JP2008118985A - 溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法 - Google Patents
溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008118985A JP2008118985A JP2007268523A JP2007268523A JP2008118985A JP 2008118985 A JP2008118985 A JP 2008118985A JP 2007268523 A JP2007268523 A JP 2007268523A JP 2007268523 A JP2007268523 A JP 2007268523A JP 2008118985 A JP2008118985 A JP 2008118985A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- acid sequence
- amino acid
- seq
- bacillus subtilis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 title claims abstract description 95
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title claims description 53
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title claims description 51
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 449
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 349
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 104
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 104
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 96
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 81
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 176
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims description 72
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 62
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 28
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 18
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 12
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 10
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 20
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 249
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 39
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 17
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 13
- 101150070375 epr gene Proteins 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 11
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 10
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108700017382 Bacillus subtilis yoeB Proteins 0.000 description 7
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 7
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 101150051250 wprA gene Proteins 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000617708 Escherichia coli M13 Species 0.000 description 4
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 101150001496 yoeB gene Proteins 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 101710099182 S-layer protein Proteins 0.000 description 3
- 101710183296 Surface layer protein Proteins 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 2
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 101150065460 relK gene Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 241000006382 Bacillus halodurans Species 0.000 description 1
- 101100449690 Bacillus licheniformis (strain ATCC 14580 / DSM 13 / JCM 2505 / CCUG 7422 / NBRC 12200 / NCIMB 9375 / NCTC 10341 / NRRL NRS-1264 / Gibson 46) blaSE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 101000588395 Bacillus subtilis (strain 168) Beta-hexosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 101100043757 Bacillus subtilis (strain 168) bpr gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289922 Bacillus subtilis (strain 168) lytF gene Proteins 0.000 description 1
- 101100238373 Bacillus subtilis (strain 168) mpr gene Proteins 0.000 description 1
- 101100460774 Bacillus subtilis (strain 168) nprB gene Proteins 0.000 description 1
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101100381938 Dichelobacter nodosus bprV gene Proteins 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 101710108755 Extracellular serine protease Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 1
- 241000243251 Hydra Species 0.000 description 1
- 241000243328 Hydridae Species 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030397 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase Human genes 0.000 description 1
- 241000620875 Natrialba aegyptia Species 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 101710149136 Protein Vpr Proteins 0.000 description 1
- 108010082913 S-layer proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001931 ampicillin sodium Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 101150039719 cwlO gene Proteins 0.000 description 1
- 101150080450 cwlS gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 101150064197 lytE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150112117 nprE gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 1
- 239000011345 viscous material Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000020138 yakult Nutrition 0.000 description 1
- 238000007805 zymography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】溶菌酵素の細胞壁溶解活性を調節して、微生物の溶菌を抑制する。
【解決手段】溶菌酵素阻害剤及び溶菌抑制剤は、枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分としている。YoeBタンパク質としては、例えば、枯草菌由来の特定なアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。該遺伝子を組み込んだ形質転換体は高分子量のポリ−ガンマ−グルタミン酸を製造することができる。
【選択図】なし
【解決手段】溶菌酵素阻害剤及び溶菌抑制剤は、枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分としている。YoeBタンパク質としては、例えば、枯草菌由来の特定なアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。該遺伝子を組み込んだ形質転換体は高分子量のポリ−ガンマ−グルタミン酸を製造することができる。
【選択図】なし
Description
本発明は、枯草菌に由来する特定の溶菌酵素の溶菌活性を抑制することができる溶菌酵素阻害剤、微生物の溶菌を抑制できる溶菌抑制剤、溶菌が抑制された微生物、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法に関する。
枯草菌の溶菌酵素は、細胞分裂や胞子形成期の母細胞の溶解、胞子の発芽等の生活環の中で重要な役割を果たしている。枯草菌においては、細胞分裂過程や胞子形成過程などに応じて特異的に発現する溶菌酵素が異なっている。これら溶菌酵素の多くは、細胞壁に対する結合ドメインと、細胞壁を溶解するための活性ドメインとを有している。枯草菌の対数増殖期に発現する溶菌酵素としてCwlB（非特許文献１及び２を参照）及びCwlG（非特許文献３及び４を参照）が知られている。また、枯草菌の細胞分裂の最終段階に発現する溶菌酵素としてCwlE（非特許文献５及び６を参照）及びCwlF（非特許文献７及び８）が知られている。
しかしながら、これら枯草菌における溶菌酵素の細胞壁に対する作用機序は完全に理解されているわけではなく、溶菌酵素の活性を抑制する方法は確立されていない。仮に、溶菌酵素の活性を抑制することが可能となれば、微生物の溶菌自体を抑制できることになる。
一方、ポリ−ガンマ−グルタミン酸（以下、PGA）は、グルタミン酸のγ位のカルボシキル基とα位のアミノ基がペプチド結合によって結合した高分子化合物である。PGAは、納豆菌（Bacillus subtilis var.natto）が産生する粘性物質として知られており、種々の性質から近年新たな高分子素材として注目されている。特に、素材としての種々の用途を考慮すると、比較的に高分子量のPGAが望まれている。しかしながら、PGA産生能を有する微生物を利用して比較的に高分子量のPGAを製造するための技術は知られていない。
Kuroda, A. and J. Sekiguchi, 1991, "Molecular cloning and sequencing of a major Bacillus subtilis autolysin gene." J. Bacteriol. 173: 7304-7312
Lazarevic, V., P. Margot, B. Sold, and D. Karamata, 1992, "Sequencing and analysis of the Bacillus subtilis lytRABC divergone: a regulatory unit encompassing the structural gene of the N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase and its modifier." J. Gen. Microbiol. 138: 1949-1961
Margot, P., C. Mauel, and D. Karamata, 1994, "The gene of the N-acetyl-glucosaminidase, a Bacillus subtilis cell wall hydrase not involved in vegetative cell autolysis." J. Bacteriol. 12: 535-545
Rashid, M. H., M. Mori, and J. Sekiguchi, 1995. "Glucosaminidase of Bacillus subtilis: cloning, regulation, primary structure and biochemicalcharacterrization." Microbiology 141: 2391-2404
Margot, P., M. Pagni, and D. Karamata, 1999. "Bacillus subtilis 168 gene lytF encodes a γ-D-glutamate-meso-diaminopimelate muropeptidase expressed by the alternative vegetative sigma factor, σD." Microbiology 145: 57-65
Ohnishi, R., S. Ishikawa, and J Sekiguchi, 1999. "Peptidoglycan hydrase LytF plays a role in cell separation with LytE during vegetative growth of Bacillus subtilis." J. Bacteriol. 181: 3178-3184
Ishikawa, S.、 Y. Hara, R. Ohnishi, and J. Sekiguchi, 1998. "Regulation of a new cell wall hydrase gene, CwlF, which affects cell separation in Bacillus subtilis." J. Bacteriol. 180: 2549-2555
Margot, P., M. Wahlen, A. Gholamhuseinian, P. Piggot, and D. Karamata, 1998. "The lytE gene of Bacillus subtilis 168 encodes a cell wall hydrase." J. Bacteriol. 80: 749-752
そこで、本発明は、上述したような課題に鑑みて、溶菌酵素の細胞壁溶解活性を調節することができる溶菌酵素阻害剤及び微生物の溶菌を抑制することができる溶菌抑制剤を提供することを目的とし、比較的に高分子量のPGAを製造できるPGAの製造方法及びPGAの分解抑制方法を提供することを目的としている。
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、機能未知の特定の遺伝子産物が溶菌酵素における細胞壁溶解活性を抑制していること、及び当該遺伝子産物がPGAの分解（低分子化）する酵素の酵素活性を抑制することを見いだし、本発明を完成するに至った。
本発明に係る溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びPGAの分解抑制剤は、枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分としている。
ここで、YoeBタンパク質としては、以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質と定義することができる。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
また、本発明に係る溶菌酵素阻害剤は、特に、CwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質又はYddHタンパク質による溶菌作用を抑制することができる。
ここで、CwlEタンパク質としては、以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質と定義することができる。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
また、CwlFタンパク質としては、以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質と定義することができる。
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
さらに、本発明に係る溶菌抑制剤は、特に枯草菌の溶菌を抑制することができる。枯草菌としては、野生型の枯草菌に限定されず、例えば少なくとも１種以上の分泌型プロテアーゼを欠損した変異株を挙げることができる。
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
さらに、本発明に係る溶菌抑制剤は、特に枯草菌の溶菌を抑制することができる。枯草菌としては、野生型の枯草菌に限定されず、例えば少なくとも１種以上の分泌型プロテアーゼを欠損した変異株を挙げることができる。
また、CwlSタンパク質としては、以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質定義することができる。
（ａ）配列番号５５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５５に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ａ）配列番号５５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５５に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
また、CwlOタンパク質としては、以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質と定義することができる。
（ａ）配列番号５７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５７に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５７に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ａ）配列番号５７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５７に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５７に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
また、YddHタンパク質としては、以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質と定義することができる。
（ａ）配列番号５９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５９に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５９に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ａ）配列番号５９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５９に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５９に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
なお、本発明に係るPGAの分解抑制剤は、上記溶菌酵素のうちCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質又はCwlOタンパク質によるポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解を抑制することができる。なお、上記溶菌酵素のうちYddHタンパク質は、CwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質及びCwlOタンパク質とは異なりPGAの分解活性を示さない。
さらにまた、本発明に係る微生物は、枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子を発現誘導型プロモーターの制御下に発現することで溶菌が抑制されたものである。特に本発明に係る微生物は、少なくとも１種以上の分泌型プロテアーゼを欠損していることが好ましい。
また、本発明に係る微生物は、PGA産生能を有することが好ましい。本発明に係る微生物においては、Yoebタンパク質によって上記溶菌酵素のPGA分解活性を抑制することができる。ここで、PGA分解活性を抑制する溶菌酵素としては、例えば枯草菌由来のCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及び前記タンパク質と機能的に等価なタンパク質を挙げることができる。
一方、本発明に係るPGAの製造方法は、PGA産生能を有する微生物を、枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質の存在下に培養し、培地に産生されたPGAを回収するものである。本発明に係るPGAの製造方法は、枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子を発現誘導型プロモーターの制御下に発現する微生物を使用するものであっても良いし、培地にYoeBタンパク質を添加するものであってもよい。本発明に係るPGAの製造方法においては、Yoebタンパク質によってPGA分解酵素におけるPGA分解活性が抑制された状態で上記微生物がPGAを産生する。
本発明によれば、例えば枯草菌由来の溶菌酵素の活性を効果的に抑制することができる新規な溶菌酵素阻害剤、及び、例えば枯草菌の溶菌を抑制することができる溶菌抑制剤を提供することができる。すなわち、本発明に係る溶菌酵素阻害剤は、枯草菌由来の溶菌酵素をはじめとして、各種の溶菌酵素の溶菌活性を阻害することができる。また、本発明に係る溶菌抑制剤は、枯草菌をはじめとして各種の微生物の溶菌を抑制することができる。
また、本発明によれば、溶菌酵素の作用による溶菌が抑制された微生物を提供することができる。本発明に係る微生物によれば、溶菌が抑制されているため、例えば物質生産の宿主として使用することによって当該物質の生産性を向上させることができる。
さらに、本発明によれば、溶菌酵素の作用によるPGAの分解を抑制するPGAの分解抑制剤を提供することができる。また、本発明によれば、野生株と比較して高分子量のPGAを製造する方法を提供することができる。
以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。
本発明に係る溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びPGAの分解抑制剤は、枯草菌YoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分としている。
本発明に係る溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びPGAの分解抑制剤は、枯草菌YoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分としている。
枯草菌YoeB遺伝子の塩基配列の一例を配列番号１に示し、配列番号１に示す塩基配列によってコードされるYoeBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、枯草菌YoeB遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質としては、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するポリペプチド（以下、変異型ポリペプチドと称する）であってもよい。ここで、置換、欠失、付加又は挿入するアミノ酸は、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個とすることができる。また、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入される領域としては、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列において24〜181番目の領域を除く領域を挙げることができる。この24〜181番目の領域は、溶菌酵素に結合する領域と考えられるため、当該領域を除く領域であれば１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたとしても、溶菌酵素の溶菌活性に対する抑制活性を保持できるものと考えられる。
また、枯草菌YoeB遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質としては、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するポリペプチドからなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するポリペプチド（以下、同様に、変異型ポリペプチドと称する）であってもよい。ここで、相同性の値は、複数のアミノ酸配列間の相同性を演算するソフトウェア（例えば、DANASYSやBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を意味する。
また、枯草菌YoeB遺伝子としては、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドに限定されず、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、変異型ポリヌクレオチドと称する）も含まれる。変異型ポリヌクレオチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するポリペプチド（以下、変異型ポリペプチドと称する）をコードすることとなる。
ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件下としては、例えば、相同性が高いＤＮＡ同士(例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士)がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。具体的に、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。変異型ポリヌクレオチドは、枯草菌に由来する野生型のYoeB遺伝子に対して所定の突然変異を導入することによって取得することができる。突然変異を導入する手法は、特に限定されないが、いわゆる部位特異的突然変異導入方法を適用することができる。
また、上述した各種の変異型ポリペプチドが溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するか否かは、以下のようにして判別することができる。すなわち、変異型ポリペプチドをコードする遺伝子を、野生型YoeB遺伝子と置換した変異株又は野生型YoeB遺伝子を破壊するとともに変異型ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した変異株を作製する。この変異株を培養して形態観察する。変異型ポリペプチドが溶菌酵素の溶菌活性に対する抑制活性を有する場合には、変異株の形態が野生型に比較して丸くなる。一方、変異型ポリペプチドが溶菌酵素の溶菌活性に対する抑制活性を有しない場合には、変異株の形態が野生型と同様に桿状となる。このように、変異型ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する変異株の形態を観察することによって、変異型ポリペプチドが溶菌酵素の溶菌活性を抑制する活性を有するか否か判別することができる。
一方、本発明に係る溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びPGAの分解抑制剤は、枯草菌由来のYoeB遺伝子がコードするタンパク質に限定されず、枯草菌とは異なる微生物から単離された、枯草菌YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分とするものであってもよい。枯草菌以外の微生物としては、例えば、Bacillus licheniformis等の微生物を挙げることができる。
以下、これら枯草菌以外の微生物からYoeB遺伝子の相同遺伝子を単離する一手法を説明する。しかしながら、当業者は、以下の手法に限定されず、定法に従って目的とする相同遺伝子を単離することができる。
先ず、塩基配列情報を格納したデータベースを用いて、配列番号１に示す塩基配列をクエリー配列として相同性の高い遺伝子を特定する。次に、特定した遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーを設計するとともに化学的に合成する。次に、対象の微生物から定法に従ってゲノムDNAを抽出する。抽出したゲノムDNAを鋳型として上記プライマーを用いてPCRによって、目的とするYoeB遺伝子の相同遺伝子を増幅し、単離することができる。
単離したYoeB遺伝子の相同遺伝子がYoeBタンパク質と同様な機能を有するか否かは、単離したYoeB遺伝子の相同遺伝子を組み込んだ発現ベクターを調製し、対象の微生物に形質転換し、上記相同遺伝子が発現する条件下で形質転換微生物を培養したときの形態を観察することによって確認することができる。単離したYoeB遺伝子の相同遺伝子がYoeBタンパク質と同様な機能を有する場合には、上記形質転換微生物が野生型と比較して丸くなる。一方、単離したYoeB遺伝子の相同遺伝子がYoeBタンパク質と同様な機能を有する場合には、上記形質転換微生物が野生型と同等な形態を示す。
上述した枯草菌YoeB遺伝子及び当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子を用いることによって、本発明に係る溶菌酵素阻害剤及び溶菌抑制剤の主成分となるYoeBタンパク質を調製することができる。上述した枯草菌YoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子を用いたYoeBタンパク質の生産は、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターに当該遺伝子を組込み、得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換することにより行えばよい。
ベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、特に限定されないが、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社）等を使用することができる。また、枯草菌を宿主にする場合、特に限定されないが、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol,Biocem., 59,2172-2175, 1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等を使用することができる。
宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されないがバチルス属（枯草菌）等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、ストレプトマイセス属等の放線菌、サッカロマイセス属等の酵母あるいはアスペルギルス属等のカビが挙げられる。
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、限外ろ過濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等によって、溶菌酵素の溶菌活性を抑制する活性を有するかたちでYoeBタンパク質を得ることができる。
本発明に係る溶菌酵素阻害剤及び溶菌抑制剤は、微生物を培養している培地又は微生物を懸濁した緩衝液に添加されると、当該微生物が発現した溶菌酵素の活性を低下させることができ、当該微生物の溶菌を抑制することができる。本発明に係る溶菌酵素阻害剤が阻害する溶菌酵素としては、特に限定されないが、細胞周期に依存して発現する溶菌酵素、細胞周期に非依存的に発現する溶菌酵素を挙げることができる。特に本発明に係る溶菌酵素阻害剤は、枯草菌における溶菌酵素であるCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及びYddHタンパク質による溶菌作用を抑制することができる。CwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及びYddHタンパク質は、枯草菌の細胞分裂の最終段階に、細胞分裂面及び菌体の両極に発現する溶菌酵素であることが知られている。CwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及びYddHタンパク質は、それぞれN末端側から順にシグナルペプチド、細胞壁結合ドメイン及び細胞壁溶解活性ドメイン（D,L-エンドペプチダーゼ・ドメイン）を有している。本発明に係る溶菌酵素阻害剤及び溶菌抑制剤は、これらCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及びYddHタンパク質における細胞壁溶解活性ドメインに結合して、CwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及びYddHタンパク質の細胞壁溶解活性を抑制することで溶菌を抑制することができる。
また、本発明に係るPGAの分解抑制剤は、PGA産生能を有する微生物を培養する際に添加されると、PGAの分解活性を有する溶菌酵素のPGA分解活性を低下させることがき、当該微生物が産生するPGAの低分子量化を防止することができる。本発明に係るPGAの分解抑制剤が阻害する溶菌酵素としては、例えば、CwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質及びCwlOタンパク質を挙げることができる。これら溶菌酵素によるPGA分解活性を低下させることによって、比較的に高分子量のPGAを製造することができる。
CwlEタンパク質をコードする遺伝子（CwlE遺伝子）の塩基配列を配列番号３に示し、CwlEタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、CwlFタンパク質をコードする遺伝子（CwlF遺伝子）の塩基配列を配列番号５に示し、CwlFタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。CwlSタンパク質をコードする遺伝子（CwlS遺伝子）の塩基配列を配列番号５４に示し、CwlSタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５５に示す。CwlOタンパク質をコードする遺伝子（CwlO遺伝子）の塩基配列を配列番号５６に示し、CwlOタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５７に示す。YddHタンパク質をコードする遺伝子（YddH遺伝子）の塩基配列を配列番号５８に示し、YddHタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５９に示す。
枯草菌由来のCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質又はYddHタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、配列番号４、６、５５、５７又は５９に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質や、配列番号４、６、５５、５７又は５９に示すアミノ酸配列に対して７０％以上、８０％以上または、９０％以上の相同性を有するタンパク質、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、特に好ましくは９７％以上、より特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質を意味する。本発明に係る溶菌酵素阻害剤は、これらのタンパク質に対しても作用することができる。
ここで、置換、欠失、付加又は挿入するアミノ酸は、例えば１〜４０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個とすることができる。また、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入される領域としては、例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列において371〜488番目の領域、配列番号６に示すアミノ酸配列において218〜334番目の領域、配列番号５５に示すアミノ酸配列において1〜290番目の領域、配列番号５７に示すアミノ酸配列において1〜343番目の領域、配列番号５９に示すアミノ酸配列において1〜206番目の領域を除く領域を挙げることができる。この配列番号４に示すアミノ酸配列における371〜488番目の領域、配列番号６に示すアミノ酸配列における218〜334番目の領域、配列番号５５に示すアミノ酸配列において1〜290番目の領域、配列番号５７に示すアミノ酸配列において1〜343番目の領域、配列番号５９に示すアミノ酸配列において1〜260番目の領域は、本発明に係る溶菌酵素阻害剤が結合する領域と考えられるため、当該領域を除く領域であれば１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたとしても、本発明に係る溶菌酵素阻害剤における抑制活性を保持できるものと考えられる。
以上説明したように、本発明に係る溶菌酵素阻害剤及び溶菌抑制剤によれば、YoeBタンパク質がCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質又はYddHタンパク質といった溶菌酵素の細胞壁溶解活性ドメインに結合することによって、当該溶菌酵素の細胞壁溶解活性を抑制することができる。これにより、上記溶菌酵素を発現する微生物は、溶菌が抑えられ比較的に長時間の培養が可能となる。例えば、枯草菌などの微生物を用いて物質生産を行う場合、個々の菌体の培養時間を長くできれば、物質の生産量も向上するといえる。所望の物質を生産する微生物を培養する際に、本発明に係る溶菌酵素阻害剤を添加することによって、当該物質の生産効率の向上を期待することができる。
本発明に係る溶菌抑制剤は、広く微生物に適用することができるが、特に、枯草菌等のBacillus属に属する細菌に対して適用することが好ましい。本発明に係る溶菌抑制剤が対象とする微生物は、野生型の微生物に限定されず、例えば種々の突然変異を有する変異株を対象とすることもできる。本発明に係る溶菌抑制剤が対象とする微生物の一例としては、少なくとも１種以上の分泌型プロテアーゼを欠損した変異株を挙げることができる。この変異株は、分泌型プロテアーゼを欠損しているので、有用タンパク質等の物質を菌体外に産生する宿主として好適である。この変異株を用いて当該物質を生産する系において、本発明に係る溶菌抑制剤を添加することによって変異株の溶菌を抑制することができ、比較的長期に亘って変異株を培養することができる。その結果、当該物質の生産効率を向上させることができ、物質の製造コストを低減することができる。
また、本発明に係る溶菌酵素阻害剤及び溶菌抑制剤の添加量は、特に限定されず、CwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質又はYddHタンパク質といった溶菌酵素の細胞壁溶解活性ドメインに結合しうる範囲で適宜規定することができる。
また、以上説明したように、本発明に係るPGAの分解抑制剤によれば、YoeBタンパク質がCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質又はCwlOタンパク質といったPGAの分解活性を有する溶菌酵素の細胞壁溶解活性ドメインに結合することによって、当該溶菌酵素によるPGA分解活性を抑制することができる。これにより、PGA産生能を有し、上記溶菌酵素を発現する微生物は、PGAの分解抑制剤の存在下において培養されると、比較的に高分子量のPGAを産生することができる。ここで、比較的に高分子量のPGAとは、本発明に係るPGAの分解抑制剤の非存在下において微生物が産生したPGAの平均分子量と比較して有意に高分子量であることを意味する。また、本発明に係るPGAの分解抑制剤は、上述したように微生物の溶菌を抑制することもできるため、比較的に高分子量のPGAを長時間に亘って産生することができる。
本発明に係るPGAの分解抑制剤は、PGA産生能を有する微生物に広く利用することができる。ここで、PGA産生能を有する微生物としては、Bacillus subtilis var.natto、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus anthracis、Bacillus haloduransや、Natrialba aegyptiaca、Hydra等を挙げることができる。
一方、本発明によれば、上述した溶菌酵素阻害剤或いは溶菌抑制剤をコードする遺伝子が発現誘導型プロモーターの制御下に発現するように改変した微生物を提供することができる。本発明に係る微生物を発現誘導条件下で培養することによって、上述した溶菌抑制剤が培地中に分泌される結果、比較的に長期間に亘って溶菌を抑制することができる。
したがって、このように構成された本発明に係る微生物を利用して、有用タンパク質等の物質を生産することによって当該物質の生産効率を高めることができる。特に、本発明に係る微生物は、少なくとも１種以上の分泌型プロテアーゼを欠損した変異株を宿主とし、上述した溶菌酵素阻害剤或いは溶菌抑制剤をコードする遺伝子が発現誘導型プロモーターの制御下に発現するように改変したものであることが好ましい。このように構成することによって、生産対象の有用タンパク質等の分解を防止することができ、より優れた生産効率を達成することができる。
ここで発現誘導型プロモーターとは、所定の物質の存在を条件として下流に位置する遺伝子の発現を亢進する機能を有するプロモーターを意味する。本発明に係る微生物において、発現誘導型プロモーターとしては、特に限定されず、一例としてlacオペロンのリプレッサーであるlaclによって制御されIPTGの存在下で下流遺伝子の発現誘導するプロモーター（Pspac）を挙げることができる。
特に、本発明に係る微生物としては、PGA産生能を有する微生物に対して、上述したPGAの分解抑制剤をコードする遺伝子が発現誘導型プロモーターの制御下に発現するように改変されたものであることが好ましい。この微生物を培地に培養することによって、比較的に高分子量のPGAを製造することができる。なお、この微生物を培地に培養して高分子量のPGAを製造するに際して、当該培地に対して別途準備したPGAの分解抑制剤を添加しても良い。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕YoeBタンパク質と溶菌酵素との相互作用検討
本実施例では、YoeB遺伝子（配列番号１）によりコードされるYoeBタンパク質（配列番号２）と、CwlE遺伝子（配列番号３）によりコードされるCwlEタンパク質との相互作用を検討した。
〔実施例１〕YoeBタンパク質と溶菌酵素との相互作用検討
本実施例では、YoeB遺伝子（配列番号１）によりコードされるYoeBタンパク質（配列番号２）と、CwlE遺伝子（配列番号３）によりコードされるCwlEタンパク質との相互作用を検討した。
具体的には、先ず、YoeB-3×FLAGタンパク質をIPTGによる誘導によって発現するWE1YoeB3FL株と、CwlE-3×FLAGタンパク質をIPTGによる誘導によって発現するWE1E3FL株とを構築した。WE1YoeB3FL株及びWE1E3FL株は、WE1株（Yamamoto, H. et al., 2003 "Localization of the vegetative cell wall hydrases LytC, LytE, LytF on the Bacillus subtilis cell surface and stability of these enzymes to cell wall-bound or extracellular proteases." J. Becteriol. 185:6666-6677）を用いて作製した。このWE1株は、minor extracellular serine protease であるepr遺伝子をテトラサイクリン耐性遺伝子を挿入することで欠損するとともにcell wall associate protease であるwprA遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子を挿入することで欠損した遺伝子型を有している。
WE1YoeB3FL株は、IPTG誘導型プロモーターの下流にYoeB-3×FLAGタンパク質をコードする遺伝子を配したベクターpCA3FLYoeBをWE1株に形質転換することによって作製した。WE1E3FL株は、IPTG誘導型プロモーターの下流にCwlE-3×FLAGタンパク質をコードする遺伝子を配したベクターpCA3FLCEをWE1株に形質転換することによって作製した。なお、3×FLAGと融合されたタンパク質は、sigma社製のanti-FLAG M2 monoclonal antibodyによって検出することができる。
次に、構築したWE1YoeB3FL株及びWE1E3FL株からそれぞれ表層タンパク質を抽出した。具体的には、各株をそれぞれLB寒天培地に植菌し、37℃で12時間前々培養を行った後、得られたシングルコロニーを5mlのLB液体培地に植菌して30℃で10時間前培養を行った。前培養後、50mlのLB液体培地にOD600の値が0.01となるように植菌し、OD600の値が2.0になるまで本培養を行った。培養終了後、培養液を10000rpmで10分間の条件で遠心分離した。上清を取り除き、25mM Tris-HCl(pH7.2)で洗浄した。洗浄後の沈殿を10μl/ODとなるように3M LiCl(25mM Tris-HCl、pH7.2)に懸濁し、氷上に20分間静置した。その後、4℃、10000rpmで10分間の条件で遠心分離した。上清を回収し、終濃度が5％となるようにTCA（トリクロロ酢酸）を加えてよく懸濁し、氷上に60分間静置した。その後、4℃、15000rpmで5分間の条件で遠心分離を行った。上清を取り除き、沈殿を70％エタノールでリンスをしてTCAを充分に除去した。以上のようにして、WE1YoeB3FL株及びWE1E3FL株から表層タンパク質をそれぞれ抽出した。
次に、TBSバッファー（50mM Tris-HCl、150mM NaCl(pH7.4)）に置換したアフィニティーゲル（Anti-FLAG M2 Affinity Gel Freezer-Safe (Sigma社製)）を200μl加えて混合した。4℃で1時間緩やかに（8rpm）撹拌した。その後、5000rpmで1分間の条件で遠心分離した。沈殿したゲルを吸引しないように留意ながら、上清を除去した。その後、TBSバッファーを500μl加えて懸濁した。その後、ゲルをSpin Column(Micro Bio Spin Chromatography Columns (BIO RAD社製))に移し、1000gで30秒間の条件で遠心してゲルをトラップさせた。その後、500μlのTBSバッファーで3回洗浄した。次に、Glycine HCl elution buffer(0.1M glycine-HCl)を100μlずつ加え、よく撹拌した。1分後、1000gで30秒間で溶出し、これを2回繰り返したものを併せて溶出溶液を得た。
次に、得られた溶出溶液についてSDS-PAGEを用いてバンドパターンを調べた。なお、電気泳動には、菌体OD600＝200から抽出した量に相当するタンパク質を各レーンにチャージした。結果を図１Aに示す。図１Aにおいて、レーン１はWE1YoeB3FL株から抽出した抗FLAG抗体で精製した表層タンパク質であり、レーン２はWE1E3FL株から抽出した抗FLAG抗体で精製した表層タンパク質である。
図１Aのレーン１から判るように、WE1YoeB3FL株から抽出した抗FLAG抗体で精製した表層タンパク質には、CwlEタンパク質、CwlFタンパク質及びYojLタンパク質の位置にバンドが検出された。このときの積算値とその比率とを表１に示した。
この結果より、菌体菌体OD600が2.0の時にYoeBタンパク質は、CwlEタンパク質、CwlFタンパク質及びYojLタンパク質と結合していることが示された。なお、YojLタンパク質は、peptidoglycan hydrolase（DL-endopeptidase II family）として知られている成分である。また、図１Aのレーン２から判るように、WE1E3FL株から抽出した抗FLAG抗体で精製した表層タンパク質には、YoeBタンパク質の位置にバンドが検出された。
また、YoeBタンパク質と相互作用しているタンパク質がCwlEタンパク質であることを確認するため、基質として細胞壁成分を使用したザイモグラフを行った。細胞壁成分は以下のように調製した。すなわち、先ず、枯草菌168株を４Lの系で培養して集菌した後、菌体を4M LiCl溶液に懸濁し、15分間煮沸した。室温まで冷却した後、溶液にガラスビーズ（φ0.1mm）を加え、ホモジェナイザーを用いて１時間破砕し、続いて超音波を用いて30分間破砕した。得られた破砕液を静置して上清のみを回収した。3000rmpで5分間遠心分離した後の上清を回収することで、ガラスビーズを完全に除去した。次に、13000rpmで10分間遠心分離することで沈殿画分に細胞壁成分を回収した。次に、4%(w/v)のSDS溶液に沈殿画分を懸濁し、15分間煮沸した。室温まで冷却した後、SDSを完全に除去できるまでイオン交換水で洗浄した。得られた溶液を細胞壁成分溶液とした。なお、細胞壁成分溶液の濃度は、細胞壁成分溶液の540nmにおけるODを測定し、OD540の値が1.0のとき1.1mg/mlとして算出した。
ザイモグラフィは以下のように行った。先ず、SDS-PAGEを行う際に、separation gelに終濃度0.05％となるように上述した細胞壁成分を加えた。泳動終了後、37℃で1〜16時間の条件でゲルをRenaturation Buffer（25mM Tris-HCl(pH7.2)、1％Triton-X100）内で緩やかに振とうした。その後、染色液（0.01％ methylene blue、0.01％KOH）に浸して室温で穏やかに振とうし、イオン交換水で活性バンドが目視できるまで脱色した。
結果を図１Bに示す。図１Bにおいて、レーン１はWE1YoeB3FL株から抽出した抗FLAG抗体で精製した表層タンパク質であり、レーン２は基質として細胞壁成分を加えたザイモグラフである。図１Bのレーン２に示すように、YoeBタンパク質と相互作用していたタンパク質として、CwlEタンパク質を同じ位置にほぼ同じ強度でバンドが検出された。
以上、図１A及びBの結果から、YoeBタンパク質とCwlEタンパク質が結合することが示された。
次に、YoeBタンパク質がCwlEタンパク質のどのドメインに結合しているのかを調べた。なお、CwlEタンパク質は、N末端から順にシグナルペプチド、細胞壁結合ドメイン及び活性ドメインを有している。そこで、活性ドメインを有しない、N末端から順にシグナルペプチド、細胞壁結合ドメイン及びFLAGタグからなる変異型CwlE-3×FLAGタンパク質をIPTGによる誘導によって発現するWE15xLysM3FL株を構築した。
そして、上述したWE1E3FL株及びWE15xLysM3FL株を用いて上述した実験と同様にして、抗FLAG抗体を用いて表層タンパク質を精製し、SDS-PAGEを用いてバンドパターンを調べた。なお、電気泳動に際しては、WE1E3FL株の場合には菌体OD600＝200から抽出した量に相当するタンパク質を、WE15xLysM3FL株の場合には菌体OD600＝2000から抽出した量に相当するタンパク質を各レーンにチャージした。
結果を図２Aに示す。図２Aのレーン１はWE1E3FL株から抽出した抗FLAG抗体で精製した表層タンパク質であり、レーン２はWE15xLysM3FL株から抽出した抗FLAG抗体で精製した表層タンパク質である。図２Aから判るように、レーン１ではYoeBタンパク質のバンドが検出されているがレーン２では検出されていない。この結果から、YoeBタンパク質は、CwlEタンパク質における活性ドメインに結合していることが明かとなった。
一方、図１Aに示したように、YoeBタンパク質はCwlFタンパク質とも結合していることが明かとなった。そこで、CwlFタンパク質についても、YoeBタンパク質との相互作用部位を検討した。なお、CwlFタンパク質は、枯草菌における主要な細胞壁溶解酵素であり、CwlEタンパク質と同様な局在パターン（すなわち、分裂面及び両極）を示すことが知られている。
本実験では、CwlF-3×FLAGタンパク質をIPTGによる誘導によって発現するWE1F3FL株と、活性ドメインを有しない、N末端から順にシグナルペプチド、細胞壁結合ドメイン及びFLAGタグからなる変異型CwlF-3×FLAGタンパク質をIPTGによる誘導によって発現するWE13xLysM3FL株を構築した。これらWE1F3FL株及びWE13xLysM3FL株を用いて、上述した実験と同様にして、抗FLAG抗体を用いて表層タンパク質を精製し、SDS-PAGEを用いてバンドパターンを調べた。
結果を図２Bに示す。図２Bのレーン１はWE1F3FL株から抽出した抗FLAG抗体で精製した表層タンパク質であり、レーン２はWE13xLysM3FL株から抽出した抗FLAG抗体で精製した表層タンパク質である。図２Bから判るように、レーン１ではYoeBタンパク質のバンドが検出されているがレーン２では検出されていない。この結果から、YoeBタンパク質は、CwlFタンパク質に対してもCwlEタンパク質と同様に、活性ドメインに結合していることが明かとなった。
〔実施例２〕溶菌酵素活性に対するYoeBタンパク質の抑制作用１
本実施例では、溶菌酵素のもつ細胞壁溶解活性に対してYoeBタンパク質がどのように作用するのかを、液体中における活性測定により調べた。本実施例では、実施例１と同様にして調製した細胞壁成分を基質として、YoeBタンパク質の存在下又は非存在下でCwlEのC末端側活性ドメイン(CwlECTD)の細胞壁溶解活性を測定した。
本実施例では、溶菌酵素のもつ細胞壁溶解活性に対してYoeBタンパク質がどのように作用するのかを、液体中における活性測定により調べた。本実施例では、実施例１と同様にして調製した細胞壁成分を基質として、YoeBタンパク質の存在下又は非存在下でCwlEのC末端側活性ドメイン(CwlECTD)の細胞壁溶解活性を測定した。
本実施例において、細胞壁溶解活性測定には、全て20mM MES buffer(pH6.5)を用いた。この測定用bufferで、OD540=0.6に相当する量の細胞壁成分を洗浄し、遠心分離して細胞壁を沈澱させた。上清を取り除き、沈澱に2mlの測定用bufferを加えて懸濁し、最終的にOD540=0.3となるように細胞壁成分を調整し、基質溶液とした。
活性測定に際しては、His-tagを融合させたCwlEのC末端側活性ドメイン(His-CwlECTD)を基質溶液に作用させ、基質溶液の濁度を測定した。すなわち、His-CwlECTDによる細胞壁溶解活性を濁度の減少率として評価した。基質溶液の濁度は、V-560型紫外可視分光光度計（日本分光社製）を用いて測定した。濁度の減少率は、測定開始後0分のOD540値を100％とし、5、10、20及び30分後のOD540値から算出した。
本実施例では、基質溶液に2nmol（29μg）のHis-CwlECTDを加えたサンプル、基質溶液に2nmol（29μg）のHis-CwlECTD及び2nmol（38.1μg）のHis-YoeBを加えたサンプル、並びに基質溶液に2nmol（29μg）のHis-CwlECTD及び4nmol（76.1μg）のHis-YoeBを加えたサンプルについて測定した。
反応時間と濁度の減少率との関係を図３に示す。図３から判るように、基質溶液にHis-CwlECTDを加えたサンプルでは、測定開始直後からOD540値が著しく減少したことから、His-CwlECTDが細胞壁に対して強い溶解活性を持つことが分かった。これに対して、基質溶液に等モル量でHis-CwlECTD及びHis-YoeBを加えたサンプルでは、測定開始直後からOD540値の減少はみられるが、His-CwlECTDのみを加えたサンプルと比べて緩やかな曲線が得られたことから、等モル量のHis-YoeBを加えたことによりHis-CwlECTDの活性が抑制されたといえる。さらに、His-CwlECTDとHis-YoeBとを1:2のモル比で加えたサンプルの場合、測定開始直後からOD540値の減少はほとんどみられず、ほぼ一定であった。このことから、His-CwlECTDに対して2倍のモル量のHis-YoeBを加えることにより、His-CwlECTDの活性はほぼ100％阻害されることが分かった。
〔実施例３〕溶菌酵素活性に対するYoeBタンパク質の抑制作用２
本実施例では、実施例１と同様にして調製した細胞壁成分を基質として、YoeBタンパク質の存在下又は非存在下でCwlS、CwlO及びYddHのC末端側活性ドメインの細胞壁溶解活性を測定した。
本実施例では、実施例１と同様にして調製した細胞壁成分を基質として、YoeBタンパク質の存在下又は非存在下でCwlS、CwlO及びYddHのC末端側活性ドメインの細胞壁溶解活性を測定した。
＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞
DL-エンドペプチダーゼ・ドメイン(第290番目から終止コドンおよび61bpの転写終結様配列を含む)に相当するcwlS遺伝子の3'末端DNA配列を、プライマーBF-YOJL（gcgcggatcctcaaacattcaaataggttcg：配列番号６０）及びKR-YOJL（gcgcggtaccggtcaatcattgtctggta：配列番号６１）を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにて増幅した。なお、上記プライマーBF-YOJL及びKR-YOJLにおける下線の塩基配列は、それぞれBamHI及びKpnI制限酵素認識配列を示す。PCRによる増幅後、得られたPCR産物を制限酵素BamHI及びKpnIで処理し、インサートを得た。
DL-エンドペプチダーゼ・ドメイン(第290番目から終止コドンおよび61bpの転写終結様配列を含む)に相当するcwlS遺伝子の3'末端DNA配列を、プライマーBF-YOJL（gcgcggatcctcaaacattcaaataggttcg：配列番号６０）及びKR-YOJL（gcgcggtaccggtcaatcattgtctggta：配列番号６１）を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにて増幅した。なお、上記プライマーBF-YOJL及びKR-YOJLにおける下線の塩基配列は、それぞれBamHI及びKpnI制限酵素認識配列を示す。PCRによる増幅後、得られたPCR産物を制限酵素BamHI及びKpnIで処理し、インサートを得た。
次いで、プラスミドpQE30をBamHI及びKpnIで処理し、上記のインサートと連結し、プラスミドpQEΔojLを構築した。なお、プラスミドpQE30は、大腸菌においてHisタグ融合タンパク質を発現させるために開発されたプラスミドである。
インサート部分のDNA配列が正しく挿入されたか否かをシーケンスにより確認した。正しく挿入されたことを確認できたプラスミドpQEΔojLを、コンピテント法により大腸菌JM109株に導入した。以後、プラスミドpQEΔojLが導入された大腸菌M13(pREP4)株を「M13 (pQEΔojL)」と呼ぶ。
M13(pQEΔojL)を、100μg/mlのアンピシリン、25μg/mlのカナマイシン、2%のグルコースを含むLB培地(200ml)にて、37℃で培養した。培養液のOD600が1.0のとき、最終濃度が1mMになるようにIPTG(isopropyl 1-thio-β-D-galactoside)を培地に添加し、さらに5時間培養した。培養後、培養物を遠心分離(8000rpm, 10分, 4℃)に供することで集菌し、菌体を開始バッファー(5ml；10mM imidazoleを含む1×リン酸バッファー(pH7.0))に懸濁した。
次いで、超音波破砕(on:0.5秒、off:1秒/on:30秒、off:30秒、計10分)に供した後、さらに遠心分離(12,000rpm、10分、4℃)に供した。得られた上清を0.45μmフィルターにて濾過した。濾過により抽出したh-ΔCwlSタンパク質の精製は、GEヘルスケアバイオサイエンス社のHis-Trapカラム精製の定法に従い行った。精製したh-ΔCwlSタンパク質溶液を20mMのリン酸バッファー(pH 7.0)でさらに透析し、h-ΔCwlSタンパク質溶液を調製した。
＜CwlOのC末端側活性ドメインの調整＞
DL-エンドペプチダーゼ・ドメイン(第343番目から終止コドンおよび84bpの転写終結様配列を含む)に相当するcwlO遺伝子の3'末端DNA配列を、プライマーBF-YVCE（gcgcggatccgaaggcgcgatcagcgtt：配列番号６２）及びKR-YVCE（gcgcggtaccgctcaacacgattaaatgtat：配列番号６３）を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにて増幅した。なお、上記プライマーBF-YVCE及びKR-YVCEにおける下線の塩基配列は、それぞれBamHI及びKpnI制限酵素認識配列を示す。
得られたPCR産物を用いて、上記＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によってプラスミドpQEVCEを作製し、pQEVCEを導入した大腸菌M13 (pQEVCE)を得た。得られたM13 (pQEVCE)を用いて、上記＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によって同様にして6His-C-CwlOタンパク質溶液を調製した。
DL-エンドペプチダーゼ・ドメイン(第343番目から終止コドンおよび84bpの転写終結様配列を含む)に相当するcwlO遺伝子の3'末端DNA配列を、プライマーBF-YVCE（gcgcggatccgaaggcgcgatcagcgtt：配列番号６２）及びKR-YVCE（gcgcggtaccgctcaacacgattaaatgtat：配列番号６３）を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにて増幅した。なお、上記プライマーBF-YVCE及びKR-YVCEにおける下線の塩基配列は、それぞれBamHI及びKpnI制限酵素認識配列を示す。
得られたPCR産物を用いて、上記＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によってプラスミドpQEVCEを作製し、pQEVCEを導入した大腸菌M13 (pQEVCE)を得た。得られたM13 (pQEVCE)を用いて、上記＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によって同様にして6His-C-CwlOタンパク質溶液を調製した。
＜YddHのC末端側活性ドメインの調整＞
DL-エンドペプチダーゼ・ドメイン(第206番目から終止コドンおよび9bpの非翻訳領域を含む)に相当するYddH遺伝子の3'末端DNA配列を、プライマーBF-YDDH（gcgcggatccgatttctatgaaacggtcatg：配列番号６４）及びKR-YDDH（gcgcggtacccactcctagttatttaatgcg：配列番号６５）を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにて増幅した。なお、上記プライマーBF-YDDH及びKR-YDDHにおける下線の塩基配列は、それぞれBamHI及びKpnI制限酵素認識配列を示す。
得られたPCR産物を用いて、上記＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によってプラスミドpQEDDHを作製し、pQEDDHを導入した大腸菌M13 (pQEDDH)を得た。得られたM13 (pQEDDH)を用いて、上記＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によって同様にして6His-C-YddHタンパク質溶液を調製した。
DL-エンドペプチダーゼ・ドメイン(第206番目から終止コドンおよび9bpの非翻訳領域を含む)に相当するYddH遺伝子の3'末端DNA配列を、プライマーBF-YDDH（gcgcggatccgatttctatgaaacggtcatg：配列番号６４）及びKR-YDDH（gcgcggtacccactcctagttatttaatgcg：配列番号６５）を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにて増幅した。なお、上記プライマーBF-YDDH及びKR-YDDHにおける下線の塩基配列は、それぞれBamHI及びKpnI制限酵素認識配列を示す。
得られたPCR産物を用いて、上記＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によってプラスミドpQEDDHを作製し、pQEDDHを導入した大腸菌M13 (pQEDDH)を得た。得られたM13 (pQEDDH)を用いて、上記＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によって同様にして6His-C-YddHタンパク質溶液を調製した。
＜細胞壁溶解活性を測定及び結果＞
細胞壁溶解活性の測定は、実施例２に記載した方法に準じて行った。なお、本実施例では、h-ΔCwlSタンパク質、6His-C-CwlOタンパク質又は6His-C-YddHタンパク質に対してHis-YoeBタンパク質を２倍のモル比で加えた。CwlSタンパク質による細胞壁溶解活性を測定した結果を図４に示し、CwlOタンパク質による細胞壁溶解活性を測定した結果を図５に示し、YddHタンパク質による細胞壁溶解活性を測定した結果を図６に示す。
図４〜６に示すように、YoeBタンパク質は、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及びYddHタンパク質といった溶菌酵素における細胞壁溶解活性も抑制できることが明らかになった。特に、２倍のモル比でYoeBタンパク質を作用させることによって、これら溶菌酵素の細胞壁溶解活性はほぼ100％阻害されることが明かとなった。
細胞壁溶解活性の測定は、実施例２に記載した方法に準じて行った。なお、本実施例では、h-ΔCwlSタンパク質、6His-C-CwlOタンパク質又は6His-C-YddHタンパク質に対してHis-YoeBタンパク質を２倍のモル比で加えた。CwlSタンパク質による細胞壁溶解活性を測定した結果を図４に示し、CwlOタンパク質による細胞壁溶解活性を測定した結果を図５に示し、YddHタンパク質による細胞壁溶解活性を測定した結果を図６に示す。
図４〜６に示すように、YoeBタンパク質は、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及びYddHタンパク質といった溶菌酵素における細胞壁溶解活性も抑制できることが明らかになった。特に、２倍のモル比でYoeBタンパク質を作用させることによって、これら溶菌酵素の細胞壁溶解活性はほぼ100％阻害されることが明かとなった。
〔実施例４〕溶菌酵素活性に対するYoeBタンパク質の抑制作用３
本実施例では、８種類の分泌型プロテアーゼを欠損する枯草菌変異株Dpr8（Δepr/ΔwprA/Δmpr/ΔnprB/Δbpr/ΔnprE/Δvpr/ΔaprEにおいて、YoeBタンパク質を過剰に発現させた場合における溶菌抑制効果を検討した。なお、Dpr8株は、既知分泌型プロテアーゼ8種類を欠失しているため野生型と比較して溶菌しやすいといった特徴を有している。
本実施例では、８種類の分泌型プロテアーゼを欠損する枯草菌変異株Dpr8（Δepr/ΔwprA/Δmpr/ΔnprB/Δbpr/ΔnprE/Δvpr/ΔaprEにおいて、YoeBタンパク質を過剰に発現させた場合における溶菌抑制効果を検討した。なお、Dpr8株は、既知分泌型プロテアーゼ8種類を欠失しているため野生型と比較して溶菌しやすいといった特徴を有している。
Dpr8株は以下のように構築した。Dpr8株の構築に際して使用したプライマーの一覧を表２に示す。
また、各遺伝子の欠損用に使用したプライマーを表３に纏めた。
先ず、野生型である枯草菌168株からepr遺伝子を欠損させる方法を説明する。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表２に示したeprfw1とeprUpr、及びeprDNfとeprrv-repの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のepr遺伝子の上流に隣接する0.6kb断片（A）、及び下流に隣接する0.5kb断片（B）をそれぞれ調製した。また別途プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子の上流にプラスミドpUB110（Plasmid 15, 93 (1986)）由来のrepU遺伝子のプロモーター領域（Nucleic Acids Res. 17, 4410 (1989)）を連結した1.2kb断片（C）を調製した。次に、得られた（A）（B）（C）3断片を混合して鋳型とし、表２のプライマーeprfw2とCmrv2を用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（A）（B）（C）の順になる様に結合させ、2.2kbのDNA断片を得た。このDNA断片の末端を平滑化及び5’-リン酸化し、プラスミドpUC118（Methods Enzymol. 153, 3 (1987)）のSmaI制限酵素部位に挿入してepr遺伝子欠失用プラスミドpUC118-CmrΔeprを構築した。なお、上記1.2kb断片（C）は、repUfwとrepUr-Cmのプライマーセット（表２）及び鋳型としてプラスミドpUB110を用いて調製したrepU遺伝子プロモーター領域を含む0.4kb断片（D）と、CmUf-repとCmrv1のプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpC194を用いて調製したクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.8kb断片（E）とを混合して鋳型とし、表２に示したプライマーrepUfwとCmrv1を用いたSOE-PCRを行なうことによって調製した。
次に、上述のように作製したepr遺伝子欠失用プラスミドpUC118-CmrΔeprをコンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）によって枯草菌168株に導入し、epr遺伝子上流領域、或いは下流領域の相当する領域間での1重交差の相同組換えによりゲノムDNAと融合した形質転換株を、クロラムフェニコール耐性を指標に取得した。得られた形質転換株をLB培地に接種し、37℃にて２時間培養後、再度、コンピテンス誘導操作を行うことにより、ゲノム上で重複して存在するepr遺伝子上流領域、或いは下流領域の間におけるゲノム内相同組換えを誘導した。プラスミド導入の際と異なる領域で、ゲノム内相同組換えが起こった場合には、プラスミドに由来するクロラムフェニコール耐性遺伝子及びpUC118ベクター領域の脱落に伴ってepr遺伝子が欠失することになる。次に、クロラムフェニコール感受性となった株の存在比率を高める為、以下の要領でアンピシリン濃縮操作を行なった。コンピテントセル誘導後の培養液を終濃度5ppmのクロラムフェニコール及び終濃度100ppmのアンピシリンナトリウムを含むLB培地1mLに600nmにおける濁度（OD600）が0.003になるように接種した。37℃にて5時間培養後、10,000ppmのアンピシリンナトリウム水溶液を10μL添加して更に３時間培養した。培養終了後、2%塩化ナトリウム水溶液にて菌体を遠心洗浄した後、1mLの2%塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、懸濁液100μLをLB寒天培地に塗沫した。37℃にて約15時間インキュベーションし、生育した菌株のうち、プラスミド領域の脱落に伴ってクロラムフェニコール感受性となったものを選抜した。選抜した菌株のゲノムDNAを鋳型とし、表２に示すプライマーeprfw2とeprrv-repを用いたPCRを行なうことによりepr遺伝子欠失の確認を行ない、epr遺伝子欠失株を取得した。
次に、得られたepr遺伝子欠失株に対し、次の欠失としてwprA遺伝子の欠失をepr遺伝子欠失と同様に行なった。すなわち、同様にしてwprA遺伝子欠失用プラスミドpUC118-CmrΔwprAを構築し、構築したプラスミドのゲノムDNAへの導入とそれに続くゲノム内相同組換えによるwprA遺伝子の欠失によりepr遺伝子とwprA遺伝子の２重欠失株を取得した。以降同様の操作を繰り返すことにより、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprEの各遺伝子を順次欠失させ、最終的に８種類のプロテアーゼ遺伝子が欠失したプロテアーゼ８重欠失株を構築し、Dpr8株と命名した。
一方、Dpr8株に導入するyoeB大量発現用プラスミドpDG148YBは以下のように作製した。先ず、yoeB遺伝子増幅用プライマーyoeBSal-F-2 (5’-GCGCAGATCTGTCGACTAAGAGAAAGAGATTTTGAAGG（配列番号52）)及びyoeBSph-R (5’-GCGCGCATGCTTATATAACTGCGTCAAATTG（配列番号53）)を用いて枯草菌野生株染色体DNAを鋳型としてPCR増幅した。得られた増幅断片（595 bp）をSalI及びSphIで制限酵素処理した。この断片を、同様にSalI及びSphIで制限酵素処理したプラスミドpUC118にライゲーションし、pU8YBを得た。挿入断片の塩基配列を確認後、pU8YBをSalI及びSphIで制限酵素処理した。切り出されたyoeB遺伝子断片（575 bp）を、同様にSalI及びSphIで制限酵素処理したpDG148にライゲーションし、目的とするpDG148YBを得た。なお、pDG148は、IPTGにより発現誘導されるプロモーターを有するマルチコピープラスミドであり、Bacillus Genetic Stock Centerから入手することができる。
以上のように作製したpDG148YBをDpr8株に導入し、以下の実験を行なった。前培養はLB培地で30℃、15時間培養した。前培養液600μlを7.5％マルトース、7.5μg/ml MnSO4および10μg/mlのカナマイシンを含む30 mlの2×L培地添加し、本培養を開始した。yoeBの大量発現を誘導するため、培養開始0、8、20時間後にそれぞれ終濃度1 mMとなるように本培養液にIPTGを添加した。またIPTGを加えないサンプルをコントロールとした。OD600にて培養液濁度を経時的に測定し、溶菌抑制効果を検討した。
結果を図７に示す。図７から判るように、IPTGを加えないサンプルにおいては、培養開始30時間を超えたあたりから濁度の減少、すなわちDpr8株の溶菌が観察された。これに対して、IPTG添加によってYoeBタンパク質を大量に発現させたサンプルにおいては、培養開始30時間を超えても濁度の減少は観察されなかった。これにより、YoeBタンパク質を大量発現したDpr8株においては、溶菌が抑制されていることが明かとなった。
〔実施例５〕YoeBタンパク質におけるPGA分解抑制活性
本実施例では、YoeB遺伝子（配列番号１）によりコードされるYoeBタンパク質（配列番号２）によるPGA分解抑制効果を検討した。具体的には、所定の範囲の分子量をもつPGAに対して各種溶菌酵素を作用させたときのPGAの分解（低分子化）を、YoeBタンパク質の存在下或いは非存在下で比較した。なお、本実施例で使用した各種溶菌酵素及びYoeBタンパク質は、実施例２及び３で使用したものを用いた。
本実施例では、YoeB遺伝子（配列番号１）によりコードされるYoeBタンパク質（配列番号２）によるPGA分解抑制効果を検討した。具体的には、所定の範囲の分子量をもつPGAに対して各種溶菌酵素を作用させたときのPGAの分解（低分子化）を、YoeBタンパク質の存在下或いは非存在下で比較した。なお、本実施例で使用した各種溶菌酵素及びYoeBタンパク質は、実施例２及び３で使用したものを用いた。
また、本実施例において、PGAとしては、平均分子量が4,000kDa〜6,000kDaである製品（和光：No.168-21413）を用いた。PGAの分解反応は、10mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）中で1nmolの溶菌酵素と2mgのPGAを用いた。YoeBタンパク質を添加する場合には2nmolとした。反応温度は37℃とした。所定の反応時間が経過した後、100℃で５分間煮沸することによって反応を停止した。反応停止後のサンプルを14％SDS-ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供し、メチレンブルー染色によりPGAの分解を確認した。
詳細に、CwlEタンパク質については、下記表４に示す組成の反応溶液を調整した。CwlEタンパク質によるPGA分解活性を検討した結果を図８に示す。
CwlFタンパク質については、下記表５に示す組成の反応溶液を調整した。CwlFタンパク質によるPGA分解活性を検討した結果を図９に示す。
CwlSタンパク質については、下記表６に示す組成の反応溶液を調整した。CwlSタンパク質によるPGA分解活性を検討した結果を図１０に示す。
CwlOタンパク質については、下記表７に示す組成の反応溶液を調整した。CwlOタンパク質によるPGA分解活性を検討した結果を図１１に示す。
なお、図９において、レーン１はサンプルNo.１の反応溶液であり、レーン２〜５は反応時間をそれぞれ0.5時間、1.0時間、2.0時間及び4.0時間としたサンプルNo.2の反応溶液であり、レーン６〜１０は反応時間をそれぞれ0時間、0.5時間、1.0時間、2.0時間及び4.0時間としたサンプルNo.3の反応溶液である。また、図１０〜１１において、レーン１はサンプルNo.１の反応溶液であり、レーン２〜６は反応時間をそれぞれ0.5時間、1.0時間、2.0時間、4.0時間及び6.0時間としたサンプルNo.2の反応溶液であり、レーン７〜１２は反応時間をそれぞれ0時間、0.5時間、1.0時間、2.0時間、4.0時間及び6.0時間としたサンプルNo.3の反応溶液である。
図９〜１１に示すように、YoeBタンパク質の非存在下において、CwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質及びCwlOタンパク質は、全てPGAを分解して低分子化する活性を有することが判る。また、これらCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質及びCwlOタンパク質におけるPGA分解活性は、YoeBタンパク質の存在下において阻害され、PGAは分解されず所定範囲の分子量を維持することが明らかとなった。本実施例により、YoeBタンパク質には、溶菌酵素によるPGA分解活性を抑制する新規な作用があることが明らかとなった。
また、比較のため、細胞壁の分解活性を有しないが、PGAの分解活性を有することが知られているYwtDタンパク質についても、YoeBタンパク質によるPGA分解抑制効果がみられるか検討した。YwtD遺伝子の塩基配列を配列番号６６に示し、YwtDタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６７に示した。
YwtDタンパク質については、実施例３の＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によって取得した。すなわち、DL-エンドペプチダーゼ・ドメインを含むYwtD遺伝子のDNA配列を、プライマーYwtD-FL-Fw（gcgcggtaccgatacatcatcagaattgatt：配列番号６８）及びYwtD-FL-Rv（gcgcctgcagttattgcacccgtatacttc：配列番号６９）を用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、PCRにて増幅した。なお、上記プライマーYwtD-FL-Fw及びYwtD-FL-Rvにおける下線の塩基配列は、それぞれKpnI及びPstI制限酵素認識配列を示す。
得られたPCR産物を用いて、上記＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によってプラスミドpQEYwtDを作製し、pQEYwtDを導入した大腸菌M13(pREP4,pQEYwtD)を得た。得られたM13(pREP4,pQEYwtD)を用いて、上記＜CwlSのC末端側活性ドメインの調整＞と同様な方法によって同様にしてh-YwtDタンパク質溶液を調製した。得られたYwtDタンパク質を用いたPGA分解反応は、下記表８に示す組成の反応溶液を調整して、上述した方法と同様にして行った。
その結果を図１２に示す。なお図１２においてレーン１はサンプルNo.１の反応溶液であり、レーン２〜５は反応時間をそれぞれ0.5時間、1.0時間、2.0時間及び4.0時間としたサンプルNo.2の反応溶液であり、レーン６〜１０は反応時間をそれぞれ0時間、0.5時間、1.0時間、2.0時間及び4.0時間としたサンプルNo.3の反応溶液である。図１２から判るように、YoeBタンパク質の存在下及び非存在下のいずれにおいても、YwtDタンパク質によるPGA分解活性に変化は見られなかった。すなわち、YoeBタンパク質は、YwtDタンパク質におけるPGA分解活性を阻害しないことが明らかとなった。
以上の結果から、YoeBタンパク質は、細胞壁溶解活性を有する溶菌酵素によるPGA分解活性を阻害し、細胞壁溶解活性を有しないPGA分解酵素によるPGA分解活性を阻害しないことが明らかとなった。
以上の結果から、YoeBタンパク質は、細胞壁溶解活性を有する溶菌酵素によるPGA分解活性を阻害し、細胞壁溶解活性を有しないPGA分解酵素によるPGA分解活性を阻害しないことが明らかとなった。
Claims (33)
- 枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分とする、溶菌酵素阻害剤。
- 上記YoeBタンパク質は以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１記載の溶菌酵素阻害剤。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質 - 枯草菌由来のCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質、YddHタンパク質及び前記タンパク質と機能的に等価なタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一種の溶菌酵素の溶菌活性を阻害することを特徴とする請求項１又は２記載の溶菌酵素阻害剤。
- 上記CwlEタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項３記載の溶菌酵素阻害剤。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlFタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項３記載の溶菌酵素阻害剤。
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlSタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項３記載の溶菌酵素阻害剤。
（ａ）配列番号５５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５５に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlOタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項３記載の溶菌酵素阻害剤。
（ａ）配列番号５７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５７に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５７に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記YddHタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項３記載の溶菌酵素阻害剤。
（ａ）配列番号５９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５９に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５９に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分とする、溶菌抑制剤。
- 上記YoeBタンパク質は以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項９記載の溶菌抑制剤。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質 - 枯草菌の溶菌を抑制することを特徴とする請求項９又は１０記載の溶菌抑制剤。
- 上記枯草菌は、少なくとも１種以上の分泌型プロテアーゼを欠損した変異株であることを特徴とする請求項１１記載の溶菌抑制剤。
- 枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質を主成分とする、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
- 上記YoeBタンパク質は以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１３記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質 - 上記YoeBタンパク質によって、枯草菌由来のCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及び前記タンパク質と機能的に等価なタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一種の溶菌酵素の溶菌活性を阻害することで、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解を抑制することを特徴とする請求項１３又は１４記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
- 上記CwlEタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlFタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlSタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
（ａ）配列番号５５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５５に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlOタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１５記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤。
（ａ）配列番号５７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５７に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５７に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子を発現誘導型プロモーターの制御下に発現することで溶菌が抑制された微生物。
- 上記YoeB遺伝子は以下の（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項２０記載の微生物。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌由来の溶菌酵素に結合し、当該溶菌酵素による溶菌活性を抑制する活性を有するタンパク質 - 少なくとも１種以上の分泌型プロテアーゼを欠損している請求項２０又は２１記載の微生物。
- 枯草菌由来の株であることを特徴とする請求項２０乃至２２いずれか１項記載の微生物。
- ポリ−ガンマ−グルタミン酸産生能を有することを特徴とする請求項２０乃至２３いずれか１項記載の微生物。
- 上記YoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質によって、枯草菌由来のCwlEタンパク質、CwlFタンパク質、CwlSタンパク質、CwlOタンパク質及び前記タンパク質と機能的に等価なタンパク質からなる群から選ばれる少なくとも一種の溶菌酵素の溶菌活性を阻害することで、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の低分子化を抑制することを特徴とする請求項２４記載の微生物。
- 上記CwlEタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項２５記載の微生物。
（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlFタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項２５記載の微生物。
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlSタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項２５記載の微生物。
（ａ）配列番号５５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５５に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - 上記CwlOタンパク質は（ａ）乃至（ｃ）いずれかに記載のタンパク質であることを特徴とする請求項２５記載の微生物。
（ａ）配列番号５７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号５７に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加或いは挿入されたアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号５７に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、枯草菌の細胞壁を溶解する活性を有するタンパク質 - ポリ−ガンマ−グルタミン酸産生能を有する微生物を、枯草菌由来のYoeB遺伝子又は当該YoeB遺伝子に対応する相同遺伝子によりコードされるYoeBタンパク質の存在下に培養し、培地に産生されたポリ−ガンマ−グルタミン酸を回収することを特徴とする、ポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
- 上記ポリ−ガンマ−グルタミン酸は、上記YoeBタンパク質の非存在下で産生されるポリ−ガンマ−グルタミン酸と比較して高分子量であることを特徴とする請求項３０記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
- 上記微生物は、請求項２４乃至２９いずれか１項記載の微生物であることを特徴とする請求項３０又は３１記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
- 上記YoeBタンパク質を培地に添加することを特徴とする請求項３０乃至３２いずれか１項記載のポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007268523A JP5247112B2 (ja) | 2006-10-16 | 2007-10-16 | 溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006281768 | 2006-10-16 | ||
| JP2006281768 | 2006-10-16 | ||
| JP2007268523A JP5247112B2 (ja) | 2006-10-16 | 2007-10-16 | 溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008118985A true JP2008118985A (ja) | 2008-05-29 |
| JP5247112B2 JP5247112B2 (ja) | 2013-07-24 |
Family
ID=39504428
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007268523A Active JP5247112B2 (ja) | 2006-10-16 | 2007-10-16 | 溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5247112B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011234632A (ja) * | 2010-05-06 | 2011-11-24 | Asahimatsu Shokuhin Kk | ポリ−γ―グルタミン酸高生産性納豆菌株および該株を用いて製造したポリ−γ−グルタミン酸および納豆 |
| JP2012200168A (ja) * | 2011-03-24 | 2012-10-22 | Kao Corp | 遺伝子欠損株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 |
-
2007
- 2007-10-16 JP JP2007268523A patent/JP5247112B2/ja active Active
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| JPN6007015746; ＳＡＬＺＢＥＲＧ， Ｌ． Ｉ． ａｎｄ ＨＥＬＭＡＮＮ， Ｊ． Ｄ．: 'Ａｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ-ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｐｒｏｔｅｃｔｓＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｆｒｏｍ ａｕｔｏｌｙｓｉｓ' Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． Ｖｏｌ．１８９， Ｎｏ．１３, 200707, ｐ．４６７１-４６８０ * |
| JPN6007015747; 岩下智昭， 外４名: '枯草菌の細胞分離を阻害するＹｏｅＢの機能解析' 日本農芸化学会２００７年度（平成１９年度）大会講演要旨集 , 20070305, ｐ．４９ * |
| JPN6007015758; ＹＡＭＡＧＵＣＨＩ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．: 'Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｇｅｎｅ， ｙｖｃＥ （ｎａｍｅｄ ｃｗｌＯ）， ａｎｄ ｔｈｅ' Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． Ｖｏｌ．９８， Ｎｏ．３, 2004, ｐ．１７４-１８１ * |
| JPN6007015760; ＦＵＫＵＳＨＩＭＡ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．: 'Ａ ｎｅｗ Ｄ，Ｌ-ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ， ＹｏｊＬ （ｒｅｎａｍｅｄ ＣｗｌＳ）， ｐｌａｙｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＬｙｔＥ' Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． Ｖｏｌ．１８８， Ｎｏ．１５, 200608, ｐ．５５４１-５５５０ * |
| JPN6012057181; Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１４６, 2000, ｐ．２４９-２６２ * |
| JPN6012057182; 日本生物工学会大会講演要旨集 Ｖｏｌ．２００２, 20020925, ｐ．１２６ * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011234632A (ja) * | 2010-05-06 | 2011-11-24 | Asahimatsu Shokuhin Kk | ポリ−γ―グルタミン酸高生産性納豆菌株および該株を用いて製造したポリ−γ−グルタミン酸および納豆 |
| JP2012200168A (ja) * | 2011-03-24 | 2012-10-22 | Kao Corp | 遺伝子欠損株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP5247112B2 (ja) | 2013-07-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH04507346A (ja) | アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法 | |
| JPH07147978A (ja) | 変性ペプチドの生物学的製法 | |
| CN115717137B (zh) | 赖氨酰特异性内切酶突变体及其制备方法和应用 | |
| KR20110129991A (ko) | 재조합 ｃｒｍ197의 고 수준 발현 | |
| CN101918551B (zh) | 草酸脱羧酶的生产中利用的重组表达质粒载体及重组菌、以及重组草酸脱羧酶的生产方法 | |
| JP5247112B2 (ja) | 溶菌酵素阻害剤、溶菌抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の分解抑制剤及びポリ−ガンマ−グルタミン酸の製造方法 | |
| EP2088192A1 (en) | Lytic enzyme inhibitor, lysis inhibitor, inhibitor of degradation of poly- gamma-glutamic acid, and method for production of poly- gamma-glutamic acid | |
| JP6693723B2 (ja) | 枯草菌変異株及びその利用 | |
| JP6059416B2 (ja) | 溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法 | |
| JP7233203B2 (ja) | Ｍ２３ａファミリープロテアーゼの製造方法 | |
| KR102026836B1 (ko) | 토양 메타게놈 유래 신규 리파아제 유전자 Lip-1420 및 이의 용도 | |
| JP2003250588A (ja) | タンナーゼ、その遺伝子及びタンナーゼの製造法 | |
| KR20140018850A (ko) | 효모에서 엔테로키나아제를 생산하는 조성물과 방법 | |
| JP5739113B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP6660718B2 (ja) | 枯草菌変異株及びその利用 | |
| KR102088811B1 (ko) | 토양 메타게놈 유래 신규 알칼리성 리파아제/에스터라제 유전자 Lip-1447 및 이의 용도 | |
| JP5841749B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| CN112062822B (zh) | 一种碳分解代谢调控蛋白CcpA突变体I42A | |
| JP2009038985A (ja) | 微生物及びこれを用いたタンパク質又ポリペプチドの製造方法 | |
| JP2016106620A (ja) | ４−ケト−ｄ−アラボン酸合成用酵素 | |
| JP2002272466A (ja) | 改変プロモーター | |
| JP5739114B2 (ja) | 組換え微生物 | |
| JP5828634B2 (ja) | 組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法 | |
| US20090255014A1 (en) | Transgenic organisms with lower growth temperature | |
| JP4701440B2 (ja) | 麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する組換えベクター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100914 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121106 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121227 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130312 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130409 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5247112 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160419 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |