KR100642051B1 - 버섯으로부터 유래한 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법 및 그 균사체 - Google Patents

버섯으로부터 유래한 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법 및 그 균사체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 버섯으로부터 유래한 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법 및 그 균사체에 관한 것으로서, Okamura 등의 방법에 따라 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 33 내지 38 U/mg인 상황버섯 유래의 균사체를 알코올성 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법 및 그 균사체를 제공함으로써, 알코올 발효 공정이 단축되고 알코올성 음료 또는 주류 생산성 향상에 기여하고, 살아있는 버섯 균사체가 발효원으로 제공되어 발효과정 중 버섯 균사체에 의한 미네랄, 비타민, 항암 및 면역증강 등의 유용성분들을 함유하는 기능성 주류가 생산되어 국민건강 보호에 기여할 것으로 기대된다.

Description

버섯으로부터 유래한 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법 및 그 균사체{Method for producing alcoholic drink or liquor using mycelia of mushroom having alcohol dehydrogenase or its mycelia}
도 1은 본 발명에 의한 상황버섯 자실체로부터 상황버섯 균사체의 분리 및 이들 균사체의 인공배지에서의 고체배양 및 액체배양 형태와 현미경 상의 형태를 보여준다.
도 2는 본 발명에 의한 버섯 균사체를 25 ~ 26℃에서 배양한 것으로, 200ml 삼각플라스크에서 4 ~ 5 일간 진탕배양, 20L 배양기에서 2 ~ 3 일간 전배양, 그리고 3 ton 배양탱크에서 3일간 배양하는 절차를 나타낸 그림이다.
본 발명은 버섯 균사체 대량배양에 의한 효율적 주류생산에 관한 것으로, 보다 상세하게는 버섯 균사체를 삼각프라스크(200ml)에서 액체배양하고 이를 전배양(20L)과정을 거친 다음 대량배양(3ton) 하여 회수한 균사체를 직접 알코올 생산에 이용하는 것이다.
버섯은 비타민, 미네랄, 섬유질 등이 풍부하고, 항암작용, 면역증강 등의 효능이 있어 웰빙 식품으로 각광을 받고 있다. 특히, 상황버섯 및 송이버섯은 항암효과 면역증강 등의 기능이 밝혀지면서 약용식품으로 널리 이용되고 있다. 상황버섯의 가장 큰 효과는 균사체가 체내 면역력을 높이는 물질을 함유하고 있어 이것이 체내에서 흡수되어 암세포를 죽이거나 암세포에 대항하는 항체가 활발하게 활동하도록 돕는다는 것이다. 따라서 직접적인 암치료제 라기보다는 보충제에 가까우며 암환자의 인체 면역력을 회복시키는데 상당한 효과가 있다. 송이 버섯의 효능은 「동의보감」에 따르면 위의 기능을 돕고, 식욕을 증진시키며 설사를 멎게 하고 기를 더하여 준다고 되어있다. 일본의 「균보(菌譜)」에는 이뇨작용 및 항암효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 콜레스테롤을 감소시켜 고혈압치료에 효능이 있다고 되어 있다. 따라서 이들 기능성을 함유하는 주류를 개발하기 위해 최근에 아가리쿠스, 팽이버섯, 송이버섯, 느타리버섯 등 몇몇 버섯 균사체를 이용한 알코올발효 연구가 진행되고 있다(Okamura-Matsui et. al., 2003). 하지만 현재까지 주류제품개발에는 성공을 거두지 못하고 있는 실정이다.
인간은 수 천년 동안 하나의 음식으로서 술을 마심으로 인해 즐거움을 누리고 있다. 다만 잘못된 음주 습관으로 지방간 및 간손상과 같은 부작용을 낳고 있는 것도 사실이다. 와인(과실주), 맥주, 약주 및 청주 등은 전세계의 많은 사람들에 의해 소비되고 있다. 일반적으로 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)가 강력한 알코올 가수분해 효소를 가지고 있기 때문에 주류 생산에 주된 발효원으로 이용되어 오고 있다.
한편, 이전발명에서 상황버섯, 느타리버섯, 송이버섯, 팽이버섯, 아가리쿠스 등과 같은 버섯에서 알코올 가수분해효소를 발견하였으며, 이에 대해 기출원한 바 있다(대한민국 특허출원 10-2000-00151444). 구체적으로는, 맥아추출물, 감자추출물, 옥수수액 및 효모추출물이 각각 10%씩 포함된 배지를 500㎖ 삼각플라스크에 넣고 버섯의 균사체를 2% 접종한 후 25℃에서 진탕배양한 후, 원심분리하여 균사를 모으는 과정을 거쳐 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 버섯 균사체를 배양하였다.
그러나, 이와 같이 얻어진 버섯 균사체의 경우는 알코올 가수분해효소 활성이 상황버섯의 경우 23.2U/mg 정도이었고 송이버섯의 경우는 2.5U/mg 정도에 그쳤다. 또한 이를 이용하여 통상의 방법에 따라 알코올 발효시킨 결과 상황버섯 유래의 균사체의 경우 와인의 경우 12.1%의 알코올을 생산하였고, 맥주의 경우는 3.9%, 청주의 경우는 6.9%의 알코올을 생산하여 아직까지는 적정한 정도의 알코올 발효능을 갖는 균사체로는 미흡하였다.
이에 본 발명자는 부단히 연구노력한 결과, 알코올 가수분해효소 활성이 현저히 향상된 상황버섯 유래의 균사체, 송이버섯 유래의 균사체를 얻었으며, 그 대 량 배양방법을 개발하게 되었다.
따라서, 본 발명은 알코올 가수분해효소 활성이 현저히 향상된 상황버섯 유래의 균사체를 제공하는 데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 알코올 발효능이 향상된 상황버섯 유래의 균사체를 제공하는 데도 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 알코올 가수분해효소 활성이 현저히 향상된 송이버섯 유래의 균사체를 제공하는 데 그 목적이 있다.
또한 본 발명은 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 버섯 균사체의 대량 배양방법을 제공하는 데도 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 버섯 유래의 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법을 제공하는 데도 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적은, Okamura 등의 방법에 따라 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 33 내지 38 U/mg인 상황버섯 유래의 균사체로부터 달성될 수 있다.
또한, Okamura 등의 방법에 따라 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 3.5 내지 5 U/mg인 송이버섯 유래의 균사체로부터도 달성될 수 있다.
삭제
또한, 버섯 균사체를 평판배양하는 공정; 평판배양된 버섯 균사체를 진탕배양하는 공정; 진탕배양된 버섯 균사체를 전배양하는 공정; 상기 전배양된 버섯 균사체를 본배양하는 공정; 및 본배양된 버섯 균사체 배양물을 체거름하는 공정을 포함하며, 배양에 있어서 영양원은 탄소원 중 슈크로오스를 포함하여 수행되는, 버섯으로부터 유래한 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 버섯 균사체의 대량 배양방법을 통해서도 본 발명의 목적은 달성될 수 있다.
또한, 본 발명은 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 33 내지 38 U/mg인 상황버섯 유래의 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법을 통해서도 달성될 수 있다.
또한, 본 발명은 발효시 과실주의 경우 10 내지 13%의 알코올을 생산하고, 맥주의 경우 5 ~ 5.3%의 알코올을 생산하며, 청주 또는 약주의 경우 14 ~ 16%의 알코올을 생산하는 상황버섯 유래의 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법으로부터도 달성될 수 있다.
또한, 본 발명은 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 3.5 내지 5 U/mg인 송이버섯 유래의 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법으로부터도 달성될 수 있다.
또한, 본 발명은 버섯 균사체를 평판배양하는 공정; 평판배양된 버섯 균사체를 진탕배양하는 공정; 진탕배양된 버섯 균사체를 전배양하는 공정; 상기 전배양된 버섯 균사체를 본배양하는 공정; 및 본배양된 버섯 균사체 배양물을 체거름하는 공정을 포함하며, 배양에 있어서 영양원은 탄소원 중 슈크로오스를 포함하여 수행되는 방법에 따라 얻어진, 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 버섯 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법으로부터도 달성될 수 있다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 버섯으로부터 유래한 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 버섯 균사체에 관한 것으로서, 그 하나는 Okamura 등의 방법에 따라 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 33 내지 38 U/mg인 상황버섯 유래의 균사체이다.
상기 및 이하의 기재에 있어서, 'Okamura 등의 방법'이라 함은 Biosci. Biotechnol. Biochem., 65(7), 1596-1600, 2001에 게재된 효소 분석 방법(Enzyme assay)으로서, 구체적으로는 다음과 같은 알코올 가수분해효소 활성의 측정방법으로서 정의된다;
에틸 알코올 200μmol, NAD+ 1μmol 및 트리스-HCl 완충액(pH7.5) 200μmol에 추출한 효소를 첨가하여 최종적으로 1.0㎖ 부피가 되도록 조정한다. 기질을 물로써 대체한 것을 대조구로 한다. 1cm 광 경로를 갖는 큐벳 내에서 30℃에서 항온반응을 수행한다. 반응은 NAD+를 첨가하는 순간부터 시작되며, 자동온도조절되는 큐벳 홀더(thermostatically controlled cuvette holder)와 연소식 차트 기록기(continuous chart recoder)가 장치된 분광광도계(Hitachi 150-20 double beam spectrophotometer)를 이용하여 340nm에서의 흡광도로써 초기 변화를 측정하여 효소 활성을 측정한다. 효소 활성의 단위 유닛은 반응 1분당 1μmol의 NADH의 형성을 촉매하는 양으로 정의된다. 효소 활성은 단백질 1mg 당 유닛(유닛/mg)으로 정의된다. 단백질은 표준물질로서 BSA(crystalline bovine serum albumin)을 사용하여 Lowry 등의 방법에 의해 검출한다.
본 발명에 따른 상황버섯 유래의 균사체에 있어서 알코올 가수분해효소 활성이 33 U/mg보다 작을 경우에는 알코올 생산농도가 낮은 관계로 경제적인 약주제조로서 바람직하지 못하다.
이와 같은 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 상황버섯 유래의 균사체를 통상의 방법에 따라 주류 발효에 사용할 경우, 와인과 같은 과실주의 경우 10 내지 13%, 맥주의 경우 5 ~ 5.3%, 청주 또는 약주의 경우 14 ~ 16%의 알코올을 생산한다. 이는 알코올 발효시 첨가되는 균사체의 양이 전체발효양의 0.1 내지 1% 정도인 경우를 기준으로 한 것이다.
다른 하나는, Okamura 등의 방법에 따라 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 3.5 내지 5 U/mg인 송이버섯 유래의 균사체이다. 송이버섯 유래의 균사체에 있어서 알코올 가수분해효소 활성이 3.5 U/mg 보다 작을 경우에는 주세법상의 주류제조 알코올 농도에 미치지 못하므로 바람직하지 못하다.
이와 같은 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 버섯 유래의 균사체는 버섯 자실체로부터 얻어진 버섯 균사체를 분리하여 고체배지에서 배양하고, 이를 액체배지에서 배양하는 일련의 과정을 통해 대량 배양된 것으로서, 대량 배양방법을 도 1 및 도 2를 참조하여 단계적으로 살피면 다음과 같다. 도 1은 일예로서 상황버섯 자실체로부터 고체배양한 상태, 액체배양한 상태 및 최종적으로 분리배양된 균사체의 형태를 현미경으로 관찰한 사진이고, 도 2는 삼각플라스크에서 액체배양, 20L 배양기에서 전배양 및 3ton 배양기에서 대량 배양하는 절차를 나타낸 도면이다.
(1) 버섯 균사체의 평판배양 공정
일정 크기의 버섯 자실체 조각을 취하여 이를 평판배지 위에 올려두어 25 내지 26℃에서 5 내지 7일 동안 정치배양한다.
이때, 영양원 중 탄소원으로는 슈크로오스를 포함하는 것이 단당류인 덱스트로오스를 포함하는 것보다 증식능력 및 알코올가수분해 효소(ADH)의 활성을 더 높일 수 있어서 바람직하다.
또한 영양원 중 무기질원으로는 다양한 종류의 2가 양이온을 고려할 수 있으나, 균체의 성장 및 ADH 활성에 있어서 MgCl2를 포함하는 것이 균체의 증식속도가 높으면서 ADH의 활성도 높일 수 있어 바람직하다.
또한 탄소원 중 수용성 전분을 사용할 경우 알코올 분비력을 촉진시킬 수 있어 바람직하다.
이와 같은 점을 고려하여 바람직한 영양원 조성은, 슈크로오스 5 내지 7.5%, 펩톤 3.5 내지 4.5%, 효모 추출물 3 내지 5%, 바이오틴(biotin) 0.01 내지 0.02%, MgCl2 0.05내지 0.1%, FeSO4 0.01 내지 0.02%. 한천 1.5 내지 2%를 포함하며, pH가 6.5 내지 7.0인 것이다.
얻어진 균사체는 도 1의 B와 같은 형태를 나타낸다.
(2) 평판배양된 버섯 균사체를 진탕배양하는 공정(액체배양 공정)
상기와 같이 배양된 플레이트로부터 버섯 균사체의 가장자리 부분을 일정 규격으로 자른 5 내지 7개의 한천 조각을 삼각플라스크의 액체 배지에 접종하여 25 내지 26℃에서 50 내지 150rpm으로 4 내지 5일간 진탕배양한다. 이때 한천 조각의 수는 액체배양배지 규모에 달라질 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
진탕배양시 회전수 50 rpm 미만으로 회전시키면 성장한 균사체가 배양물 내에 고르게 분포하지 못하고 서로 엉겨 붙게 되고, 또한 이로 인해 균사체가 성장하는데 필요한 산소의 공급이 배양물 내에 충분하게 이루어지지 못하게 되므로 고품질의 액체 배양물을 얻을 수 없게 된다. 반면에 진탕배양시 회전수가 150 rpm보다 클 경우에는 산소의 공급은 충분하지만 과도한 회전력으로 인해 균사체의 성장이 저하되거나 균사체가 절단되어 바람직스럽지 못하다.
이때 영양원은 평판배양과 동등한 배지 조성을 갖는 것이 바람직하다.
얻어진 버섯 균사체의 액체배양물은 도 1의 C와 같은 형태를 갖는다.
(3) 진탕배양된 버섯 균사체의 전배양 공정
진탕배양된 균사체를 무균적으로 잘게 찢은 다음 이를 접종원으로 하여 10 내지 20L 용량의 배양기에서 전배양한다. 전배양을 통해 균사체는 안정화되고 증식이 활성화 된다.
전배양액:진탕배양 접종원의 비는 부피를 기준으로 50 내지 200:1, 바람직하게는 50 내지 100:1인 것이다. 이때 진탕배양 접종원이 너무 적게 이식되면 성장속도가 느려 배양기간이 늘어나고 그 양이 과다하면 경제적이지 못하다.
전배양은 25 내지 26℃에서 2 내지 3일간 수행되는 것이 바람직하다.
(4) 전배양된 버섯 균사체를 본배양하는 공정
상기와 같은 방법으로 전배양된 것을 접종원으로 하여 대량 배양을 수행하는데, 전배양액을 이식함에 있어서도 무균적으로 수행되는 것이 바람직하다.
대량 배양액:전배양액 접종원의 비는 100 내지 2000:1 정도가 되도록 접종시킨다. 보다 바람직하기로는 1000 내지 2000:1의 비율인 것이다. 전배양 접종원을 너무 적게 접종시키면 균사체의 성장이 더디거나 실패할 가능성이 커지는 반면에, 그 양이 과다하면 경제적이지 못하다.
상황버섯 균사체의 경우, 본배양은 25 내지 26℃에서 3일 이내, 바람직하게는 2 내지 3일간 수행되는 것인데, 3일을 지나도록 대량 배양을 수행하게 되면 균사체의 알코올가수분해 효소 활성이 급격히 감소되는 경향을 나타내어 바람직하지 못하다.
송이버섯 균사체의 경우는 7일 정도 본배양을 수행하여도 효소 활성의 급격한 저하는 발생되지는 않는다.
(5) 본배양된 버섯 균사체 배양물을 체거름하는 공정
일련의 과정을 통해 대량 배양된 버섯 유래의 균사체는 원심분리를 통한 회수 공정없이 단지 체거름을 통해 여과하여 이를 알코올 발효에 사용할 수 있다.
알코올 발효에 사용할 경우 그 첨가량은 알코올 생산량과 배양기간 등을 고려하여 달라질 수 있으나, 전체 발효량의 0.1 내지 1% 정도, 구체적으로 청주 또는 약주의 경우라면 코지(koji)의 1 내지 3% 정도이면 발효에 있어 충분하다. 과실주의 경우에는 과실 총량을 기준으로 하여 1 내지 3% 정도, 맥주 제조의 경우라면 맥아즙을 기준으로 0.1 내지 2% 정도면 발효에 있어서 충분하다.
본배양되어 체거름을 통해 얻어진 버섯 균사체의 경우 상기 액체배양단계까지만을 수행하여 얻어진 버섯 균사체에 비하여 알코올가수분해 효소활성이 1.5 내지 2배 정도 향상되고, 알코올 발효력 역시 증가되는 결과를 보인다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 상황버섯으로부터 유래한 알코올가수분해효소 활성을 갖는 균사체의 대량 배양
< 버섯 균사체의 분리, 배양 및 회수 >
(1) 상황버섯 균사체의 평판배양
상황버섯으로부터 균사체의 분리 및 배양된 균사체의 형태를 도 1에 나타내었다. 요약하면, 일정크기의 상황버섯 자실체 조각을 취하여 YMD(7.5% 슈크로오스, 4.5% 펩톤(peptone), 5% 효모 추출물(yeast extract), 0.01% 바이오틴(biotin), 0.05% MgCl2, 0.01% FeSO4, 2% 한천, pH 7.0) 플레이트 위에 올려두어 25℃에서 6일 동안 정치 배양하였다.
(2) 진탕배양
상기 (1) 배양된 YMD 플레이트로부터, 상황버섯 균사체의 가장자리 부분을 0.5cm × 0.5cm의 크기로 자른 4-5개의 한천 조각을 다음과 같은 액체 배지조성을 갖는 200ml의 삼각 플라스크에 접종하여 25℃에서 100rpm으로 6일간 진탕배양하였다.
액체 배지조성: 7.5% 슈크로오스, 4.5% 펩톤, 5% 효모 추출물, 0.01% 바이오틴, 0.05% MgCl2, 0.01% FeSO4, pH 7.0
이 과정을 통해 얻어진 분리된 균사체의 형태를 현미경으로 관찰한 결과 도 1의 D와 같은 형태의 균사체를 얻었다.
< 버섯 균사체의 대량배양 >
(3)전배양
상기 (2)로부터 얻어진 버섯 균사체를 무균적으로 잘게 찢은 다음 20L 배양기에서 25 내지 26℃에서 2 ~ 3일간 전배양하였다.
이때, 전배양액은 진탕배양 접종원의 부피를 기준으로 하여 100 내지 200 부피비가 되도록 하였다.
(4)본배양
상기 (3)으로부터 얻어진 전배양액을 접종원으로 하여 3톤 배양탱크에서 1.5톤 배양액에 이식하여 3일간 배양하였다. 이때의 본배양액은 전배양액 접종원의 부피를 기준으로 하여 1000 내지 2000 부피비가 되도록 이식한 것이다.
(5) 알코올가수분해 효소 활성을 갖는 대량 배양된 버섯 균사체의 분리 및 회수
상기 (4)의 본배양액으로부터 얻어진 대량 배양액을 자체수압을 이용하여 체거름으로 집균하였다. 이때 체는 Φ0.5mm 메쉬인 것을 사용하였다.
걸러진 버섯 균사체는 별도의 파쇄과정없이 그대로 알코올 발효에 사용할 수 있다.
실시예 2: 송이버섯으로부터 유래한 알코올가수분해효소 활성을 갖는 균사체의 대량 배양
상기 실시예 1과 동일한 공정을 통해 알코올가수분해효소 활성을 갖는 균사체를 대량 배양하되, 다만 상황버섯 대신에 송이버섯을 사용하였다.
비교실시예 1: 배지조성 중 무기질원의 변경
상기 실시예 1과 동일한 공정을 통해 알코올가수분해효소 활성을 갖는 균사체를 대량 배양하되, 배지조성 중 MgCl2를 첨가하지 않았다.
비교실시예 2: 본배양 시간의 변경
상기 실시예 1과 동일한 공정을 통해 알코올가수분해효소 활성을 갖는 균사체를 대량 배양하되, (4) 본배양 시간을 5일 이상으로 늘렸다.
비교예 1: 배지조성 중 탄소원의 변경
상기 실시예 1과 동일한 공정을 통해 알코올가수분해효소 활성을 갖는 균사체를 대량 배양하되, 배지조성 중 슈크로오스 대신에 덱스트로오스를 사용하였다.
비교예 2
상기 실시예 1의 (2) 진탕배양까지만을 거쳐 상황버섯 유래의 균사체를 얻었다.
비교예 3
상기 실시예 2의 (2) 진탕배양까지만을 거쳐 송이버섯 유래의 균사체를 얻었다.
실험예 1
실시예 및 비교실시예에 따라 배양배지 조성에 따른 각각의 버섯 유래의 균사체에 대해 알코올가수분해 효소활성을 확인하기 위해, 단계적인 크로마토그래피를 통해 ADH를 분리 정제하였다. 이들 정제 효소를 SDS 폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동을 통해 분자량을 측정하였다.
구체방법은 다음과 같다.
알코올가수분해 효소활성 및 분자량의 측정은 실시예 1 및 비교실시예 1, 비교예 1에 있어서 (2) 진탕배양까지만을 수행한 후 얻어진 버섯 균사체를 가지고 수행하였다.
구체 방법은 다음과 같다.
얻어진 각각의 균사체를, 10% 글리세롤이 포함된 20mM 트리스-HCl(Tris-HCl, pH 8.0)에 2:1(v/v) 비율로 섞어 초음파 파쇄기(Branson Sonifier 250, USA)를 이용하여 균사체를 파쇄하였다. 파쇄액을 4℃, 13,000rpm, 20분 동안 원심분리한 상등액을 투석막을 이용하여 20mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.0)에 투석하여 조효소액으로 사용하였다. 이 조효소액을 DEAE 세파덱스(Sephadex) A-50 이온-교환 컬럼(ion-exchange column), 세파덱스 G-200 및 세파덱스 G-75로 단계적으로 분리 및 정제하였다. 최종적으로 3.5% 수율로 분리 정제되어 48.6 유닛/mg의 정제된 효소를 얻었다.
구분 단계 총 단백질(mg) 총 활성 (유닛) 특이활성 (유닛/mg) 배율 (fold) 수율 (%)
상황버섯 유래의 균사체 (실시예 1) 무세포 추출액 633.0 7330.0 12.4 1.00 100.0
DEAE A-50 이온-교환 64.3 1516.8 23.6 1.90 20.7
세파덱스 G-200 겔 여과 11.3 354.2 31.3 2.52 4.8
세파덱스 G-75 최상급 겔 여과 5.25 255.4 48.6 3.92 3.5
비교실시예 1 무세포 추출액 620.0 7230.0 12.0 1.0 100.0
DEAE A-50 이온-교환 62.5 1490.0 23.0 1.8 20.6
세파덱스 G-200 겔 여과 11.5 350.1 30.0 2.4 4.6
세파덱스 G-75 최상급 겔 여과 5.0 250.0 47.0 3.6 3.4
비교예 1 무세포 추출액 610.0 7130.0 11.8 1.0 100
DEAE A-50 이온-교환 60.2 1450.8 22.5 1.7 20.0
세파덱스 G-200 겔 여과 11.0 340.2 28.5 2.3 4.5
세파덱스 G-75 최상급 겔 여과 4.9 245.4 46.0 3.5 3.2
< 효소의 분자량 측정 >
상기와 같이 정제된 효소를 90V에서 2시간 SDS-PAGE 전기영동을 행한 후 실버(silver) 염색하여 단백질 밴드(band)를 확인하였고, 그 분자량은 로그 그래프(logarithmic graph)에 의한 Rf치로 구하였다.
이들 중 상황버섯 균사체 유래의 알코올 가수분해효소의 분자량을 다음 표 2에 나타내었다.
구분 분자량(달톤)
실시예 1 46,000
비교실시예 1 33,000
비교예 1 46,000
<알코올 가수분해효소 활성>
알코올 가수분해효소의 역할은 당원으로부터 해당과정을 통해 생성된 아세트알데히드를 에틸알코올로 환원시켜 최종산물인 에탄올을 생성하는 것이다. 이때, 아세트알데히드를 에탄올로 전환시키는 과정에서 작용하는 알코올 가수분해효소의 활성은 매우 중요하다. 좀 더 구체적인 실험방법 및 결과는 아래와 같다.
실시예 1 내지 2 및 비교실시예 1 내지 2, 그리고 비교예 1에 따라 대량 배양 후 원심분리(10,000xg, 10 min)하여 균사체를 모은 다음 냉장보관한 염용액으로 2회 세척하고, 균사체 침전물을 20mM 인산 완충액(pH 7.0)에 녹여서 초음파 분쇄기(BRANSON, 20kKz)로 8℃ 이하에서 16분 동안 파쇄시켰다. 파쇄되지 않은 균사체와 찌꺼기는 원심분리(10,000xg, 10 min)하여 제거하고 현탁액만 모아서 세포추출물로서 이용하였다.
준비한 세포추출물을 이용하여 상술한 Okamura 등의 방법에 따라 버섯 균사체의 알코올 가수분해효소의 활성을 측정하였다.
표준반응혼합물은 기질로 알코올 200μmol과 보조작용을 하는 NAD+ 1μmol 및 트리스-염산 완충액(pH 7.5) 200μmol에 추출한 효소를 첨가하여 최종적으로 1.0ml 부피가 되도록 조정하였으며, 반응은 30℃에서 알코올에 NAD+을 첨가하는 순간부터 시작되며, 이 혼합액은 버섯 균사체로부터 추출한 효소에 의해 아세트알데히드와 NADH로 전환된다. 반응 후 효소 활성은 분광광도계(Hitachi 150-20 double beam spectrophotometer)를 이용하여 340nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 실시예 1 내지 2, 비교실시예 1 내지 2 및 비교예 1로부터 얻어진 버섯 유래의 알코올 가수분해 효소 활성을 DEAE A-50 이온-교환수지 단계로 정제한 후 측정하였으며, 액체배양조건에 따른 결과를 다음 표 3에 나타내었다. 효소 1 유닛은 반응 1분당 1μ mol의 NADH의 형성을 촉매하는 양으로 정하였다.
구분 효소활성(유닛/mg)
실시예 1 38
실시예 2 5.0
비교실시예 1 33
비교실시예 2 25
비교예 1 30
비교예 2 23.6
비교예 3 3.1
상기 결과에서 살펴본 바와 같이, 대량 배양과정을 거친 상황버섯 유래의 균사체의 경우(실시예 1) 삼각플라스크 배양까지만을 거친 경우(비교예 2)에 비하여 알코올 가수분해 효소활성이 현저히 높다는 것을 확인할 수 있었다.
또한 대량 배양과정을 거친 송이버섯 유래의 균사체의 경우(실시예 2) 삼각플라스크 배양까지만을 거친 경우(비교예 3)에 비하여 알코올 가수분해 효소활성이 현저히 높다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 배지 조성 중 탄소원으로서 슈크로오스 대신에 덱스트로오스를 사용한 비교예 1의 경우 알코올 가수분해효소활성이 낮았다.
한편, 무기질원으로서 MgCl2를 포함하지 않는 경우(비교실시예 1)에는 다소 알코올 가수분해효소활성이 낮아진다. 특히 상황버섯 균사체의 경우 대량 배양을 하더라도 대량 배양에 소요되는 시간이 5일인 경우에는 알코올 가수분해효소활성이 낮아짐을 알 수 있다(비교실시예 2).
실험예 2: 알코올 생성량 비교실험
상기 실시예 1, 비교실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 2로부터 얻어진 상황버섯 유래 균사체와 실시예 2 및 비교예 3으로부터 얻어진 송이버섯 유래 균사체를 이용하여 다음과 같은 방법으로 네 종류의 주류를 제조하였다. 이때, 균사체는 체거름된 그대로를 술의 제조에 적용한 것이다.
제조방법은 통상의 약주, 청주, 와인 및 맥주의 제조공정에 따랐다.
구체 제조의 일예는 다음과 같다.
(1) 약주의 제조
쌀(1,700kg)을 증자한 후 황국균이나 백국균을 접종하여 코지를 제조한다. 원료로서 상기 제조된 코지(1,700kg), 쌀(2,480kg), 물(8,600kg)을 준비하고 여기에 알코올 발효원인 버섯 균사체(34kg)를 접종하여 알코올 발효하여 약주를 제조한다.
(2) 청주의 제조
(1)의 제조방법과 동일하다. 다만 알코올의 농도를 맞추기 위해 약간의 주정 을 첨가할 수 있다.
(3) 와인의 제조
원료인 포도(100kg)를 파쇄한 후 최종 당농도가 24% 내외가 되게 당을 첨가하고 버섯 균사체(2kg)를 가하여 본 발효를 거친후 저온에서 후발효하여 여과과정을 거쳐 와인을 제조한다.
(4) 맥주의 제조
백미 혹은 전분(1kg)을 넣고 끓이고 여기에 맥아(1kg)와 물(9L)을 첨가한 후 여과하고 호프(60g)를 첨가하여 다시 끓인다. 이것을 냉각한 냉맥아즙(11.6kg)에 버섯 균사체(15g)를 첨가하여 본발효 그리고 후발효를 거쳐 맥주를 제조한다.
얻어진 각각의 술로부터 알코올 생성량을 주정계를 이용한 부칭법에 의거 측정하여 그 결과를 다음 표 4로써 나타내었다.
구 분 술의 종류 알코올 생성량(%)
실시예 1 (상황버섯 유래 균사체) 약주 16
청주 15.5
와인 12.1
맥주 5.1
실시예 2 (송이버섯 유래 균사체) 약주 6.8
청주 5.1
와인 3.2
맥주 1.5
비교실시예 1 (상황버섯 유래 균사체) 약주 13
청주 12
와인 9
맥주 4.5
비교실시예 2 (상황버섯 유래 균사체) 약주 11
청주 10
와인 8
맥주 3
비교예 1 (상황버섯 유래 균사체) 약주 12.5
청주 11.5
와인 8
맥주 4
비교예 2 (상황버섯 유래 균사체) 약주 12
청주 11
와인 10
맥주 4
비교예 3 (송이버섯 유래 균사체) 약주 6.1
청주 4.5
와인 2.5
맥주 1.0
상기 표 4의 결과로부터, 상황 버섯 균사체를 대량 배양하여 알코올 발효에 사용하는 경우(실시예 1)가 동일한 배지조성 하에서 200ml 삼각플라스크 배양한 것(비교예 2)보다 알코올 생성량에 있어서 우수함을 확인할 수 있었다.
또한 송이 버섯 균사체를 대량 배양하여 알코올 발효에 사용하는 경우(실시예 2)가 동일한 배지조성 하에서 200ml 삼각플라스크 배양한 것(비교예 3)보다 알코올 생성량에 있어서 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, 배지 조성 중 탄소원으로서 슈크로오스 대신에 덱스트로오스를 사용한 비교예 1의 경우 알코올 생성량이 낮았다. 한편, 무기질원으로서 MgCl2를 포함하지 않는 경우(비교실시예 1) 알코올 생성량이 다소 낮아진다. 특히 대량 배양을 하더라도 대량 배양에 소요되는 시간이 5일인 경우에는 상황버섯 균사체의 경우 현저히 알코올 생성량이 낮았다(비교실시예 2).
이상에서 상세히 설명한 것과 같이, 본 발명은 알코올 가수분해효소 활성이 현저히 향상된 상황 버섯 균사체, 송이 버섯 균사체를 제공함으로써 알코올 음료 또는 주류 생산성을 향상시킬 수 있으며 항암 및 면역증강 효과가 있는 기능성 주류를 생산함으로써 국민건강에 기여할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 알코올 가수분해효소 활성이 현저히 향상되도록 버섯 유래의 균사체를 대량 배양하는 방법을 제공함으로써, 알코올 음료 또는 주류 생산성을 향상시킬 수 있으며 항암 및 면역증강 효과가 있는 기능성 주류를 생산함으로써 국민건강에 기여할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명의 알코올 가수분해효소 활성이 우수한 버섯 균사체를 대량 생산하여 별도의 원심분리나 파쇄의 과정없이 그대로를 적용할 수 있으므로 알코올 음료 또는 주류 생산성을 향상시킬 수 있고 공정을 단순화시킬 수 있다.

Claims (9)

  1. (정정)Okamura 등의 방법에 따라 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 33 내지 38 U/mg인 상황버섯 유래의 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법.
  2. (정정)Okamura 등의 방법에 따라 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 3.5 내지 5 U/mg인 송이버섯 유래의 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법.
  3. (정정)버섯 균사체를 평판배양하는 공정;
    평판배양된 버섯 균사체를 진탕배양하는 공정;
    진탕배양된 버섯 균사체를 전배양하는 공정;
    상기 전배양된 버섯 균사체를 본배양하는 공정; 및
    본배양된 버섯 균사체 배양물을 체거름하는 공정을 포함하며,
    배양에 있어서 영양원은 탄소원 중 슈크로오스를 포함하여 수행되는 방법에 따라 대량 배양된 버섯 균사체를 알코올 음료 또는 주류 생산에 사용하는 방법.
  4. (정정)Okamura 등의 방법에 따라 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 33 내지 38 U/mg인 상황버섯 유래의 균사체.
  5. (삭제)
  6. (정정)Okamura 등의 방법에 따라 알코올 가수분해효소 활성을 측정하였을 때 효소활성이 3.5 내지 5 U/mg인 송이버섯 유래의 균사체.
  7. 버섯 균사체를 평판배양하는 공정;
    평판배양된 버섯 균사체를 진탕배양하는 공정;
    진탕배양된 버섯 균사체를 전배양하는 공정;
    상기 전배양된 버섯 균사체를 본배양하는 공정; 및
    본배양된 버섯 균사체 배양물을 체거름하는 공정을 포함하며,
    배양에 있어서 영양원은 탄소원 중 슈크로오스를 포함하여 수행되는 버섯으로부터 유래한 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 버섯 균사체의 대량 배양방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 배양에 있어서 영양원은 무기질원 중 MgCl2를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는 버섯으로부터 유래한 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 버섯 균사체의 대량 배양방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 버섯이 상황버섯이며 배양에 있어서 본배양 시간은 3일 이내로 수행되는 것을 특징으로 하는 버섯으로부터 유래한 알코올 가수분해효소 활성을 갖는 버섯 균사체의 대량 배양방법.
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