JP4676639B2 - アスペルギルス属由来の新規なプロモーター - Google Patents
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Description
【発明の属する技術的分野】
本発明は、アスペルギルス(Aspergillus)属糸状菌の新規プロモーターに関する。更に詳細には、本発明はアスペルギルス・オリゼ由来の新規プロモーター配列をクローニングし、アスペルギルス属糸状菌を宿主として有用蛋白質およびペプチドを発現させるために必要なDNA断片を有するプラスミドと、それを用いた有用蛋白質およびペプチドの製造法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
近年の遺伝子組換え技術の発展とともに、ヒトの有用蛋白質が大腸菌や酵母を用いて生産することが可能となってきた。しかし大腸薗を宿主としてヒトなどの真核生物由来の遺伝子を発現させた場合、正常なプロセッシングが行われない、糖鎖が付着しないなどの問題点が指摘されている。また酵母によって異種タンパクの分泌生産を行う場合は、糖鎖結合はされるものの、その分泌量が非常に少ないという欠点を有する。そこで高いタンパク分泌能を持つ糸状菌が、真核生物のタンパク発現の宿主として注目されてきた。なかでも黄麹菌Aspergillus oryzaeは、清酒や味噌など醸造産業上で長く使用された実績から、異種遺伝子発現への応用に積極的に利用されている。既にMucor mieheiの酸性プロテアーゼなどがA.oryzaeを宿主として、工業生産されている。
【0003】
このような麹菌による異種タンパク生産には、αアミラーゼやグルコアミラーゼなどのアミラーゼ遺伝子のプロモーターが用いられることが多い。しかしながら、異種タンパクの生産性を向上させるためにはより強力な発現能を有するとともに、様々な遺伝子産物の発現に対応した複数のプロモーターの探索が不可欠である。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
麹菌の異種タンパク生産を行うプロモーターとしては、主に麹菌の分泌酵素など生産量が多いタンパクの遺伝子にターゲットが当てられている。これは麹菌は菌体外に大量のタンパクを分泌するため、このようなタンパクの遺伝子プロモーターは発現能も高いと考える発想である。しかし麹菌の全タンパクの発現を見た場合、必ずしも菌体外タンパクの遺伝子が高発現しているわけではなく、菌体内のタンパクの遺伝子であっても高い発現能を有するものも存在すると考えられる。
【0005】
本発明者らは、我が国独自の培養法であって、清酒、味噌、醤油、みりん等の発酵産業で利用される蒸し米を用いた麹菌の固体培養ではその生産される蛋白質の種類が多く、未だにクローニングされていない遺伝子が多数存在するとの着想を得た。よって、従来の技術常識にとらわれることなく、固体培養で発現する遺伝子群からのプロモーターを検索することが望ましいとの新しい発想に本発明者らはたった。
【0006】
さらに、異種遺伝子発現の場合、発現させる蛋白質によって相性の良いプロモーターの選択が重要である。誘導条件、発現時期、培養方法など、目的遺伝子産物に最も適したプロモーターを選択することが望ましい。これらの点に鑑み、本発明者らは、効率的な異種蛋白質発現のためには、様々な発現特性を持つ複数のプロモーターを準備していくことが必要であるとの観点にたった。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明は、麹菌の高発現プロモーターを探索し、様々な異種遺伝子の発現に対応できる複数のプロモーターを単離し、取得プロモーターを利用した麹菌の遺伝子発現系を用いて異種蛋白質を製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
本発明は以下の様にして上記目的を達成することができた。
【0008】
麹菌をはじめとする糸状菌の遺伝子解析は、主に液体培養を行った菌体を用いて解析を行うため、液体培養で発現する遺伝子については既に多くの報告例がある。一方、清酒、味噌、醤油、みりんなどの発酵産業で行われている固体培養については、その遺伝子発現機構についてはほとんど解明されていない。すなわち、固体培養で発現する遺伝子の解析例は少なく、この中には未だクローニングされていない未知遺伝子が多数含まれていることが予想される。そしてこれらの未知遺伝子のプロモーターの中に、固体培養で強力に発現するなど固体培養での物質生産に適したプロモーターが含まれていることが期待できる。そこで、プロモーターの探索源として固体培養で発現する遺伝子群を用いることにした。固体培養から得られたcDNAライブラリーから、未発表の遺伝子に関するcDNAを抽出し、そのプロモーター領域の単離を行った。
【0009】
プロモーター領域の取得方法の一例として、麹菌のゲノムDNAをテンペレートにしたPCR法を挙げる。麹菌からゲノムDNAを抽出してEcoRV、ScaI、DraI、PvuIIあるいはSspI等の6bpを認識して平滑末端に切断するそれぞれの制限酵素で完全消化し、そのゲノムDNA断片の両端に適当なアダプターを連結する。この両端にアダプターが連結されたゲノムDNA断片を鋳型として、cDNAの塩基配列から合成したプライマーおよびアダプターの一本鎖部分の配列を有するプライマーを用いてPCRを行う。増幅産物を電気泳動で確認して1〜2kb程度の長さを有するDNA断片を電気泳動によって単離・精製する。この断片の塩基配列を決定し、ホモロジー検索から推定される開始コドンより上流をプロモーター配列とする。
【0010】
また、本発明に係るプロモーターは、いずれも、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)O−1013(独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P−16528として寄託)にふくまれているので、ゲノムDNAから直接切り出すことによって容易に入手することができる。その場合、当該プロモーターを含む遺伝子配列を分離し、その配列において、開始コドンより上流をプロモーター配列とし、そのプロモーター活性を上記するプロモーター解析システムで確認してもよい。
【0011】
さらに得られたプロモーター断片を、既に作成しているプロモーター活性測定用プラスミドpNGUS(図36)のGUS遺伝子上流に転写方向が合うように挿入する。このプラスミドをA.oryzaeのniaD変異株に導入し、導入プラスミドが宿主の染色体上のniaD locusに1コピーだけ相同組換えを起こした株を選択する。この遺伝子導入株を種々の条件で培養し、菌体内のGUS活性を測定することにより、プロモーター発現能とした。
【0012】
プロモーター解析用プラスミドpNGUSは、本発明者らが開発するのに成功したものであって、このプラスミドは、形質転換用マーカーであるA.oryzaeのniaD遺伝子(E.S. Unkleら、Mol. Gen. Genet., 218, p.99-104, 1989)と、レポーター遺伝子である大腸菌のβ−グルクロニダーゼ(GUS)をコードするuidA遺伝子(R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Acad. Sci., P.8447-8451,1986)を含むものである。
【0013】
このプラスミドを用いてプロモーター活性を測定して有用プロモーターをスクリーニングするには、このプラスミドのuidA遺伝子の上流域(例えばSalI、PstIサイト)に、検討しようとする種々の遺伝子プロモーター(又はプロモーターと予測される配列)あるいはその一部分、DNA断片をAspergillus oryzae O−1013(FERM P−16528)のniaD変異株(アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)1013−niaD:本菌株は、硝酸資化能欠損株、Nitrate Reductase欠損株であって、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERMP−17707として寄託されている。)に導入し、導入プラスミドが宿主染色体のniaD locusに1コピーだけ導入された形質転換体を選択する。そしてこれらの形質転換体のGUS活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とし、プロモーターを効率的にスクリーニングするものである。
【0014】
本発明者らは、上記スクリーニング方法で、Aspergillus oryzae O−1013(FERM P−16528)のゲノムDNAについて種々検討した結果、以下に挙げる遺伝子のプロモーターが液体培養及び固体培養で強力に発現していることをはじめて確認し、これら新規プロモーターを開発するのに成功したものである。
【0015】
クルシフォーム結合蛋白賀(cruciform binding protein)遺伝子、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase)遺伝子、ユビキチンコンジュゲーティング酵素(ubiquitin conjugating enzyme)遺伝子、ATP依存性トランスポーター(ATP-dependent transpoter)遺伝子、H+トランスポーティングATPシンターゼ(H+ transporting ATP synthase)遺伝子、ユビキチン(ubiquitin)遺伝子、Rab5様GTPase(Rab5-like GTPase)遺伝子、リボソーム蛋白質L37(ribosomal protein L37)遺伝子、リボソーム蛋白質S16(ribosomal protein S16)遺伝子、ホスファチジルシンテターゼ(phosphatidyl synthetase)遺伝子、mRNA除去因子Iの25kDaサブユニット(mRNA cleavage factor I25-kDa subunit)遺伝子、ヒストンH3サブユニット(histone H3 subunit)遺伝子、26Sプロテアソームp44.5蛋白質(26S proteasome p44.5 protein)遺伝子、酵母由来飢餓生存蛋白質(yeast reduced viability upon starvation protein)遺伝子、推定膜蛋白質(putative integral protein)遺伝子、脂質トランスポート蛋白質POX18(lipid transporting protein POX18)遺伝子、ペルオキシソーム膜蛋白質per10(peroxisomal membrane protein per10)遺伝子、液胞H+ATPaseサブユニット(H+ATPase subunit vacuolar)遺伝子、DNA結合P52/P100複合体100kDaサブユニット(DNA binding P52/P100 complex 100kDa subunit)遺伝子、アデノシンキナーゼ(adenosine kinase)遺伝子、複製因子A蛋白質(replication factor-A protein)遺伝子、T.reesei様プロテインキナーゼ(T. reesei-like protein kinase)遺伝子、カルシウム結合蛋白質(calcium binding protein)遺伝子、マンノース結合蛋白質(mannose-binding protein)遺伝子、ソルビトールユーティリゼーション蛋白質(sorbitol utilization protein)遺伝子、チオレドキシン(thioredoxin)遺伝子、チトクロームC(cytochrome C)遺伝子、マンノースレクチン(mannose-binding lectin)遺伝子、マンガンスーパーオキシドディスムターゼ2(alternative MnSOD)遺伝子、sar1(sar1)遺伝子、d12−デサチュラーゼ(d12-desaturase)遺伝子、d9−デサチュラーゼ(d9-desaturase)遺伝子、d6−デサチュラーゼ(d6-desaturase)遺伝子、アルコールアシルトランスフェラーゼ(AACTase)遺伝子、ccg−9(ccg-9)遺伝子。
【0016】
これらのプロモーターについては、いずれもその塩基配列の決定にも成功し、それらを配列表の配列番号1〜35(図1〜図35)にそれぞれ示した。なお、上記した各遺伝子のプロモーターの記載順序と配列番号(図番号)は対応している。
【0017】
本発明のプロモーターは上述のようにして決定された塩基配列に対してストリンジェントな条件、例えば、0.1%SDS、1×SSC(60℃、0.3mol NaCl、0.03Mクエン酸ソーダ)でハイブリダイズする塩基配列をも包含する。
【0018】
本発明のプロモーターは、その下流に、所望の有用蛋白質遺伝子を連結してベクターを構築し、該ベクターで宿主を形質転換し、それを培養することにより、有用蛋白質を著量生産させることができる。宿主としては、アスペルギルス・オリゼをはじめ、その他のアスペルギルス属、リゾプス属、ノイロスポラ属、ペニシリウム属、トリコデルマ属などの微生物が使用できる。特に、発現効率の点から、宿主として、アスペルギルス・オリゼを用いることが好ましい。
【0019】
得られたプロモーターへの有用蛋白質遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、それ自体公知の方法で行うことができる。有用蛋白質遺伝子としては、特に限定するものではない。また、ベクターとしては、アルギニン要求性などの栄養要求性相補遺伝子、アセトアミド資化などの炭素、窒素源資化遺伝子、オリゴマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。宿主の形質転換も自体公知の方法で行うことができる。また、該形質転換体の培養も常法に従って、所望の蛋白質に適した培地、培養条件を適宜選択することにより行うことができ、得られた蛋白質の採取、精製も公知の方法で行うことができる。
【0020】
以下、実施例を参照しながら本発明を詳細に説明するが、実施例に使用したプラスミドなどは一例として挙げたものであり、本発明に使用できるものであればこれらに限定されるものではない。
【0021】
【実施例1】
(麹菌A.oryzae O−1013株(FERM P−16528)の米麹固体培養cDNAライブラリーの構築)
麹菌A.oryzae O−1013株を70%精米した蒸し米上にて40時間米麹固体培養を行った。その培養菌体より常法であるAGPC法(Chomczynski, P.et al., An al. Biochem. 162, 156〜159(1987))により全RNAを抽出した。得られた全RNAからoligotex−dt30<super>mRNApurification kit(寶酒造)を用いて、mRNAを精製した。得られた1μgのmRNAを用いて、SMARTcDNA library construction kit(クロンテック社)を用いてλTriplEx2ファージcDNAライブラリーを構築した。
【0022】
【実施例2】
(有用遺伝子のプロモーター断片の単離方法)
クロンテック社製Genome Walkerを用いて、プロモーター断片取得用のテンペレートDNAライブラリーを構築した。まず、A.oryzae O−1013(FERM P−16528)のゲノムDNAを5種類の制限酵素(DraI、EcoRV、PvuII、ScaI、StuI)で切断し、各制限酵素で切断したゲノムDNAに対してその両端にアダプターを連結し、PCR増幅用のゲノムテンペレートとする。次にEST情報から得られる遺伝子のアンチセンス配列から設計したプライマーと、アダプターから設計したプライマーを用いて、先に作成したゲノムテンプレートライブラリーに対してPCR反応を行う。反応条件のー例は次のとおりである。
【0023】
PCR条件
・95℃(1分)、1サイクル
・94℃(5秒)、72℃(3分)、7サイクル
・94℃(5秒)、67℃(3分)、70℃(3分)、32サイクル
・67℃(7分)、1サイクル
【0024】
5種類のテンペレートそれぞれについてPCR反応後、1〜3kbのDNA断片が増幅されたものについて、電気泳動装置を用いて単離した。これらの断片の塩基配列を決定し、ブラストサーチを用いた相同性検索の結果から推定された開始コドンの上流をプロモーター部分とした。
【0025】
【実施例3】
(有用遺伝子のプロモーター活性の測定方法)
まず目的とするプロモーター断片を、プロモーター活性測定用プラスミドに挿入する。Genome Walkerで単離したプロモーターDNA断片の両端に、脱リン酸化を施したSalIのリンカーをT4DNAリガーゼによりライゲーションする。得られた産物をT4ポリヌクレオチドキナーゼで5’末端をリン酸化後、未反応のSalIリンカーをアガロースゲル電気泳動により除去した。得られたプロモーターSalI断片をプロモーター活性測定用に開発したプラスミドpNGUS(図36)のGUS遺伝子上流SalIサイトへT4DNAリガーゼにより挿入した。挿入プロモーターの方向がGUS遺伝子のコーディング領域と正の方向にサブクローニングされたものを選択した。このプロモーター解析プラスミドpNGUSを含む大腸菌(Escherichia cori)IN113株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P−18254として寄託されている。プロモーター部分を挿入したプラスミドを麹菌に挿入することにより、挿入したプロモーターの支配下でレポーター遺伝子であるGUS遺伝子が発現し、プロモーターの発現能をGUS活性で測定することができる。それぞれのプラスミドでA.oryzaeのniaD変異株(Aspergillus oryzae 1013-niaD:FERM P-17707)を形質転換し、プラスミドが宿主のゲノムのniaD locusに1コピーのみ導入された形質転換体を選択する。この形質転換体を様々な培養条件で培養し、GUS生産能を測定し、それぞれのプロモーター発現能とした。このように、プロモーター解析用プラスミドpNGUSを利用することによって、目的とするプロモーターを選択、取得することが可能となり、本発明を容易に実施することができる。
【0026】
【実施例4】
(単離遺伝子のプロモーターの液体培養、固体培養における発現能の検討)
表1に示すように、得られたプロモーター解析株を用いて富栄養(デキストリン−ペプトン−酵母エキス培地:DPY培地)と貧栄養(ツアペック・ドックス培地:Czapek−Dox培地)の液体培養及び米麹固体培養を行った。単離した35個の遺伝子のプロモーターの支配下でGUS蛋白質が生産され、これらのプロモーターの有効性が示された。
【0027】
【0028】
【発明の効果】
本発明によって35種類のプロモーターが新たに開発された。これら麹菌に含まれるプロモーター又はこれらプロモーター由来のDNAを利用することにより、これらのプロモーターが直接関連する同種の遺伝子はもとより他の遺伝子のきわめて効率的な発現システムが構築された。
【0029】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】クルシフォーム結合蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列(711塩基)を示す。
【図2】ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列(671塩基)を示す。
【図3】ユビキチンコンジュゲーティング酵素遺伝子プロモーターの塩基配列(803塩基)を示す。
【図4】ATP依存性トランスポーター遺伝子プロモーターの塩基配列(615塩基)を示す。
【図5】H+トランスポーティングATPシンターゼ遺伝子プロモーターの塩基配列(1062塩基)を示す。
【図6】ユビキチン遺伝子プロモーターの塩基配列(766塩基)を示す。
【図7】Rab5様GTPase遺伝子プロモーターの塩基配列(870塩基)を示す。
【図8】リボソーム蛋白質L37遺伝子プロモーターの塩基配列(714塩基)を示す。
【図9】リボソーム蛋白質S16遺伝子プロモーターの塩基配列(810塩基)を示す。
【図10】ホスファチジルシンテターゼ遺伝子プロモーターの塩基配列(1181塩基)を示す
【図11】mRNA除去因子Iの25kDaサブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列(721塩基)を示す
【図12】ヒストンH3サブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列(751塩基)を示す。
【図13】26Sプロテアソームp44.5蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列(716塩基)を示す。
【図14】酵母由来飢餓生存蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列(788塩基)を示す。
【図15】推定膜蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列(853塩基)を示す。
【図16】脂質トランスポート蛋白質POX18遺伝子プロモーターの塩基配列(660塩基)を示す。
【図17】ペルオキシソーム膜蛋白質per10遺伝子プロモーターの塩基配列(681塩基)を示す。
【図18】液胞H+ATPaseサブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列(868塩基)を示す。
【図19】DNA結合P52/P100複合体100kDaサブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列(596塩基)を示す。
【図20】アデノシンキナーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列(706塩基)を示す。
【図21】複製因子A蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列(694塩基)を示す。
【図22】T.reesei様プロテインキナーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列(1002塩基)を示す。
【図23】カルシウム結合蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列(576塩基)を示す。
【図24】マンノース結合蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列(805塩基)を示す。
【図25】ソルビトールユーティリゼーション蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列(780塩基)を示す。
【図26】チオレドキシン遺伝子プロモーターの塩基配列(714塩基)を示す。
【図27】チトクロームC遺伝子プロモーターの塩基配列(790塩基)を示す。
【図28】マンノースレクチン遺伝子プロモーターの塩基配列(361塩基)を示す。
【図29】マンガンスーパーオキシドディスムターゼ2遺伝子プロモーターの塩基配列(1239塩基)を示す。
【図30】sar1遺伝子プロモーターの塩基配列(749塩基)を示す。
【図31】d12−デサチュラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列(515塩基)を示す。
【図32】d9−デサチュラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列(88塩基)を示す。
【図33】d6−デサチュラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列(162塩基)を示す。
【図34】アルコールアシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列(728塩基)を示す
【図35】ccg−9遺伝子プロモーターの塩基配列(939塩基)を示す。
【図36】プラスミドpNGUSの制限酵素地図を示す。
Claims (5)
- 配列表の配列番号1又は2に示す塩基配列からなる、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)で用いる高発現プロモーターDNA。
- 請求項1記載のDNAと有用蛋白質遺伝子のコーディング領域を連結してなる、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)で用いる有用蛋白質高発現DNA。
- 請求項2に記載のDNAを挿入してなる組換えプラスミド。
- 請求項3に記載のプラスミドを導入してなるアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)の形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を液体培養又は固体培養し、該培養物から有用蛋白質を採取、精製することを特徴とするアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)を用いた有用蛋白質の製造方法。
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