JP4701440B2 - 麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する組換えベクター - Google Patents
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Description
(1)配列番号1、2、3又は4で表される塩基配列からなるDNAを含む組換えベクター。
(2)配列番号1、2、3又は4で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするDNAを含む組換えベクター。
(3)配列番号1、2、3又は4で表される塩基配列からなるDNAと80%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするDNAを含む組換えベクター。
(4)上記1、2又は3記載の組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする麹菌。
(5)上記4記載の麹菌を、固体培地若しくは液体培地で培養して培地中に蛋白質加水分解酵素を分泌させたのち、培地から蛋白質加水分解酵素を採取することを特徴とする、蛋白質加水分解酵素の生産方法。
(6)上記4記載の麹菌を培養して得られる培養物と蛋白質含有原料とを混合し、原料中の蛋白質を分解することを特徴とする、蛋白質分解物の製造方法。
(7)上記4記載の麹菌を培養して得られる培養物とゼラチン含有原料とを混合し、原料中のゼラチンを分解することを特徴とする調味液の製造方法。
(8)以下の(a)、(b)又は(c)のDNA:
(a)配列番号1、2、3又は4で表される塩基配列からなるDNA、
(b)(a)の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするDNA、
(c)(a)の塩基配列からなるDNAと80%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするDNA。
(9)以下の(a)又は(b)の蛋白質:
(a)配列番号1、2、3又は4で表される塩基配列からなるDNAにコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)(a)のアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、麹菌蛋白質分解酵素の分泌を増大する機能を有する活性を有する蛋白質。
麹菌アスペルギルス・オリゼの全ゲノム情報(特開2005−176602号公報参照)から、次のような方法により、転写調節因子遺伝子をコードすると推定される配列を抽出した。このステップにおいては、詳細な吟味は行わず、転写調節因子遺伝子である可能性のあるものは基本的にリストアップの対象とした。
(1)相同性検索による転写調節因子遺伝子と推定される配列の抽出
麹菌アスペルギルス・オリゼの全ゲノム情報から、遺伝子自動予測ソフトにより遺伝子配列と推定されるDNA配列をすべて抽出し、これらのDNA配列を自動予測遺伝子配列(以下、「自動予測遺伝子配列」という)とした。
(2)転写調節因子の構造に関わるモチーフと推定されるアミノ酸配列をコードするDNA配列の検索
自動予測遺伝子産物配列について、モチーフ検索ソフト(HMMER)を用いてモチーフ(Pfam)検索を行い、転写調節因子に関わるモチーフを含むと推定されるアミノ酸配列をコードする自動予測遺伝子配列を選択した。
(3)既知転写調節因子配列と相同性を有するDNA配列の検索
麹菌や麹菌以外の糸状菌に関する既知の転写調節因子のアミノ酸配列を問い合わせ配列として、今回得られた自動予測遺伝子産物配列に対して、相同性検索ソフトBLASTを用いて相同性検索を行った。同様な問い合わせ配列を用いて、麹菌のゲノムコンティグ配列に対してBLAST(tblast)を用いて相同性検索を行うことにより、自動予測で予測されていなかった遺伝子や、自動予測でDNA結合領域などの保存性の高い領域を欠損した形で予測されてしまっていた遺伝子についても検索可能とした。
前項で抽出した転写調節因子遺伝子と思われる候補遺伝子について、順次遺伝子領域の推定を行った。また、推定に先立ち、相同な既知遺伝子のアノテーションや文献情報、モチーフの種類などの情報をもとに、強制発現による解析対象として相応しいか否かを検討し、ヘテロ複合体で機能するものなど、相応しくないものは除外した。
転写調節因子遺伝子を麹菌内で発現させるために用いる発現プラスミドとして、発現ユニットとしてアスペルギルス・オリゼアミラーゼ遺伝子プロモーター及びアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーター、転写調節因子遺伝子挿入用マルチクローニングサイト、マーカー遺伝子としてアスペルギルス・オリゼniaD遺伝子を含むプラスミドpAPTLNを構築した。
5’−gggtagtcgtacccgatgatgaaac−3’(配列番号5)
5’−agcctaggccgctgcaggcag−3’ (配列番号6)
PCR反応は、TaKaRa LA Taq(タカラバイオ株式会社製)を使用し、PTC−200(MJ
Research社製)を用いて行った。反応液の組成は以下のとおりである。
TaKaRa LA Taq:0.5μl
10×LA PCR BufferII:5μl:1×
25mM MgCl2:5μl:2.5mM
dNTP Mixture:8μl:それぞれ0.4mM
鋳型DNA(0.5μg):1μl
プライマー:1μl×2種類:それぞれ0.2μM
滅菌水:28.5μl
合計液量:50μl
上記の反応液50μlを0.2ml反応チューブ中で混合してPTC−200にセットし、以下の温度設定によりPCRを行った。
95℃、2分:1サイクル
95℃、30秒 58℃、30秒 72℃、2分:30サイクル
72℃、3分:1サイクル。
プラスミドpMAR5(Biosci.Biotech.Biochem.,56(10),1674−1675,1992)をSmaIおよびHindIIIで消化した後、0.7%アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット(QIAGEN社製)を用いてargB遺伝子およびアスペルギルス・オリゼアミラーゼ遺伝子ターミネーターを除去したDNA断片を回収した。pATおよびpMAR5由来の両DNA断片をライゲーションした後、大腸菌JM109を形質転換し、アスペルギルス・オリゼアミラーゼ遺伝子プロモーターおよびアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターを含むプラスミドpAPTを得た。
転写調節因子遺伝子と予測されたDNA配列を基にPCRにより各転写調節因子遺伝子を取得した。まず、アスペルギルス・オリゼRIB40のゲノムDNAを調製した。次に調製したゲノムDNAを鋳型に、予測遺伝子の開始コドン上流100bpのDNA配列及び終始コドン近傍のDNA配列を参考に作製した2種類のプライマーを用いて、PCRにより各転写調節因子遺伝子を取得した。開始コドン上流のDNA配列を参考にプライマーを作製する際には、pAPTLNのマルチクローニングサイト上にある制限酵素認識配列であり、かつ、増幅する転写調節因子遺伝子配列内に認識配列が存在しない制限酵素認識配列を導入した。増幅した転写調節因子遺伝子は作製したプライマーに認識配列を導入した制限酵素で処理した後、pAPTLNのマルチクローニングサイトに挿入し(導入した制限酵素部位とSmaI部位の間)、各転写調節因子遺伝子発現用組換えプラスミドベクターとした。
5’−atacaggcattctatcgataaaatgtttcc−3’(配列番号7)
5’−gggctacatctgctgttgtagaagttgc−3’ (配列番号8)
PCR反応は、TOYOBO KOD−Plus−DNA Polymerase(TOYOBO社製)を使用し、PTC−200(MJ Research社製)を用いて行った。反応液の組成は以下のとおりである。
KOD−Plus−DNA Polymerase:1μl
10×PCR buffer for KOD−Plus−:5μl:1×
25mM MgCl2:2μl:1mM
2mM dNTP Mixture:5μl:それぞれ0.2mM
鋳型DNA(0.2μg):1μl
プライマー:1μl×2種類:それぞれ0.3μM
滅菌水:34μl
合計液量:50μl
上記の反応液50μlを0.2ml反応チューブ中で混合してPTC−200にセットし、以下のような温度設定によりPCRを行った。
94℃、2分:1サイクル
94℃、15秒 58℃、30秒 68℃、4分:30サイクル
68℃、3分:1サイクル。
5’−tcatacaagctagcaaaatggcggaga−3’(配列番号9)
5’−gggctcgataactttttactcccgtgata−3’ (配列番号10)
5’−ccatcgataatattagtatgctgaatga−3’(配列番号11)
5’−ggactagttcaggtctttcgaatgtcagga−3’(配列番号12)
5’−ccatcgataagtaaaaggatgttattagat−3’(配列番号13)
5’−ggactagtttaatccgttctcatggccgaa−3’ (配列番号14)
アスペルギルス・オリゼRIB326株からMol.Gen.Genet(1989)218:99−104記載の方法で取得したniaD欠損株を転写調節因子遺伝子発現用プラスミドpC001、pC002、pC004、pC003で形質転換した。形質転換法は、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法(Mol.Gen.Genet(1989)218:99−104)によって行った。各プラスミド5μgを用いて形質転換し、最小培地で形質転換体を選択したところ、それぞれ約200個のコロニーが得られた。このうち各プラスミドにつき15コロニーについて最小培地で単分生子分離を繰り返し、形質の安定化を行った。次に、各転写調節因子遺伝子の成熟領域をプローブとしてサザン解析を実施し、それぞれの形質転換体の中から、形質転換に用いたプラスミドが形質転換体のゲノム上のniaD遺伝子領域に挿入されている株を選択し、それぞれの選択株をC001、C002、C003、C004と命名した。サザン解析の結果を図1に示した。
(1)ゼラチン培地における麹菌の培養方法とゼラチン分解に関する蛋白質加水分解酵素活性の測定
各形質転換体をゼラチンを含む液体培地で振とう培養し、ゼラチン分解能を確認した。各形質転換体のゼラチン分解能の評価は、ゼラチンが分解されて生じる培地中のグルタミン酸濃度をコントロールと比較することで行った。
KH2PO4、0.05% MgSO4、0.05% KCl、0.001% FeSO4・7H2O、0.3%NaNO3、3%
Maltose pH6.0)に植菌した(1×107個胞子/40mlゼラチン培地)。30℃、150rpmで115時間振とう培養した後、培養上清中のグルタミン酸量をヤマサ L−グルタミン酸測定キット(ヤマサ醤油株式会社製)を用いて測定した。また、上記のゼラチン分解能を指標として、培養上清の蛋白質加水分解酵素活性を測定した。コントロールとして、実験毎にRIB326株niaD欠損株をpAPTLNで形質転換して得られたniaD+株を培養した。形質転換体の中で最もゼラチン分解能が高いと思われるC004培養上清中のグルタミン酸量及び蛋白質加水分解酵素活性をコントロールに対する相対値として示した。
フスマ:脱イオン水を5:4の比率で混合し、室温で30分間放置した後、150ml容量の三角フラスコに5gずつ分注し、オートクレーブで15分滅菌した。次いで、予め血球計で胞子数を計測しておいた野生株アスペルギルス・オリゼRIB326株や強制発現株の胞子懸濁液を、胞子がフスマ培地1g当たり5×105個になるように接種した。培養は30℃で4日間行い、培養開始後24時間目と48時間目に混合し、その後は培養終了まで静置した。酵素液は、以下のようにして得た。培養終了後のフスマ培地に、50mlの脱イオン水と500μlのトルエンを加え、2時間室温で振とうし、懸濁液をNo.2濾紙(アドバンテック社製)で濾過し濾液を得て、これを酵素液とした。
finger モチーフを持ち、アスペルギルス・ニドランスのsteA遺伝子とアミノ酸レベルで81%同一の相同性を示した。steA遺伝子は、アスペルギルス・ニドランスにおいて、有性生殖に必要とされる遺伝子として報告されている(Vallimら、Mol
Microbiol. 36(2):290−301, (2000))。
fingerモチーフを持ち、アスペルギルス・フミガタスのC6 finger domain protein, putativeをコードする機能未知の遺伝子と、アミノ酸レベルで67%同一の相同性を示した。C002と相同性を示す遺伝子のうち、機能が報告されているもので最も高い相同性を示したのは、ネクトリア・ヘマトコッカの、クチナーゼ遺伝子の転写に関わるnaf遺伝子であったが、その相同性は、アミノ酸レベルで31%同一に過ぎなかった。
Microbiol. 23(3):591−602, (1997))。
Claims (3)
- 以下のDNA:
(1)配列番号4で表される塩基配列からなるDNA;
(2)配列番号4で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするDNA;又は
(3)配列番号4で表される塩基配列からなるDNAと95%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするDNA
を含む組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする麹菌を、固体培地若しくは液体培地で培養して培地中に蛋白質加水分解酵素を分泌させたのち、培地から蛋白質加水分解酵素を採取することを特徴とする、蛋白質加水分解酵素の生産方法。 - 以下のDNA:
(1)配列番号4で表される塩基配列からなるDNA;
(2)配列番号4で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするDNA;又は
(3)配列番号4で表される塩基配列からなるDNAと95%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするDNA
を含む組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする麹菌を培養して得られる培養物と蛋白質含有原料とを混合し、原料中の蛋白質を分解することを特徴とする、蛋白質分解物の製造方法。 - 以下のDNA:
(1)配列番号4で表される塩基配列からなるDNA;
(2)配列番号4で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするDNA;又は
(3)配列番号4で表される塩基配列からなるDNAと95%以上の配列相同性を示す塩基配列からなるDNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするDNA
を含む組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする麹菌を培養して得られる培養物とゼラチン含有原料とを混合し、原料中のゼラチンを分解することを特徴とする調味液の製造方法。
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