JP2008118985A - 溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】溶菌酵素阻害剤及び溶菌抑制剤は、枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分としている。YoeBタンパク質としては、例えば、枯草菌由来の特定なアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。該遺伝子を組み込んだ形質転換体は高分子量のポリ−ガンマ−グルタミン酸を製造することができる。
【選択図】なし
Description
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(a)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号6に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
さらに、本発明に係る溶菌抑制剤は、特に枯草菌の溶菌を抑制することができる。枯草菌としては、野生型の枯草菌に限定されず、例えば少なくとも1種以上の分泌型プロテアーゼを欠損した変異株を挙げることができる。
(a)配列番号55に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号55に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号55に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(a)配列番号57に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号57に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号57に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(a)配列番号59に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号59に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号59に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
本発明に係る溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びPGAの分解抑制剤は、枯草菌YoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分としている。
〔実施例1〕YoeBタンパク質と溶菌酵素との相互作用検討
本実施例では、YoeB遺伝子(配列番号1)によりコードされるYoeBタンパク質(配列番号2)と、CwlE遺伝子(配列番号3)によりコードされるCwlEタンパク質との相互作用を検討した。
本実施例では、溶菌酵素のもつ細胞壁溶解活性に対してYoeBタンパク質がどのように作用するのかを、液体中における活性測定により調べた。本実施例では、実施例1と同様にして調製した細胞壁成分を基質として、YoeBタンパク質の存在下又は非存在下でCwlEのC末端側活性ドメイン(CwlECTD)の細胞壁溶解活性を測定した。
本実施例では、実施例1と同様にして調製した細胞壁成分を基質として、YoeBタンパク質の存在下又は非存在下でCwlS、CwlO及びYddHのC末端側活性ドメインの細胞壁溶解活性を測定した。
DL-エンドペプチダーゼ・ドメイン(第290番目から終止コドンおよび61bpの転写終結様配列を含む)に相当するcwlS遺伝子の3'末端DNA配列を、プライマーBF-YOJL(gcgcggatcctcaaacattcaaataggttcg:配列番号60)及びKR-YOJL(gcgcggtaccggtcaatcattgtctggta:配列番号61)を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにて増幅した。なお、上記プライマーBF-YOJL及びKR-YOJLにおける下線の塩基配列は、それぞれBamHI及びKpnI制限酵素認識配列を示す。PCRによる増幅後、得られたPCR産物を制限酵素BamHI及びKpnIで処理し、インサートを得た。
DL-エンドペプチダーゼ・ドメイン(第343番目から終止コドンおよび84bpの転写終結様配列を含む)に相当するcwlO遺伝子の3'末端DNA配列を、プライマーBF-YVCE(gcgcggatccgaaggcgcgatcagcgtt:配列番号62)及びKR-YVCE(gcgcggtaccgctcaacacgattaaatgtat:配列番号63)を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにて増幅した。なお、上記プライマーBF-YVCE及びKR-YVCEにおける下線の塩基配列は、それぞれBamHI及びKpnI制限酵素認識配列を示す。
得られたPCR産物を用いて、上記<CwlSのC末端側活性ドメインの調整>と同様な方法によってプラスミドpQEVCEを作製し、pQEVCEを導入した大腸菌M13 (pQEVCE)を得た。得られたM13 (pQEVCE)を用いて、上記<CwlSのC末端側活性ドメインの調整>と同様な方法によって同様にして6His-C-CwlOタンパク質溶液を調製した。
DL-エンドペプチダーゼ・ドメイン(第206番目から終止コドンおよび9bpの非翻訳領域を含む)に相当するYddH遺伝子の3'末端DNA配列を、プライマーBF-YDDH(gcgcggatccgatttctatgaaacggtcatg:配列番号64)及びKR-YDDH(gcgcggtacccactcctagttatttaatgcg:配列番号65)を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにて増幅した。なお、上記プライマーBF-YDDH及びKR-YDDHにおける下線の塩基配列は、それぞれBamHI及びKpnI制限酵素認識配列を示す。
得られたPCR産物を用いて、上記<CwlSのC末端側活性ドメインの調整>と同様な方法によってプラスミドpQEDDHを作製し、pQEDDHを導入した大腸菌M13 (pQEDDH)を得た。得られたM13 (pQEDDH)を用いて、上記<CwlSのC末端側活性ドメインの調整>と同様な方法によって同様にして6His-C-YddHタンパク質溶液を調製した。
細胞壁溶解活性の測定は、実施例2に記載した方法に準じて行った。なお、本実施例では、h-ΔCwlSタンパク質、6His-C-CwlOタンパク質又は6His-C-YddHタンパク質に対してHis-YoeBタンパク質を2倍のモル比で加えた。CwlSタンパク質による細胞壁溶解活性を測定した結果を図4に示し、CwlOタンパク質による細胞壁溶解活性を測定した結果を図5に示し、YddHタンパク質による細胞壁溶解活性を測定した結果を図6に示す。
図4〜6に示すように、YoeBタンパク質は、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及びYddHタンパク質といった溶菌酵素における細胞壁溶解活性も抑制できることが明らかになった。特に、2倍のモル比でYoeBタンパク質を作用させることによって、これら溶菌酵素の細胞壁溶解活性はほぼ100%阻害されることが明かとなった。
本実施例では、8種類の分泌型プロテアーゼを欠損する枯草菌変異株Dpr8(Δepr/ΔwprA/Δmpr/ΔnprB/Δbpr/ΔnprE/Δvpr/ΔaprEにおいて、YoeBタンパク質を過剰に発現させた場合における溶菌抑制効果を検討した。なお、Dpr8株は、既知分泌型プロテアーゼ8種類を欠失しているため野生型と比較して溶菌しやすいといった特徴を有している。
本実施例では、YoeB遺伝子(配列番号1)によりコードされるYoeBタンパク質(配列番号2)によるPGA分解抑制効果を検討した。具体的には、所定の範囲の分子量をもつPGAに対して各種溶菌酵素を作用させたときのPGAの分解(低分子化)を、YoeBタンパク質の存在下或いは非存在下で比較した。なお、本実施例で使用した各種溶菌酵素及びYoeBタンパク質は、実施例2及び3で使用したものを用いた。
以上の結果から、YoeBタンパク質は、細胞壁溶解活性を有する溶菌酵素によるPGA分解活性を阻害し、細胞壁溶解活性を有しないPGA分解酵素によるPGA分解活性を阻害しないことが明らかとなった。
Claims (33)
- 枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分とする、溶菌酵素阻害剤。
- 上記YoeBタンパク質は以下の(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項1記載の溶菌酵素阻害剤。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質 - 枯草菌由来のCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質、YddHタンパク質及び前記タンパク質と機能的に等価なタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一種の溶菌酵素の溶菌活性を阻害することを特徴とする請求項1又は2記載の溶菌酵素阻害剤。
- 上記CwlEタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項3記載の溶菌酵素阻害剤。
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlFタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項3記載の溶菌酵素阻害剤。
(a)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号6に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlSタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項3記載の溶菌酵素阻害剤。
(a)配列番号55に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号55に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号55に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlOタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項3記載の溶菌酵素阻害剤。
(a)配列番号57に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号57に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号57に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記YddHタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項3記載の溶菌酵素阻害剤。
(a)配列番号59に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号59に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号59に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分とする、溶菌抑制剤。
- 上記YoeBタンパク質は以下の(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項9記載の溶菌抑制剤。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質 - 枯草菌の溶菌を抑制することを特徴とする請求項9又は10記載の溶菌抑制剤。
- 上記枯草菌は、少なくとも1種以上の分泌型プロテアーゼを欠損した変異株であることを特徴とする請求項11記載の溶菌抑制剤。
- 枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分とする、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
- 上記YoeBタンパク質は以下の(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項13記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質 - 上記YoeBタンパク質によって、枯草菌由来のCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及び前記タンパク質と機能的に等価なタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一種の溶菌酵素の溶菌活性を阻害することで、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解を抑制することを特徴とする請求項13又は14記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
- 上記CwlEタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項15記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlFタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項15記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
(a)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号6に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlSタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項15記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
(a)配列番号55に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号55に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号55に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlOタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項15記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
(a)配列番号57に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号57に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号57に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子を発現誘導型プロモーターの制御下に発現することで溶菌が抑制された微生物。
- 上記YoeB遺伝子は以下の(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項20記載の微生物。
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質 - 少なくとも1種以上の分泌型プロテアーゼを欠損している請求項20又は21記載の微生物。
- 枯草菌由来の株であることを特徴とする請求項20乃至22いずれか1項記載の微生物。
- ポリ−ガンマ−グルタミン酸産生能を有することを特徴とする請求項20乃至23いずれか1項記載の微生物。
- 上記YoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質によって、枯草菌由来のCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及び前記タンパク質と機能的に等価なタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一種の溶菌酵素の溶菌活性を阻害することで、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の低分子化を抑制することを特徴とする請求項24記載の微生物。
- 上記CwlEタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項25記載の微生物。
(a)配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号4に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlFタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項25記載の微生物。
(a)配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号6に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号6に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlSタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項25記載の微生物。
(a)配列番号55に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号55に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号55に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlOタンパク質は(a)乃至(c)いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項25記載の微生物。
(a)配列番号57に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号57に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
(c)配列番号57に示すアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - ポリ−ガンマ−グルタミン酸産生能を有する微生物を、枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質の存在下に培養し、培地に産生されたポリ−ガンマ−グルタミン酸を回収することを特徴とする、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
- 上記ポリ−ガンマ−グルタミン酸は、上記YoeBタンパク質の非存在下で産生されるポリ−ガンマ−グルタミン酸と比較して高分子量であることを特徴とする請求項30記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
- 上記微生物は、請求項24乃至29いずれか1項記載の微生物であることを特徴とする請求項30又は31記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
- 上記YoeBタンパク質を培地に添加することを特徴とする請求項30乃至32いずれか1項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
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2007
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