
(4)酸'性プロテアーゼ pepA (Aspergillus oryzae由来： GenBank, Accession No. D 138 94)
フォワードプライマー； 897- cgctagcaagattagcgatcagt (酉己歹 U番号 17)
リノくースプライマー； 958— gctttcagctcgatcaacactg (配歹 [J番号 18)
このプライマー対は、上記 pepA (GenBank, Accession No. D13894)のうち 897〜979 番目力 なる DNA断片を増幅するように設計されたものである。
(5)ヒストン H4 (Aspergillus oryzae由来： GenBank, Accession No AB033943) フォワードプライマー； 110- cgtgacaacatccagggtatca (配列番号 19)
リバースプライマー； 171- tcaagcgtatctctgccatga (配列番号 20)
このプライマー対は、上記 H4 (GenBank, Accession No AB033943)のうち 110〜191 番目力 なる DNA断片を増幅するように設計されたものである。
<結果 > ヒストン H4発現量に対する相対値として各酵素遺伝子の発現量を定量し た。結果は表 3の通り。各遺伝子とも 98%精白麦を用いた試験区 (本発明）で、対照 区よりも発現強度が上昇しており、本発明の組換えタンパク製造方法において、これ らの酵素遺伝子のプロモーターが有効に利用可能なことが明ら力となった。
[表 3]
Figure imgf000019_0001
産業上の利用可能性
本発明によれば、麹菌を宿主として組換えタンパクを大量生産する方法を提供する ことができる。麹菌は、培地が安価であり、特別な培養装置を必要としないため、所望 のタンパクを低コストで製造することが可能である。し力も、古くから発酵飲食品の製 造に利用されてきた麹菌は宿主としての安全性が高ぐ得られる組換えタンパクは様 々な用途に利用される可能性が高い。

Claims

請求の範囲
[1] 麹菌を宿主として形質転換させて得られた組換え麹菌を用いる組換えタンパクの製 造方法において、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われた穀類;表面が外 皮で覆われた豆類及び Z又は芋類；並びに、細砕や粉砕などの前処理をしな ヽアマ ランサス及び Z又はキヌァカゝら選ばれた少なくとも 1種を培養原料として含有する液 体培地で、当該組換え麹菌を培養し、培養物から組換えタンパクを採取することを特 徴とする組換えタンパクの製造方法。
[2] 組換え麹菌が、糖やアミノ酸などの栄養分濃度によりカタボライト抑制を受ける酵素 をコードする遺伝子のプロモーターの下流に、目的とするタンパクをコードする遺伝 子を連結したものを、宿主の麹菌に導入して得たものである請求項 1に記載の組換 えタンパクの製造方法。
[3] プロモーターが、デンプン分解酵素、セルロース分解酵素およびタンパク分解酵素 のいずれかの酵素をコードする遺伝子のプロモーターである請求項 2に記載の組換 えタンパクの製造方法。
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