JP4676639B2 - アスペルギルス属由来の新規なプロモーター - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術的分野】
本発明は、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の新規プロモーターに関する。更に詳細には、本発明はアスペルギルス・オリゼ由来の新規プロモーター配列をクローニングし、アスペルギルス属糸状菌を宿主として有用蛋白質およびペプチドを発現させるために必要なＤＮＡ断片を有するプラスミドと、それを用いた有用蛋白質およびペプチドの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子組換え技術の発展とともに、ヒトの有用蛋白質が大腸菌や酵母を用いて生産することが可能となってきた。しかし大腸薗を宿主としてヒトなどの真核生物由来の遺伝子を発現させた場合、正常なプロセッシングが行われない、糖鎖が付着しないなどの問題点が指摘されている。また酵母によって異種タンパクの分泌生産を行う場合は、糖鎖結合はされるものの、その分泌量が非常に少ないという欠点を有する。そこで高いタンパク分泌能を持つ糸状菌が、真核生物のタンパク発現の宿主として注目されてきた。なかでも黄麹菌Aspergillus oryzaeは、清酒や味噌など醸造産業上で長く使用された実績から、異種遺伝子発現への応用に積極的に利用されている。既にＭｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉの酸性プロテアーゼなどがＡ．ｏｒｙｚａｅを宿主として、工業生産されている。
【０００３】
このような麹菌による異種タンパク生産には、αアミラーゼやグルコアミラーゼなどのアミラーゼ遺伝子のプロモーターが用いられることが多い。しかしながら、異種タンパクの生産性を向上させるためにはより強力な発現能を有するとともに、様々な遺伝子産物の発現に対応した複数のプロモーターの探索が不可欠である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
麹菌の異種タンパク生産を行うプロモーターとしては、主に麹菌の分泌酵素など生産量が多いタンパクの遺伝子にターゲットが当てられている。これは麹菌は菌体外に大量のタンパクを分泌するため、このようなタンパクの遺伝子プロモーターは発現能も高いと考える発想である。しかし麹菌の全タンパクの発現を見た場合、必ずしも菌体外タンパクの遺伝子が高発現しているわけではなく、菌体内のタンパクの遺伝子であっても高い発現能を有するものも存在すると考えられる。
【０００５】
本発明者らは、我が国独自の培養法であって、清酒、味噌、醤油、みりん等の発酵産業で利用される蒸し米を用いた麹菌の固体培養ではその生産される蛋白質の種類が多く、未だにクローニングされていない遺伝子が多数存在するとの着想を得た。よって、従来の技術常識にとらわれることなく、固体培養で発現する遺伝子群からのプロモーターを検索することが望ましいとの新しい発想に本発明者らはたった。
【０００６】
さらに、異種遺伝子発現の場合、発現させる蛋白質によって相性の良いプロモーターの選択が重要である。誘導条件、発現時期、培養方法など、目的遺伝子産物に最も適したプロモーターを選択することが望ましい。これらの点に鑑み、本発明者らは、効率的な異種蛋白質発現のためには、様々な発現特性を持つ複数のプロモーターを準備していくことが必要であるとの観点にたった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、麹菌の高発現プロモーターを探索し、様々な異種遺伝子の発現に対応できる複数のプロモーターを単離し、取得プロモーターを利用した麹菌の遺伝子発現系を用いて異種蛋白質を製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
本発明は以下の様にして上記目的を達成することができた。
【０００８】
麹菌をはじめとする糸状菌の遺伝子解析は、主に液体培養を行った菌体を用いて解析を行うため、液体培養で発現する遺伝子については既に多くの報告例がある。一方、清酒、味噌、醤油、みりんなどの発酵産業で行われている固体培養については、その遺伝子発現機構についてはほとんど解明されていない。すなわち、固体培養で発現する遺伝子の解析例は少なく、この中には未だクローニングされていない未知遺伝子が多数含まれていることが予想される。そしてこれらの未知遺伝子のプロモーターの中に、固体培養で強力に発現するなど固体培養での物質生産に適したプロモーターが含まれていることが期待できる。そこで、プロモーターの探索源として固体培養で発現する遺伝子群を用いることにした。固体培養から得られたｃＤＮＡライブラリーから、未発表の遺伝子に関するｃＤＮＡを抽出し、そのプロモーター領域の単離を行った。
【０００９】
プロモーター領域の取得方法の一例として、麹菌のゲノムＤＮＡをテンペレートにしたＰＣＲ法を挙げる。麹菌からゲノムＤＮＡを抽出してＥｃｏＲＶ、ＳｃａＩ、ＤｒａＩ、ＰｖｕIIあるいはＳｓｐＩ等の６ｂｐを認識して平滑末端に切断するそれぞれの制限酵素で完全消化し、そのゲノムＤＮＡ断片の両端に適当なアダプターを連結する。この両端にアダプターが連結されたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として、ｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマーおよびアダプターの一本鎖部分の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う。増幅産物を電気泳動で確認して１〜２ｋｂ程度の長さを有するＤＮＡ断片を電気泳動によって単離・精製する。この断片の塩基配列を決定し、ホモロジー検索から推定される開始コドンより上流をプロモーター配列とする。
【００１０】
また、本発明に係るプロモーターは、いずれも、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）Ｏ−１０１３（独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８として寄託）にふくまれているので、ゲノムＤＮＡから直接切り出すことによって容易に入手することができる。その場合、当該プロモーターを含む遺伝子配列を分離し、その配列において、開始コドンより上流をプロモーター配列とし、そのプロモーター活性を上記するプロモーター解析システムで確認してもよい。
【００１１】
さらに得られたプロモーター断片を、既に作成しているプロモーター活性測定用プラスミドｐＮＧＵＳ（図３６）のＧＵＳ遺伝子上流に転写方向が合うように挿入する。このプラスミドをＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株に導入し、導入プラスミドが宿主の染色体上のｎｉａＤ ｌｏｃｕｓに１コピーだけ相同組換えを起こした株を選択する。この遺伝子導入株を種々の条件で培養し、菌体内のＧＵＳ活性を測定することにより、プロモーター発現能とした。
【００１２】
プロモーター解析用プラスミドｐＮＧＵＳは、本発明者らが開発するのに成功したものであって、このプラスミドは、形質転換用マーカーであるＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ遺伝子（E.S. Unkleら、Mol. Gen. Genet., 218, p.99-104, 1989）と、レポーター遺伝子である大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Acad. Sci., P.8447-8451,1986）を含むものである。
【００１３】
このプラスミドを用いてプロモーター活性を測定して有用プロモーターをスクリーニングするには、このプラスミドのｕｉｄＡ遺伝子の上流域（例えばＳａｌＩ、ＰｓｔＩサイト）に、検討しようとする種々の遺伝子プロモーター（又はプロモーターと予測される配列）あるいはその一部分、ＤＮＡ断片をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）のｎｉａＤ変異株（アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）１０１３−ｎｉａＤ：本菌株は、硝酸資化能欠損株、Ｎｉｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株であって、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−１７７０７として寄託されている。）に導入し、導入プラスミドが宿主染色体のｎｉａＤ ｌｏｃｕｓに１コピーだけ導入された形質転換体を選択する。そしてこれらの形質転換体のＧＵＳ活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とし、プロモーターを効率的にスクリーニングするものである。
【００１４】
本発明者らは、上記スクリーニング方法で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）のゲノムＤＮＡについて種々検討した結果、以下に挙げる遺伝子のプロモーターが液体培養及び固体培養で強力に発現していることをはじめて確認し、これら新規プロモーターを開発するのに成功したものである。
【００１５】
クルシフォーム結合蛋白賀（cruciform binding protein）遺伝子、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase）遺伝子、ユビキチンコンジュゲーティング酵素（ubiquitin conjugating enzyme）遺伝子、ＡＴＰ依存性トランスポーター（ATP-dependent transpoter）遺伝子、Ｈ＋トランスポーティングＡＴＰシンターゼ（H+ transporting ATP synthase）遺伝子、ユビキチン（ubiquitin）遺伝子、Ｒａｂ５様ＧＴＰａｓｅ（Rab5-like GTPase）遺伝子、リボソーム蛋白質Ｌ３７（ribosomal protein L37）遺伝子、リボソーム蛋白質Ｓ１６（ribosomal protein S16）遺伝子、ホスファチジルシンテターゼ（phosphatidyl synthetase）遺伝子、ｍＲＮＡ除去因子Ｉの２５ｋＤａサブユニット（mRNA cleavage factor Ｉ25-kDa subunit）遺伝子、ヒストンＨ３サブユニット（histone H3 subunit）遺伝子、２６Ｓプロテアソームｐ４４．５蛋白質（26S proteasome p44.5 protein）遺伝子、酵母由来飢餓生存蛋白質（yeast reduced viability upon starvation protein）遺伝子、推定膜蛋白質（putative integral protein）遺伝子、脂質トランスポート蛋白質ＰＯＸ１８（lipid transporting protein POX18）遺伝子、ペルオキシソーム膜蛋白質ｐｅｒ１０（peroxisomal membrane protein per10）遺伝子、液胞Ｈ＋ＡＴＰａｓｅサブユニット（H+ATPase subunit vacuolar)遺伝子、ＤＮＡ結合Ｐ５２／Ｐ１００複合体１００ｋＤａサブユニット（DNA binding P52/P100 complex 100kDa subunit)遺伝子、アデノシンキナーゼ（adenosine kinase）遺伝子、複製因子Ａ蛋白質（replication factor-A protein)遺伝子、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ様プロテインキナーゼ（T. reesei-like protein kinase)遺伝子、カルシウム結合蛋白質（calcium binding protein)遺伝子、マンノース結合蛋白質（mannose-binding protein)遺伝子、ソルビトールユーティリゼーション蛋白質（sorbitol utilization protein)遺伝子、チオレドキシン（thioredoxin）遺伝子、チトクロームＣ（cytochrome C)遺伝子、マンノースレクチン（mannose-binding lectin)遺伝子、マンガンスーパーオキシドディスムターゼ２（alternative MnSOD)遺伝子、ｓａｒ１（sar1）遺伝子、ｄ１２−デサチュラーゼ（d12-desaturase）遺伝子、ｄ９−デサチュラーゼ（d9-desaturase）遺伝子、ｄ６−デサチュラーゼ（d6-desaturase）遺伝子、アルコールアシルトランスフェラーゼ（AACTase）遺伝子、ｃｃｇ−９（ccg-9）遺伝子。
【００１６】
これらのプロモーターについては、いずれもその塩基配列の決定にも成功し、それらを配列表の配列番号１〜３５（図１〜図３５）にそれぞれ示した。なお、上記した各遺伝子のプロモーターの記載順序と配列番号（図番号）は対応している。
【００１７】
本発明のプロモーターは上述のようにして決定された塩基配列に対してストリンジェントな条件、例えば、０．１％ＳＤＳ、１×ＳＳＣ（６０℃、０．３ｍｏｌ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ソーダ）でハイブリダイズする塩基配列をも包含する。
【００１８】
本発明のプロモーターは、その下流に、所望の有用蛋白質遺伝子を連結してベクターを構築し、該ベクターで宿主を形質転換し、それを培養することにより、有用蛋白質を著量生産させることができる。宿主としては、アスペルギルス・オリゼをはじめ、その他のアスペルギルス属、リゾプス属、ノイロスポラ属、ペニシリウム属、トリコデルマ属などの微生物が使用できる。特に、発現効率の点から、宿主として、アスペルギルス・オリゼを用いることが好ましい。
【００１９】
得られたプロモーターへの有用蛋白質遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、それ自体公知の方法で行うことができる。有用蛋白質遺伝子としては、特に限定するものではない。また、ベクターとしては、アルギニン要求性などの栄養要求性相補遺伝子、アセトアミド資化などの炭素、窒素源資化遺伝子、オリゴマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。宿主の形質転換も自体公知の方法で行うことができる。また、該形質転換体の培養も常法に従って、所望の蛋白質に適した培地、培養条件を適宜選択することにより行うことができ、得られた蛋白質の採取、精製も公知の方法で行うことができる。
【００２０】
以下、実施例を参照しながら本発明を詳細に説明するが、実施例に使用したプラスミドなどは一例として挙げたものであり、本発明に使用できるものであればこれらに限定されるものではない。
【００２１】
【実施例１】
（麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）の米麹固体培養ｃＤＮＡライブラリーの構築）
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３株を７０％精米した蒸し米上にて４０時間米麹固体培養を行った。その培養菌体より常法であるＡＧＰＣ法（Chomczynski, P.et al., An al. Biochem. 162, 156〜159(1987))により全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡからｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０＜ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（寶酒造）を用いて、ｍＲＮＡを精製した。得られた１μｇのｍＲＮＡを用いて、ＳＭＡＲＴｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（クロンテック社）を用いてλＴｒｉｐｌＥｘ２ファージｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【００２２】
【実施例２】
（有用遺伝子のプロモーター断片の単離方法）
クロンテック社製Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒを用いて、プロモーター断片取得用のテンペレートＤＮＡライブラリーを構築した。まず、Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）のゲノムＤＮＡを５種類の制限酵素（ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕII、ＳｃａＩ、ＳｔｕＩ）で切断し、各制限酵素で切断したゲノムＤＮＡに対してその両端にアダプターを連結し、ＰＣＲ増幅用のゲノムテンペレートとする。次にＥＳＴ情報から得られる遺伝子のアンチセンス配列から設計したプライマーと、アダプターから設計したプライマーを用いて、先に作成したゲノムテンプレートライブラリーに対してＰＣＲ反応を行う。反応条件のー例は次のとおりである。
【００２３】
ＰＣＲ条件
・９５℃（１分）、１サイクル
・９４℃（５秒）、７２℃（３分）、７サイクル
・９４℃（５秒）、６７℃（３分）、７０℃（３分）、３２サイクル
・６７℃（７分）、１サイクル
【００２４】
５種類のテンペレートそれぞれについてＰＣＲ反応後、１〜３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたものについて、電気泳動装置を用いて単離した。これらの断片の塩基配列を決定し、ブラストサーチを用いた相同性検索の結果から推定された開始コドンの上流をプロモーター部分とした。
【００２５】
【実施例３】
（有用遺伝子のプロモーター活性の測定方法）
まず目的とするプロモーター断片を、プロモーター活性測定用プラスミドに挿入する。Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒで単離したプロモーターＤＮＡ断片の両端に、脱リン酸化を施したＳａｌＩのリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼによりライゲーションする。得られた産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端をリン酸化後、未反応のＳａｌＩリンカーをアガロースゲル電気泳動により除去した。得られたプロモーターＳａｌＩ断片をプロモーター活性測定用に開発したプラスミドｐＮＧＵＳ（図３６）のＧＵＳ遺伝子上流ＳａｌＩサイトへＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入した。挿入プロモーターの方向がＧＵＳ遺伝子のコーディング領域と正の方向にサブクローニングされたものを選択した。このプロモーター解析プラスミドｐＮＧＵＳを含む大腸菌（Escherichia cori）ＩＮ113株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１８２５４として寄託されている。プロモーター部分を挿入したプラスミドを麹菌に挿入することにより、挿入したプロモーターの支配下でレポーター遺伝子であるＧＵＳ遺伝子が発現し、プロモーターの発現能をＧＵＳ活性で測定することができる。それぞれのプラスミドでＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株（Aspergillus oryzae 1013-niaD:FERM P-17707）を形質転換し、プラスミドが宿主のゲノムのｎｉａＤ ｌｏｃｕｓに１コピーのみ導入された形質転換体を選択する。この形質転換体を様々な培養条件で培養し、ＧＵＳ生産能を測定し、それぞれのプロモーター発現能とした。このように、プロモーター解析用プラスミドｐＮＧＵＳを利用することによって、目的とするプロモーターを選択、取得することが可能となり、本発明を容易に実施することができる。
【００２６】
【実施例４】
（単離遺伝子のプロモーターの液体培養、固体培養における発現能の検討）
表１に示すように、得られたプロモーター解析株を用いて富栄養（デキストリン−ペプトン−酵母エキス培地：ＤＰＹ培地）と貧栄養（ツアペック・ドックス培地：Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地）の液体培養及び米麹固体培養を行った。単離した３５個の遺伝子のプロモーターの支配下でＧＵＳ蛋白質が生産され、これらのプロモーターの有効性が示された。
【００２７】
【００２８】
【発明の効果】
本発明によって３５種類のプロモーターが新たに開発された。これら麹菌に含まれるプロモーター又はこれらプロモーター由来のＤＮＡを利用することにより、これらのプロモーターが直接関連する同種の遺伝子はもとより他の遺伝子のきわめて効率的な発現システムが構築された。
【００２９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】クルシフォーム結合蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（７１１塩基）を示す。
【図２】ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（６７１塩基）を示す。
【図３】ユビキチンコンジュゲーティング酵素遺伝子プロモーターの塩基配列（８０３塩基）を示す。
【図４】ＡＴＰ依存性トランスポーター遺伝子プロモーターの塩基配列（６１５塩基）を示す。
【図５】Ｈ＋トランスポーティングＡＴＰシンターゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（１０６２塩基）を示す。
【図６】ユビキチン遺伝子プロモーターの塩基配列（７６６塩基）を示す。
【図７】Ｒａｂ５様ＧＴＰａｓｅ遺伝子プロモーターの塩基配列（８７０塩基）を示す。
【図８】リボソーム蛋白質Ｌ３７遺伝子プロモーターの塩基配列（７１４塩基）を示す。
【図９】リボソーム蛋白質Ｓ１６遺伝子プロモーターの塩基配列（８１０塩基）を示す。
【図１０】ホスファチジルシンテターゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（１１８１塩基）を示す
【図１１】ｍＲＮＡ除去因子Ｉの２５ｋＤａサブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列（７２１塩基）を示す
【図１２】ヒストンＨ３サブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列（７５１塩基）を示す。
【図１３】２６Ｓプロテアソームｐ４４．５蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（７１６塩基）を示す。
【図１４】酵母由来飢餓生存蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（７８８塩基）を示す。
【図１５】推定膜蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（８５３塩基）を示す。
【図１６】脂質トランスポート蛋白質ＰＯＸ１８遺伝子プロモーターの塩基配列（６６０塩基）を示す。
【図１７】ペルオキシソーム膜蛋白質ｐｅｒ１０遺伝子プロモーターの塩基配列（６８１塩基）を示す。
【図１８】液胞Ｈ＋ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列（８６８塩基）を示す。
【図１９】ＤＮＡ結合Ｐ５２／Ｐ１００複合体１００ｋＤａサブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列（５９６塩基）を示す。
【図２０】アデノシンキナーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（７０６塩基）を示す。
【図２１】複製因子Ａ蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（６９４塩基）を示す。
【図２２】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ様プロテインキナーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（１００２塩基）を示す。
【図２３】カルシウム結合蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（５７６塩基）を示す。
【図２４】マンノース結合蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（８０５塩基）を示す。
【図２５】ソルビトールユーティリゼーション蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（７８０塩基）を示す。
【図２６】チオレドキシン遺伝子プロモーターの塩基配列（７１４塩基）を示す。
【図２７】チトクロームＣ遺伝子プロモーターの塩基配列（７９０塩基）を示す。
【図２８】マンノースレクチン遺伝子プロモーターの塩基配列（３６１塩基）を示す。
【図２９】マンガンスーパーオキシドディスムターゼ２遺伝子プロモーターの塩基配列（１２３９塩基）を示す。
【図３０】ｓａｒ１遺伝子プロモーターの塩基配列（７４９塩基）を示す。
【図３１】ｄ１２−デサチュラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（５１５塩基）を示す。
【図３２】ｄ９−デサチュラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（８８塩基）を示す。
【図３３】ｄ６−デサチュラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（１６２塩基）を示す。
【図３４】アルコールアシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（７２８塩基）を示す
【図３５】ｃｃｇ−９遺伝子プロモーターの塩基配列（９３９塩基）を示す。
【図３６】プラスミドｐＮＧＵＳの制限酵素地図を示す。
【発明の属する技術的分野】
本発明は、アスペルギルス（Aspergillus）属糸状菌の新規プロモーターに関する。更に詳細には、本発明はアスペルギルス・オリゼ由来の新規プロモーター配列をクローニングし、アスペルギルス属糸状菌を宿主として有用蛋白質およびペプチドを発現させるために必要なＤＮＡ断片を有するプラスミドと、それを用いた有用蛋白質およびペプチドの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子組換え技術の発展とともに、ヒトの有用蛋白質が大腸菌や酵母を用いて生産することが可能となってきた。しかし大腸薗を宿主としてヒトなどの真核生物由来の遺伝子を発現させた場合、正常なプロセッシングが行われない、糖鎖が付着しないなどの問題点が指摘されている。また酵母によって異種タンパクの分泌生産を行う場合は、糖鎖結合はされるものの、その分泌量が非常に少ないという欠点を有する。そこで高いタンパク分泌能を持つ糸状菌が、真核生物のタンパク発現の宿主として注目されてきた。なかでも黄麹菌Aspergillus oryzaeは、清酒や味噌など醸造産業上で長く使用された実績から、異種遺伝子発現への応用に積極的に利用されている。既にＭｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉの酸性プロテアーゼなどがＡ．ｏｒｙｚａｅを宿主として、工業生産されている。
【０００３】
このような麹菌による異種タンパク生産には、αアミラーゼやグルコアミラーゼなどのアミラーゼ遺伝子のプロモーターが用いられることが多い。しかしながら、異種タンパクの生産性を向上させるためにはより強力な発現能を有するとともに、様々な遺伝子産物の発現に対応した複数のプロモーターの探索が不可欠である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
麹菌の異種タンパク生産を行うプロモーターとしては、主に麹菌の分泌酵素など生産量が多いタンパクの遺伝子にターゲットが当てられている。これは麹菌は菌体外に大量のタンパクを分泌するため、このようなタンパクの遺伝子プロモーターは発現能も高いと考える発想である。しかし麹菌の全タンパクの発現を見た場合、必ずしも菌体外タンパクの遺伝子が高発現しているわけではなく、菌体内のタンパクの遺伝子であっても高い発現能を有するものも存在すると考えられる。
【０００５】
本発明者らは、我が国独自の培養法であって、清酒、味噌、醤油、みりん等の発酵産業で利用される蒸し米を用いた麹菌の固体培養ではその生産される蛋白質の種類が多く、未だにクローニングされていない遺伝子が多数存在するとの着想を得た。よって、従来の技術常識にとらわれることなく、固体培養で発現する遺伝子群からのプロモーターを検索することが望ましいとの新しい発想に本発明者らはたった。
【０００６】
さらに、異種遺伝子発現の場合、発現させる蛋白質によって相性の良いプロモーターの選択が重要である。誘導条件、発現時期、培養方法など、目的遺伝子産物に最も適したプロモーターを選択することが望ましい。これらの点に鑑み、本発明者らは、効率的な異種蛋白質発現のためには、様々な発現特性を持つ複数のプロモーターを準備していくことが必要であるとの観点にたった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、麹菌の高発現プロモーターを探索し、様々な異種遺伝子の発現に対応できる複数のプロモーターを単離し、取得プロモーターを利用した麹菌の遺伝子発現系を用いて異種蛋白質を製造する方法を提供することを目的としてなされたものである。
本発明は以下の様にして上記目的を達成することができた。
【０００８】
麹菌をはじめとする糸状菌の遺伝子解析は、主に液体培養を行った菌体を用いて解析を行うため、液体培養で発現する遺伝子については既に多くの報告例がある。一方、清酒、味噌、醤油、みりんなどの発酵産業で行われている固体培養については、その遺伝子発現機構についてはほとんど解明されていない。すなわち、固体培養で発現する遺伝子の解析例は少なく、この中には未だクローニングされていない未知遺伝子が多数含まれていることが予想される。そしてこれらの未知遺伝子のプロモーターの中に、固体培養で強力に発現するなど固体培養での物質生産に適したプロモーターが含まれていることが期待できる。そこで、プロモーターの探索源として固体培養で発現する遺伝子群を用いることにした。固体培養から得られたｃＤＮＡライブラリーから、未発表の遺伝子に関するｃＤＮＡを抽出し、そのプロモーター領域の単離を行った。
【０００９】
プロモーター領域の取得方法の一例として、麹菌のゲノムＤＮＡをテンペレートにしたＰＣＲ法を挙げる。麹菌からゲノムＤＮＡを抽出してＥｃｏＲＶ、ＳｃａＩ、ＤｒａＩ、ＰｖｕIIあるいはＳｓｐＩ等の６ｂｐを認識して平滑末端に切断するそれぞれの制限酵素で完全消化し、そのゲノムＤＮＡ断片の両端に適当なアダプターを連結する。この両端にアダプターが連結されたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として、ｃＤＮＡの塩基配列から合成したプライマーおよびアダプターの一本鎖部分の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行う。増幅産物を電気泳動で確認して１〜２ｋｂ程度の長さを有するＤＮＡ断片を電気泳動によって単離・精製する。この断片の塩基配列を決定し、ホモロジー検索から推定される開始コドンより上流をプロモーター配列とする。
【００１０】
また、本発明に係るプロモーターは、いずれも、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）Ｏ−１０１３（独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８として寄託）にふくまれているので、ゲノムＤＮＡから直接切り出すことによって容易に入手することができる。その場合、当該プロモーターを含む遺伝子配列を分離し、その配列において、開始コドンより上流をプロモーター配列とし、そのプロモーター活性を上記するプロモーター解析システムで確認してもよい。
【００１１】
さらに得られたプロモーター断片を、既に作成しているプロモーター活性測定用プラスミドｐＮＧＵＳ（図３６）のＧＵＳ遺伝子上流に転写方向が合うように挿入する。このプラスミドをＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株に導入し、導入プラスミドが宿主の染色体上のｎｉａＤ ｌｏｃｕｓに１コピーだけ相同組換えを起こした株を選択する。この遺伝子導入株を種々の条件で培養し、菌体内のＧＵＳ活性を測定することにより、プロモーター発現能とした。
【００１２】
プロモーター解析用プラスミドｐＮＧＵＳは、本発明者らが開発するのに成功したものであって、このプラスミドは、形質転換用マーカーであるＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ遺伝子（E.S. Unkleら、Mol. Gen. Genet., 218, p.99-104, 1989）と、レポーター遺伝子である大腸菌のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするｕｉｄＡ遺伝子（R. A. Jeffersonら、Proc. Natl. Acad. Sci., P.8447-8451,1986）を含むものである。
【００１３】
このプラスミドを用いてプロモーター活性を測定して有用プロモーターをスクリーニングするには、このプラスミドのｕｉｄＡ遺伝子の上流域（例えばＳａｌＩ、ＰｓｔＩサイト）に、検討しようとする種々の遺伝子プロモーター（又はプロモーターと予測される配列）あるいはその一部分、ＤＮＡ断片をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）のｎｉａＤ変異株（アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）１０１３−ｎｉａＤ：本菌株は、硝酸資化能欠損株、Ｎｉｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ欠損株であって、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−１７７０７として寄託されている。）に導入し、導入プラスミドが宿主染色体のｎｉａＤ ｌｏｃｕｓに１コピーだけ導入された形質転換体を選択する。そしてこれらの形質転換体のＧＵＳ活性を測定することにより、プロモーター活性の指標とし、プロモーターを効率的にスクリーニングするものである。
【００１４】
本発明者らは、上記スクリーニング方法で、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）のゲノムＤＮＡについて種々検討した結果、以下に挙げる遺伝子のプロモーターが液体培養及び固体培養で強力に発現していることをはじめて確認し、これら新規プロモーターを開発するのに成功したものである。
【００１５】
クルシフォーム結合蛋白賀（cruciform binding protein）遺伝子、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase）遺伝子、ユビキチンコンジュゲーティング酵素（ubiquitin conjugating enzyme）遺伝子、ＡＴＰ依存性トランスポーター（ATP-dependent transpoter）遺伝子、Ｈ＋トランスポーティングＡＴＰシンターゼ（H+ transporting ATP synthase）遺伝子、ユビキチン（ubiquitin）遺伝子、Ｒａｂ５様ＧＴＰａｓｅ（Rab5-like GTPase）遺伝子、リボソーム蛋白質Ｌ３７（ribosomal protein L37）遺伝子、リボソーム蛋白質Ｓ１６（ribosomal protein S16）遺伝子、ホスファチジルシンテターゼ（phosphatidyl synthetase）遺伝子、ｍＲＮＡ除去因子Ｉの２５ｋＤａサブユニット（mRNA cleavage factor Ｉ25-kDa subunit）遺伝子、ヒストンＨ３サブユニット（histone H3 subunit）遺伝子、２６Ｓプロテアソームｐ４４．５蛋白質（26S proteasome p44.5 protein）遺伝子、酵母由来飢餓生存蛋白質（yeast reduced viability upon starvation protein）遺伝子、推定膜蛋白質（putative integral protein）遺伝子、脂質トランスポート蛋白質ＰＯＸ１８（lipid transporting protein POX18）遺伝子、ペルオキシソーム膜蛋白質ｐｅｒ１０（peroxisomal membrane protein per10）遺伝子、液胞Ｈ＋ＡＴＰａｓｅサブユニット（H+ATPase subunit vacuolar)遺伝子、ＤＮＡ結合Ｐ５２／Ｐ１００複合体１００ｋＤａサブユニット（DNA binding P52/P100 complex 100kDa subunit)遺伝子、アデノシンキナーゼ（adenosine kinase）遺伝子、複製因子Ａ蛋白質（replication factor-A protein)遺伝子、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ様プロテインキナーゼ（T. reesei-like protein kinase)遺伝子、カルシウム結合蛋白質（calcium binding protein)遺伝子、マンノース結合蛋白質（mannose-binding protein)遺伝子、ソルビトールユーティリゼーション蛋白質（sorbitol utilization protein)遺伝子、チオレドキシン（thioredoxin）遺伝子、チトクロームＣ（cytochrome C)遺伝子、マンノースレクチン（mannose-binding lectin)遺伝子、マンガンスーパーオキシドディスムターゼ２（alternative MnSOD)遺伝子、ｓａｒ１（sar1）遺伝子、ｄ１２−デサチュラーゼ（d12-desaturase）遺伝子、ｄ９−デサチュラーゼ（d9-desaturase）遺伝子、ｄ６−デサチュラーゼ（d6-desaturase）遺伝子、アルコールアシルトランスフェラーゼ（AACTase）遺伝子、ｃｃｇ−９（ccg-9）遺伝子。
【００１６】
これらのプロモーターについては、いずれもその塩基配列の決定にも成功し、それらを配列表の配列番号１〜３５（図１〜図３５）にそれぞれ示した。なお、上記した各遺伝子のプロモーターの記載順序と配列番号（図番号）は対応している。
【００１７】
本発明のプロモーターは上述のようにして決定された塩基配列に対してストリンジェントな条件、例えば、０．１％ＳＤＳ、１×ＳＳＣ（６０℃、０．３ｍｏｌ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ソーダ）でハイブリダイズする塩基配列をも包含する。
【００１８】
本発明のプロモーターは、その下流に、所望の有用蛋白質遺伝子を連結してベクターを構築し、該ベクターで宿主を形質転換し、それを培養することにより、有用蛋白質を著量生産させることができる。宿主としては、アスペルギルス・オリゼをはじめ、その他のアスペルギルス属、リゾプス属、ノイロスポラ属、ペニシリウム属、トリコデルマ属などの微生物が使用できる。特に、発現効率の点から、宿主として、アスペルギルス・オリゼを用いることが好ましい。
【００１９】
得られたプロモーターへの有用蛋白質遺伝子の連結、ベクターへの挿入は、それ自体公知の方法で行うことができる。有用蛋白質遺伝子としては、特に限定するものではない。また、ベクターとしては、アルギニン要求性などの栄養要求性相補遺伝子、アセトアミド資化などの炭素、窒素源資化遺伝子、オリゴマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。宿主の形質転換も自体公知の方法で行うことができる。また、該形質転換体の培養も常法に従って、所望の蛋白質に適した培地、培養条件を適宜選択することにより行うことができ、得られた蛋白質の採取、精製も公知の方法で行うことができる。
【００２０】
以下、実施例を参照しながら本発明を詳細に説明するが、実施例に使用したプラスミドなどは一例として挙げたものであり、本発明に使用できるものであればこれらに限定されるものではない。
【００２１】
【実施例１】
（麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）の米麹固体培養ｃＤＮＡライブラリーの構築）
麹菌Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３株を７０％精米した蒸し米上にて４０時間米麹固体培養を行った。その培養菌体より常法であるＡＧＰＣ法（Chomczynski, P.et al., An al. Biochem. 162, 156〜159(1987))により全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡからｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０＜ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（寶酒造）を用いて、ｍＲＮＡを精製した。得られた１μｇのｍＲＮＡを用いて、ＳＭＡＲＴｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（クロンテック社）を用いてλＴｒｉｐｌＥｘ２ファージｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【００２２】
【実施例２】
（有用遺伝子のプロモーター断片の単離方法）
クロンテック社製Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒを用いて、プロモーター断片取得用のテンペレートＤＮＡライブラリーを構築した。まず、Ａ．ｏｒｙｚａｅ Ｏ−１０１３（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）のゲノムＤＮＡを５種類の制限酵素（ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕII、ＳｃａＩ、ＳｔｕＩ）で切断し、各制限酵素で切断したゲノムＤＮＡに対してその両端にアダプターを連結し、ＰＣＲ増幅用のゲノムテンペレートとする。次にＥＳＴ情報から得られる遺伝子のアンチセンス配列から設計したプライマーと、アダプターから設計したプライマーを用いて、先に作成したゲノムテンプレートライブラリーに対してＰＣＲ反応を行う。反応条件のー例は次のとおりである。
【００２３】
ＰＣＲ条件
・９５℃（１分）、１サイクル
・９４℃（５秒）、７２℃（３分）、７サイクル
・９４℃（５秒）、６７℃（３分）、７０℃（３分）、３２サイクル
・６７℃（７分）、１サイクル
【００２４】
５種類のテンペレートそれぞれについてＰＣＲ反応後、１〜３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されたものについて、電気泳動装置を用いて単離した。これらの断片の塩基配列を決定し、ブラストサーチを用いた相同性検索の結果から推定された開始コドンの上流をプロモーター部分とした。
【００２５】
【実施例３】
（有用遺伝子のプロモーター活性の測定方法）
まず目的とするプロモーター断片を、プロモーター活性測定用プラスミドに挿入する。Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒで単離したプロモーターＤＮＡ断片の両端に、脱リン酸化を施したＳａｌＩのリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼによりライゲーションする。得られた産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端をリン酸化後、未反応のＳａｌＩリンカーをアガロースゲル電気泳動により除去した。得られたプロモーターＳａｌＩ断片をプロモーター活性測定用に開発したプラスミドｐＮＧＵＳ（図３６）のＧＵＳ遺伝子上流ＳａｌＩサイトへＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入した。挿入プロモーターの方向がＧＵＳ遺伝子のコーディング領域と正の方向にサブクローニングされたものを選択した。このプロモーター解析プラスミドｐＮＧＵＳを含む大腸菌（Escherichia cori）ＩＮ113株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ Ｐ−１８２５４として寄託されている。プロモーター部分を挿入したプラスミドを麹菌に挿入することにより、挿入したプロモーターの支配下でレポーター遺伝子であるＧＵＳ遺伝子が発現し、プロモーターの発現能をＧＵＳ活性で測定することができる。それぞれのプラスミドでＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株（Aspergillus oryzae 1013-niaD:FERM P-17707）を形質転換し、プラスミドが宿主のゲノムのｎｉａＤ ｌｏｃｕｓに１コピーのみ導入された形質転換体を選択する。この形質転換体を様々な培養条件で培養し、ＧＵＳ生産能を測定し、それぞれのプロモーター発現能とした。このように、プロモーター解析用プラスミドｐＮＧＵＳを利用することによって、目的とするプロモーターを選択、取得することが可能となり、本発明を容易に実施することができる。
【００２６】
【実施例４】
（単離遺伝子のプロモーターの液体培養、固体培養における発現能の検討）
表１に示すように、得られたプロモーター解析株を用いて富栄養（デキストリン−ペプトン−酵母エキス培地：ＤＰＹ培地）と貧栄養（ツアペック・ドックス培地：Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ培地）の液体培養及び米麹固体培養を行った。単離した３５個の遺伝子のプロモーターの支配下でＧＵＳ蛋白質が生産され、これらのプロモーターの有効性が示された。
【００２７】
【発明の効果】
本発明によって３５種類のプロモーターが新たに開発された。これら麹菌に含まれるプロモーター又はこれらプロモーター由来のＤＮＡを利用することにより、これらのプロモーターが直接関連する同種の遺伝子はもとより他の遺伝子のきわめて効率的な発現システムが構築された。
【００２９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】クルシフォーム結合蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（７１１塩基）を示す。
【図２】ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（６７１塩基）を示す。
【図３】ユビキチンコンジュゲーティング酵素遺伝子プロモーターの塩基配列（８０３塩基）を示す。
【図４】ＡＴＰ依存性トランスポーター遺伝子プロモーターの塩基配列（６１５塩基）を示す。
【図５】Ｈ＋トランスポーティングＡＴＰシンターゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（１０６２塩基）を示す。
【図６】ユビキチン遺伝子プロモーターの塩基配列（７６６塩基）を示す。
【図７】Ｒａｂ５様ＧＴＰａｓｅ遺伝子プロモーターの塩基配列（８７０塩基）を示す。
【図８】リボソーム蛋白質Ｌ３７遺伝子プロモーターの塩基配列（７１４塩基）を示す。
【図９】リボソーム蛋白質Ｓ１６遺伝子プロモーターの塩基配列（８１０塩基）を示す。
【図１０】ホスファチジルシンテターゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（１１８１塩基）を示す
【図１１】ｍＲＮＡ除去因子Ｉの２５ｋＤａサブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列（７２１塩基）を示す
【図１２】ヒストンＨ３サブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列（７５１塩基）を示す。
【図１３】２６Ｓプロテアソームｐ４４．５蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（７１６塩基）を示す。
【図１４】酵母由来飢餓生存蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（７８８塩基）を示す。
【図１５】推定膜蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（８５３塩基）を示す。
【図１６】脂質トランスポート蛋白質ＰＯＸ１８遺伝子プロモーターの塩基配列（６６０塩基）を示す。
【図１７】ペルオキシソーム膜蛋白質ｐｅｒ１０遺伝子プロモーターの塩基配列（６８１塩基）を示す。
【図１８】液胞Ｈ＋ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列（８６８塩基）を示す。
【図１９】ＤＮＡ結合Ｐ５２／Ｐ１００複合体１００ｋＤａサブユニット遺伝子プロモーターの塩基配列（５９６塩基）を示す。
【図２０】アデノシンキナーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（７０６塩基）を示す。
【図２１】複製因子Ａ蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（６９４塩基）を示す。
【図２２】Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ様プロテインキナーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（１００２塩基）を示す。
【図２３】カルシウム結合蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（５７６塩基）を示す。
【図２４】マンノース結合蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（８０５塩基）を示す。
【図２５】ソルビトールユーティリゼーション蛋白質遺伝子プロモーターの塩基配列（７８０塩基）を示す。
【図２６】チオレドキシン遺伝子プロモーターの塩基配列（７１４塩基）を示す。
【図２７】チトクロームＣ遺伝子プロモーターの塩基配列（７９０塩基）を示す。
【図２８】マンノースレクチン遺伝子プロモーターの塩基配列（３６１塩基）を示す。
【図２９】マンガンスーパーオキシドディスムターゼ２遺伝子プロモーターの塩基配列（１２３９塩基）を示す。
【図３０】ｓａｒ１遺伝子プロモーターの塩基配列（７４９塩基）を示す。
【図３１】ｄ１２−デサチュラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（５１５塩基）を示す。
【図３２】ｄ９−デサチュラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（８８塩基）を示す。
【図３３】ｄ６−デサチュラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（１６２塩基）を示す。
【図３４】アルコールアシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列（７２８塩基）を示す
【図３５】ｃｃｇ−９遺伝子プロモーターの塩基配列（９３９塩基）を示す。
【図３６】プラスミドｐＮＧＵＳの制限酵素地図を示す。
Claims (5)
- 配列表の配列番号１又は２に示す塩基配列からなる、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）で用いる高発現プロモーターＤＮＡ。
- 請求項１記載のＤＮＡと有用蛋白質遺伝子のコーディング領域を連結してなる、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）で用いる有用蛋白質高発現ＤＮＡ。
- 請求項２に記載のＤＮＡを挿入してなる組換えプラスミド。
- 請求項３に記載のプラスミドを導入してなるアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の形質転換体。
- 請求項４に記載の形質転換体を液体培養又は固体培養し、該培養物から有用蛋白質を採取、精製することを特徴とするアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）を用いた有用蛋白質の製造方法。
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