WO2007034782A1 - 麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する組換えベクター - Google Patents

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Genryou Umitsuki
Masayuki Machida
Motoaki Sano
Akimitsu Tanaka
Chitoshi Oka
Hiroshi Maeda
Hitoshi Tainaka
Touru Ito
Tomomi Uchikawa
Tsutomu Masuda
Kenichiro Matsushima
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Definitions

  • a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA that also has a base sequence ability complementary to the DNA that has a base sequence ability represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4, and is a gonococcal protein hydrolase A recombinant vector comprising a DNA encoding a protein having a function of increasing secretion of the protein.
  • a method for producing a protein degradation product comprising: mixing a culture obtained by culturing the koji mold as described in 4 above and a protein-containing raw material, and degrading the protein in the raw material.
  • a method for producing a seasoning liquid comprising mixing a culture obtained by culturing koji mold as described in 4 above and a gelatin-containing raw material, and decomposing gelatin in the raw material.
  • DNA having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4" has a nucleotide sequence that only has a region encoding an amino acid (that is, only the exon part is linked).
  • CDNA consisting of a combined base sequence is also included.
  • Such cDNA can be obtained by PCR or the like using the koji mold mRNA as a cocoon by using an appropriate primer prepared based on the nucleotide sequence information disclosed in the present specification.
  • the DNA of the present invention can also be chemically synthesized by any method known to those skilled in the art.
  • Hybridization is described in, for example, Current 'Protocorenoles' In' Molecular ⁇ ⁇ ⁇ Biolon ⁇ ⁇ "(Current protocols in molecular biology ⁇ edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987).
  • the method can be carried out according to a method known in the art or a method analogous thereto, such as the method described above, etc.
  • a commercially available library it can be carried out according to the method described in the attached instruction manual.
  • the vector may include any marker gene known to those of skill in the art to allow selection of transformed cells.
  • the marker gene include genes that complement the auxotrophy of the host, such as URA3 and niaD, or resistance genes to drugs such as ampicillin, kanamycin, and oligomycin.
  • the recombinant vector includes a promoter capable of expressing the gene of the present invention in a host cell and other control sequences (eg, enhancer sequence, terminator sequence, polyadenylation sequence, etc.) It is desirable to include multi-cloning to insert DNA. Each element contained in these recombinant vectors is known to those skilled in the art.
  • TaKaRa LA Taq 0. 5 ⁇ 1
  • the above reaction solution 50 1 was mixed in a 0.2 ml reaction tube and set in PTC-200, and PCR was performed at the following temperature settings.
  • Each transformant was cultured with shaking in a liquid medium containing gelatin, and the gelatin resolution was confirmed. Evaluation of the gelatin resolution of each transformant was performed by comparing the glutamic acid concentration in the medium produced by the degradation of gelatin with the control.
  • Enzyme activity ratio forced expression strain (sample absorbance-blank absorbance) / wild strain (sample absorbance-blank absorbance).
  • protein hydrolase activity measurement was performed as follows, and the absorbance of the sample and the blank was determined.
  • C004 had a Zinc finger motif of the C2H2 type and showed 73% homology with the amdX gene of Aspergillus drans at the amino acid level.
  • the amdX gene has been reported in Aspergillus' -Drans as a transcriptional activator of the amdS gene encoding acetoamidase (Murphy et al., Mol Microbiol. 23 (3): 591-6 02, (1997)).

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Abstract

【課題】調味料の食品製造や、消化剤等の医薬品製造、洗剤用の蛋白質加水分解酵素生産等において、固体培地培養及び液体培地培養での麹菌の蛋白質加水分解酵素活性を向上させる。 【解決手段】麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する組換えベクター、該ベクターによって形質転換された麹菌により蛋白質加水分解酵素遺伝子発現・分泌が亢進した麹菌、形質転換された麹菌による蛋白質加水分解酵素生産方法等を提供する。  

Description

明 細 書
麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する組換えベクター
技術分野
[0001] 本発明は、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する組換えべク ター、該ベクターによって形質転換された麹菌により蛋白質加水分解酵素遺伝子発 現，分泌が亢進した麹菌、形質転換された麹菌による蛋白質加水分解酵素生産方 法等に関する。
背景技術
[0002] ァスペルギルス ·ォリゼ（Aspergillus oryzae)及びァスペルギルス ·ソーャ（Aspe rgillus sojae)等の麹菌は醤油、酒、味噌などの醸造食品の製造に工業的に用い られている。さらに、近年、他の生物種同様ァスペルギルス 'ォリゼのゲノム配列が明 らカとなり（特開 2005— 176602号公報）、遺伝子の機能的解析の重要性がますま す高まってきている。
[0003] このような麹菌は、様々な酵素類 (蛋白質加水分解酵素、アミラーゼ類等)を産生 · 分泌し、その優れた澱粉糖化能力及び蛋白質分解力等により、醸造食品の製造に 幅広く利用されている。
[0004] 従来、特許文献 1〜3に記載されているような、麹菌の遺伝子発現を制御する様々 な転写因子の解析が行われてきた。
特許文献 1：特開 2003— 240号公報
特許文献 2：特開 2003 - 70484号公報
特許文献 3：特開 2003 - 235584号公報
特許文献 4：特開 2005 - 176602号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、新たに、麹菌の蛋白質加水分解酵素の分泌を増大させる組換えべクタ 一を提供すること、及び、該組換えベクターを用いることによって固体培地培養及び 液体培地培養での蛋白質含有物の分解の効率が向上した麹菌を提供すること等を 目的とする。
課題を解決するための手段
即ち、本発明は、以下の各態様の発明に係るものである。
(1)配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAを含む組換えべクタ
(2)配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列 力もなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、麹菌蛋 白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードする DNAを含む 組換えベクター。
(3)配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAと 80%以上の配列相 同性を示す塩基配列カゝらなる DNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増 大する機能を有する蛋白質をコードする DNAを含む組換えベクター。
(4)上記 1、 2又は 3記載の組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と 比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする麹菌。
(5)上記 4記載の麹菌を、固体培地若しくは液体培地で培養して培地中に蛋白質加 水分解酵素を分泌させたのち、培地から蛋白質加水分解酵素を採取することを特徴 とする、蛋白質加水分解酵素の生産方法。
(6)上記 4記載の麹菌を培養して得られる培養物と蛋白質含有原料とを混合し、原 料中の蛋白質を分解することを特徴とする、蛋白質分解物の製造方法。
(7)上記 4記載の麹菌を培養して得られる培養物とゼラチン含有原料とを混合し、原 料中のゼラチンを分解することを特徴とする調味液の製造方法。
(8)以下の（a)、（b)又は（c)の DNA:
(a)配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNA、
(b) (a)の塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジ ン トな条件下でハイブリダィズする DNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を 増大する機能を有する蛋白質をコードする DNA、
(c) (a)の塩基配列力もなる DNAと 80%以上の配列相同性を示す塩基配列からな る DNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質 をコードする DNA。
(9)以下の（a)又は (b)の蛋白質：
(a)配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAにコードされるアミノ酸 配列からなる蛋白質、
(b) (a)のアミノ酸配列において、 1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは 付加されたアミノ酸配列からなり、麹菌蛋白質分解酵素の分泌を増大する機能を有 する活性を有する蛋白質。
発明の効果
[0007] 本発明の組換えベクターを用いることによって、麹菌の蛋白質加水分解酵素の分 泌を増大させることが可能になった。該組換えベクターで形質転換麹菌を用いること によって固体培地培養及び液体培地培養での蛋白質含有物の分解の効率を向上さ せることができる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]本発明の形質転換体 (形質転換菌）において、形質転換に用いたプラスミドが 形質転換体のゲノム上の niaD遺伝子領域に挿入されて ヽることを示す、サザン解析 の結果により得られた電気泳動の写真である。
[図 2]フスマ培地における、野生株と本発明の形質転換体の蛋白質加水分解酵素活 性を比較した結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明の組換えベクターに含まれる配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列か らなる DNAは麹菌のゲノム由来であり、以下の実施例に具体的に記載されるように、 ァスペルギルス.ォリゼの全ゲノム情報（特開 2005— 176602号公報）に基づき、相 同性検索、モチーフ検索、及び、既知遺伝子のァノテーシヨンや文献情報、モチーフ の種類などの情報をもとに、転写調節遺伝子をコードする DNAと推定されたもので あり、実施例に示すような、適当なプライマーを用いる PCRにより麹菌のゲノム DNA 等から取得することができる。
[0010] 更に、本発明における「配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNA」 には、アミノ酸をコードする領域のみ力 成る塩基配列（即ち、ェクソン部分のみが結 合された塩基配列）からなる cDNAも含まれる。このような cDNAは、本明細書に開 示の塩基配列情報に基づき調製した適当なプライマーを用いて、麹菌の mRNAを 铸型とした PCR等により取得することが可能である。又、本発明に関する DNAは当 業者に公知の任意の方法によって化学合成することも可能である。
[0011] さらに、本発明の組換えベクターには、上記 DNAと相補的な塩基配列からなる DN Aとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA、及び、上記 DNAと約 80% 以上、好ましくは約 95%以上である配列相同性を示す塩基配列力 なる DNAであ つて、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードする DNAが含まれる。
[0012] ここで、ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecular cloninng third, ed. (Cold Spr ing Harbor Lab. Press, 2001)に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいは それに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場 合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
[0013] ハイブリダィゼーシヨンは、例えば、カレント 'プロトコーノレズ'イン'モレキュラ^ ~ ·バイ ォロン■ ~" (Current protocols in molecular biology ^edited by Frederick M. Ausubel et al. , 1987)に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいは それに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場 合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
[0014] 本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、温度 60°C〜68°Cに ぉ ヽて、ナトリウム濃度 150〜900mM、好ましくは 600〜900mM、 pH6〜8である ような条件を挙げることができる。
[0015] 従って、配列番号 1ないし配列番号 4で表される塩基配列を含む DNAと相補的な 塩基配列からなる DNAとハイブリダィズできる DNAとしては、例えば、該 DNAの全 塩基配列との相同性の程度力 全体の平均で、約 80%以上、好ましくは約 95%以 上である塩基配列を含有する DNA等を挙げることができる。なお、塩基配列間の同 一性は、当業者に公知のアルゴリズム、例えば、 Blastを用いて決定することができる
[0016] 従って、本発明は、配列番号 1ないし配列番号 4で表される塩基配列を含む DNA 、該 DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダ ィズする DNA、及び、上記 DNAと約 80%以上、好ましくは約 95%以上である配列 相同性を示す塩基配列カゝらなる DNAであって、麹菌蛋白質分解酵素の分泌を増大 する機能を有する蛋白質をコードする DNA、並びに、配列番号 1、 2、 3又は 4で表さ れる塩基配列からなる DNAにコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、及び、これ らのアミノ酸配列からなり麹菌蛋白質分解酵素の分泌を増大する機能を有する活性 を有する蛋白質にも係るものである。
[0017] 2つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性を決定するために、配列は 比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることによ り、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残 基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する 部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位にお いて同一である。 2つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数 の全部位 (全アミノ酸又は全塩基)数に対する百分率で示される。
[0018] 上記の原理に従い、 2つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性は、例 えば、 Karlin及び Altschulのアルゴリズム（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 2 264— 2268、 1990及び Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873— 5877、 199 3)により決定される。このようなアルゴリズムを用いた BLASTプログラムや FASTA プログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータべ 一ス中カも検索するために用いられる。これらは、例えば米国 National Center f or Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて禾 lj用 可能である。
[0019] 上記のような塩基配列の配列相同性又はコードするアミノ酸配列の配列相同性を 示すような DNAは、上記のようにハイブリダィゼーシヨンを指標に得ることもでき、ゲノ ム塩基配列解析等によって得られた機能未知の DNA群又は公共データベースの中 から、本技術分野の研究者か通常用いている方法により、例えば、前述の BLASTソ フトウェアを用いた検索により発見することも容易である。さらに、本発明遺伝子は種 々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。 [0020] 本発明の組換えベクターは、当業者に公知の適当な遺伝子工学的な手段を用い て、上記の DNAをベクター内に連結することにより調製することができる。ベクターと しては、形質導入又は形質転換する宿主微生物のゲノム上の適当な位置に上記の DNAが挿入され、その緒果、親株と比較して、その宿主微生物の蛋白質加水分解 酵素分泌能を増大することができるものであれば、その構造及び種類等に、特に、制 限はない。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウィルス、染色体組み込み型、人 ェ染色体等のベクターを用いることかできる。
[0021] 上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするための当業者 に公知の任意のマーカー遺伝子が含まれて 、てもよ 、。マーカー遺伝子としては、 例えば、 URA3、 niaDのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子又はアンピシ リン、カナマイシンあるいはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げら れる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのでき るプロモーター及びその他の制御配列（例えば、ェンハンサー配列、ターミネータ一 配列、ポリアデニルイ匕配列等）、さらに、目的とする DNAを挿入するためのマルチク ローニングを含むことが望ましい。これらの組換えベクターに含まれる各要素は当業 者に公知であり、例えば、具体的には、実施例に示されるように、ァスペルギルス -ォ リゼのアミラーゼ遺伝手プロモーター、ァスペルギルス'ニーデュランスのアミラーゼタ ーミネーター、マーカー遺伝子としてのァスペルキルス'ォリゼの niaD遺伝子を挙げ ることがでさる。
[0022] 形質導入又は形質転換は、公知の適当な方法で行うことができる。例えば、プロト プラストイ匕した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Mol. Ge n. Genet. , 218, 99— 104 (1989) )を用! /、ること力できる。
[0023] 本発明の組換えベクターを形質導入又は形質転換された麹菌は、親株と比較して 蛋白質加水分解酵素分泌が増大されたものとなる。本明細書において、「蛋白質カロ 水分解酵秦の分泌を増大する」、又は、「蛋白質加水分解酵素の分泌が増大してい る」とは、最終的な結果 (現象)として、菌体外へ蛋白質加水分解酵素の分泌量 (分 泌能）が増大していることを意味し、その原因 ·機構としては、例えば、蛋白質加水分 解酵素の発現量 (産生量）自体が増大する場合と、産生された該酵素の菌体外への 分泌量 (分泌能)が増大している場合等が考えられる。さらに、ここで、「増大する」と は、以下の実施例に記載されているように、ゼラチン又はァゾカゼインを蛋白質として 使用する測定方法を用いて、本発明の組換えベクターで形質導入又は形質転換さ れた菌の培地中の蛋白質加水分解酵素量 (活性)が、親株と比較して有意に増大す ることを意味する。
[0024] 従って、該ベクターに含まれる各配列にコードされる蛋白質は、以下の実施例に記 載されるように、転写調節因子であると予測されるが、必ずしも蛋白質加水分解酵素 の転写調節エレメントに結合し、該蛋白質加水分解酵素の発現を促進させる機能を 有するものに限られず、本発明の組換えベクターにより形質導入又は形質転換され た麹菌において、発現された蛋白質加水分解酵素の菌体外への分泌を促進させる 機能を有するものであっても良い。
[0025] 麹菌とは、ァスペルギルス属に属する微生物（菌類)の総称であり、その代表的な 例として、既に記載したァスペルギルス'ォリゼ (Aspergillus oryzae)及びァスペル ギルス'ソーャ (Aspergillus sojae)に加えて、特に食品'醸造分野で使用される菌 としてァスペルギルス ·ァヮモリ（Aspergillus awamori)及びァスペルギルス · -ガ 一 (Aspergillus niger)等を挙げることができる。また、麹菌以外の食品 '醸造'ィ匕 学'医療分野で使用される産業上有用な糸状菌等を用いても実質的に同様の効果 を得ることができる。これらの菌は、市販品として、又は、アメリカンタイプカルチャーコ レクシヨン (ATCC)等の様々な公的寄託機関から入手することも可能である。
[0026] また、「蛋白質加水分解酵素」はプロテアーゼとも呼ばれ、蛋白質を主に分解する プロティナーゼ、又はエンドべプチダーゼ、小ペプチドを分解するぺプチダーゼなど を含む総称である。
[0027] 親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大している本発明の麹菌を当業 者に公知の任意の方法で培養することにより、それが分泌する蛋白質分解酵素を生 産することができる。例えば、本発明の麹菌を、固体培地若しくは液体培地で培養し て培地中に蛋白質加水分解酵素を分泌させたのち、培地力 蛋白質加水分解酵素 を採取することが可能である。このような生産方法における、培養系'培地の選択、培 養温度'時間等の培養条件は、以下の実施例等を参考に、当業者が適宜設定する ことができる。
[0028] また、本発明は麹菌を培養して得られる培養物と蛋白質含有原料とを混合し、原料 中の蛋白質を分解することによって、蛋白質分解物を製造することができる。この方 法で使用される原料に含まれる蛋白質の種類に特に制限はなぐ例えば、ゼラチン、 コラーゲン及びダルテン等を挙げることができる。例えば、ゼラチン、コラーゲン及び ダルテン等含有原料の蛋白質分解物は調味液として有用である。
[0029] なお、組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して蛋白質加 水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする本発明の麹菌の具体例である 、 C001、 C002、 C003及び C004は平成 17年 9月 9日付で、郵便番号 305- 8566日 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合 研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号 FERM P— 20659、 FERM P— 20660、FERM P— 20661及び FERM P— 20662がそれぞれ付与され、 その後、 2006年 8月 30日付けで、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に 関するブダペスト条約に基づく寄託に移管され、受託番号 FERM BP— 10668、 F ERM BP— 10669、 FERM BP— 10670及び FERM BP— 10671がそれぞれ 付与されている。
[0030] 以下、実施例に則して本発明をさらに説明するが、本発明の技術的範囲は、これら に限定されるものでない。
実施例 1
[0031] (転写調節因子遺伝子の推定と抽出）
麹菌ァスペルギルス 'ォリゼの全ゲノム情報（特開 2005— 176602号公報参照）か ら、次のような方法により、転写調節因子遺伝子をコードすると推定される配列を抽出 した。このステップにおいては、詳細な吟味は行わず、転写調節因子遺伝子である 可能性のあるものは基本的にリストアップの対象とした。
(1)相同性検索による転写調節因子遺伝子と推定される配列の抽出
麹菌ァスペルギルス 'ォリゼの全ゲノム情報から、遺伝子自動予測ソフトにより遺伝 子配列と推定される DNA配列をすベて抽出し、これらの DNA配列を自動予測遺伝 子配列 (以下、「自動予測遺伝子配列」 t 、う）とした。 [0032] 各々の自動予測遺伝子配列から予測されるその遺伝子産物配列（（以下、「自動予 測遺伝子産物配列」 t 、う）を基礎配列として、既知蛋白質の公共データベース (NC BIによる非重複蛋白質データベース nr)に対して、相同性検索ソフト BLASTを用い て相同性検索を行った。相同性検索の結果得られた配列の機能に関する情報を整 理し、その配列に関わる遺伝子機能情報に対してキーワード検索を行い、転写調節 因子に関わるキーワードを含む自動予測遺伝子配列を選択した。
(2)転写調節因子の構造に関わるモチーフと推定されるアミノ酸配列をコードする D NA配列の検索
自動予測遺伝子産物配列につ 、て、モチーフ検索ソフト（HMMER)を用いてモ チーフ (Pfam)検索を行い、転写調節因子に関わるモチーフを含むと推定されるアミ ノ酸配列をコードする自動予測遺伝子配列を選択した。
(3)既知転写調節因子配列と相同性を有する DNA配列の検索
麹菌や麹菌以外の糸状菌に関する既知の転写調節因子のアミノ酸配列を問い合 わせ配列として、今回得られた自動予測遺伝子産物配列に対して、相同性検索ソフ ト BLASTを用いて相同性検索を行った。同様な問い合わせ配列を用いて、麹菌の ゲノムコンティグ配列に対して BLAST (tblast)を用 ヽて相同性検索を行うことにより 、自動予測で予測されていな力つた遺伝子や、自動予測で DNA結合領域などの保 存性の高 、領域を欠損した形で予測されてしまって ヽた遺伝子にっ ヽても検索可能 とした。
[0033] これらの方法により、自動予測遺伝子配列から合計 667個の候補遺伝子 (以下、「 候補遺伝子」 t ヽぅ）を抽出した。
[0034] (候補遺伝子の絞込みと遺伝子領域の in silico推定）
前項で抽出した転写調節因子遺伝子と思われる候補遺伝子にっ 、て、順次遺伝 子領域の推定を行った。また、推定に先立ち、相同な既知遺伝子のァノテーシヨンや 文献情報、モチーフの種類などの情報をもとに、強制発現による解析対象として相応 しいか否かを検討し、ヘテロ複合体で機能するものなど、相応しくないものは除外し た。
[0035] 遺伝子領域の推定は、主に相同な既知遺伝子との比較により行った。相同な既知 遺伝子との比較は、 BLAST、 FASTA及び ALN (Bioinfomatics 2000 16 : 1 90 202)を用 V、て行った。既知遺伝子との相同性が限定的で 5 '端が推定できなか つた場合は、 5 'RACEを行うために、相同部分のアラインメント情報を準備した。 3， 末端の予測が本来の遺伝子領域より短すぎた場合は、転写調節因子の C末側がトラ ンケートされてしまうが、予測が長すぎた場合は、本来の C末端で翻訳は終止すると 考えられる。そこで、 3'末端が予測できな力つた場合は、相同部分からの距離や、隣 の遺伝子との位置関係などから、本来の 3'末端より十分に下流部分までを強制発現 ベクターに組み込む領域とすることにした。
[0036] このような方法で、前項の抽出の際に既知の遺伝子との相同性が高力つたものから 順次遺伝子領域の推定を行った。全長が in 3 0で推定できたものと5'1^^^にょ り 5 '末端が明らかにされたもの一部の合計 300遺伝子について強制発現株作成た めの予測配列を得た。
実施例 2
[0037] (発現用プラスミドの作製）
転写調節因子遺伝子を麹菌内で発現させるために用いる発現プラスミドとして、発 現ユニットとしてァスペルギルス.ォリゼアミラーゼ遺伝子プロモーター及びァスペル ギルス ·二ドランスアミラーゼ遺伝子ターミネータ一、転写調節因子遺伝子挿入用マ ルチクロ一-ングサイト、マーカー遺伝子としてァスペルギルス 'ォリゼ niaD遺伝子を 含むプラスミド pAPTLNを構築した。
[0038] 寒天プレート培地上で生育させた、ァスペルギルス. -ドランス IAM2130株の胞子 5 X 105個を搔き取り、滅菌したマイクロチューブに入れた 300 μ 1の Nuclei Lysis Solutionバッファー（Promega社製）に懸濁した。胞子を懸濁したマイクロチューブ に lgのガラスビーズ BZ— 06 (ァズワン株式会社製）を加え、 tissue lyser (QIAGE N社製)を用いて、 25回 Z秒、 3分間処理を 2回繰り返した。 65°Cで 15分間加温した 後、室温で 5分間放置した。 1.5 μ 1の Rnase Solution (lOmg/ml)を加え、 37°C で 1時間加温した。 100 1の Protein Precipitation Solutionをカ卩え 20秒間激し く振とうした後、 13, 500rpmで 5分間遠心処理した。遠心後の上清を別のマイクロチ ユーブに移し、 350 1のイソプロパノールを加え転倒混和した後、 12, OOOrpmで 3 分間遠心処理した。得られた沈殿を 70%エタノールで洗浄および乾燥処理した後、 100/zlの TEバッファー〔10mM Tris— HCl(pH7. 5), ImM EDTA〕に懸濁し ゲノム DNA溶液を得た。得られたゲノム DNAを铸型として、下記のプライマーを用 V、て PCRを行 、ァスペルギルス ·二ドランスアミラーゼ遺伝子ターミネータ一領域の 増幅を行った。
5 ― gggtagtcgtacccgatgatgaaac― 3 (酉歹 号 5)
5 ― agcctaggccgctgcaggcag― 3 ( 歹 U番 6)
PCR反応は、 TaKaRa LA Taq (タカラバイオ株式会社製）を使用し、 PTC— 200( MJ Research社製）を用いて行った。反応液の組成は以下のとおりである。
[0039] (試薬:使用量:終濃度）
TaKaRa LA Taq:0. 5^1
10XLA PCR BufferllrS^lrlX
25mM MgCl :5^1:2. 5mM
2
dNTP Mixture :8^1:それぞれ 0. 4mM
铸型 DNA (0. 5μΕ) :1μ\
プライマー： 1 1 X 2種類：それぞれ 0. 2μΜ
滅菌水： 28. 5^1
合計液量： 50 1
上記の反応液 50 1を 0. 2ml反応チューブ中で混合して PTC— 200にセットし、 以下の温度設定により PCRを行った。
95°C、 2分： 1サイクル
95。C、30秒 58。C、30秒 72。C、 2分： 30サイクル
72°C、 3分： 1サイクル。
[0040] 反応液をエタノール沈澱処理後、沈殿を 20 μ 1の ΤΕバッファーに懸濁した。さらに 、 Pstlで消化した後、 0. 7%ァガロースゲルで電気泳動し、 目的の増幅産物を切り出 した。切り出した増幅産物はゲルェクストラクシヨンキット (QIAGEN社製)を用いて精 製し、ァスペルギルス' -ドランスアミラーゼ遺伝子ターミネータ一を得た。プラスミド p UC19を Smal及び Pstlで処理した後、 0. 7%ァガロースゲルで電気泳動し、ゲルェ タストラクシヨンキット（QIAGEN社製）を用いて約 2. 7kbの DNA断片を回収した。回 収した DNA断片とァスペルギルス ·二ドランスアミラーゼ遺伝子ターミネータ一をライ ゲーシヨンした後、大腸菌 JM109を形質転換し、 pUC19のマルチクローユングサイト 内にある Smal - Pstl部位にァスペルギルス ·二ドランスアミラーゼ遺伝子ターミネ一 ターが挿入されたプラスミド pATを得た。
[0041] pATを Smal及び Hindlllで消化した後、 0. 7%ァガロースゲルで電気泳動し、ゲ ルェタストラクシヨンキット（QIAGEN社製）を用いてァスペルギルス ·二ドランスァミラ ーゼ遺伝子ターミネータ一を含む DNA断片を回収した
プラスミド PMAR5 (Biosci. Biotech. Biochem. , 56 (10) , 1674—1675, 199 2)を Smalおよび Hindlllで消化した後、 0. 7%ァガロースゲルで電気泳動し、ゲル ェクストラクシヨンキット（QIAGEN社製）を用いて argB遺伝子およびァスペルギルス •ォリゼアミラーゼ遺伝子ターミネータ一を除去した DNA断片を回収した。 pATおよ び PMAR5由来の両 DNA断片をライゲーシヨンした後、大腸菌 JM109を形質転換 し、ァスペルギルス ·ォリゼアミラーゼ遺伝子プロモーターおよびァスペルギルス · -ド ランスアミラーゼ遺伝子ターミネータ一を含むプラスミド pAPTを得た。
[0042] 下記の 2種類の合成 DNAを含む（各 100 μ Μ)ΤΕバッファー 100 μ 1を 5分間煮沸 後、室温まで徐冷しマルチクローユングサイトリンカ一とした。 ρΑΡΤを EcoRIおよび S malで消化した後、 0. 7%ァガロースゲルで電気泳動し、ゲルェクストラクシヨンキット (QIAGEN社製)を用いてマルチクローユングサイトを除去した DNA断片を回収し た。回収した DNA断片にマルチクローユングサイトリンカ一をライゲーシヨンした後、 大腸菌 JM109を形質転換しプラスミド pAPTLを得た。プラスミド pST14〔（Mol. Ge n. Genet (1989) 218 : 99— 104)を Hindlllで消ィ匕した後、 0. 7%ァガロースゲル で電気泳動し、ゲルェクストラクシヨンキット（QIAGEN社製）を用いてァスペルギルス •ォリゼ niaD遺伝子を含む DNA断片を回収した。回収した niaD遺伝子を含む DN A断片を pAPTLの Hindlll部位に挿入し、転写調節因子遺伝子発現用プラスミド pA PTLNを得た。
[0043] (転写調節因子遺伝子発現用組換えベクターの作製）
転写調節因子遺伝子と予測された DNA配列を基に PCRにより各転写調節因子遺 伝子を取得した。まず、ァスペルギルス'ォリゼ RIB40のゲノム DNAを調製した。次 に調製したゲノム DNAを铸型に、予測遺伝子の開始コドン上流 lOObpの DNA配列 及び終始コドン近傍の DNA配列を参考に作製した 2種類のプライマーを用いて、 P CRにより各転写調節因子遺伝子を取得した。開始コドン上流の DNA配列を参考に プライマーを作製する際には、 pAPTLNのマルチクローユングサイト上にある制限酵 素認識配列であり、かつ、増幅する転写調節因子遺伝子配列内に認識配列が存在 しない制限酵素認識配列を導入した。増幅した転写調節因子遺伝子は作製したブラ イマ一に認識配列を導入した制限酵素で処理した後、 pAPTLNのマルチクローニン グサイトに挿入し (導入した制限酵素部位と Smal部位の間）、各転写調節因子遺伝 子発現用組換えプラスミドベクターとした。
[0044] 以下、転写調節因子遺伝子発現用プラスミドベクターの作製の一例を示す。
[0045] 前記の方法を用いてァスペルギルス.ォリゼ RIB40株より調製したゲノム DNAを铸 型として、下記のプライマーを用いて PCRを行い、転写調節因子遺伝子 C001 (配列 番号 1)を得た。
5 ― atacaggcattctatcgataaaatgtttcc― a ' (目列 ¾·号
5 ― gggctacatctgctgttgtagaagttgc― 3 (酉己歹 U番号 8)
PCR反応は、 TOYOBO KOD— Plus— DNA Polymerase (TO YOBO社製）を 使用し、 PTC- 200 (MJ Research社製）を用いて行った。反応液の組成は以下の とおりである。
[0046] (試薬:使用量:終濃度）
KOD Plus DNA Polymerase : 1 μ \
10 X PCR buffer for KOD— Plus—： 5 1: 1 X
25mM MgCl : 2 ^ 1: 1πιΜ
2
2mM dNTP Mixture : 5 1:それぞれ 0. 2mM
铸型 DNA (0. 2 μ Ε) : 1 μ \
プライマー： 1 1 X 2種類：それぞれ 0. 3 Μ
滅菌水： 34 1
合計液量： 50 1 上記の反応液 50 1を 0. 2ml反応チューブ中で混合して PTC— 200にセットし、以 下のような温度設定により PCRを行った。
94°C、 2分： 1サイクル
94。C、 15秒 58。C、30秒 68。C、 4分： 30サイクル
68°C、 3分： 1サイクル。
[0047] 反応液をエタノール沈澱処理後、沈殿を 20 μ 1の ΤΕバッファー〔10mM Tris—H Cl (pH7. 5) , ImM EDTA〕に懸濁した。更に、 Clalで消化した後、 0. 7%ァガロ ースゲルで電気泳動し、 目的の増幅産物を切り出した。切り出した増幅産物はゲル ェクストラクシヨンキット（QIAGEN社製）を用いて精製した後、 pAPTLNのマルチク ローニングサイト上の Clal— Smal部位に挿入し、転写調節因子遺伝子 C001発現 用プラスミド pCOO 1を得た。
[0048] 同様の方法を用いて転写調節因子遺伝子 C002発現用プラスミド pC002、転写調 節因子遺伝子 C003発現用プラスミド pC003、転写調節因子遺伝子 C004発現用プ ラスミド PC004を得た。
[0049] 転写調節因子遺伝子 C002 (配列番号 2)を増幅する際には、 Clalの代わりに Nhel 認識配列を導入した下記の 2種類のプライマーを用いて増幅、精製後、 pAPTLNの マルチクロー-ングサイト上の Clal— Smal部位に挿入した。
5 — tcatacaagctagcaaaatggcggaga— 5 (目 ti列 ¾·号 9)
5 ― gggctcgataactttttactcccgtgata― 3 (酉己列番 10)
[0050] 転写調節因子遺伝子 C003 (配列番号 3)を増幅する際には、 Clalおよび Spel認識 配列を導入した下記の 2種類のプライマーを用いて増幅、精製後、 pAPTLNのマル チクロ一-ングサイト上の Clal— Spel部位に挿入した。
5 ― ccatcgataatattagtatgctgaatga― a ' (目 3列 ¾·号丄 1)
5 ― ggactagttcaggtctttcgaatgtcagga― 3 (酉己列番 12)
[0051] 転写調節因子遺伝子 C004 (配列番号 4)を増幅する際には、 Clal及び Spel認識配 列を導入した下記の 2種類のプライマーを用いて増幅、精製後、 pAPTLNのマルチ クロー-ングサイト上の Clal— Spel部位に挿入した。
5 ― ccatcgataagtaaaaggatgttattagat― ά (酉己列番号 5 '― ggactagtttaatccgttctcatggccgaa― 3 ' (酉己列番号 14)
実施例 3
[0052] (転写調節因子遺伝子強制発現麹菌の取得）
ァスペルギルス 'ォリゼ RIB326株から Mol. Gen. Genet (1989) 218： 99 - 104 記載の方法で取得した niaD欠損株を転写調節因子遺伝子発現用プラスミド pCOO 1 、 pC002、 pC004、 pC003で形質転換した。形質転換法は、プロトプラスト化した後 ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Mol. Gen. Genet (198 9) 218 : 99 - 104)によって行った。各プラスミド 5 gを用いて形質転換し、最小培 地で形質転換体を選択したところ、それぞれ約 200個のコロニーが得られた。このう ち各プラスミドにっき 15コロニーについて最小培地で単分生子分離を繰り返し、形質 の安定化を行った。次に、各転写調節因子遺伝子の成熟領域をプローブとしてサザ ン解析を実施し、それぞれの形質転換体の中から、形質転換に用いたプラスミドが形 質転換体のゲノム上の niaD遺伝子領域に挿入されて ヽる株を選択し、それぞれの 選択株を C001、 C002、 C003、 C004と命名した。サザン解析の結果を図 1に示し た。
実施例 4
[0053] (麹菌の培養方法及び菌体外酵素活性の測定）
(1)ゼラチン培地における麹菌の培養方法とゼラチン分解に関する蛋白質加水分解 酵素活性の測定
各形質転換体をゼラチンを含む液体培地で振とう培養し、ゼラチン分解能を確認し た。各形質転換体のゼラチン分解能の評価は、ゼラチンが分解されて生じる培地中 のグルタミン酸濃度をコントロールと比較することで行った。
[0054] 寒天最小培地上で生育させた各形質転換体の胞子を 3mlの滅菌水で搔き取り、 1 50ml容三角フラスコに入れた 40mlのゼラチン培地（2% Gelatin, 0. 1% KH P
2
O、 0. 05% MgSO、 0. 05% KC1、 0. 001% FeSO · 7Η 0、 0. 3%NaNO
4 4 4 2 3
、 3% Maltose pH6. 0)に植菌した（1 X 107個胞子 Z40mlゼラチン培地）。 30°C 、 150rpmで 115時間振とう培養した後、培養上清中のグルタミン酸量をャマサ L— グルタミン酸測定キット (ャマサ醤油株式会社製)を用いて測定した。また、上記のゼ ラチン分解能を指標として、培養上清の蛋白質加水分解酵素活性を測定した。コント ロールとして、実験毎に RIB326株 niaD欠損株を pAPTLNで形質転換して得られ た niaD+株を培養した。形質転換体の中で最もゼラチン分解能が高!、と思われる CO 04培養上清中のグルタミン酸量及び蛋白質加水分解酵素活性をコントロールに対 する相対値として示した。
[0055] [表 1]
Figure imgf000018_0001
[0056] (2)フスマ培地における麹菌野生株との培養方法と本発明の形質転換体の蛋白質 加水分解酵素活性の比較
フスマ:脱イオン水を 5 :4の比率で混合し、室温で 30分間放置した後、 150ml容量 の三角フラスコに 5gずつ分注し、オートクレーブで 15分滅菌した。次いで、予め血球 計で胞子数を計測してぉ 、た野生株ァスペルギルス ·ォリゼ RIB326株や強制発現 株の胞子懸濁液を、胞子がフスマ培地 lg当たり 5 X 105個になるように接種した。培 養は 30°Cで 4日間行い、培養開始後 24時間目と 48時間目に混合し、その後は培養 終了まで静置した。酵素液は、以下のようにして得た。培養終了後のフスマ培地に、 50mlの脱イオン水と 500 1のトルエンを加え、 2時間室温で振とうし、懸濁液を No. 2濾紙 (アドバンテック社製)で濾過し濾液を得て、これを酵素液とした。
[0057] 蛋白質加水分解酵素活性は、以下の計算式で示されるように、野生株の酵素活性 を 1とした時の比率で比較した。酵素活性比率 =強制発現株 (試料の吸光度-ブラン クの吸光度) /野生株 (試料の吸光度-ブランクの吸光度)。また、蛋白質加水分解酵 素活¾測定を下記のようにして行 、、試料とブランクの吸光度を求めた。
[0058] 予め 30°Cに温めた 2mlの基質液（1%ァゾカゼイン、 0. 05Mリン酸緩衝液： pH7.
0)に酵素液 20 1を加えて混合した。次に、これを 30°Cで 20分反応させた後、反応 停止液（10%トリクロ口酢酸） 2mlを加え、反応を停止した。 30°Cで 20分間放置して、 生じた沈殿をアドバンテック社製 No. 5C濾紙で濾過し、濾液の吸光度 (410nm)を 測定した。ブランクは、酵素液添加前に反応停止液を加えて、同じ操作を行った。
[0059] 野生株と強制発現株の蛋白質加水分解酵素活性を比較した結果、 C002、 COOl 、C003が野生株の 3倍の蛋白質加水分解酵素活性を示すことが確認された（図 2)。 また、 C004についても野生株の 2. 2倍の蛋白質加水分解酵素活性を示した。
[0060] 以上の結果から、 C001、 C002、 C003、 C004の各 DNA配列を含む本発明の組 換えベクターで形質転換された麹菌は麹菌原株に対して著しく蛋白質加水分解酵 素分泌が増大していることが判明した。また、液体培地であるゼラチン培地、固体培 地であるふすま培地においてそれぞれ蛋白質加水分解酵素活性が増大し、産業上 の利用可能性が高 、ものであった。
[0061] これらのうち、本発明における C001、 C002、 C003、 C004の DNA配列は、配列 表 1〜4のとおりである（配列中の初めから 101番目が開始コドンの先頭塩基、終わり 力 101番目が終止コドンの最終塩基を示す）。 COOlは、 C2H2型の Zinc finger モチーフを持ち、ァスペルギルス · -ドランスの steA遺伝子とアミノ酸レベルで 81 % 同一の相同性を示した。 steA遺伝子は、ァスペルギルス' -ドランスにおいて、有性 生殖に必要とされる遺伝子として報告されて 、る（Vallimら、 Mol Microbiol. 36 ( 2) : 290- 301, (2000) )。
[0062] C002は、 Zn2-Cys6 (Fungal zinc binuclear cluster)型の zinc fingerモチー フを持ち、ァスペルギルス'フミガタスの C6 finger domain protein, putativeをコ ードする機能未知の遺伝子と、アミノ酸レベルで 67%同一の相同性を示した。 C002 と相同性を示す遺伝子のうち、機能が報告されているもので最も高い相同性を示した のは、ネクトリア'へマトコッ力の、クチナーゼ遺伝子の転写に関わる naf遺伝子であつ た力 その相同性は、アミノ酸レベルで 31%同一に過ぎな力つた。
[0063] C003は、 Zn2— Cys6 (Fungal zinc binuclear cluster)型の zinc fingerモ チーフを持ち、ァスペルギルス'フミガタスの C6 finger domain protein, putati veをコードする機能未知の遺伝子（上記 C002と最も高い相同性を示す遺伝子とは 別遺伝子）と、アミノ酸レベルで 55%同一の相同性を示した。 C002と相同性を示す 遺伝子のうち、機能が報告されているもので最も高い相同性を示したのは、ァスペル ギルス '-ドランスの、硝酸同化関連遺伝子の転写に関わる nirA遺伝子であった力 その相同性は、アミノ酸レベルで 22%同一に過ぎなかった（以上の相同性は、 BLA ST(blastp)により、 NCBIの nrデータベースを対象とした相同性検索の結果を示し た)。
[0064] C004は、 C2H2型の Zinc fingerモチーフを持ち、ァスペルギルス · -ドランスの a mdX遺伝子とアミノ酸レベルで 73%同一の相同性を示した。 amdX遺伝子は、ァス ペルギルス '-ドランスにおいて、ァセトアミダーゼをコードする amdS遺伝子の転写 活性化因子として報告されている（Murphyら、 Mol Microbiol. 23 (3) : 591— 6 02, (1997) )。
[0065] 従って、これらの従来公知の遺伝子は全て、遺伝子配列、及び相同遺伝子の機能 から強制発現により蛋白質加水分解酵素活性を増大させることを何等示唆されるも のではない。
産業上の利用可能性
[0066] 本発明は、調味料の食品製造や、消化剤等の医薬品製造、洗剤用の蛋白質加水 分解酵素生産等において産業上極めて重要でかつ有用なものである。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAを含む組換えベクター。
[2] 配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列から なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、麹菌蛋白 質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードする DNAを含む組 換えベクター。
[3] 配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAと 80%以上の配列相同 性を示す塩基配列カゝらなる DNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大 する機能を有する蛋白質をコードする DNAを含む組換えベクター。
[4] 請求項 1、 2又は 3記載の組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と 比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする麹菌。
[5] 請求項 4記載の麹菌を、固体培地若しくは液体培地で培養して培地中に蛋白質カロ 水分解酵素を分泌させたのち、培地から蛋白質加水分解酵素を採取することを特徴 とする、蛋白質加水分解酵素の生産方法。
[6] 請求項 4記載の麹菌を培養して得られる培養物と蛋白質含有原料とを混合し、原料 中の蛋白質を分解することを特徴とする、蛋白質分解物の製造方法。
[7] 請求項 4記載の麹菌を培養して得られる培養物とゼラチン含有原料とを混合し、原料 中のゼラチンを分解することを特徴とする調味液の製造方法。
[8] 以下の（a)、（b)又は（c)の DNA:
(a)配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNA、
(b) (a)の塩基配列力 なる DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジ ン トな条件下でハイブリダィズする DNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を 増大する機能を有する蛋白質をコードする DNA、
(c) (a)の塩基配列力もなる DNAと 80%以上の配列相同性を示す塩基配列からな る DNAであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質 をコードする DNA。
[9] 以下の（a)又は (b)の蛋白質：
(a)配列番号 1、 2、 3又は 4で表される塩基配列力 なる DNAにコードされるアミノ酸 配列からなる蛋白質、
(b) (a)のアミノ酸配列において、 1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは 付加されたアミノ酸配列からなり、麹菌蛋白質分解酵素の分泌を増大する機能を有 する活性を有する蛋白質。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001500022A (ja) * 1997-07-05 2001-01-09 ソシエテ デ プロデユイ ネツスル ソシエテ アノニム 麹菌における蛋白分解酵素の発現の増強
JP2002101888A (ja) * 2000-09-29 2002-04-09 National Institute Of Advanced Industrial & Technology アルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するｄｎａ結合タンパク質の遺伝子とアミノ酸配列および該遺伝子を使用したアルカリプロテアーゼ生産量の増強法
JP2003000240A (ja) 2001-06-22 2003-01-07 National Research Inst Of Brewing 麹菌の固体培養発現遺伝子を制御する転写因子をコードするｄｎａ
JP2003070484A (ja) 2001-09-06 2003-03-11 Gekkeikan Sake Co Ltd 麹菌のアミラーゼ転写制御因子をコードするｄｎａ
JP2003235584A (ja) 2002-02-21 2003-08-26 Noda Inst For Scient Res 転写因子、転写因子遺伝子、転写因子遺伝子を含む組み換えベクター、該ベクターによって形質転換された麹菌及び麹菌の使用法
JP2005176602A (ja) 2001-12-27 2005-07-07 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 麹菌遺伝子

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7186540B2 (en) * 2001-12-27 2007-03-06 National Institute of Advanced Indusrtial Science and Technology Thermostable glutaminase and thermostable glutaminase gene

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001500022A (ja) * 1997-07-05 2001-01-09 ソシエテ デ プロデユイ ネツスル ソシエテ アノニム 麹菌における蛋白分解酵素の発現の増強
JP2002101888A (ja) * 2000-09-29 2002-04-09 National Institute Of Advanced Industrial & Technology アルカリプロテアーゼ遺伝子の発現を制御するｄｎａ結合タンパク質の遺伝子とアミノ酸配列および該遺伝子を使用したアルカリプロテアーゼ生産量の増強法
JP2003000240A (ja) 2001-06-22 2003-01-07 National Research Inst Of Brewing 麹菌の固体培養発現遺伝子を制御する転写因子をコードするｄｎａ
JP2003070484A (ja) 2001-09-06 2003-03-11 Gekkeikan Sake Co Ltd 麹菌のアミラーゼ転写制御因子をコードするｄｎａ
JP2005176602A (ja) 2001-12-27 2005-07-07 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 麹菌遺伝子
JP2003235584A (ja) 2002-02-21 2003-08-26 Noda Inst For Scient Res 転写因子、転写因子遺伝子、転写因子遺伝子を含む組み換えベクター、該ベクターによって形質転換された麹菌及び麹菌の使用法

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current protocols in molecular biology", 1987
"Molecular cloning", 2001, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS
BIOINFORMATICS, vol. 16, 2000, pages 190 - 202
BIOSCI. BIOTECH. BIOCHEM., vol. 56, no. 10, 1992, pages 1674 - 1675
CHEEVADHANARAK S. ET AL.: "Cloning and selective overexpression of an alkaline protease-encoding gene from Aspergillus oryzae", GENE, vol. 108, 1991, pages 151 - 155, XP003010844 *
KARLIN; ALTSCHUL, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 87, no. 2, 1993, pages 264 - 2268
MOL. GEN, GENET., vol. 218, 1989, pages 99 - 104
MOL. GEN. GENET, vol. 218, 1989, pages 99 - 104
MOL. GEN. GENET., vol. 218, 1989, pages 99 - 104
MURPHY ET AL., MOL MICROBIOL., vol. 23, no. 3, 1997, pages 591 - 602
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 990, 1993, pages 5873 - 5877
See also references of EP1932912A4 *
TANAKA A.: "Koujikin Asperfillus oryzae Yurai Alkaline Protease Idenshi no Hatsugen Kiko no Kaiseki", THE SOCIETY OF BIOTECHNOLOGY, JAPAN TAIKAI KOEN YOSHISHU, no. 953, 24 August 2001 (2001-08-24), pages 370, XP003010843 *
VALLIM ET AL., MOL MICROBIOL., vol. 36, no. 2, 2000, pages 290 - 301

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