JPWO2002077223A1 - 新規アミノペプチダーゼおよびその遺伝子 - Google Patents
新規アミノペプチダーゼおよびその遺伝子 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2002077223A1 JPWO2002077223A1 JP2002576666A JP2002576666A JPWO2002077223A1 JP WO2002077223 A1 JPWO2002077223 A1 JP WO2002077223A1 JP 2002576666 A JP2002576666 A JP 2002576666A JP 2002576666 A JP2002576666 A JP 2002576666A JP WO2002077223 A1 JPWO2002077223 A1 JP WO2002077223A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- protein
- activity
- seq
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
- C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本発明の目的は、難分解性ペプチドを効率良く分解する麹菌由来のアミノペプチダーゼおよび該アミノペプチダーゼをコードする遺伝子を提供することである。本発明により、アスペルギルス・ニジュランス由来アミノペプチダーゼおよびこれをコードする核酸分子が提供される。特に、本発明により、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜５１９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質または、そのアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質、およびこれらをコードする核酸分子が提供される。
Description
発明の背景
本発明は、アミノペプチダーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
醤油、味噌、その他のタンパク質加水分解物を含む天然調味料の製造に、麹菌が利用されている。たとえば、醤油は、製麹および発酵の２段階を経て製造される。主として、製麹段階において、麹菌（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌）が生産する酵素によって原料が分解される。その際、醤油中の呈味性をよくするためには、諸味中の遊離アミノ酸の量を増加させることが重要である。
アミノ酸は、原料タンパク質から２つの段階を経て生成される。第一は、プロテアーゼによるタンパク質からのペプチドの放出であり、第二はペプチダーゼによって触媒されるペプチドの加水分解によるアミノ酸の生成である。
麹菌のペプチダーゼについては、アスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・ソーヤ由来のもの（特開平１１−３４６７７７号、ＤＥ９５−１９５２６４８、ＷＯ９８５１１６３、ＷＯ９６２８５４２、ＷＯ９６１５５０４、ＷＯ９８５１８０３、ＷＯ９８１４５９９）について報告されている。そのなかでも、醤油製造においてはロイシンアミノペプチダーゼの重要性が示されている。しかしながら、これまで知られているロイシンアミノペプチダーゼについて耐塩性があるという報告はない。また、アスペルギルス属のロイシンアミノペプチダーゼの遺伝子については海附ら（特開平１１−３４６７７７号）のアスペルギルス・ソーヤの報告があるが、該酵素の耐塩性についての報告はない。
また、バチルス属では耐塩性をもつロイシンアミノペプチダーゼの報告がある（Ｌｅｅ，Ｇ．Ｄ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８），８５（３））。
一方、浅野らはダイズが、その発芽過程において、種子中の貯蔵タンパク質を非常に短時間にアミノ酸まで分解することに着目し、ダイズ子葉中よりペプチダーゼ類（酸性アミノ酸含有ペプチドを効率的に分解するアミノペプチダーゼＧＸ、及びロイシンアミノペプチダーゼ群）を見出し、ダイズタンパク質の効率的な加水分解を行うことに成功した（特開平９−２９４５８３号）。
ダイズのアミノペプチダーゼＧＸはその酵素学的諸性質から、これまでに報告されていない新規なアミノペプチダーゼであり、発芽大豆以外にはその存在は知られていない。ダイズのアミノペプチダーゼＧＸはＮ末端にグルタミン酸などの酸性アミノ酸を有するペプチドから、効率的にＮ末端の酸性アミノ酸を遊離する活性を有する。従って、本酵素の作用により、グルタミン酸の遊離率が高く呈味性の優れた醤油の製造が可能である。
二宮らはダイズのアミノペプチダーゼＧＸを遺伝子組換え技術を用いて大量生産することに成功した（特開２０００−３２５０９０）が、この方法により生産したダイズのアミノペプチダーゼＧＸを醤油醸造に利用することは、ＧＭＯ問題、コスト面等で困難である。
発明の開示
本発明は遊離アミノ酸含量が高く、呈味性の優れた醤油またはタンパク質分解物の製造に効果のある麹菌由来のアミノペプチダーゼおよび該アミノペプチダーゼをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
本研究者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ダイズ由来アミノペプチダーゼＧＸ遺伝子と相同性のある、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＥＳＴをプローブに用いることにより、アスペルギルス・ニジュランスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、アスペルギルス・ニジュランス由来新規アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すタンパク質である：
（Ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜５１９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１〜５１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｃ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜５１９で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質、
（Ｄ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１〜５１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
また本発明は、上記の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかをコードする核酸分子、該核酸分子を含む組換え核酸分子、形質転換微生物宿主、および該形質転換微生物宿主を用いたアミノペプチダーゼの製造法である。特に本発明は、形質転換微生物宿主として形質転換糸状菌、とりわけ形質転換麹菌を含む。
また、本発明は、以下の１）〜８）の性質を有するアミノペプチダーゼである。
１）ロイシン、メチオニンをＮ末端に含むペプチド又はタンパク質を分解してロイシンあるいはメチオニンを遊離する。
２）至適ｐＨが約７．０〜７．５である。
３）至適温度が約３７〜４５℃である。
４）食塩非存在下での活性を１００％としたとき、３Ｍの食塩濃度下でも８０％以上の残存活性を示す。
５）０℃、食塩非存在下、２４時間保存の条件での活性を１００％としたとき、０℃、３Ｍ食塩存在下、２４時間保存の条件で８０％以上の残存活性を示す。
６）ｐＨ７．５、０℃、２４時間保存の条件での活性を１００％としたとき、ｐＨ５．８〜９．５の範囲で０℃、２４時間保存の条件で６０％以上の残存活性を示す。
７）未変性−ＰＡＧＥにより約５５０ｋＤ、還元、加熱ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２２、３３ｋＤの分子量を示す。
８）活性化にコバルトイオン、或いは亜鉛イオンを必要とする。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、上述したとおり、麹菌由来のアミノペプチダーゼおよび、それをコードする核酸分子、および前記核酸分子を含む組換えＤＮＡを含む形質転換微生物宿主、その形質転換微生物宿主を培養することを特徴とするアミノペプチダーゼの製造方法である。本明細書においては、本発明の麹菌由来アミノペプチダーゼタンパク質をＰｅｐＥと記載し、ＰｅｐＥをコードする遺伝子をｐｅｐＥと記載することがある。また、本明細書において、「アミノペプチダーゼ」とは、ペプチドのＮ−末端から順次アミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。
本発明のアミノペプチダーゼをコードする核酸分子は、アスペルギルス・ニジュランスの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから取得することができる。具体的には、アスペルギルス・ニジュランス、例えばアスペルギルス・ニジュランスＡ２６株の染色体ＤＮＡライブラリーから取得することができる。発芽大豆由来のアミノペプチダーゼＧＸ（特開２０００−３２５０９０）の遺伝子配列とアスペルギルス・ニジュランスＥＳＴデータベース中の相同性の高いＥＳＴ断片の塩基配列を参考に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）プライマーを作製し、アスペルギルス・ニジュランス染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲ法により本発明の核酸分子を含むクローンを取得することができる。ＰＣＲ用プライマーの例としては、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
また、本発明の核酸分子は、アスペルギルス・ニジュランスのポリ（Ａ）ＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーから、例えば配列番号８及び９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ、さらに配列番号１０及び１１に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとする５’−ＲＡＣＥによって、取得することができる。上記のようにして得られるアスペルギルス・ニジュランスＡ２６由来のＰｅｐＥをコードする遺伝子を含むゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。また、ｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号３を示す。ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果、ゲノムＤＮＡ中にはイントロンは見出されなかった。
本発明の核酸分子は、本発明のアミノペプチダーゼをコードするものであればよく、配列番号２に示す塩基配列のうち塩基番号７２〜１６２８からなる塩基配列を有するＤＮＡの他、５’末端側の不要な部分を除いたものも含まれる。「核酸分子」にはＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらのアナログも含まれる。使用する目的によっては、成熟タンパク質のみをコードするものであってもよい。また、コード領域において各アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他の等価のコドンに置換したものも本発明の核酸分子に含まれる。さらに、本発明の核酸分子は、コードされるアミノペプチダーゼの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノペプチダーゼをコードするものであってもよい。ここで、「複数」とは、ペプチダーゼタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、通常２〜３００個、好ましくは２〜１７０個、さらに好ましくは２〜５０個、最も好ましくは２〜１０個である。
上記のようなアミノペプチダーゼと実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるようにｐｅｐＥの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された核酸分子は、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、ＰｅｐＥをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びＰｅｐＥをコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、麹菌の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有する核酸分子を、適当な細胞で発現させ、発現産物のＰｅｐＥ活性を調べることにより、ＰｅｐＥと実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。また、変異を有するＰｅｐＥをコードする核酸分子またはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７２〜１６２８からなる塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰｅｐＥ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を単離することによっても、ＰｅｐＥタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。この条件は個々の配列のＧＣ含量や繰り返し配列の有無などに依存するため明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸分子同士、例えば６５％以上の相同性を有する核酸分子同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸分子同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗滌条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれる可能性があるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎＰｅｐＥ活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
また、本発明の核酸分子は、アスペルギルス属の他の種に属する微生物、例えばアスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから取得することもできる。具体的には、アスペルギルス・オリゼ、例えばアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法により取得することができる。上記アスペルギルス・ニジュランスのＰｅｐＥの塩基配列をもとに、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、アスペルギルス・オリゼ、例えばアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の菌体より調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲ用プライマーとしては、５’−ＲＡＣＥ用には配列番号１２及び１３に示す塩基配列、３’−ＲＡＣＥ用には配列番号１４及び１５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上記のようにして得られるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のｐｅｐＥに対応する遣伝子ｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号５に示す。配列番号２に示すアスペルギルス・ニジュランスのＰｅｐＥのアミノ酸配列と配列番号４に示すアスペルギルス・オリゼの対応するアミノペプチダーゼのアミノ酸配列は、約７７％の相同性を有しており、成熟タンパク質部分では約１２０アミノ酸残基が異なっている。アスペルギルス・オリゼのｐｅｐＥ対応遺伝子とアスペルギルス・ニジュランスのｐｅｐＥとの相同性は、コード領域では約７１％であった。
本発明の一つの実施態様において、本発明の核酸分子は、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１〜５１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸からなり、かつ、ペプチドからアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む。また、本発明の別の実施態様では、本発明の核酸分子は、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち、塩基番号７３〜１６０２からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチドからアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む。
以下に示す実施例においては、本発明の核酸分子は上記のようにして得られたＤＮＡである。その塩基配列が明らかとなったので、アスペルギルス・ニジュランスＡ２６もしくはアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０、又はアスペルギルス・ニジュランスもしくはアスペルギルス・オリゼの他の菌株のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーション等により、これらの菌株から対応するアミノペプチダーゼをコードする核酸分子を容易にクローニングすることができる。従って、そのような核酸分子も本発明の範囲である。
本発明の核酸分子は本発明のアミノペプチダーゼを製造するために使用することができる。
本発明の核酸分子は、麹菌等の糸状菌の育種、あるいはアミノペプチダーゼＰｅｐＥの製造に利用することができる。例えば、本発明の一つの実施態様において、本発明のアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを、糸状菌（例えばアスペルギルス・オリゼ）細胞内に好ましくはマルチコピーで導入することにより、ＰｅｐＥ活性を増大させることができる。また、本発明の核酸分子を適当な宿主で発現させることにより、ＰｅｐＥを製造することができる。このようにして得られる麹菌等の糸状菌又はそれらより得られるＰｅｐＥを、醤油、味噌、その他のタンパク質加水分解物を含む調味料等の製造に利用することができる。
本発明の核酸分子を導入する糸状菌としては、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニジュランス等のアスペルギルス属、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）等のニューロスポラ属、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）等のリゾムコール属に属する糸状菌が挙げられる。アスペルギルス属糸状菌が特に好ましい。
上記のような糸状菌に本発明の核酸分子を導入するためのベクターとしては特に制限されず、糸状菌の育種等に通常用いられているものを使用することができる。例えば、アスペルギルス・オリゼに用いられるベクターとしては、ｐＵＮＧ（Ｌｅｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４，４２５−４３１（１９９５））、ｐＭＡＲＧ（Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４０，３２７−３３２（１９９３））、ｐＵＳＣ（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，２５４９−２５５５（１９８７））等が挙げられる。ｐＵＮＧはアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００（Ｍｉｎｅｔｏｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３０，４３２−４３８（１９９６））のｎｉａＤ−（硝酸資化能欠損）を相補するマーカーを、ｐＭＡＲＧはアスペルギルス・オリゼＭ２−３（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１（９），２５４９−２５５５（１９８７））のａｒｇＢ−（アルギニン要求）を相補するマーカーを、ｐＵＳＣはアスペルギルス・オリゼＮＳ４（Ｙａｍａｄａ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９（１９９７））のｓＣ−（ＡＴＰスルフリラーゼ欠損）を相補するマーカーを、それぞれ有している。
これらのベクターのうち、ｐＵＮＧ及びｐＭＡＲＧは、グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）のプロモーター及びα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＢのターミネーター）を有しており、該プロモーターの下流に本発明のＤＮＡ（例えば配列番号２において塩基番号７２〜１６２８を含む領域）をフレームを合わせて挿入することにより、該プロモーター制御下でＰｅｐＥを発現させることができる。また、ｐＵＳＣはプロモーターを含んでいないので、これを用いる場合は、本発明のＤＮＡを挿入したｐＵＣ１９等のプラスミドとｐＵＳＣとの共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により宿主糸状菌に導入することによってＰｅｐＥを発現させることができる。
また、以下の表１中に示した文献に記載されているベクター、プロモーター及びマーカーも宿主糸状菌に応じて使用することができる。表１中、プロモーターは天然にその制御下にある遺伝子がコードする酵素名で示してある。
糸状菌の形質転換は、上記文献に記載されている方法の他、任意の公知の方法を採用することができる。例えばアスペルギルス・オリゼは以下のようにして形質転換することができる。
ＤＰＹ培地（グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ｐＨ５．０）に菌体（分生子）を植菌し、３０℃で２４時間程度激しく振盪培養する。培養液をミラクロス（Ｍｙｒａｃｌｏｔｈ、ＣＡＬＢＩＯ ＣＨＥＭ社製）又は滅菌したガーゼ等で濾過し、菌体を回収し、滅菌水で洗浄し、水分をよく切る。この菌体を、試験管に入れ、酵素液（１．０％ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ、宝酒造（株）製）、または０．５％ノボザイム（ＮｏｖｏＺｙｍｅ、ノボノルディスク社製）及び０．５％セルラーゼ（例えばＣｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ、ヤクルト社製）、０．６Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭリンゴ酸、ｐＨ５．５）を加え、３０℃で３時間程度穏やかに振盪する。顕微鏡でプロトプラスト化の程度を観察し、良好であれば氷中に保存する。
上記酵素反応液をミラクロスで濾過して菌体残渣を除去し、プロトプラストを含む濾液に等量の緩衝液Ａ（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、３５ｍＭ ＮａＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えて氷中に置く。これを０℃、１５００〜２，５００ｒｐｍで５〜１０分間遠心した後、緩やかに停止させ、ペレットを緩衝液Ａで洗浄し、適量の緩衝液Ａに懸濁する。１００〜２００μｌのプロトプラスト懸濁液に２０μｌ以下のＤＮＡ溶液（５〜１０μｇ）を加え、２０〜３０分氷中に置く。緩衝液Ｂ（６０％ポリエチレングリコール６０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を２５０μｌ加えて穏やかに混合し、再び緩衝液Ｂを２５０μｌ加えて穏やかに混合した後、さらに緩衝液Ｂを８５０μｌ加えて穏やかに混合し、２０分室温で静置する。その後、１０ｍｌの緩衝液Ａを加えて試験管を反転させ、０℃、１，５００〜２，５００ｒｐｍで５分間〜１０分間遠心し、ペレットを５００μｌの緩衝液Ａに懸濁する。
上記懸濁液の適量を、予め分注し保温しておいた５ｍｌのトップアガーに加えて、下層培地（１．２Ｍソルビトールを含有し、マーカーに応じて調製した選択培地）に重層し、３０℃で培養する。生育した菌体を選択培地に植え継いで、形質転換体であることを確認する。さらに、菌体から組換えＤＮＡを調製し、制限酵素解析又はサザン解析等によって、本発明のＤＮＡが導入されていることを確認しておくことが好ましい。
上記のようにして得られる形質転換体を、使用するプロモーターに適した条件で培養することによってｐｅｐＥが発現し、ＰｅｐＥが得られる。例えば、アスペルギルス・オリゼを宿主に用い、プロモーターとしてグルコアミラーゼプロモーターを使用する場合には、小麦フスマ、リン酸カリウム等を含む培地に形質転換アスベルギルス・オリゼの胞子を懸濁し、約３０℃にて約３日間培養することによりＰｅｐＥを産生させることができる。必要に応じて培養物を蒸留水等で希釈し、ストマッカー等で処理することによってＰｅｐＥを含む酵素粗抽出液を得ることができる。得られた粗抽出液はゲル濾過、種々のクロマトグラフィー等を用いることによって更にＰｅｐＥを精製することもできる。得られたＰｅｐＥは更に塩析、等電点沈殿、ゲル濾過、イオンクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によって精製して、タンパク質の分解のために使用することができる。しかしながら、本発明の核酸分子を導入しＰｅｐＥ活性の向上した形質転換微生物の培養物をタンパク質分解酵素とともにタンパク質原料と直接混合してタンパク質またはその混合物に作用させることにより、遊離アミノ酸含量が高く、呈味の強いタンパク質加水分解物を得ることもできる。作用させるタンパク質原料としては、例えば大豆、小麦、小麦グルテン等が挙げられ、さらに脱脂大豆あるいは膨化や可溶化等の加工をされた種々のタンパク質あるいはこれらの種々の原料からの分離タンパク質であってもよい。
ＰｅｐＥ活性は、例えば１ｍＭ Ｌｅｕ−ｐＮＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５）０．７５ｍｌに酵素粗抽出液０．０２ｍｌ、１００ｍＭ塩化亜鉛０．０１５ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた、４０％酢酸を０．２５ｍｌ添加して反応を停止させた後、反応液の４０５ｎｍの吸光度を測定することにより測定することができる。種々の調製物中の活性は１分間あたりに１μｍｏｌのパラニトロアニリドを生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）として比較することができる。
形質転換微生物の培養物または粗精製酵素をタンパク質に作用させる実用的条件としては、たとえば０．２〜５０％濃度のタンパク質原料に形質転換微生物の培養物をタンパク質分解酵素存在下で混合し、５〜６０℃にて４時間〜１０日間反応させればよい。
反応終了後、未反応のタンパク質原料、菌体などの不溶物は遠心分離や濾過等、従来の分離法を用いて除去すればよい。また、必要に応じて減圧濃縮、逆浸透法などにより濃縮を行い、濃縮物は、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理により粉末化または顆粒化することもできる。かくして遊離アミノ酸含有量が高く、呈味性の強いタンパク質加水分解物を得ることができる。
実施例
実施例１．アスペルギルス・ニジュランスのｐｅｐＥゲノムＤＮＡのクローニング
発芽大豆由来のアミノペプチダーゼＧＸの配列をもとに、アスペルギルス・ニジュランスのＥＳＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｏｕ．ｅｄｕ／ｆｕｎｇａｌ．ｈｔｍｌ）を用いて、ホモロジー検索したところ、相同性の高いＥＳＴ ｏｂｄ０３ａ１．ｆ１を見出した。
この情報を下に、アスペルギルス・ニジュランス ゲノムライブラリーからアスペルギルス・ニジュランスｐｅｐＥのクローニングを以下のように行なった。
アスペルギルス・ニジュランス ゲノムライブラリーはＦｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）より購入した。本ライブラリーはアスペルギルス・ニジュランスのゲノムＤＮＡを制限酵素で切断した後、コスミドベクターに連結させ、エシェリヒア・コリに導入したものである。ライブラリーのスクリーニングは以下のようにおこなった。即ち、コスミドベクターを含む大腸菌を鋳型ＤＮＡ源として、ＥＳＴ ｏｂｄ０３ａ１．ｆ１の塩基配列に基づいて合成した下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲにより、目的遺伝子が含まれる大腸菌クローンをスクリーニングした。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号６，７：ＰＣＲプライマー
ＰＣＲ反応は、９４℃３分間の熱変性後、９４℃３０秒、５２℃１０秒、７２℃３０秒の反応を２５サイクルで行なった。その結果、４個のクローンに目的遺伝子が含まれることが明らかとなった。これらのクローンよりコスミドベクターを回収し、塩基配列を決定した。本塩基配列およびこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号３に示す。
本遺伝子をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株は、プライベートナンバーＡＪ１３８５６が付され２００１年３月１９日に経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６３が付与され、平成１４年３月１１日付けで同センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４９として国際寄託へ移管されている。
実施例２．アスペルギルス・ニジュランスのｐｅｐＥ ｃＤＮＡのクローニング
アスペルギルス・ニジュランスＡ２６をＹＧ培地（酵母エキストラクト０．５％，グルコース２．５％，微量元素＊０．１％、ｐＨ６．５）５０ｍｌで３０℃、４８時間振とう培養した（微量元素＊：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８８％，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０４％，ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．０１５％，Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ ０．０１％，（ＮＨ４）６ＭｏＯ２４・４Ｈ２Ｏ ０．００５％）。
菌体を回収し、液体窒素にて凍結後、乳鉢を用いて粉砕した。粉砕物より、ＲＮ ｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡの調製を行ない、Ｍｉｃｒｏ ＦＡＳＴ Ｔｒａｃｋ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を用いてｍＲＮＡの調製を行なった。このｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーの作製を行った。
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、アスペルギルス・ニジュランスゲノムＤＮＡ配列よりデザインした下記配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲおよび５’−ＲＡＣＥにより、ｐｅｐＥ ｃＤＮＡのクローニングを行った。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号８〜１１：ＰＣＲプライマー
ＰＣＲの反応条件は、９４℃９分間の熱変性の後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒の反応を３０サイクル行い、さらに７２℃５分の反応を行った。その結果、配列番号８及び９のプライマーを用いたＰＣＲにより約１８００ｂｐのＤＮＡ断片が、配列番号１０及び１１のプライマーを用いた５’−ＲＡＣＥにより約２５０ｂｐの増幅断片が得られた。これらのＤＮＡ断片の塩基配列および塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
上記アスペルギルス・ニジュランスｐｅｐＥ ｃＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに挿入して得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株は、プライベートナンバーＡＪ１３８５７が付され、２００１年３月１９日に経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６４が付与され、平成１４年３月１１日付けで同センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９５０として国際寄託に移管されている。
実施例３．アスペルギルス・オリゼのｐｅｐＥ相同ｃＤＮＡのクローニング
（１）アスペルギルス・オリゼｃＤＮＡライブラリーの構築
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）を、ＤＰＹ培地５０ｍｌで３０℃、６４時間培養した。菌体をろ過により集め、１ｇを回収した。この菌体を直ちに液体窒素で凍結し、乳鉢で粉砕した後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて全ＲＮＡを得た。このＲＮＡからｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてｍＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡ ＰＣＲ ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ（ＴａＫＡＲａ社）または３’−ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）により、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
（２）アスペルギルス・オリゼｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
実施例２で得たアスペルギルス・ニジュランスのＰｅｐＥ配列を参考に、配列番号１２及び１３で示したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いた５’−ＲＡＣＥおよび配列番号１４及び１５を用いた３’−ＲＡＣＥによって、アスペルギルス・オリゼのｐｅｐＥに相同なｃＤＮＡのクローニングを行った。
＜配列表フリーテキスト＞
配列番号１２〜１５：ＰＣＲプライマー
５’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応は、９５℃で９分熱変性した後、９４℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃１分の反応を３５サイクル行った。これにより約１４００ｂｐのアスペルギルス・オリゼｐｅｐＥ断片を得た。３’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応は、９５℃で９分熱変性した後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分の反応を３５サイクル行った。これにより約３００ｂのアスペルギルス・オリゼのｐｅｐＥ相同遺伝子断片を得た。
上記遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、全長ｐｅｐＥ相同配列を含むことが明らかとなった。この塩基配列およびこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号５に示す。
本遺伝子配列をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに挿入して得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＤＨ５α株は、プライベートナンバーＡＪ１３８５８が付され、２００１年３月１９日に経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６５が付与されて、平成１４年３月１１日付けで同センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９５１として国際寄託に移管されている。
実施例４． アスペルギルス・オリゼにおけるｐｅｐＥの発現
（１）形質転換アスペルギルス・オリゼの作製
実施例３で得たアスペルギルス・オリゼのｐｅｐＥ ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩサイトに連結してプラスミドｐＢＳＡｏｐｅｐＥを作成した。本プラスミドからｐｅｐＥ ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで切り出し、マーカー遺伝子ｎｉａＤを含むベクターｐＵＮＧ１（Ｌｅｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４４，４２５−４３１（１９９５））のグルコアミラーゼプロモーターの下流に連結し、形質転換用のプラスミドｐＮＧＡＰＥを作成した。本プラスミドＤＮＡ１０μｇにより形質転換を行った。
ＤＰＹ培地にアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００株の分生子を植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養液を滅菌したガーゼでろ過し、菌体を回収し、滅菌水で洗浄した。この菌体を試験管に入れ、酵素液２０ｍｌ（１．０％ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ，宝酒造（株）製））を加え、３０℃で３時間穏やかに振とうした。顕微鏡でプロトプラスト化の程度を観察し、氷中に保存した。
上記酵素反応液をミラクロスでろ過して菌体残さを除去し、プロトプラストを含むろ液に等量の緩衝液Ａ（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えて氷中に置いた。これを０℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心したのち、穏やかに停止させ、ペレットを１０ｍｌの緩衝液Ａで２回洗浄し、１ｍｌの緩衝液Ａに懸濁した。
１００μｌのプロトプラスト懸濁液に１０μｌのＤＮＡ溶液（１０μｇ）を加え、３０分間氷中に置いた。緩衝液Ｂ（６０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）６０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を２５０μｌ加えて穏やかに混合し、再び緩衝液Ｂを２５０μｌ加えて穏やかに混合した後、さらに緩衝液Ｂを８５０μｌ加えて穏やかに混合し、２０分間室温で静置した。その後、１０ｍｌの緩衝液Ａを加えて、試験管を反転させ、０℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを５００μｌの緩衝液Ａに懸濁した。
上記懸濁液をあらかじめ分注し保温しておいた５ｍｌのトップアガー培地に加え、ツアペックドックス培地（１．２Ｍソルビトール、０．３％硝酸ナトリウム、０．２％塩化カリウム、０．１％リン酸カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム七水和物、０．００２％硫酸第一鉄七水和物、２％グルコース、ｐＨ５．５）に重層し、３０℃で培養した。生育した菌体１０株をツアペックドックス培地に植え継いで、安定した形質転換体を得た。
（２）ｐｅｐＥの産生
上述のようにして得られた形質転換体を小麦フスマで培養し、その抽出液についてアミノペプチダーゼ活性を測定した。
小麦フスマ２０ｇ、リン酸カリウム０．３ｇ、蒸留水１４ｍｌをよく攪拌した後、三角フラスコに入れ、１２０℃で３０分間オートクレーブすることによって培地を作成した。胞子を十分形成させたシャーレに滅菌水８ｍｌを注ぎ、攪拌して胞子懸濁液を調製し、これを前記培地に散布した。胞子を接種した培地を良く混和し、３０℃で３日間培養した。上記のようにして作成したフスマ麹に１０倍量の蒸留水を添加してストマッカーで５分間処理することで、酵素粗抽出液を得た。
上述のように調製した酵素粗抽出液中のアミノペプチダーゼ活性を以下のように測定した。即ち、１ｍＭ Ｌｅｕ−ｐＮＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５）０．７５ｍｌに酵素粗抽出液０．０２ｍｌ、１００ｍＭ 塩化亜鉛０．０１５ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、４０％酢酸を０．２５ｍｌ添加して反応を停止した。反応液の４０５ｎｍの吸光度を測定し、活性を測定した。活性は１分間あたりに１μｍｏｌのパラニトロアニリドを生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）とした。対照としてマーカー遺伝子のみを含むベクターＤＮＡで形質転換して得られた形質転換体についても同様に酵素粗抽出液を調製し、前述した方法でアミノペプチダーゼ活性を測定した。
その結果、本発明の遺伝子を導入した株において顕著なアミノペプチダーゼ活性の上昇が認められた（表２）。従って、導入したアミノペプチダーゼ遺伝子が実際に発現し、アミノペプチダーゼが産生されたことが示された。
実施例５．ＰｅｐＥの特性解析
（１）ｐｅｐＥの精製
小麦フスマ培地２０ｇを３００ｍｌフラスコに入れ、１２０℃、２０分間オートクレーブすることによって培地を作製した。
実施例４で作成したＰｅｐＥ高発現形質転換株の胞子懸濁液を調製し、これを前記培地に接種した。胞子を接種した培地をよく混和し、３０℃で５日間培養した。途中４８時間後に培地を撹拌して手入れを行った。
上記のようにして作製したフスマ麹を１０倍量（ｗ／ｗ）の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリド）に浸漬し、４℃で１６時間静置後、ガーゼ濾過及び遠心分離（４℃、１０分間、７，５００ｒｐｍ）により得られた上清を酵素粗抽出液とした。
この酵素粗抽出液に硫酸アンモニウムを添加し、４０％−６０％硫安沈殿画分を取得した。この沈殿を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。これを孔径０．４５μｍのフィルターで濾過した。あらかじめ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した脱塩用カラム（アマシャムファルマシア製 ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（２５ｍｌ））に前述の濾液を供し、同緩衝液で溶出した。得られた活性画分を限外濾過することにより、濃縮した。
次に、あらかじめ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した陰イオン交換カラム（アマシャムファルマシア製ＨｉＴｒａｐ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（２５ｍｌ））に、上記で得た試料を吸着させ、カラム体積の３倍量の同緩衝液で洗浄した。洗浄後、緩衝液のＮａＣｌ濃度を０Ｍから１Ｍにカラム体積の２０倍量で直線的に増加させて溶出した。溶出液中に回収された活性画分を、限外濾過にて濃縮した。
得られた試料を、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（アマシャムファルマシア製）を用い、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。あらかじめ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したこのカラムに試料を供し、同緩衝液で溶出して活性画分を回収した。以上の操作により、精製ＰｅｐＥを得た。
（２）ＰｅｐＥの活性測定
本酵素液のアミノペプチダーゼ活性の測定は以下のように行った。即ち、基質液（１ｍＭ Ｌｅｕ−ｐＮＡ、５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５），２ｍＭ塩化コバルト）０．７３ｍｌに酵素粗抽出液０．０２ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、４０％酢酸を０．２５ｍｌ添加して反応を停止した。本反応液の４０５ｎｍの吸光値を測定し、活性値を算出した。なお、活性は１分間あたりに１μｍｏｌのパラニトロアニリドを生成する酵素活性を１ユニットとした。
以下に本酵素の酵素学的諸性質を示す。
（ｉ）基質特異性
前記活性測定法において、Ｌｅｕ−ｐＮＡの代わりにＸ−ｐＮＡを用い、各種Ｘ−ｐＮＡの分解活性を測定した。Ｌｅｕ−ｐＮＡの分解活性を１００とした時の相対活性を下表（表３）に示す。本酵素はＮ末端にＬｅｕを含むペプチドを効率よく分解することがわかった。
（ｉｉ）至適温度
前記活性測定法において、各種温度でＬＡＰ活性を測定した。３７℃での活性値を１００とした時の、相対活性を図１に示す。
（ｉｉｉ）反応液中食塩濃度の影響
前記活性測定法において、ＮａＣｌを各濃度添加した際のＬＡＰ活性を測定した。ＮａＣｌ無添加区の活性値を１００とした時の、相対活性を図２に示す。本酵素は高濃度の食塩下でも、十分にその活性を保持していることがわかった。
（ｉｖ）至適ｐＨ
前記活性測定法において、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）の代わりに、終濃度５０ｍＭとなるよう、各種ｐＨ緩衝液を反応液に加えた。リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中におけるＬＡＰ活性を１００とした。各ｐＨにおける活性を図３に示す。
（ｖ）ｐＨ安定性
精製酵素を５０ｍＭ各種ｐＨ緩衝液中、０℃で２４時間保存した後、前記活性測定方法（ｐＨ７．５）でＬＡＰ活性を測定した。ｐＨ７．５リン酸緩衝液で保存した際の活性値を１００とした時の相対活性値を表４に示す。
（ｖｉ）食塩溶液中での安定性
精製酵素を０−４Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中、０℃で２４時間保存した後、保存塩濃度と同じ塩濃度の反応液中での活性を測定した。その結果を表５に示す。
（ｖｉｉ）金属イオンの影響
前記活性測定法において、塩化コバルトの代わりに各種２価金属塩を用い、各種Ｘ−ｐＮＡの分解活性を測定した。塩化コバルトを加えた際のＬｅｕ−ｐＮＡの分解活性を１００とした時の相対活性を表６に示す。
本発明により、遊離アミノ酸含有量が高く、呈味の強いタンパク質加水分解物を得る手段が提供される。特に、多量の食塩を含む醤油醸造下でペプチドを効率よく分解するアミノペプチダーゼおよびこれをコードする核酸分子が提供され、これによって醤油またはタンパク質加水分解物の呈味性を更に高めることが可能となる。
本発明の核酸分子を発現可能な形態で導入された宿主は、本発明のタンパク質を産生するために利用することが可能となる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰｅｐＥ活性の温度依存性を示したグラフである。横軸は温度、縦軸は３７℃における活性値を１００としたときのロイシンアミノペプチダーゼ活性の相対値である。
図２は、ＰｅｐＥに対する反応液中の食塩濃度の影響を示すグラフである。横軸はＮａＣｌ濃度（Ｍ）、縦軸はＮａＣｌ無添加の場合の活性値を１００としたときのＮａＣｌ濃度におけるロイシンアミノペプチダーゼ活性の相対値である。
図３は、ＰｅｐＥ活性のｐＨ依存性を示したグラフである。横軸はｐＨ、縦軸はリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中における活性値を１００としたときのロイシンアミノペプチダーゼ活性の相対値である。
本発明は、アミノペプチダーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
醤油、味噌、その他のタンパク質加水分解物を含む天然調味料の製造に、麹菌が利用されている。たとえば、醤油は、製麹および発酵の２段階を経て製造される。主として、製麹段階において、麹菌（アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌）が生産する酵素によって原料が分解される。その際、醤油中の呈味性をよくするためには、諸味中の遊離アミノ酸の量を増加させることが重要である。
アミノ酸は、原料タンパク質から２つの段階を経て生成される。第一は、プロテアーゼによるタンパク質からのペプチドの放出であり、第二はペプチダーゼによって触媒されるペプチドの加水分解によるアミノ酸の生成である。
麹菌のペプチダーゼについては、アスペルギルス・オリゼやアスペルギルス・ソーヤ由来のもの（特開平１１−３４６７７７号、ＤＥ９５−１９５２６４８、ＷＯ９８５１１６３、ＷＯ９６２８５４２、ＷＯ９６１５５０４、ＷＯ９８５１８０３、ＷＯ９８１４５９９）について報告されている。そのなかでも、醤油製造においてはロイシンアミノペプチダーゼの重要性が示されている。しかしながら、これまで知られているロイシンアミノペプチダーゼについて耐塩性があるという報告はない。また、アスペルギルス属のロイシンアミノペプチダーゼの遺伝子については海附ら（特開平１１−３４６７７７号）のアスペルギルス・ソーヤの報告があるが、該酵素の耐塩性についての報告はない。
また、バチルス属では耐塩性をもつロイシンアミノペプチダーゼの報告がある（Ｌｅｅ，Ｇ．Ｄ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８），８５（３））。
一方、浅野らはダイズが、その発芽過程において、種子中の貯蔵タンパク質を非常に短時間にアミノ酸まで分解することに着目し、ダイズ子葉中よりペプチダーゼ類（酸性アミノ酸含有ペプチドを効率的に分解するアミノペプチダーゼＧＸ、及びロイシンアミノペプチダーゼ群）を見出し、ダイズタンパク質の効率的な加水分解を行うことに成功した（特開平９−２９４５８３号）。
ダイズのアミノペプチダーゼＧＸはその酵素学的諸性質から、これまでに報告されていない新規なアミノペプチダーゼであり、発芽大豆以外にはその存在は知られていない。ダイズのアミノペプチダーゼＧＸはＮ末端にグルタミン酸などの酸性アミノ酸を有するペプチドから、効率的にＮ末端の酸性アミノ酸を遊離する活性を有する。従って、本酵素の作用により、グルタミン酸の遊離率が高く呈味性の優れた醤油の製造が可能である。
二宮らはダイズのアミノペプチダーゼＧＸを遺伝子組換え技術を用いて大量生産することに成功した（特開２０００−３２５０９０）が、この方法により生産したダイズのアミノペプチダーゼＧＸを醤油醸造に利用することは、ＧＭＯ問題、コスト面等で困難である。
発明の開示
本発明は遊離アミノ酸含量が高く、呈味性の優れた醤油またはタンパク質分解物の製造に効果のある麹菌由来のアミノペプチダーゼおよび該アミノペプチダーゼをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
本研究者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ダイズ由来アミノペプチダーゼＧＸ遺伝子と相同性のある、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＥＳＴをプローブに用いることにより、アスペルギルス・ニジュランスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、アスペルギルス・ニジュランス由来新規アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを取得することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すタンパク質である：
（Ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜５１９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１〜５１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｃ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜５１９で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質、
（Ｄ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１〜５１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
また本発明は、上記の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかをコードする核酸分子、該核酸分子を含む組換え核酸分子、形質転換微生物宿主、および該形質転換微生物宿主を用いたアミノペプチダーゼの製造法である。特に本発明は、形質転換微生物宿主として形質転換糸状菌、とりわけ形質転換麹菌を含む。
また、本発明は、以下の１）〜８）の性質を有するアミノペプチダーゼである。
１）ロイシン、メチオニンをＮ末端に含むペプチド又はタンパク質を分解してロイシンあるいはメチオニンを遊離する。
２）至適ｐＨが約７．０〜７．５である。
３）至適温度が約３７〜４５℃である。
４）食塩非存在下での活性を１００％としたとき、３Ｍの食塩濃度下でも８０％以上の残存活性を示す。
５）０℃、食塩非存在下、２４時間保存の条件での活性を１００％としたとき、０℃、３Ｍ食塩存在下、２４時間保存の条件で８０％以上の残存活性を示す。
６）ｐＨ７．５、０℃、２４時間保存の条件での活性を１００％としたとき、ｐＨ５．８〜９．５の範囲で０℃、２４時間保存の条件で６０％以上の残存活性を示す。
７）未変性−ＰＡＧＥにより約５５０ｋＤ、還元、加熱ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２２、３３ｋＤの分子量を示す。
８）活性化にコバルトイオン、或いは亜鉛イオンを必要とする。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、上述したとおり、麹菌由来のアミノペプチダーゼおよび、それをコードする核酸分子、および前記核酸分子を含む組換えＤＮＡを含む形質転換微生物宿主、その形質転換微生物宿主を培養することを特徴とするアミノペプチダーゼの製造方法である。本明細書においては、本発明の麹菌由来アミノペプチダーゼタンパク質をＰｅｐＥと記載し、ＰｅｐＥをコードする遺伝子をｐｅｐＥと記載することがある。また、本明細書において、「アミノペプチダーゼ」とは、ペプチドのＮ−末端から順次アミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。
本発明のアミノペプチダーゼをコードする核酸分子は、アスペルギルス・ニジュランスの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから取得することができる。具体的には、アスペルギルス・ニジュランス、例えばアスペルギルス・ニジュランスＡ２６株の染色体ＤＮＡライブラリーから取得することができる。発芽大豆由来のアミノペプチダーゼＧＸ（特開２０００−３２５０９０）の遺伝子配列とアスペルギルス・ニジュランスＥＳＴデータベース中の相同性の高いＥＳＴ断片の塩基配列を参考に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）プライマーを作製し、アスペルギルス・ニジュランス染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型としたＰＣＲ法により本発明の核酸分子を含むクローンを取得することができる。ＰＣＲ用プライマーの例としては、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
また、本発明の核酸分子は、アスペルギルス・ニジュランスのポリ（Ａ）ＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーから、例えば配列番号８及び９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ、さらに配列番号１０及び１１に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとする５’−ＲＡＣＥによって、取得することができる。上記のようにして得られるアスペルギルス・ニジュランスＡ２６由来のＰｅｐＥをコードする遺伝子を含むゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。また、ｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号３を示す。ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの塩基配列を比較した結果、ゲノムＤＮＡ中にはイントロンは見出されなかった。
本発明の核酸分子は、本発明のアミノペプチダーゼをコードするものであればよく、配列番号２に示す塩基配列のうち塩基番号７２〜１６２８からなる塩基配列を有するＤＮＡの他、５’末端側の不要な部分を除いたものも含まれる。「核酸分子」にはＤＮＡ、ＲＮＡおよびこれらのアナログも含まれる。使用する目的によっては、成熟タンパク質のみをコードするものであってもよい。また、コード領域において各アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他の等価のコドンに置換したものも本発明の核酸分子に含まれる。さらに、本発明の核酸分子は、コードされるアミノペプチダーゼの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノペプチダーゼをコードするものであってもよい。ここで、「複数」とは、ペプチダーゼタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、通常２〜３００個、好ましくは２〜１７０個、さらに好ましくは２〜５０個、最も好ましくは２〜１０個である。
上記のようなアミノペプチダーゼと実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されるようにｐｅｐＥの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変された核酸分子は、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、ＰｅｐＥをコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びＰｅｐＥをコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等には、麹菌の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有する核酸分子を、適当な細胞で発現させ、発現産物のＰｅｐＥ活性を調べることにより、ＰｅｐＥと実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。また、変異を有するＰｅｐＥをコードする核酸分子またはこれを保持する細胞から、例えば配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７２〜１６２８からなる塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰｅｐＥ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を単離することによっても、ＰｅｐＥタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。この条件は個々の配列のＧＣ含量や繰り返し配列の有無などに依存するため明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸分子同士、例えば６５％以上の相同性を有する核酸分子同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸分子同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗滌条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれる可能性があるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎＰｅｐＥ活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
また、本発明の核酸分子は、アスペルギルス属の他の種に属する微生物、例えばアスペルギルス・オリゼの染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡから取得することもできる。具体的には、アスペルギルス・オリゼ、例えばアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法により取得することができる。上記アスペルギルス・ニジュランスのＰｅｐＥの塩基配列をもとに、ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、アスペルギルス・オリゼ、例えばアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０の菌体より調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲ用プライマーとしては、５’−ＲＡＣＥ用には配列番号１２及び１３に示す塩基配列、３’−ＲＡＣＥ用には配列番号１４及び１５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上記のようにして得られるアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のｐｅｐＥに対応する遣伝子ｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号５に示す。配列番号２に示すアスペルギルス・ニジュランスのＰｅｐＥのアミノ酸配列と配列番号４に示すアスペルギルス・オリゼの対応するアミノペプチダーゼのアミノ酸配列は、約７７％の相同性を有しており、成熟タンパク質部分では約１２０アミノ酸残基が異なっている。アスペルギルス・オリゼのｐｅｐＥ対応遺伝子とアスペルギルス・ニジュランスのｐｅｐＥとの相同性は、コード領域では約７１％であった。
本発明の一つの実施態様において、本発明の核酸分子は、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１〜５１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸からなり、かつ、ペプチドからアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む。また、本発明の別の実施態様では、本発明の核酸分子は、配列表の配列番号４に示す塩基配列のうち、塩基番号７３〜１６０２からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチドからアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含む。
以下に示す実施例においては、本発明の核酸分子は上記のようにして得られたＤＮＡである。その塩基配列が明らかとなったので、アスペルギルス・ニジュランスＡ２６もしくはアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０、又はアスペルギルス・ニジュランスもしくはアスペルギルス・オリゼの他の菌株のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーション等により、これらの菌株から対応するアミノペプチダーゼをコードする核酸分子を容易にクローニングすることができる。従って、そのような核酸分子も本発明の範囲である。
本発明の核酸分子は本発明のアミノペプチダーゼを製造するために使用することができる。
本発明の核酸分子は、麹菌等の糸状菌の育種、あるいはアミノペプチダーゼＰｅｐＥの製造に利用することができる。例えば、本発明の一つの実施態様において、本発明のアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡを、糸状菌（例えばアスペルギルス・オリゼ）細胞内に好ましくはマルチコピーで導入することにより、ＰｅｐＥ活性を増大させることができる。また、本発明の核酸分子を適当な宿主で発現させることにより、ＰｅｐＥを製造することができる。このようにして得られる麹菌等の糸状菌又はそれらより得られるＰｅｐＥを、醤油、味噌、その他のタンパク質加水分解物を含む調味料等の製造に利用することができる。
本発明の核酸分子を導入する糸状菌としては、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニジュランス等のアスペルギルス属、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）等のニューロスポラ属、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）等のリゾムコール属に属する糸状菌が挙げられる。アスペルギルス属糸状菌が特に好ましい。
上記のような糸状菌に本発明の核酸分子を導入するためのベクターとしては特に制限されず、糸状菌の育種等に通常用いられているものを使用することができる。例えば、アスペルギルス・オリゼに用いられるベクターとしては、ｐＵＮＧ（Ｌｅｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４，４２５−４３１（１９９５））、ｐＭＡＲＧ（Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４０，３２７−３３２（１９９３））、ｐＵＳＣ（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１，２５４９−２５５５（１９８７））等が挙げられる。ｐＵＮＧはアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００（Ｍｉｎｅｔｏｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．３０，４３２−４３８（１９９６））のｎｉａＤ−（硝酸資化能欠損）を相補するマーカーを、ｐＭＡＲＧはアスペルギルス・オリゼＭ２−３（Ｇｏｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１（９），２５４９−２５５５（１９８７））のａｒｇＢ−（アルギニン要求）を相補するマーカーを、ｐＵＳＣはアスペルギルス・オリゼＮＳ４（Ｙａｍａｄａ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９（１９９７））のｓＣ−（ＡＴＰスルフリラーゼ欠損）を相補するマーカーを、それぞれ有している。
これらのベクターのうち、ｐＵＮＧ及びｐＭＡＲＧは、グルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）のプロモーター及びα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＢのターミネーター）を有しており、該プロモーターの下流に本発明のＤＮＡ（例えば配列番号２において塩基番号７２〜１６２８を含む領域）をフレームを合わせて挿入することにより、該プロモーター制御下でＰｅｐＥを発現させることができる。また、ｐＵＳＣはプロモーターを含んでいないので、これを用いる場合は、本発明のＤＮＡを挿入したｐＵＣ１９等のプラスミドとｐＵＳＣとの共形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により宿主糸状菌に導入することによってＰｅｐＥを発現させることができる。
また、以下の表１中に示した文献に記載されているベクター、プロモーター及びマーカーも宿主糸状菌に応じて使用することができる。表１中、プロモーターは天然にその制御下にある遺伝子がコードする酵素名で示してある。
ＤＰＹ培地（グルコース２％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ｐＨ５．０）に菌体（分生子）を植菌し、３０℃で２４時間程度激しく振盪培養する。培養液をミラクロス（Ｍｙｒａｃｌｏｔｈ、ＣＡＬＢＩＯ ＣＨＥＭ社製）又は滅菌したガーゼ等で濾過し、菌体を回収し、滅菌水で洗浄し、水分をよく切る。この菌体を、試験管に入れ、酵素液（１．０％ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ、宝酒造（株）製）、または０．５％ノボザイム（ＮｏｖｏＺｙｍｅ、ノボノルディスク社製）及び０．５％セルラーゼ（例えばＣｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋａ、ヤクルト社製）、０．６Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭリンゴ酸、ｐＨ５．５）を加え、３０℃で３時間程度穏やかに振盪する。顕微鏡でプロトプラスト化の程度を観察し、良好であれば氷中に保存する。
上記酵素反応液をミラクロスで濾過して菌体残渣を除去し、プロトプラストを含む濾液に等量の緩衝液Ａ（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、３５ｍＭ ＮａＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えて氷中に置く。これを０℃、１５００〜２，５００ｒｐｍで５〜１０分間遠心した後、緩やかに停止させ、ペレットを緩衝液Ａで洗浄し、適量の緩衝液Ａに懸濁する。１００〜２００μｌのプロトプラスト懸濁液に２０μｌ以下のＤＮＡ溶液（５〜１０μｇ）を加え、２０〜３０分氷中に置く。緩衝液Ｂ（６０％ポリエチレングリコール６０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を２５０μｌ加えて穏やかに混合し、再び緩衝液Ｂを２５０μｌ加えて穏やかに混合した後、さらに緩衝液Ｂを８５０μｌ加えて穏やかに混合し、２０分室温で静置する。その後、１０ｍｌの緩衝液Ａを加えて試験管を反転させ、０℃、１，５００〜２，５００ｒｐｍで５分間〜１０分間遠心し、ペレットを５００μｌの緩衝液Ａに懸濁する。
上記懸濁液の適量を、予め分注し保温しておいた５ｍｌのトップアガーに加えて、下層培地（１．２Ｍソルビトールを含有し、マーカーに応じて調製した選択培地）に重層し、３０℃で培養する。生育した菌体を選択培地に植え継いで、形質転換体であることを確認する。さらに、菌体から組換えＤＮＡを調製し、制限酵素解析又はサザン解析等によって、本発明のＤＮＡが導入されていることを確認しておくことが好ましい。
上記のようにして得られる形質転換体を、使用するプロモーターに適した条件で培養することによってｐｅｐＥが発現し、ＰｅｐＥが得られる。例えば、アスペルギルス・オリゼを宿主に用い、プロモーターとしてグルコアミラーゼプロモーターを使用する場合には、小麦フスマ、リン酸カリウム等を含む培地に形質転換アスベルギルス・オリゼの胞子を懸濁し、約３０℃にて約３日間培養することによりＰｅｐＥを産生させることができる。必要に応じて培養物を蒸留水等で希釈し、ストマッカー等で処理することによってＰｅｐＥを含む酵素粗抽出液を得ることができる。得られた粗抽出液はゲル濾過、種々のクロマトグラフィー等を用いることによって更にＰｅｐＥを精製することもできる。得られたＰｅｐＥは更に塩析、等電点沈殿、ゲル濾過、イオンクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等によって精製して、タンパク質の分解のために使用することができる。しかしながら、本発明の核酸分子を導入しＰｅｐＥ活性の向上した形質転換微生物の培養物をタンパク質分解酵素とともにタンパク質原料と直接混合してタンパク質またはその混合物に作用させることにより、遊離アミノ酸含量が高く、呈味の強いタンパク質加水分解物を得ることもできる。作用させるタンパク質原料としては、例えば大豆、小麦、小麦グルテン等が挙げられ、さらに脱脂大豆あるいは膨化や可溶化等の加工をされた種々のタンパク質あるいはこれらの種々の原料からの分離タンパク質であってもよい。
ＰｅｐＥ活性は、例えば１ｍＭ Ｌｅｕ−ｐＮＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５）０．７５ｍｌに酵素粗抽出液０．０２ｍｌ、１００ｍＭ塩化亜鉛０．０１５ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた、４０％酢酸を０．２５ｍｌ添加して反応を停止させた後、反応液の４０５ｎｍの吸光度を測定することにより測定することができる。種々の調製物中の活性は１分間あたりに１μｍｏｌのパラニトロアニリドを生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）として比較することができる。
形質転換微生物の培養物または粗精製酵素をタンパク質に作用させる実用的条件としては、たとえば０．２〜５０％濃度のタンパク質原料に形質転換微生物の培養物をタンパク質分解酵素存在下で混合し、５〜６０℃にて４時間〜１０日間反応させればよい。
反応終了後、未反応のタンパク質原料、菌体などの不溶物は遠心分離や濾過等、従来の分離法を用いて除去すればよい。また、必要に応じて減圧濃縮、逆浸透法などにより濃縮を行い、濃縮物は、凍結乾燥、減圧乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理により粉末化または顆粒化することもできる。かくして遊離アミノ酸含有量が高く、呈味性の強いタンパク質加水分解物を得ることができる。
実施例
実施例１．アスペルギルス・ニジュランスのｐｅｐＥゲノムＤＮＡのクローニング
発芽大豆由来のアミノペプチダーゼＧＸの配列をもとに、アスペルギルス・ニジュランスのＥＳＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｏｕ．ｅｄｕ／ｆｕｎｇａｌ．ｈｔｍｌ）を用いて、ホモロジー検索したところ、相同性の高いＥＳＴ ｏｂｄ０３ａ１．ｆ１を見出した。
この情報を下に、アスペルギルス・ニジュランス ゲノムライブラリーからアスペルギルス・ニジュランスｐｅｐＥのクローニングを以下のように行なった。
アスペルギルス・ニジュランス ゲノムライブラリーはＦｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）より購入した。本ライブラリーはアスペルギルス・ニジュランスのゲノムＤＮＡを制限酵素で切断した後、コスミドベクターに連結させ、エシェリヒア・コリに導入したものである。ライブラリーのスクリーニングは以下のようにおこなった。即ち、コスミドベクターを含む大腸菌を鋳型ＤＮＡ源として、ＥＳＴ ｏｂｄ０３ａ１．ｆ１の塩基配列に基づいて合成した下記の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲにより、目的遺伝子が含まれる大腸菌クローンをスクリーニングした。
配列番号６，７：ＰＣＲプライマー
ＰＣＲ反応は、９４℃３分間の熱変性後、９４℃３０秒、５２℃１０秒、７２℃３０秒の反応を２５サイクルで行なった。その結果、４個のクローンに目的遺伝子が含まれることが明らかとなった。これらのクローンよりコスミドベクターを回収し、塩基配列を決定した。本塩基配列およびこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号２に、アミノ酸配列のみを配列番号３に示す。
本遺伝子をプラスミドｐＵＣ１９に挿入して得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株は、プライベートナンバーＡＪ１３８５６が付され２００１年３月１９日に経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６３が付与され、平成１４年３月１１日付けで同センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９４９として国際寄託へ移管されている。
実施例２．アスペルギルス・ニジュランスのｐｅｐＥ ｃＤＮＡのクローニング
アスペルギルス・ニジュランスＡ２６をＹＧ培地（酵母エキストラクト０．５％，グルコース２．５％，微量元素＊０．１％、ｐＨ６．５）５０ｍｌで３０℃、４８時間振とう培養した（微量元素＊：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．８８％，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０４％，ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．０１５％，Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ ０．０１％，（ＮＨ４）６ＭｏＯ２４・４Ｈ２Ｏ ０．００５％）。
菌体を回収し、液体窒素にて凍結後、乳鉢を用いて粉砕した。粉砕物より、ＲＮ ｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡの調製を行ない、Ｍｉｃｒｏ ＦＡＳＴ Ｔｒａｃｋ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を用いてｍＲＮＡの調製を行なった。このｍＲＮＡから、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーの作製を行った。
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、アスペルギルス・ニジュランスゲノムＤＮＡ配列よりデザインした下記配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲおよび５’−ＲＡＣＥにより、ｐｅｐＥ ｃＤＮＡのクローニングを行った。
配列番号８〜１１：ＰＣＲプライマー
ＰＣＲの反応条件は、９４℃９分間の熱変性の後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒の反応を３０サイクル行い、さらに７２℃５分の反応を行った。その結果、配列番号８及び９のプライマーを用いたＰＣＲにより約１８００ｂｐのＤＮＡ断片が、配列番号１０及び１１のプライマーを用いた５’−ＲＡＣＥにより約２５０ｂｐの増幅断片が得られた。これらのＤＮＡ断片の塩基配列および塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
上記アスペルギルス・ニジュランスｐｅｐＥ ｃＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに挿入して得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９株は、プライベートナンバーＡＪ１３８５７が付され、２００１年３月１９日に経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６４が付与され、平成１４年３月１１日付けで同センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９５０として国際寄託に移管されている。
実施例３．アスペルギルス・オリゼのｐｅｐＥ相同ｃＤＮＡのクローニング
（１）アスペルギルス・オリゼｃＤＮＡライブラリーの構築
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＡＴＣＣ４２１４９）を、ＤＰＹ培地５０ｍｌで３０℃、６４時間培養した。菌体をろ過により集め、１ｇを回収した。この菌体を直ちに液体窒素で凍結し、乳鉢で粉砕した後、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて全ＲＮＡを得た。このＲＮＡからｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてｍＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡ ＰＣＲ ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ（ＴａＫＡＲａ社）または３’−ＲＡＣＥ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）により、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。
（２）アスペルギルス・オリゼｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
実施例２で得たアスペルギルス・ニジュランスのＰｅｐＥ配列を参考に、配列番号１２及び１３で示したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いた５’−ＲＡＣＥおよび配列番号１４及び１５を用いた３’−ＲＡＣＥによって、アスペルギルス・オリゼのｐｅｐＥに相同なｃＤＮＡのクローニングを行った。
配列番号１２〜１５：ＰＣＲプライマー
５’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応は、９５℃で９分熱変性した後、９４℃３０秒、５３℃３０秒、７２℃１分の反応を３５サイクル行った。これにより約１４００ｂｐのアスペルギルス・オリゼｐｅｐＥ断片を得た。３’ＲＡＣＥのＰＣＲ反応は、９５℃で９分熱変性した後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分の反応を３５サイクル行った。これにより約３００ｂのアスペルギルス・オリゼのｐｅｐＥ相同遺伝子断片を得た。
上記遺伝子断片の塩基配列を決定したところ、全長ｐｅｐＥ相同配列を含むことが明らかとなった。この塩基配列およびこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号５に示す。
本遺伝子配列をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに挿入して得られたプラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリＤＨ５α株は、プライベートナンバーＡＪ１３８５８が付され、２００１年３月１９日に経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８２６５が付与されて、平成１４年３月１１日付けで同センターにおいて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７９５１として国際寄託に移管されている。
実施例４． アスペルギルス・オリゼにおけるｐｅｐＥの発現
（１）形質転換アスペルギルス・オリゼの作製
実施例３で得たアスペルギルス・オリゼのｐｅｐＥ ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩサイトに連結してプラスミドｐＢＳＡｏｐｅｐＥを作成した。本プラスミドからｐｅｐＥ ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで切り出し、マーカー遺伝子ｎｉａＤを含むベクターｐＵＮＧ１（Ｌｅｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４４，４２５−４３１（１９９５））のグルコアミラーゼプロモーターの下流に連結し、形質転換用のプラスミドｐＮＧＡＰＥを作成した。本プラスミドＤＮＡ１０μｇにより形質転換を行った。
ＤＰＹ培地にアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ３００株の分生子を植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養液を滅菌したガーゼでろ過し、菌体を回収し、滅菌水で洗浄した。この菌体を試験管に入れ、酵素液２０ｍｌ（１．０％ヤタラーゼ（Ｙａｔａｌａｓｅ，宝酒造（株）製））を加え、３０℃で３時間穏やかに振とうした。顕微鏡でプロトプラスト化の程度を観察し、氷中に保存した。
上記酵素反応液をミラクロスでろ過して菌体残さを除去し、プロトプラストを含むろ液に等量の緩衝液Ａ（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えて氷中に置いた。これを０℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心したのち、穏やかに停止させ、ペレットを１０ｍｌの緩衝液Ａで２回洗浄し、１ｍｌの緩衝液Ａに懸濁した。
１００μｌのプロトプラスト懸濁液に１０μｌのＤＮＡ溶液（１０μｇ）を加え、３０分間氷中に置いた。緩衝液Ｂ（６０％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）６０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を２５０μｌ加えて穏やかに混合し、再び緩衝液Ｂを２５０μｌ加えて穏やかに混合した後、さらに緩衝液Ｂを８５０μｌ加えて穏やかに混合し、２０分間室温で静置した。その後、１０ｍｌの緩衝液Ａを加えて、試験管を反転させ、０℃、１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを５００μｌの緩衝液Ａに懸濁した。
上記懸濁液をあらかじめ分注し保温しておいた５ｍｌのトップアガー培地に加え、ツアペックドックス培地（１．２Ｍソルビトール、０．３％硝酸ナトリウム、０．２％塩化カリウム、０．１％リン酸カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム七水和物、０．００２％硫酸第一鉄七水和物、２％グルコース、ｐＨ５．５）に重層し、３０℃で培養した。生育した菌体１０株をツアペックドックス培地に植え継いで、安定した形質転換体を得た。
（２）ｐｅｐＥの産生
上述のようにして得られた形質転換体を小麦フスマで培養し、その抽出液についてアミノペプチダーゼ活性を測定した。
小麦フスマ２０ｇ、リン酸カリウム０．３ｇ、蒸留水１４ｍｌをよく攪拌した後、三角フラスコに入れ、１２０℃で３０分間オートクレーブすることによって培地を作成した。胞子を十分形成させたシャーレに滅菌水８ｍｌを注ぎ、攪拌して胞子懸濁液を調製し、これを前記培地に散布した。胞子を接種した培地を良く混和し、３０℃で３日間培養した。上記のようにして作成したフスマ麹に１０倍量の蒸留水を添加してストマッカーで５分間処理することで、酵素粗抽出液を得た。
上述のように調製した酵素粗抽出液中のアミノペプチダーゼ活性を以下のように測定した。即ち、１ｍＭ Ｌｅｕ−ｐＮＡ（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５）０．７５ｍｌに酵素粗抽出液０．０２ｍｌ、１００ｍＭ 塩化亜鉛０．０１５ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、４０％酢酸を０．２５ｍｌ添加して反応を停止した。反応液の４０５ｎｍの吸光度を測定し、活性を測定した。活性は１分間あたりに１μｍｏｌのパラニトロアニリドを生成する酵素活性を１ユニット（Ｕ）とした。対照としてマーカー遺伝子のみを含むベクターＤＮＡで形質転換して得られた形質転換体についても同様に酵素粗抽出液を調製し、前述した方法でアミノペプチダーゼ活性を測定した。
その結果、本発明の遺伝子を導入した株において顕著なアミノペプチダーゼ活性の上昇が認められた（表２）。従って、導入したアミノペプチダーゼ遺伝子が実際に発現し、アミノペプチダーゼが産生されたことが示された。
（１）ｐｅｐＥの精製
小麦フスマ培地２０ｇを３００ｍｌフラスコに入れ、１２０℃、２０分間オートクレーブすることによって培地を作製した。
実施例４で作成したＰｅｐＥ高発現形質転換株の胞子懸濁液を調製し、これを前記培地に接種した。胞子を接種した培地をよく混和し、３０℃で５日間培養した。途中４８時間後に培地を撹拌して手入れを行った。
上記のようにして作製したフスマ麹を１０倍量（ｗ／ｗ）の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオリド）に浸漬し、４℃で１６時間静置後、ガーゼ濾過及び遠心分離（４℃、１０分間、７，５００ｒｐｍ）により得られた上清を酵素粗抽出液とした。
この酵素粗抽出液に硫酸アンモニウムを添加し、４０％−６０％硫安沈殿画分を取得した。この沈殿を２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。これを孔径０．４５μｍのフィルターで濾過した。あらかじめ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化した脱塩用カラム（アマシャムファルマシア製 ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ（２５ｍｌ））に前述の濾液を供し、同緩衝液で溶出した。得られた活性画分を限外濾過することにより、濃縮した。
次に、あらかじめ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した陰イオン交換カラム（アマシャムファルマシア製ＨｉＴｒａｐ Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（２５ｍｌ））に、上記で得た試料を吸着させ、カラム体積の３倍量の同緩衝液で洗浄した。洗浄後、緩衝液のＮａＣｌ濃度を０Ｍから１Ｍにカラム体積の２０倍量で直線的に増加させて溶出した。溶出液中に回収された活性画分を、限外濾過にて濃縮した。
得られた試料を、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（アマシャムファルマシア製）を用い、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画した。あらかじめ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したこのカラムに試料を供し、同緩衝液で溶出して活性画分を回収した。以上の操作により、精製ＰｅｐＥを得た。
（２）ＰｅｐＥの活性測定
本酵素液のアミノペプチダーゼ活性の測定は以下のように行った。即ち、基質液（１ｍＭ Ｌｅｕ−ｐＮＡ、５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５），２ｍＭ塩化コバルト）０．７３ｍｌに酵素粗抽出液０．０２ｍｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、４０％酢酸を０．２５ｍｌ添加して反応を停止した。本反応液の４０５ｎｍの吸光値を測定し、活性値を算出した。なお、活性は１分間あたりに１μｍｏｌのパラニトロアニリドを生成する酵素活性を１ユニットとした。
以下に本酵素の酵素学的諸性質を示す。
（ｉ）基質特異性
前記活性測定法において、Ｌｅｕ−ｐＮＡの代わりにＸ−ｐＮＡを用い、各種Ｘ−ｐＮＡの分解活性を測定した。Ｌｅｕ−ｐＮＡの分解活性を１００とした時の相対活性を下表（表３）に示す。本酵素はＮ末端にＬｅｕを含むペプチドを効率よく分解することがわかった。
前記活性測定法において、各種温度でＬＡＰ活性を測定した。３７℃での活性値を１００とした時の、相対活性を図１に示す。
（ｉｉｉ）反応液中食塩濃度の影響
前記活性測定法において、ＮａＣｌを各濃度添加した際のＬＡＰ活性を測定した。ＮａＣｌ無添加区の活性値を１００とした時の、相対活性を図２に示す。本酵素は高濃度の食塩下でも、十分にその活性を保持していることがわかった。
（ｉｖ）至適ｐＨ
前記活性測定法において、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）の代わりに、終濃度５０ｍＭとなるよう、各種ｐＨ緩衝液を反応液に加えた。リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中におけるＬＡＰ活性を１００とした。各ｐＨにおける活性を図３に示す。
（ｖ）ｐＨ安定性
精製酵素を５０ｍＭ各種ｐＨ緩衝液中、０℃で２４時間保存した後、前記活性測定方法（ｐＨ７．５）でＬＡＰ活性を測定した。ｐＨ７．５リン酸緩衝液で保存した際の活性値を１００とした時の相対活性値を表４に示す。
精製酵素を０−４Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中、０℃で２４時間保存した後、保存塩濃度と同じ塩濃度の反応液中での活性を測定した。その結果を表５に示す。
前記活性測定法において、塩化コバルトの代わりに各種２価金属塩を用い、各種Ｘ−ｐＮＡの分解活性を測定した。塩化コバルトを加えた際のＬｅｕ−ｐＮＡの分解活性を１００とした時の相対活性を表６に示す。
本発明の核酸分子を発現可能な形態で導入された宿主は、本発明のタンパク質を産生するために利用することが可能となる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰｅｐＥ活性の温度依存性を示したグラフである。横軸は温度、縦軸は３７℃における活性値を１００としたときのロイシンアミノペプチダーゼ活性の相対値である。
図２は、ＰｅｐＥに対する反応液中の食塩濃度の影響を示すグラフである。横軸はＮａＣｌ濃度（Ｍ）、縦軸はＮａＣｌ無添加の場合の活性値を１００としたときのＮａＣｌ濃度におけるロイシンアミノペプチダーゼ活性の相対値である。
図３は、ＰｅｐＥ活性のｐＨ依存性を示したグラフである。横軸はｐＨ、縦軸はリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中における活性値を１００としたときのロイシンアミノペプチダーゼ活性の相対値である。
Claims (9)
- 下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すタンパク質：
（Ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜５１９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１〜５１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｃ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜５１９で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質、
（Ｄ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１〜５１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質。 - 下記（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに示すタンパク質をコードする核酸分子：
（Ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜５１９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１〜５１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｃ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１〜５１９で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質、
（Ｄ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１〜５１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質、 - 下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示すＤＮＡである請求項２記載の核酸分子：
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７２〜１６２８からなる塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号４に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１６０２からなる塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｃ）前記（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）前記（ｂ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ペプチドのＮ−末端からアミノ酸を遊離する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 配列番号２又は配列番号４に示す塩基配列を有する請求項３記載の核酸分子。
- 請求項２記載の核酸分子を含む組換え核酸分子。
- 請求項２記載の核酸分子が発現可能な形態で導入された形質転換微生物宿主。
- 糸状菌又は酵母又はエシェリヒア属細菌である請求項６記載の形質転換微生物宿主。
- 請求項７記載の形質転換微生物宿主を培養し、前記形質転換微生物宿主に導入された核酸分子を発現させ、産生されたタンパク質を回収することを特徴とするアミノペプチダーゼの製造法。
- 以下の１）〜８）の性質を有するアミノペプチダーゼ
１）ロイシン、メチオニンをＮ末端に含むペプチド又はタンパク質を分解してロイシンあるいはメチオニンを遊離する；
２）至適ｐＨが７．０〜７．５である、
３）至適温度が３７〜４５℃である；
４）食塩非存在下での活性を１００％としたとき、３Ｍの食塩濃度下でも８０％以上の残存活性を示す；
５）０℃、食塩非存在下、２４時間保存の条件での活性を１００％としたとき、０℃、３Ｍ食塩存在下、２４時間保存の条件で８０％以上の残存活性を示す；
６）ｐＨ７．５、０℃、２４時間保存の条件での活性を１００％としたとき、ｐＨ５．８〜９．５の範囲で０℃、２４時間保存の条件で６０％以上の残存活性を示す；
７）未変性ポリアクリルアミドゲル上で５５０ｋＤの分子量を示し、変性ポリアクリルアミドゲル上で２２、３３ｋＤの分子量を示す；
８）活性化にコバルトイオン、または亜鉛イオンを必要とする。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001078930 | 2001-03-19 | ||
| JP2001078930 | 2001-03-19 | ||
| JP2001293348 | 2001-09-26 | ||
| JP2001293348 | 2001-09-26 | ||
| PCT/JP2002/002476 WO2002077223A1 (fr) | 2001-03-19 | 2002-03-15 | Nouvelle aminopeptidase et son gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2002077223A1 true JPWO2002077223A1 (ja) | 2004-07-15 |
Family
ID=26611572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002576666A Pending JPWO2002077223A1 (ja) | 2001-03-19 | 2002-03-15 | 新規アミノペプチダーゼおよびその遺伝子 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7087422B2 (ja) |
| EP (1) | EP1371725B1 (ja) |
| JP (1) | JPWO2002077223A1 (ja) |
| CN (1) | CN1501975A (ja) |
| AT (1) | ATE318898T1 (ja) |
| BR (1) | BR0207889A (ja) |
| DE (1) | DE60209467T2 (ja) |
| WO (1) | WO2002077223A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108699122B (zh) * | 2016-01-06 | 2022-05-10 | 学校法人冲绳科学技术大学院大学学园 | 示出加水分解活性的新肽及其用途 |
| CN112961848B (zh) * | 2021-02-24 | 2022-09-09 | 中国海洋大学 | 一种新型氨肽酶及其可溶性表达方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU975797A1 (ru) * | 1980-12-12 | 1982-11-23 | Предприятие П/Я Г-4740 | Способ выделени лейцинаминопептидазы из aSpeRGILLUS oRYZae |
| AU4221089A (en) * | 1988-09-13 | 1990-04-02 | General Hospital Corporation, The | Isolation, purification, and characterization of the aminopeptidases: ap2, ap1, and apx |
| US5742297A (en) | 1994-11-04 | 1998-04-21 | Lockheed Martin Corporation | Apparatus and method for constructing a mosaic of data |
| EP0815210B1 (en) | 1995-03-16 | 2004-06-02 | Novozymes A/S | An enzyme with aminopeptidase activity |
| DE19526485A1 (de) | 1995-07-20 | 1997-01-23 | Roehm Gmbh | Rekombinant hergestellte Leucinaminopeptidase aus Aspergillus sojae |
| JPH09294583A (ja) * | 1996-03-08 | 1997-11-18 | Ajinomoto Co Inc | アミノペプチダーゼｇｘ及びそれを用いるタンパク質の加水分解方法 |
| WO1998014599A1 (en) | 1996-10-04 | 1998-04-09 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Carboxypeptidases from aspergillus oryzae and nucleic acids encoding same |
| DE69813212T2 (de) | 1997-05-16 | 2004-03-04 | Novozymes Biotech, Inc., Davis | Verfahren zur erzeugung von proteinhydrolysaten |
| AU7381098A (en) | 1997-05-16 | 1998-12-08 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Polypeptides having prolyl pipeptidyl aminopeptidase activity and nucleic acids encoding same |
| JP3727780B2 (ja) | 1998-06-12 | 2005-12-14 | キッコーマン株式会社 | ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びロイシンアミノペプチダーゼの製造法 |
| JP2000325090A (ja) | 1999-03-15 | 2000-11-28 | Ajinomoto Co Inc | 新規アミノペプチダーゼをコードするｄｎａ及び該アミノペプチダーゼの製造方法 |
| US6303359B1 (en) * | 1999-03-15 | 2001-10-16 | Ajinomoto Co., Inc. | DNA molecule encoding new aminopeptidase, and method of producing the aminopeptidase |
-
2002
- 2002-03-15 CN CNA02806724XA patent/CN1501975A/zh active Pending
- 2002-03-15 EP EP02705238A patent/EP1371725B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-15 AT AT02705238T patent/ATE318898T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-03-15 DE DE60209467T patent/DE60209467T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-15 JP JP2002576666A patent/JPWO2002077223A1/ja active Pending
- 2002-03-15 WO PCT/JP2002/002476 patent/WO2002077223A1/ja active IP Right Grant
- 2002-03-15 BR BR0207889-9A patent/BR0207889A/pt not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-09-22 US US10/664,958 patent/US7087422B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002077223A1 (fr) | 2002-10-03 |
| CN1501975A (zh) | 2004-06-02 |
| US20040219636A1 (en) | 2004-11-04 |
| ATE318898T1 (de) | 2006-03-15 |
| EP1371725B1 (en) | 2006-03-01 |
| DE60209467D1 (de) | 2006-04-27 |
| EP1371725A1 (en) | 2003-12-17 |
| US7087422B2 (en) | 2006-08-08 |
| EP1371725A4 (en) | 2004-09-22 |
| DE60209467T2 (de) | 2006-10-19 |
| BR0207889A (pt) | 2004-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3609648B2 (ja) | 新規蛋白質脱アミド酵素、それをコードする遺伝子、その製造法並びにその用途 | |
| EP2256192A1 (en) | Thermotolerant catalase | |
| US20090155239A1 (en) | Novel Protease, Microorganism Producing the Same, and Application Thereof | |
| JP4529183B2 (ja) | 飲食品の呈味および／または風味の改善方法 | |
| EP0897003B1 (en) | Enhanced expression of proteolytic enzymes in koji mold | |
| JP3918431B2 (ja) | 新規グルタミナーゼ、その遺伝子及びその製造法 | |
| JPWO2002077223A1 (ja) | 新規アミノペプチダーゼおよびその遺伝子 | |
| WO2006054595A1 (ja) | 新規な高アルカリプロテアーゼ及びその利用 | |
| US20070020726A1 (en) | Novel glutaminase, its gene and a method of producing it | |
| JP4324365B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
| US7842799B2 (en) | Recombinant vector capable of increasing secretion of Koji mold protease | |
| JP4438480B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
| WO2002083905A1 (fr) | $g(b)-glucosidase présentant une excellente résistance au glucose | |
| JPH08173168A (ja) | アミノペプチダーゼ遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベクターおよび形質転換体 | |
| MXPA99002071A (en) | Enhanced expression of proteolytic enzymes in koji mold | |
| JP2007259725A (ja) | 変異微生物 |