JP5256402B2 - 麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する組換えベクター - Google Patents

Description

本発明は、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する組換えベクター、該ベクターによって形質転換された麹菌により蛋白質加水分解酵素遺伝子発現・分泌が亢進した麹菌、形質転換された麹菌による蛋白質加水分解酵素生産方法等に関する。

アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）等の麹菌は醤油、酒、味噌などの醸造食品の製造に工業的に用いられている。さらに、近年、他の生物種同様アスペルギルス・オリゼのゲノム配列が明らかとなり（特開２００５−１７６６０２号公報）、遺伝子の機能的解析の重要性がますます高まってきている。

このような麹菌は、様々な酵素類（蛋白質加水分解酵素、アミラーゼ類等）を産生・分泌し、その優れた澱粉糖化能力及び蛋白質分解力等により、醸造食品の製造に幅広く利用されている。

従来、特許文献１〜３に記載されているような、麹菌の遺伝子発現を制御する様々な転写因子の解析が行われてきた。

特開２００３−２４０号公報 特開２００３−７０４８４号公報 特開２００３−２３５５８４号公報 特開２００５−１７６６０２号公報

本発明は、新たに、麹菌の蛋白質加水分解酵素の分泌を増大させる組換えベクターを提供すること、及び、該組換えベクターを用いることによって固体培地培養及び液体培地培養での蛋白質含有物の分解の効率が向上した麹菌を提供すること等を目的とする。

即ち、本発明は、以下の各態様の発明に係るものである。
（１）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む組換えベクター。
（２）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター。
（３）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換えベクター。
（４）上記１、２又は３記載の組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする麹菌。
（５）上記４記載の麹菌を、固体培地若しくは液体培地で培養して培地中に蛋白質加水分解酵素を分泌させたのち、培地から蛋白質加水分解酵素を採取することを特徴とする、蛋白質加水分解酵素の生産方法。
（６）上記４記載の麹菌を培養して得られる培養物と蛋白質含有原料とを混合し、原料中の蛋白質を分解することを特徴とする、蛋白質分解物の製造方法。
（７）上記４記載の麹菌を培養して得られる培養物とゼラチン含有原料とを混合し、原料中のゼラチンを分解することを特徴とする調味液の製造方法。
（８）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（９）以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質：
（ａ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、麹菌蛋白質分解酵素の分泌を増大する機能を有する活性を有する蛋白質。

本発明の組換えベクターを用いることによって、麹菌の蛋白質加水分解酵素の分泌を増大させることが可能になった。該組換えベクターで形質転換麹菌を用いることによって固体培地培養及び液体培地培養での蛋白質含有物の分解の効率を向上させることができる。

本発明の形質転換体（形質転換菌）において、形質転換に用いたプラスミドが形質転換体のゲノム上のｎｉａＤ遺伝子領域に挿入されていることを示す、サザン解析の結果により得られた電気泳動の写真である。 フスマ培地における、野生株と本発明の形質転換体の蛋白質加水分解酵素活性を比較した結果を示す。

本発明の組換えベクターに含まれる配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡは麹菌のゲノム由来であり、以下の実施例に具体的に記載されるように、アスペルギルス・オリゼの全ゲノム情報（特開２００５−１７６６０２号公報）に基づき、相同性検索、モチーフ検索、及び、既知遺伝子のアノテーションや文献情報、モチーフの種類などの情報をもとに、転写調節遺伝子をコードするＤＮＡと推定されたものであり、実施例に示すような、適当なプライマーを用いるＰＣＲにより麹菌のゲノムＤＮＡ等から取得することができる。

更に、本発明における「配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ」には、アミノ酸をコードする領域のみから成る塩基配列（即ち、エクソン部分のみが結合された塩基配列）からなるｃＤＮＡも含まれる。このようなｃＤＮＡは、本明細書に開示の塩基配列情報に基づき調製した適当なプライマーを用いて、麹菌のｍＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等により取得することが可能である。又、本発明に関するＤＮＡは当業者に公知の任意の方法によって化学合成することも可能である。

さらに、本発明の組換えベクターには、上記ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、及び、上記ＤＮＡと約８０％以上、好ましくは約９５％以上である配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。

ここで、ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｎｇ ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができる。

従って、配列番号１ないし配列番号４で表される塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約８０％以上、好ましくは約９５％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。なお、塩基配列間の同一性は、当業者に公知のアルゴリズム、例えば、Ｂｌａｓｔを用いて決定することができる。

従って、本発明は、配列番号１ないし配列番号４で表される塩基配列を含むＤＮＡ、該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、及び、上記ＤＮＡと約８０％以上、好ましくは約９５％以上である配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌蛋白質分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに、配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡにコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、及び、これらのアミノ酸配列からなり麹菌蛋白質分解酵素の分泌を増大する機能を有する活性を有する蛋白質にも係るものである。

２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。

上記の原理に従い、２つの塩基配列又はアミノ酸配列における配列相同性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８、１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７、１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。

上記のような塩基配列の配列相同性又はコードするアミノ酸配列の配列相同性を示すようなＤＮＡは、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもでき、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群又は公共データベースの中から、本技術分野の研究者か通常用いている方法により、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。さらに、本発明遺伝子は種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。

本発明の組換えベクターは、当業者に公知の適当な遺伝子工学的な手段を用いて、上記のＤＮＡをベクター内に連結することにより調製することができる。ベクターとしては、形質導入又は形質転換する宿主微生物のゲノム上の適当な位置に上記のＤＮＡが挿入され、その緒果、親株と比較して、その宿主微生物の蛋白質加水分解酵素分泌能を増大することができるものであれば、その構造及び種類等に、特に、制限はない。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体等のベクターを用いることかできる。

上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするための当業者に公知の任意のマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ｎｉａＤのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子又はアンピシリン、カナマイシンあるいはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター及びその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）、さらに、目的とするＤＮＡを挿入するためのマルチクローニングを含むことが望ましい。これらの組換えベクターに含まれる各要素は当業者に公知であり、例えば、具体的には、実施例に示されるように、アスペルギルス・オリゼのアミラーゼ遺伝手プロモーター、アスペルギルス・ニーデュランスのアミラーゼターミネーター、マーカー遺伝子としてのアスペルキルス・オリゼのｎｉａＤ遺伝子を挙げることができる。

形質導入又は形質転換は、公知の適当な方法で行うことができる。例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，９９−１０４（１９８９））を用いることかできる。

本発明の組換えベクターを形質導入又は形質転換された麹薗は、親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌が増大されたものとなる。本明細書において、「蛋白質加水分解酵秦の分泌を増大する」、又は、「蛋白質加水分解酵素の分泌が増大している」とは、最終的な結果（現象）として、菌体外へ蛋白質加水分解酵素の分泌量（分泌能）が増大していることを意昧し、その原因・機構としては、例えば、蛋白質加水分解酵素の発現量（産生量）自体が増大する場合と、産生された該酵素の菌体外への分泌量（分泌能）が増大している場合等が考えられる。さらに、ここで、「増大する」とは、以下の実施例に記載されているように、ゼラチン又はアゾカゼインを蛋白質として使用する測定方法を用いて、本発明の組換えベクターで形質導入又は形質転換された菌の培地中の蛋白質加水分解酵素量（活性）が、親株と比較して有意に増大することを意味する。

従って、該ベクターに含まれる各配列にコードされる蛋白質は、以下の実施例に記載されるように、転写調節因子であると予測されるが、必ずしも蛋白質加水分解酵素の転写調節エレメントに結合し、該蛋白質加水分解酵素の発現を促進させる機能を有するものに限られず、本発明の組換えベクターにより形質導入又は形質転換された麹薗において、発現された蛋白質加水分解酵素の菌体外への分泌を促進させる機能を有するものであっても良い。

麹菌とは、アスペルギルス属に属する微生物（菌類）の総称であり、その代表的な例として、既に記載したアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）及びアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）に加えて、特に食品・醸造分野で使用される菌としてアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等を挙げることができる。また、麹菌以外の食品・醸造・化学・医療分野で使用される産業上有用な糸状菌等を用いても実質的に同様の効果を得ることができる。これらの菌は、市販品として、又は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）等の様々な公的寄託機関から入手することも可能である。

また、「蛋白質加水分解酵素」はプロテアーゼとも呼ばれ、蛋白質を主に分解するプロテイナーゼ、又はエンドペプチダーゼ、小ペプチドを分解するペプチダーゼなどを含む総称である。

親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大している本発明の麹菌を当業者に公知の任意の方法で培養することにより、それが分泌する蛋白質分解酵素を生産することができる。例えば、本発明の麹菌を、固体培地若しくは液体培地で培養して培地中に蛋白質加水分解酵素を分泌させたのち、培地から蛋白質加水分解酵素を採取することが可能である。このような生産方法における、培養系・培地の選択、培養温度・時間等の培養条件は、以下の実施例等を参考に、当業者が適宜設定することができる。

また、本発明は麹菌を培養して得られる培養物と蛋白質含有原料とを混合し、原料中の蛋白質を分解することによって、蛋白質分解物を製造することができる。この方法で使用される原料に含まれる蛋白質の種類に特に制限はなく、例えば、ゼラチン、コラーゲン及びグルテン等を挙げることができる。例えば、ゼラチン、コラーゲン及びグルテン等含有原料の蛋白質分解物は調味液として有用である。

なお、組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする本発明の麹菌の具体例である、Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００３及びＣ００４は平成１７年９月９日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６５９、ＡＰ−２０６６０、ＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６１及びＦＥＲＭ ＡＰ−２０６６２がそれぞれ付与されている。

以下、実施例に則して本発明をさらに説明するが、本発明の技術的範囲は、これらに限定されるものでない。

（転写調節因子遺伝子の推定と抽出）
麹菌アスペルギルス・オリゼの全ゲノム情報（特開２００５−１７６６０２号公報参照）から、次のような方法により、転写調節因子遺伝子をコードすると推定される配列を抽出した。このステップにおいては、詳細な吟味は行わず、転写調節因子遺伝子である可能性のあるものは基本的にリストアップの対象とした。
（１）相同性検索による転写調節因子遺伝子と推定される配列の抽出
麹菌アスペルギルス・オリゼの全ゲノム情報から、遺伝子自動予測ソフトにより遺伝子配列と推定されるＤＮＡ配列をすべて抽出し、これらのＤＮＡ配列を自動予測遺伝子配列（以下、「自動予測遺伝子配列」という）とした。

各々の自動予測遺伝子配列から予測されるその遺伝子産物配列（（以下、「自動予測遺伝子産物配列」という）を基礎配列として、既知蛋白質の公共データベース（ＮＣＢＩによる非重複蛋白質データベースｎｒ)に対して、相同性検索ソフトＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行った。相同性検索の結果得られた配列の機能に関する情報を整理し、その配列に関わる遺伝子機能情報に対してキーワード検索を行い、転写調節因子に関わるキーワードを含む自動予測遺伝子配列を選択した。
（２）転写調節因子の構造に関わるモチーフと推定されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の検索
自動予測遺伝子産物配列について、モチーフ検索ソフト（ＨＭＭＥＲ）を用いてモチーフ（Ｐｆａｍ）検索を行い、転写調節因子に関わるモチーフを含むと推定されるアミノ酸配列をコードする自動予測遺伝子配列を選択した。
（３）既知転写調節因子配列と相同性を有するＤＮＡ配列の検索
麹菌や麹菌以外の糸状菌に関する既知の転写調節因子のアミノ酸配列を問い合わせ配列として、今回得られた自動予測遺伝子産物配列に対して、相同性検索ソフトＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行った。同様な問い合わせ配列を用いて、麹菌のゲノムコンティグ配列に対してＢＬＡＳＴ（ｔｂｌａｓｔ）を用いて相同性検索を行うことにより、自動予測で予測されていなかった遺伝子や、自動予測でＤＮＡ結合領域などの保存性の高い領域を欠損した形で予測されてしまっていた遺伝子についても検索可能とした。

これらの方法により、自動予測遺伝子配列から合計６６７個の候補遺伝子（以下、「候補遺伝子」という）を抽出した。

（候補遺伝子の絞込みと遺伝子領域のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ推定）
前項で抽出した転写調節因子遺伝子と思われる候補遺伝子について、順次遺伝子領域の推定を行った。また、推定に先立ち、相同な既知遺伝子のアノテーションや文献情報、モチーフの種類などの情報をもとに、強制発現による解析対象として相応しいか否かを検討し、ヘテロ複合体で機能するものなど、相応しくないものは除外した。

遺伝子領域の推定は、主に相同な既知遺伝子との比較により行った。相同な既知遺伝子との比較は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＡＬＮ（Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ ２０００ １６： １９０−２０２）を用いて行った。既知遺伝子との相同性が限定的で５’端が推定できなかった場合は、５’ＲＡＣＥを行うために、相同部分のアラインメント情報を準備した。３’末端の予測が本来の遺伝子領域より短すぎた場合は、転写調節因子のＣ末側がトランケートされてしまうが、予測が長すぎた場合は、本来のＣ末端で翻訳は終止すると考えられる。そこで、３’末端が予測できなかった場合は、相同部分からの距離や、隣の遺伝子との位置関係などから、本来の３’末端より十分に下流部分までを強制発現ベクターに組み込む領域とすることにした。

このような方法で、前項の抽出の際に既知の遺伝子との相同性が高かったものから順次遺伝子領域の推定を行った。全長がｉｎ ｓｉｌｉｃｏで推定できたものと５’ＲＡＣＥにより５’末端が明らかにされたもの一部の合計３００遺伝子について強制発現株作成ための予測配列を得た。

（発現用プラスミドの作製）
転写調節因子遺伝子を麹菌内で発現させるために用いる発現プラスミドとして、発現ユニットとしてアスペルギルス・オリゼアミラーゼ遺伝子プロモーター及びアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーター、転写調節因子遺伝子挿入用マルチクローニングサイト、マーカー遺伝子としてアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ遺伝子を含むプラスミドｐＡＰＴＬＮを構築した。

寒天プレート培地上で生育させた、アスペルギルス・ニドランスＩＡＭ２１３０株の胞子５×１０^５個を掻き取り、滅菌したマイクロチューブに入れた３００μlのＮｕｃｌｅｉ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に懸濁した。胞子を懸濁したマイクロチューブに１ｇのガラスビーズＢＺ−０６（アズワン株式会社製）を加え、ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、２５回／秒、３分間処理を２回繰り返した。６５℃で１５分間加温した後、室温で５分間放置した。1.5μｌのＲｎａｓｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１時間加温した。１００μlのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え２０秒間激しく振とうした後、１３，５００ｒｐｍで５分間遠心処理した。遠心後の上清を別のマイクロチューブに移し、３５０μlのイソプロパノールを加え転倒混和した後、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心処理した。得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄および乾燥処理した後、１００μlのＴＥバッファー〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ〕に懸濁しゲノムＤＮＡ溶液を得た。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行いアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーター領域の増幅を行った。
５’−ｇｇｇｔａｇｔｃｇｔａｃｃｃｇａｔｇａｔｇａａａｃ−３’（配列番号５）
５’−ａｇｃｃｔａｇｇｃｃｇｃｔｇｃａｇｇｃａｇ−３’ （配列番号６）
ＰＣＲ反応は、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。反応液の組成は以下のとおりである。

（試薬：使用量：終濃度）
ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ：０．５μｌ
１０×ＬＡ ＰＣＲ ＢｕｆｆｅｒII：５μｌ：１×
２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２：５μｌ：２．５ｍＭ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ：８μｌ：それぞれ０．４ｍＭ
鋳型ＤＮＡ（０．５μｇ）：１μｌ
プライマー：１μｌ×２種類：それぞれ０．２μＭ
滅菌水：２８．５μｌ
合計液量：５０μｌ
上記の反応液５０μｌを０．２ｍｌ反応チューブ中で混合してＰＴＣ−２００にセットし、以下の温度設定によりＰＣＲを行った。
９５℃、２分：１サイクル
９５℃、３０秒 ５８℃、３０秒 ７２℃、２分：３０サイクル
７２℃、３分：１サイクル。

反応液をエタノール沈澱処理後、沈殿を２０μlのＴＥバッファーに懸濁した。さらに、ＰｓｔIで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、目的の増幅産物を切り出した。切り出した増幅産物はゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、アスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターを得た。プラスミドｐＵＣ１９をＳｍａI及びＰｓｔIで処理した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片とアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターをライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト内にあるＳｍａI−ＰｓｔI部位にアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターが挿入されたプラスミドｐＡＴを得た。

ｐＡＴをＳｍａI及びＨｉｎｄIIIで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターを含むＤＮＡ断片を回収した
プラスミドｐＭＡＲ５（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６（１０），１６７４−１６７５，１９９２）をＳｍａIおよびＨｉｎｄIIIで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてａｒｇＢ遺伝子およびアスペルギルス・オリゼアミラーゼ遺伝子ターミネーターを除去したＤＮＡ断片を回収した。ｐＡＴおよびｐＭＡＲ５由来の両ＤＮＡ断片をライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、アスペルギルス・オリゼアミラーゼ遺伝子プロモーターおよびアスペルギルス・ニドランスアミラーゼ遺伝子ターミネーターを含むプラスミドｐＡＰＴを得た。

下記の２種類の合成ＤＮＡを含む（各１００μＭ）ＴＥバッファー１００μｌを５分間煮沸後、室温まで徐冷しマルチクローニングサイトリンカーとした。ｐＡＰＴをＥｃｏＲIおよびＳｍａIで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてマルチクローニングサイトを除去したＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片にマルチクローニングサイトリンカーをライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換しプラスミドｐＡＰＴＬを得た。プラスミドｐＳＴ１４〔（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ（１９８９）２１８：９９−１０４）をＨｉｎｄIIIで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、ゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてアスペルギルス・オリゼｎｉａＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。回収したｎｉａＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＡＰＴＬのＨｉｎｄIII部位に挿入し、転写調節因子遺伝子発現用プラスミドｐＡＰＴＬＮを得た。

（転写調節因子遺伝子発現用組換えベクターの作製）
転写調節因子遺伝子と予測されたＤＮＡ配列を基にＰＣＲにより各転写調節因子遺伝子を取得した。まず、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０のゲノムＤＮＡを調製した。次に調製したゲノムＤＮＡを鋳型に、予測遺伝子の開始コドン上流１００ｂｐのＤＮＡ配列及び終始コドン近傍のＤＮＡ配列を参考に作製した２種類のプライマーを用いて、ＰＣＲにより各転写調節因子遺伝子を取得した。開始コドン上流のＤＮＡ配列を参考にプライマーを作製する際には、ｐＡＰＴＬＮのマルチクローニングサイト上にある制限酵素認識配列であり、かつ、増幅する転写調節因子遺伝子配列内に認識配列が存在しない制限酵素認識配列を導入した。増幅した転写調節因子遺伝子は作製したプライマーに認識配列を導入した制限酵素で処理した後、ｐＡＰＴＬＮのマルチクローニングサイトに挿入し（導入した制限酵素部位とＳｍａI部位の間）、各転写調節因子遺伝子発現用組換えプラスミドベクターとした。

以下、転写調節因子遺伝子発現用プラスミドベクターの作製の一例を示す。

前記の方法を用いてアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株より調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、下記のプライマーを用いてＰＣＲを行い、転写調節因子遺伝子Ｃ００１（配列番号１）を得た。
５’−ａｔａｃａｇｇｃａｔｔｃｔａｔｃｇａｔａａａａｔｇｔｔｔｃｃ−３’（配列番号７）
５’−ｇｇｇｃｔａｃａｔｃｔｇｃｔｇｔｔｇｔａｇａａｇｔｔｇｃ−３’ （配列番号８）
ＰＣＲ反応は、ＴＯＹＯＢＯ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行った。反応液の組成は以下のとおりである。

（試薬：使用量：終濃度）
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：１μｌ
１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−：５μｌ：１×
２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２：２μｌ：１ｍＭ
２ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ：５μｌ：それぞれ０．２ｍＭ
鋳型ＤＮＡ（０．２μｇ）：１μｌ
プライマー：１μｌ×２種類：それぞれ０．３μＭ
滅菌水：３４μｌ
合計液量：５０μｌ
上記の反応液５０μｌを０．２ｍｌ反応チューブ中で混合してＰＴＣ−２００にセットし、以下のような温度設定によりＰＣＲを行った。
９４℃、２分：１サイクル
９４℃、１５秒 ５８℃、３０秒 ６８℃、４分：３０サイクル
６８℃、３分：１サイクル。

反応液をエタノール沈澱処理後、沈殿を２０μｌのＴＥバッファー〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ〕に懸濁した。更に、ＣｌａIで消化した後、０．７％アガロースゲルで電気泳動し、目的の増幅産物を切り出した。切り出した増幅産物はゲルエクストラクションキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した後、ｐＡＰＴＬＮのマルチクローニングサイト上のＣｌａI−ＳｍａI部位に挿入し、転写調節因子遺伝子Ｃ００１発現用プラスミドｐＣ００１を得た。

同様の方法を用いて転写調節因子遺伝子Ｃ００２発現用プラスミドｐＣ００２、転写調節因子遺伝子Ｃ００３発現用プラスミドｐＣ００３、転写調節因子遺伝子Ｃ００４発現用プラスミドｐＣ００４を得た。

転写調節因子遺伝子Ｃ００２（配列番号２）を増幅する際には、ＣｌａIの代わりにＮｈｅI認識配列を導入した下記の２種類のプライマーを用いて増幅、精製後、ｐＡＰＴＬＮのマルチクローニングサイト上のＣｌａI−ＳｍａI部位に挿入した。
５’−ｔｃａｔａｃａａｇｃｔａｇｃａａａａｔｇｇｃｇｇａｇａ−３’（配列番号９）
５’−ｇｇｇｃｔｃｇａｔａａｃｔｔｔｔｔａｃｔｃｃｃｇｔｇａｔａ−３’ （配列番号１０）

転写調節因子遺伝子Ｃ００３（配列番号３）を増幅する際には、ＣｌａIおよびＳｐｅI認識配列を導入した下記の２種類のプライマーを用いて増幅、精製後、ｐＡＰＴＬＮのマルチクローニングサイト上のＣｌａI−ＳｐｅI部位に挿入した。
５’−ｃｃａｔｃｇａｔａａｔａｔｔａｇｔａｔｇｃｔｇａａｔｇａ−３’（配列番号１１）
５’−ｇｇａｃｔａｇｔｔｃａｇｇｔｃｔｔｔｃｇａａｔｇｔｃａｇｇａ−３’（配列番号１２）

転写調節因子遺伝子Ｃ００４（配列番号４）を増幅する際には、ＣｌａI及びＳｐｅI認識配列を導入した下記の２種類のプライマーを用いて増幅、精製後、ｐＡＰＴＬＮのマルチクローニングサイト上のＣｌａI−ＳｐｅI部位に挿入した。
５’−ｃｃａｔｃｇａｔａａｇｔａａａａｇｇａｔｇｔｔａｔｔａｇａｔ−３’（配列番号１３）
５’−ｇｇａｃｔａｇｔｔｔａａｔｃｃｇｔｔｃｔｃａｔｇｇｃｃｇａａ−３’ （配列番号１４）

（転写調節因子遺伝子強制発現麹菌の取得）
アスペルギルス・オリゼＲＩＢ３２６株からＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ（１９８９）２１８：９９−１０４記載の方法で取得したｎｉａＤ欠損株を転写調節因子遺伝子発現用プラスミドｐＣ００１、ｐＣ００２、ｐＣ００４、ｐＣ００３で形質転換した。形質転換法は、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ（１９８９）２１８：９９−１０４）によって行った。各プラスミド５μｇを用いて形質転換し、最小培地で形質転換体を選択したところ、それぞれ約２００個のコロニーが得られた。このうち各プラスミドにつき１５コロニーについて最小培地で単分生子分離を繰り返し、形質の安定化を行った。次に、各転写調節因子遺伝子の成熟領域をプローブとしてサザン解析を実施し、それぞれの形質転換体の中から、形質転換に用いたプラスミドが形質転換体のゲノム上のｎｉａＤ遺伝子領域に挿入されている株を選択し、それぞれの選択株をＣ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４と命名した。サザン解析の結果を図１に示した。

（麹菌の培養方法及び菌体外酵素活性の測定）
（１）ゼラチン培地における麹菌の培養方法とゼラチン分解に関する蛋白質加水分解酵素活性の測定
各形質転換体をゼラチンを含む液体培地で振とう培養し、ゼラチン分解能を確認した。各形質転換体のゼラチン分解能の評価は、ゼラチンが分解されて生じる培地中のグルタミン酸濃度をコントロールと比較することで行った。

寒天最小培地上で生育させた各形質転換体の胞子を３ｍｌの滅菌水で掻き取り、１５０ｍｌ容三角フラスコに入れた４０ｍｌのゼラチン培地（２％ Ｇｅｌａｔｉｎ、０．１％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０５％ ＭｇＳＯ_４、０．０５％ ＫＣｌ、０．００１％ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３％ＮａＮＯ_３、３％ Ｍａｌｔｏｓｅ ｐＨ６．０）に植菌した（１×１０^７個胞子／４０ｍｌゼラチン培地）。３０℃、１５０ｒｐｍで１１５時間振とう培養した後、培養上清中のグルタミン酸量をヤマサ Ｌ−グルタミン酸測定キット（ヤマサ醤油株式会社製）を用いて測定した。また、上記のゼラチン分解能を指標として、培養上清の蛋白質加水分解酵素活性を測定した。コントロールとして、実験毎にＲＩＢ３２６株ｎｉａＤ欠損株をｐＡＰＴＬＮで形質転換して得られたｎｉａＤ^＋株を培養した。形質転換体の中で最もゼラチン分解能が高いと思われるＣ００４培養上清中のグルタミン酸量及び蛋白質加水分解酵素活性をコントロールに対する相対値として示した。

（２）フスマ培地における麹菌野生株との培養方法と本発明の形質転換体の蛋白質加水分解酵素活性の比較
フスマ：脱イオン水を５：４の比率で混合し、室温で３０分間放置した後、１５０ｍｌ容量の三角フラスコに５ｇずつ分注し、オートクレーブで１５分滅菌した。次いで、予め血球計で胞子数を計測しておいた野生株アスペルギルス・オリゼＲＩＢ３２６株や強制発現株の胞子懸濁液を、胞子がフスマ培地１ｇ当たり５×１０^５個になるように接種した。培養は３０℃で４日間行い、培養開始後２４時間目と４８時間目に混合し、その後は培養終了まで静置した。酵素液は、以下のようにして得た。培養終了後のフスマ培地に、５０ｍｌの脱イオン水と５００μｌのトルエンを加え、２時間室温で振とうし、懸濁液をＮｏ．２濾紙(アドバンテック社製)で濾過し濾液を得て、これを酵素液とした。

蛋白質加水分解酵素活性は、以下の計算式で示されるように、野生株の酵素活性を1とした時の比率で比較した。酵素活性比率＝強制発現株（試料の吸光度-ブランクの吸光度）/野生株（試料の吸光度-ブランクの吸光度）。また、蛋白質加水分解酵素活性測定を下記のようにして行い、試料とブランクの吸光度を求めた。

予め３０℃に温めた２ｍｌの基質液（１％アゾカゼイン、０．０５Ｍリン酸緩衝液：ｐＨ７．０）に酵素液２０μｌを加えて混合した。次に、これを３０℃で２０分反応させた後、反応停止液（１０％トリクロロ酢酸）２ｍｌを加え、反応を停止した。３０℃で２０分間放置して、生じた沈殿をアドバンテック社製Ｎｏ．５Ｃ濾紙で濾過し、濾液の吸光度（４１０ｎｍ）を測定した。ブランクは、酵素液添加前に反応停止液を加えて、同じ操作を行った。

野生株と強制発現株の蛋白質加水分解酵素活性を比較した結果、Ｃ００２、Ｃ００１、Ｃ００３が野生株の３倍の蛋白質加水分解酵素活性を示すことが確認された（図２）。また、Ｃ００４についても野生株の２．２倍の蛋白質加水分解酵素活性を示した。

以上の結果から、Ｃ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４の各ＤＮＡ配列を含む本発明の組換えベクターで形質転換された麹菌は麹菌原株に対して著しく蛋白質加水分解酵素分泌が増大していることが判明した。また、液体培地であるゼラチン培地、固体培地であるふすま培地においてそれぞれ蛋白質加水分解酵素活性が増大し、産業上の利用可能性が高いものであった。

これらのうち、本発明におけるＣ００１、Ｃ００２、Ｃ００３、Ｃ００４のＤＮＡ配列は、配列表１〜４のとおりである（配列中の初めから１０１番目が開始コドンの先頭塩基、終わりから１０１番目が終止コドンの最終塩基を示す）。Ｃ００１は、Ｃ２Ｈ２型のＺｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ モチーフを持ち、アスペルギルス・ニドランスのｓｔｅＡ遺伝子とアミノ酸レベルで８１％同一の相同性を示した。ｓｔｅＡ遺伝子は、アスペルギルス・ニドランスにおいて、有性生殖に必要とされる遺伝子として報告されている（Ｖａｌｌｉｍら、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３６（２）：２９０−３０１， （２０００））。

Ｃ００２は、Ｚｎ２−Ｃｙｓ６（Ｆｕｎｇａｌ ｚｉｎｃ ｂｉｎｕｃｌｅａｒ ｃｌｕｓｔｅｒ）型のｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒモチーフを持ち、アスペルギルス・フミガタスのＣ６ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｐｕｔａｔｉｖｅをコードする機能未知の遺伝子と、アミノ酸レベルで６７％同一の相同性を示した。Ｃ００２と相同性を示す遺伝子のうち、機能が報告されているもので最も高い相同性を示したのは、ネクトリア・ヘマトコッカの、クチナーゼ遺伝子の転写に関わるｎａｆ遺伝子であったが、その相同性は、アミノ酸レベルで３１％同一に過ぎなかった。

Ｃ００３は、Ｚｎ２−Ｃｙｓ６（Ｆｕｎｇａｌ ｚｉｎｃ ｂｉｎｕｃｌｅａｒ ｃｌｕｓｔｅｒ）型のｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒモチーフを持ち、アスペルギルス・フミガタスのＣ６ ｆｉｎｇｅｒ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｐｕｔａｔｉｖｅをコードする機能未知の遺伝子（上記Ｃ００２と最も高い相同性を示す遺伝子とは別遺伝子）と、アミノ酸レベルで５５％同一の相同性を示した。Ｃ００２と相同性を示す遺伝子のうち、機能が報告されているもので最も高い相同性を示したのは、アスペルギルス・ニドランスの、硝酸同化関連遺伝子の転写に関わるｎｉｒＡ遺伝子であったが、その相同性は、アミノ酸レベルで２２％同一に過ぎなかった（以上の相同性は、ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）により、ＮＣＢＩのｎｒデータベースを対象とした相同性検索の結果を示した）。

Ｃ００４は、Ｃ２Ｈ２型のＺｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒモチーフを持ち、アスペルギルス・ニドランスのａｍｄＸ遺伝子とアミノ酸レベルで７３％同一の相同性を示した。ａｍｄＸ遺伝子は、アスペルギルス・ニドランスにおいて、アセトアミダーゼをコードするａｍｄＳ遺伝子の転写活性化因子として報告されている（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２３（３）：５９１−６０２， （１９９７））。

従って、これらの従来公知の遺伝子は全て、遺伝子配列、及び相同遺伝子の機能から強制発現により蛋白質加水分解酵素活性を増大させることを何等示唆されるものではない。

本発明は、調味料の食品製造や、消化剤等の医薬品製造、洗剤用の蛋白質加水分解酵素生産等において産業上極めて重要でかつ有用なものである。

Claims (3)

1. 以下のＤＮＡ：
   （１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
   （２）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；又は
   （３）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと９５％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
   を含む組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする麹菌を、固体培地若しくは液体培地で培養して培地中に蛋白質加水分解酵素を分泌させたのち、培地から蛋白質加水分解酵素を採取することを特徴とする、蛋白質加水分解酵素の生産方法。
2. 以下のＤＮＡ：
   （１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
   （２）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；又は
   （３）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと９５％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
   を含む組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする麹菌を培養して得られる培養物と蛋白質含有原料とを混合し、原料中の蛋白質を分解することを特徴とする、蛋白質分解物の製造方法。
3. 以下のＤＮＡ：
   （１）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
   （２）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；又は
   （３）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと９５％以上の配列相同性を示す塩基配列からなるＤＮＡであって、麹菌蛋白質加水分解酵素の分泌を増大する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
   を含む組換えベクターにより形質導入又は形質転換され、親株と比較して蛋白質加水分解酵素分泌能が増大されていることを特徴とする麹菌を培養して得られる培養物とゼラチン含有原料とを混合し、原料中のゼラチンを分解することを特徴とする調味液の製造方法。

Images