JP2003144171A - アスペルギルス属由来の新規プロモーター - Google Patents

アスペルギルス属由来の新規プロモーター

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JP2003144171A
JP2003144171A JP2001351368A JP2001351368A JP2003144171A JP 2003144171 A JP2003144171 A JP 2003144171A JP 2001351368 A JP2001351368 A JP 2001351368A JP 2001351368 A JP2001351368 A JP 2001351368A JP 2003144171 A JP2003144171 A JP 2003144171A
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JP2001351368A
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Akimitsu Tanaka
昭光 田中
Masayuki Machida
雅之 町田
Motoaki Sano
元昭 佐野
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Higeta Shoyu Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
Higeta Shoyu Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子組換えによるタンパク質生産系に利用
可能である新規プロモーターの提供を課題とする。 【解決手段】 アスペルギルス・オリゼのEST解析か
ら、約16,000のESTは、約5,000の遺伝子から構成されて
いることが示唆された。それぞれの遺伝子について培養
条件別のESTの解析を行い、グルコース存在下あるいは
非存在下によって目的タンパク質をコードする遺伝子の
転写を活性化することが可能な新規プロモーター、また
はグルコースの存在非存在に依存せず恒常的に遺伝子の
転写を活性化する新規なプロモーターを取得することに
成功した。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、アスペルギルス属
糸状菌由来の新規プロモーター、およびその利用に関す
る。
【0002】
【従来の技術】麹菌アスペルギルス・オリゼ(Aspergill
us oryzae)を始めとするアスペルギルス属糸状菌は、古
くより清酒、味噌、醤油などの醸造産業において広く利
用されてきた微生物である。アスペルギルス属糸状菌
は、古くから醸造産業に使用されてきたことにより菌株
の安全性が広く認知されており、遺伝子組換えによるタ
ンパク質生産の宿主としての利用を考えた場合には、好
適に使用することが可能である。また、培養法、生成タ
ンパク質の分離精製法等の発酵技術に関しても多くの技
術的な蓄積がある。更に、各種加水分解酵素をはじめ多
くの有用酵素を菌体外に多量に分泌すること、真核生物
であるため大腸菌などの原核生物には無いタンパク質の
糖鎖付加機構を持っているなどの利点を有している。こ
れらの理由により、アスペルギルス属を始めとする糸状
菌を、遺伝子組換えによるタンパク質の高生産用宿主と
して利用することが期待されていた。
【0003】一方、遺伝子組換えによるタンパク質生産
において、目的とするタンパク質の生産量は、プロモー
ター、ターミネーターなどの転写に関わる因子、アミノ
酸コドンの種類など翻訳に関わる因子、タンパク質への
糖鎖付加、発現したタンパク質の細胞内での存在様式
(分泌過程における移動も含む)などの翻訳後に関わる
因子、遺伝子のコピー数、宿主由来のプロテアーゼなど
発現タンパク質の安定性に関わる因子など多くの因子に
より影響を受ける。これらのうちもっとも重要であり制
御しやすい因子は、プロモーターの選択である。そのた
め、これまでにも、糸状菌を宿主とした遺伝子組換えに
よる、様々な条件下での様々なタンパク質の効率的な生
産を実現するために、数々の糸状菌由来のプロモーター
が探索され公表されてきた。
【0004】これまでに公表された糸状菌由来のプロモ
ーターとしては、アスペルギルス・ニガー由来のグルコ
アミラーゼ遺伝子のプロモーター(Biotechnology, 198
7, 5, 368)、トリコデルマ・リーセイ由来のセロビオ
ハイドロラーゼI遺伝子のプロモーター(Biotechnolog
y, 1989, 7, 596)、アスペルギルス・オリゼ由来のα-
アミラーゼ遺伝子のプロモーター(Biotechnology, 198
8, 6, 1419)(特許3005618号)、アスペルギルス・ニ
ドランス由来のアルコールデヒドロゲナーゼI遺伝子の
プロモーター(Biotechnology, 1987, 5, 713)、アス
ペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガーのグリセ
ルアルデヒド-3-ホスフェイト デヒドロゲナーゼ(GAP-
DH)のプロモーター(特開平3-187392)などがある。特
にアスペルギルス・オリゼ由来のプロモーターに限れ
ば、これまでに公表されているプロモーターは上記のも
のの他に、特開平7-115976、特開平10-313864、特開平1
1-276170、特開平2001-224381記載のプロモーターなど
を挙げることができる。
【0005】これまでにも、上記の特許出願などにおい
て糸状菌における強力なプロモーターを利用した例は示
されているが、目的とするタンパク質の性質によって
は、使用するプロモーターを使い分けることが必要とな
る。また、糸状菌は固体培養によって多くのタンパク質
を多量に生産することが知られており、固体培養で強力
に作用するプロモーターを使用したタンパク質生産系も
検討されている。しかし、固体培養は培養条件を検討す
る際、多くの労力を必要とするため、液体培養で作用す
るプロモーターの開発も求められていた。
【0006】アスペルギルス・オリゼ由来のプロモータ
ーとして最も有名なものの1つにα−アミラーゼのプロ
モーターがある。このプロモーターは液体培養において
も強い転写活性化能を示し、遺伝子組換えによるタンパ
ク質生産系としての有用性が認められている(特許3005
618号)。しかし、培地中にデンプンやマルトース等の
プロモーター機能を誘導するための誘導物質を加える必
要があった。さらに加えた誘導物質の酵素による分解に
よりグルコースが生成するため、グルコースリプレッシ
ョンによりプロモーターの転写が抑制され、培養後期に
目的タンパク質の生産性が低下するといった問題があっ
た。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、遺伝子
組換えによるタンパク質生産系に利用可能な新規プロモ
ーターを提供することにある。より詳細には、グルコー
スのような単糖によって発現制御可能である、あるいは
グルコース量の影響を受けず恒常的に発現が可能である
アスペルギルス属糸状菌由来のプロモーター、該プロモ
ーターを含むベクター、該ベクターを含む形質転換体、
該プロモーターを用いた組換え遺伝子の発現方法、およ
び該プロモーターを用いた組換えタンパク質の製造方法
を提供することを目的とする。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を行った。まず、アスペル
ギルス・オリゼのEST解析結果を基にコンピューターを
用いたクラスタリングを行った。その結果、約16000のE
STは、約5000のコンティグ(遺伝子)に分類されること
が判明した。すなわち、この結果から約16,000のEST
は、約5,000の遺伝子から構成されていることが示唆さ
れた。さらにコンピューターによる解析を進め、それぞ
れの遺伝子について培養条件別のEST数を解析した(以
後、この解析データを発現頻度情報とする)。その結
果、液体培養においてグルコース存在下で転写発現の促
進される遺伝子のグループと、グルコース非存在下で転
写発現の促進される遺伝子のグループ、およびグルコー
スの存在非存在でほとんど影響が無く恒常的に転写発現
される遺伝子のグループを抽出した。それぞれの遺伝子
のプロモーター領域は、EST配列データを用いて作製し
たプライマーを使用したPCRによって単離した。
【0009】本発明者らは上記の如く、アスペルギルス
・オリゼよりグルコース存在非存在に関わらず恒常的に
目的タンパク質遺伝子の転写が可能なプロモーター、お
よび、グルコース存在下あるいは非存在下によって目的
タンパク質遺伝子の転写を活性化することが可能な新規
プロモーターを得ることに成功した。さらに、それらプ
ロモーターの下流にレポーターとなる遺伝子を連結し、
生産されたレポーターの活性値を指標とすることにより
上記の新規プロモーターのプロモーター活性を実証し、
本発明を完成させた。
【0010】このようなグルコース存在あるいは非存在
によって目的タンパク質遺伝子の発現制御を可能なプロ
モーターは、目的タンパク質の生産時期を制御する際に
有用である。また、グルコース量の影響を受けず恒常的
に目的タンパク質遺伝子の発現可能なプロモーターは、
培養全期にわたり目的タンパク質の生産を可能にするた
め大量生産に適していると考えられる。該プロモーター
の利用によって、アスペルギルス属を始めとする糸状菌
を、遺伝子組換えによるタンパク質の実用的な高生産用
宿主として使用することが可能になるものと大いに期待
される。
【0011】即ち、本発明は、遺伝子組換えによるタン
パク質生産系に利用可能な新規プロモーターに関し、よ
り具体的には、〔1〕 以下の(a)〜(c)のいずれ
かに記載のプロモーター活性を有するDNA、(a)配
列番号:76〜149のいずれかに記載の塩基配列から
なるDNA、(b)配列番号:76〜149のいずれか
に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズするDNA、(c)配列番号:
76〜149のいずれかに記載の塩基配列において、1
または複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または
挿入された塩基配列からなるDNA、〔2〕 〔1〕に
記載のDNAの部分DNAであって、プロモーター活性
を有するDNA、〔3〕 アスペルギルス属糸状菌由来
である〔1〕または〔2〕に記載のDNA、〔4〕
〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNAを含むベクタ
ー、〔5〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDN
A、または〔4〕に記載のベクターを保持する形質転換
体、〔6〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のDNA
の下流に遺伝子が機能的に結合したDNAを用いること
を特徴とする、遺伝子の発現方法、〔7〕 〔6〕に記
載の方法を用いたタンパク質の製造方法、を提供するも
のである。
【0012】
【発明の実施の形態】本発明者らは、プロモーター活性
を有する新規なDNAを見出した。本発明は、まず、プロ
モーター活性を有する新規なDNAを提供する。
【0013】本発明の上記DNAとしては、具体的には、
配列番号:76〜149のいずれかに記載された配列か
らなるプロモーター活性を有するDNAを挙げることがで
きる。該DNAは本発明者らにより、アスペルギルス・オ
リゼ由来のプロモーター活性を有するDNAとして新規に
見出されたものである。該DNAは、次の3つのグループ
に分類される。 (1)グルコース非存在下で発現の促進されるプロモー
ターDNAグループ(各DNAの塩基配列を配列番号:76〜
109に記載) (2)グルコース存在・非存在下で発現の促進されるプ
ロモーターDNAグループ(各DNAの塩基配列を配列番号:
110〜133に記載) (3)グルコース存在下で発現の促進されるプロモータ
ーDNAグループ(各DNAの塩基配列を配列番号:134〜
149に記載)
【0014】本発明の上記DNAは、プロモーター活性を
有するDNAの取得(単離)に利用することも可能であ
る。このDNAの単離においてはまず、本発明のDNAもしく
はその一部をプローブとして、または、本発明のDNAに
特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして、所望の生物から上記DNAと高い相同性を
有するDNAを単離することができる。一般的なハイブリ
ダイゼーション技術(Southern, EM., J Mol Biol, 197
5, 98, 503.)、またはPCR技術(Saiki, RK. et al., S
cience, 1985, 230, 1350.、Saiki, RK. et al., Scien
ce, 1988, 239, 487.)によって単離可能な、配列番
号:76〜149のいずれかに記載の塩基配列からなる
DNAとハイブリダイズするDNAもまた、本発明のDNAに含
まれる。すなわち、配列番号:76〜149のいずれか
に記載の塩基配列からなるDNA、もしくはその一部をプ
ローブとして、また配列番号:76〜149のいずれか
に記載の塩基配列からなるDNAに特異的にハイブリダイ
ズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、所望の
生物から配列番号:76〜149のいずれかに記載の塩
基配列からなるDNAと高い相同性を有するDNAを単離する
ことは、当業者にとって通常行い得ることである。この
ようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。
本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件としては、6M 尿素、0.4% SDS、0.5×SSCの条
件、または0.1% SDS(60℃、0.3mol NaCl、0.03M クエ
ン酸ソーダ)のハイブリダイゼーション条件、あるいは
これらと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼー
ション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条
件、例えば、6M 尿素、0.4% SDS、0.1×SSCの条件下で
は、より相同性の高いDNAを単離できることが期待され
る。高い相同性とは、塩基配列全体で好ましくは50%以
上、さらに好ましくは70%以上、最も好ましくは90%以
上の配列の同一性を指す。
【0015】塩基配列の同一性は、カーリンおよびアル
チュールによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad.
Sei. USA, 1990, 87, 2264-2268.、Karlin, S. & Alts
chul, SF., Proc Natl Acad Sci USA, 90, 5873.)を用
いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLAST
Nと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul, S
F. et al., J Mol Biol, 1990, 215, 403.)。BLASTNを
用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例
えばscore=100、wordlength=12とする。BLASTとGappe
d BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデ
フォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具
体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.go
v/)。
【0016】本発明のDNAは、通常微生物由来であり、
好ましくはアスペルギルス属糸状菌由来、より好ましく
はアスペルギルス・オリゼ由来であるが、プロモーター
活性を有するDNAであれば、特にその由来は制限されな
い。
【0017】また、本発明は、上記のDNAと構造的に類
似しており、かつプロモーター活性を有するDNAを提供
する。このようなDNAとしては、例えば、配列番号:7
6〜149のいずれかに記載の塩基配列において、1ま
たは複数の塩基が置換、欠失、付加、および/または挿
入された塩基配列からなり、プロモーター活性を有する
DNAを挙げることができる。このようなDNAもまた、本発
明のプロモーター活性を有するDNAの単離に使用するこ
とができる。このようなDNAを調製するために当業者に
よく知られた方法としては、例えば、上記ハイブリダイ
ゼーション技術、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
技術等が挙げられる。さらに上記DNAは、例えば、配列
番号:76〜149のいずれかに記載の塩基配列からな
るDNAに対して、site-directed mutagenesis法(Krame
r, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol,1987, 154, 35
0.)により変異を導入することにより調製することもで
きる。
【0018】また、上記のようにして調製されたDNAが
プロモーター活性を有するか否かは、当業者においては
レポーター遺伝子を用いた周知のレポーターアッセイ等
により検討することが可能である。該レポーター遺伝子
としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限
されず、例えば、当業者において一般的に使用されるCA
T遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グ
ルクロニダーゼ(以下、GUS)遺伝子、およびGFP遺伝子等
を挙げることができる。また、遺伝子の発現または該遺
伝子によってコードされるタンパク質の活性を検出する
ことが可能な遺伝子をレポーターとして、該遺伝子の発
現、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の
活性を評価することにより、任意のDNAがプロモーター
活性を有するか否かを検討することも可能である。
【0019】レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポ
ーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法によ
り測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が
CAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラ
ムフェニコールのアセチル化を検出することによって、
レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができ
る。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該
遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検
出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である
場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合
物の蛍光を検出することにより、また、GUS遺伝子であ
る場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるGlucur
on(ICN社)の発光や5−ブロモ−4−クロロ−3−インド
リル−β−グルクロニド(X−Gluc)の発色を検出する
ことにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタ
ンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター
遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【0020】また、上記以外の遺伝子をレポーターとす
る場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知
の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子の
mRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノー
ザンハイブリダイゼーション法、またはRT-PCR法を実施
することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うこ
とができる。さらに、DNAアレイ技術を用いて、該遺伝
子の転写レベルを測定することも可能である。また、該
遺伝子からコードされるタンパク質を含む画分を定法に
従って回収し、本発明のタンパク質の発現をSDS-PAGE等
の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベ
ルの測定を行うこともできる。さらに、該遺伝子からコ
ードされるタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタ
ンブロッティング法を実施し、該タンパク質の発現を検
出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこ
とも可能である。該遺伝子からコードされるタンパク質
の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれ
ば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、ま
たはポリクローナル抗体の両方を利用することができ
る。該抗体は、当業者に公知の方法により調製すること
が可能である。
【0021】また本発明は、上記DNAの部分DNAであっ
て、プロモーター活性を有するDNAも提供する。
【0022】本発明のDNAには、ゲノムDNA、および化学
合成DNAが含まれる。ゲノムDNAの調製は、当業者にとっ
て常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDN
Aは、例えば、本発明のDNAを有する微生物からゲノムDN
Aを抽出し、ゲノミックライブラリー(ベクターとして
は、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PAC等が利
用できる)を作製し、本発明のDNAを基に調製したプロ
ーブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、あるい
はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調
製することが可能である。また、本発明のDNAに特異的
なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うこと
によって調製することも可能である。
【0023】また、本発明は、本発明のDNAを含むベク
ター、および、本発明のDNAまたは上記ベクターを保持
する形質転換体を提供する。本発明のベクターは、宿主
細胞(宿主菌)内において本発明のDNAを保持したり、
所望の遺伝子やタンパク質を発現させるために有用であ
る。また、本発明の形質転換体としては、例えば、所望
のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用す
ることができる。
【0024】本発明におけるベクターとしては、特に制
限されず、当業者によって一般的に公知のベクターを使
用することが可能であるが、好ましくは、選択マーカー
を有するベクターである。該選択マーカーとしては、ア
ルギニン要求性などの栄養要求性相補遺伝子、アセトア
ミド資化などの炭素、窒素源資化遺伝子、オリゴマイシ
ン耐性などの薬剤耐性遭伝子等が例示できるが、これら
に制限されない。ベクターの例としては、pSal23 (Agri
c. Biol. Chem., 1987, 51, 2549-2555)やpNU1(Biosci.
Biotech. Biochem., 1997, 61, 1367-1369)等が挙げら
れる。また、ベクターには、ポリペプチド分泌のための
シグナル配列が含まれていてもよい。
【0025】また、上記宿主菌としては、アスペルギル
ス・オリゼをはじめ、その他のアスペルギルス属、ノイ
ロスボラ属、ペニシリウム属、トリコデルマ属等の微生
物を例示することができるが、これらに特に限定されな
い。本発明においては宿主菌としては、特に発現効率の
点から、アスペルギルス・オリゼを用いることが好まし
い。本発明のベクターによる宿主菌の形質転換は、当業
者においては、一般的に周知の方法、例えば塩化カルシ
ウム法、エレクトロポレーション法等により行うことが
できる。本発明のDNAまたはベクターを導入した宿主菌
は、例えば、使用した選択マーカーの種類に従って、適
当な選択用薬剤を含む公知の選択用培地を用いて培養を
行う。これにより本発明のDNAまたはベクターを保持す
る形質転換体を取得することができる。
【0026】また、本発明は、本発明のDNAの下流に遺
伝子が機能的に結合したDNAを用いることを特徴とする
遺伝子の発現方法、および、該方法を用いたタンパク質
の製造方法を提供する。
【0027】上記方法における好ましい態様としては、
本発明のDNAの下流に、発現させたい所望の遺伝子を機
能的に結合させたベクターを構築し、該ベクターで宿主
菌を形質転換し、生成した形質転換体を培養することに
より、上記遺伝子からコードされるタンパク質およびペ
プチドを生産させることができる。
【0028】本発明において、「機能的に結合した」と
は、本発明のプロモーター活性を有するDNAに転写因子
が結合することにより、下流の遺伝子の発現が誘導され
るように、本発明のDNAと該遺伝子とが結合しているこ
とをいう。従って、該遺伝子が他の遺伝子と結合してお
り、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合
であっても、本発明のDNAに転写因子が結合することに
よって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであ
れば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【0029】本発明におけるタンパク質の製造方法とし
ては、当業者に公知の方法を適宜選択することにより行
うことができる。例えば、宿主細胞内または細胞外(培
地など)から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質
として精製することができる。タンパク質の分離、精製
は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精
製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではな
い。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、
限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈
降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気
泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタ
ンパク質を分離、精製することができる。
【0030】また、タンパク質をグルタチオン S-トラ
ンスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、
あるいはヒスチジンを複数付加させた組換えタンパク質
として宿主細胞内で発現させた場合には、発現させた組
換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケル
カラムを用いて精製することができる。融合タンパク質
の精製後、必要に応じて、融合タンパク質のうち目的の
タンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクター
Xaなどにより切断し、除去することも可能である。
【0031】上記のクロマトグラフィーとしては、例え
ばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾
過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー
等が挙げられる(Strategies for Protein Purificatio
n and Characterization: A Laboratory Course Manua
l. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフ
ィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等
の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
上記アフィニティークロマトグラフィーとしては、製造
したいタンパク質と親和性を有する抗体が結合したアフ
ィニティーカラムを例示することができる。この場合、
抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗
体であってもよい。
【0032】また、タンパク質を精製前又は精製後に適
当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意
に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもで
きる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシ
ン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロ
テインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。本
発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタ
ンパク質も包含する。
【0033】
【実施例】以下、本発明を実施例により、さらに具体的
に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるもので
はない。
【0034】[実施例1] アスペルギルス・オリゼEST
配列情報の解析 アスペルギルス・オリゼRIB40株(ATCC42149)のEST配列
情報を解析することにより、各培養条件で発現している
遺伝子の数およびその種類、または、それぞれの遺伝子
の培養条件別のEST出現頻度(すなわち 発現頻度情報)
を導き出すことが可能である。そこで本発明者らは、コ
ンピューターを用いて全てのEST配列間で総当たりの相
同検索を行い、クラスタリングを行った。その結果、約
16,000のESTは、約5,000のコンティグ(遺伝子)に分類
された。本発明者らは、さらに、それぞれの遺伝子にお
けるEST数が5以上のもので、液体培養条件において良く
発現しているものを選択した。そしてさらに、グルコー
ス存在、非存在で発現が誘導される遺伝子グループとグ
ルコース存在非存在に関係なく恒常的に発現している遺
伝子グループに分類した。その結果を表1〜3に示し
た。
【0035】
【表1】
【0036】
【表2】
【0037】
【表3】
【0038】表中においては、以下のように示す。 AC/total: 各遺伝子における総EST数に占めるグルコー
ス存在下でのEST数の割合(%) AN/total: 各遺伝子における総EST数に占めるグルコー
ス非存在下でのEST数の割合(%) AC/AN: AN/totalに対するAC/totalの比率、AN/AC: AC/t
otalに対するAN/totalの比率
【0039】また、3つのグループの基準は、グルコー
ス非存在下で発現の促進されるグループ(AN/ACが3.0以
上のもの)(表1)、グルコース存在あるいは非存在下
でも恒常的に発現しているグループ(表2)、およびグ
ルコース存在下で発現の促進されるグループ(AC/ANが
3.0以上のもの)(表3)である。
【0040】[実施例2] プロモーターの単離と塩基配
列の決定 まずアスペルギルス・オリゼ菌体から染色体DNAの抽出
を行った。アスペルギルス・オリゼRIB40株(ATCC42149)
の胞子をACM培地(2% Malt extract, 0.2% Peptone, 4
% Glucose)に植菌し、30℃で一晩振とう培養した。そ
の後、飯村らの方法(Agric. Biol. Chem., 1987, 51,
323-328)に従って菌体から染色体DNAを抽出した。つい
でアスペルギルス・オリゼRIB40株の染色体DNAをEcoRV,
ScaI, DraI, PvuIIあるいはSspIのような6bpを認識し
平滑末端に切断する制限酵素で完全消化した後、Clonte
ch社製のUniversal Genome Walker kitに添付のアダプ
ターを、T4DNAリガーゼを用いて連結し、PCR用の染色体
DNAライブラリーを作製した。ついで各遺伝子の5'末端
に位置するESTの配列をもとに作製した表4〜6に示さ
れるようなプライマー(配列番号:1〜74)、および
アダプターに特異的に結合するプライマー(AP-1)(5'
- GTAATACGACTCACTATAGGGC -3'/配列番号:75)を使
用してPCRを行った。
【0041】
【表4】
【0042】
【表5】
【0043】
【表6】
【0044】PCR終了後、増幅産物をアガロース電気泳
動で確認し、作製したプライマー側から塩基配列を決定
した。得られた遺伝子上流領域の開始コドンATGの推定
は、以下のようにして行った。一般的にプロモーターと
は、遺伝子の開始コドンATGの上流500bp〜1000bpである
と考えられる。各遺伝子において最も上流に存在するES
Tおよび増幅した上流領域の塩基配列をGenBank等の遺伝
子データベースに対して相同性検索を行った。ついで相
同検索で高い相同性を有していた既知遺伝子の読み枠
(遺伝子中でタンパク質に翻訳される領域)を参考にそ
れぞれの遺伝子の開始コドンATGを推定した。このよう
にして推定された表1〜3の遺伝子No.1〜74の開始コド
ンATGから上流の領域をそれぞれプロモーター番号1〜
74とし、それぞれの配列を配列番号:76〜149と
して配列表に記載した。
【0045】[実施例3] レポーター遺伝子アッセイ用
プラスミドの構築 それぞれのプロモーターが、コンピューター解析結果で
得られた培養条件でレポーター遺伝子の発現を促進する
か検討した。レポーター遺伝子は、GUSをコードする遺
伝子uidA (Proc. Acad. Sci. U. S. A., 1986, 83, 844
7-8451)を使用した。検討は、図1に示すようなプロモ
ーターアッセイ用のプラスミドpPRO-GUSを構築し、つい
で単離したプロモーターをそれぞれこのプラスミドに挿
入し、アスペルギルス・オリゼに導入した後、生産され
たGUSの活性値を測定することにより行った。
【0046】このプロモーター解析用のプラスミドpPRO
-GUSは、以下のようにして構築した。アスペルギルス・
オリゼ由来のタカアミラーゼ遺伝子(taaG2: Gene, 198
9, 84, 319-327)のターミネーター領域を染色体DNAを鋳
型として、プライマーTaater-M(CCCCCCGGGTGAAGGGTGGA
GAGTATATG/配列番号:150)とプライマーTaater-R
(GGGGAATTCTAGTGGTTTGAACACTTCG/配列番号:151)
を使用して増幅後、EcoRIとSmaIで処理し、pUC19(Gen
e, 1985, 33, 103-119)のEcoRIからSmaIの領域に導入
した。ついでuidAをプライマーGUS-M(AAAGTCGACATGTTA
CGTCCTGTAGAAAC/配列番号:152)とプライマーGUS-
R(CCCCCCGGGTCATTGTTTGCCTCCCTGCTG/配列番号:15
3)を使用して増幅し、SmaIとSalIで処理し、先に構築
したプラスミドのSmaIからSalIの領域に導入した。さら
にこのプラスミドのHindIIIサイトにアスペルギルス・
オリゼの染色体DNAよりプライマーniaD-M1(GGGAAGCTTA
ACAGGCCCCAAATTCAATTA/配列番号:154)とプライマ
ーniaD-RV(GGGAAGCTTTGGATTTCCTACGTCTTCAAT/配列番
号:155) を使用して増幅した硝酸還元酵素遺伝子
(Biosci. Biotechnol. Biochem., 1995, 59, 1795-179
7)を導入し、pPRO-GUSを構築した。検討するプロモータ
ーは、pPRO-GUSのSalI,Sse8387Iに導入した。
【0047】[実施例4] アスペルギルス・オリゼniaD
突然変異株の取得 各種プロモーターを挿入したpPRO-GUSを使用して検討を
行う際、宿主としてアスペルギルス・オリゼのniaD突然
変異株が使用できる。アスペルギルス・オリゼのniaD突
然変異株は、塩素酸ナトリウム耐性を指標とすることで
分離できる(Mol. Gen. Genet., 1989, 218, 99-1041)。
本発明では、アスペルギルス・オリゼKBN616株(寄託番
号P-17333)からniaD突然変異株を分離し使用した。こ
のアスペルギルス・オリゼKBN616株(Aspergillus oryza
e KBN616)は、下記の通り寄託されている。
【0048】(イ)寄託機関の名称・あて名 名称:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託
センター(旧 通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所) あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央
第6(郵便番号305−8566) (ロ)寄託日(原寄託日):平成11年3月25日 (ハ)寄託番号 生命研菌寄第17333号(FERM P-1
7333)
【0049】上記の分離する方法は、以下の通りであ
る。まずアスペルギルス・オリゼKBN616株の胞子を塩素
酸ナトリウム培地(50mM Sodium chlorate, 10mM Urea,
0.2%KCl, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4・7H2O, 0.002% F
eSO4・7H2O)のプレートに塗抹し、塩素酸ナトリウム耐
性株を取得した。ついで得られた耐性株に実施例3で増
幅したniaDを導入することで2%グルコースを含むCzape
k-Dok培地(0.3% NaNO3, 0.2% KCl, 0.1% KH2PO4, 0.05%
MgSO4・7H2O, 0.002% FeSO4・7H2O)で生育が可能にな
る株を選択した。このようにして得られた株をアスペル
ギルス・オリゼKBN616(niaD-)株と命名し使用した。こ
の方法を用いれば、本発明で使用したアスペルギルス・
オリゼ以外でも比較的簡単に硝酸還元酵素変異株を作製
できる。
【0050】[実施例5] pPRO-GUSへの各種プロモータ
ーの挿入とアスペルギルス・オリゼへの導入 本発明では、配列番号:76〜149に示したプロモー
ター配列を参考にプライマーセットを作製し目的のプロ
モーターを増幅し、SalIおよびSse8387Iで切断後pPRO-G
USに導入した。例えば、配列番号:76のプロモーター
番号1の場合は、以下のようにしてpPRO-GUSに挿入し
た。配列番号:76のプロモーター配列を基に作製した
表7に記載のプロモーター番号1のプライマーセットを
使用してアスペルギルス・オリゼの染色体DNAを鋳型と
して、プロモーター番号1の断片を増幅した。増幅した
プロモーター番号1の断片には、Sse8387Iサイト(5'末
端)とSalIサイト(3'末端)が付加される。ついで得ら
れた断片をSalIおよびSse8387Iで切断後、pPRO-GUSのSa
lI、Sse8387Iサイトに導入した。
【0051】通常は、上記の方法によってプロモーター
断片のpPRO-GUSへの挿入が可能であるが、プロモーター
上にSalI認識サイトが存在する場合がある(例えば、プ
ロモーター番号14, 26, 27, 30, 36, 38,
41, 48, 65)。その場合にはプロモーター断片の
3'末端にXhoIサイトが付加されるようにプライマーを設
計した。このようなプライマーセットを使用し増幅した
プロモーター断片はXho IおよびSse8387Iで切断後、pPR
O-GUSのSalI、Sse8387Iサイトに導入した。
【0052】また、プロモーター上にSalIとXhoIの両認
識サイトがある場合は、以下の様にして行った(例え
ば、プロモーター番号7, 9, 19, 44, 64)。Sa
lI認識サイトおよびSse8387Iサイトを付加したプロモー
ターの断片をSse8387Iで切断後SalIで部分消化を行っ
た。ついで末端のSalI認識サイトのみが切断していると
考えられるプロモーター断片を電気泳動により分離し、
pPRO-GUSに導入した。以上の各プロモーターのpPRO-GUS
への導入に使用したプライマーセットは、表7〜9に示
した(配列番号:156〜229、および配列番号:2
30〜303)。
【0053】
【表7】
【0054】
【表8】
【0055】
【表9】
【0056】アスペルギルス・オリゼの形質転換は、Ba
llanceとTurnerの方法(Gene, 1985,36, 321)に従って行
った。得られたKBN616(niaD-)株の形質転換体は、サザ
ンハイブリダイゼーション法によって目的遺伝子が染色
体上のniaDの領域に1コピーで導入されていることを確
認した。同様にして、プロモーター番号2〜74を各々プ
ロモーター解析用プラスミドpPRO-GUSに挿入し、さら
に、各々のプロモーターを挿入したプラスミドによりア
スペルギルス・オリゼの形質転換を行った。
【0057】[実施例6] 形質転換株のGUS生産量の測
定 上記のようにして得られたアスペルギルス・オリゼKBN6
16(niaD-)の形質転換株を2%グルコースを含むCzapek-D
ok培地(0.3% NaNO3, 0.2% KCl, 0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4
・7H2O, 0.002%FeSO4・7H2O)200mlに植菌し、30℃で20
時間振とう培養を行った。ついで1gの菌糸を滅菌水にて
洗浄後、AC培地(3%グルコースを含むCzapek-Dok培地)
あるいはAN培地(2%ピルビン酸を含むCzapek-Dok培
地)で培養後、菌体を回収し、破砕した。菌体中のGUS
活性をJeffersonらの方法(Proc.Acad. Sci. U. S. A.,
1986, 83, 8447-8451)で測定した結果を表10〜12
に示した。
【0058】
【表10】
【0059】
【表11】
【0060】
【表12】
【0061】1Uは、1分間に1nmolのp-ニトロフェノール
を精製する酵素量である。表から各グループのAC培地お
よびAN培地におけるGUS活性が確認され、プロモーター
として機能していることが実証された。
【0062】
【発明の効果】本発明者らによって、プロモーター活性
を有する新規なDNAが提供された。該DNAは、グルコース
のような単糖によって発現制御可能なプロモーター、ま
たはグルコース量の影響を受けず恒常的に発現可能なプ
ロモーターであった。また、本発明者らによって、該プ
ロモーターを用いた遺伝子組換え技術により、所望の遺
伝子を発現させる方法、および所望のタンパク質および
ペプチドを製造する方法が提供された。
【0063】グルコース存在あるいは非存在によって目
的タンパク質遺伝子の発現制御を可能なプロモーター
は、目的タンパク質の生産時期を制御する際に有用であ
る。またグルコース量の影響を受けず恒常的に目的タン
パク質遺伝子の発現可能なプロモーターは、培養全期に
わたり目的タンパク質の生産を可能にするため大量生産
に適していると考えられる。該プロモーターの利用によ
って、アスペルギルス属を始めとする糸状菌を、遺伝子
組換えによるタンパク質の実用的な高生産用宿主として
使用することが可能になるものと大いに期待される。
【0064】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Higeta Shoyu Co., Ltd. National Institute of Advanced Industrial Science and Technology <120> Novel promoters derived from the genus Aspergillus <130> H5-A0101 <140> <141> <160> 303 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 1 ttcttggcga taatgtcatc gata 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 2 aacgacctca acaagaccgg gc 22 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 3 actccttctc ctccttctca cgctca 26 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 4 gtcaacgagg aaaacgatac c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 5 aattcaagca aggcagtgtc t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 6 tggagtggcc gacaaccttc 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 7 caggtgacgc ttctcgggga tg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 8 ggagaagagc cgataagcgc cg 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 9 gctccttggc tatccttttg ct 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 10 tgcaggttca aagggtcacg g 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 11 ttacgagagt ggatggtgac gg 22 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 12 ccaactcggc gggaatgcag ggct 24 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 13 cagtgtgagt agtgctgccg ct 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 14 ggaggagacg ggtacgggtg ggaa 24 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 15 cgtcggtagc agcggcataa ccacggagct g 31 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 16 ggcattcgat tagggctttg gc 22 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 17 acccttgata cggataacga agacaa 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 18 gggcttcaca cctcacgacg acgatc 26 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 19 ttggtgggaa gacggacggg a 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 20 cgaaagcgga gaggtcgaag at 22 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 21 ggtcttgagc caggagggag cagagcgaga 30 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 22 taacgctcga taccggcaac g 21 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 23 atgaaggtct cggtaacgtg cttgaa 26 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 24 ctcgacatga aaagacgacg ca 22 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 25 cgttgaatga taagactccg gat 23 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 26 agctcggtgg acttctggta gc 22 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 27 tgacaacgtg accgttcttc ctca 24 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 28 gaccttcttc ttacgcttct taccac 26 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 29 tgttctcggt ctcaatggcg tt 22 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 30 agtctcagca cggtacttct 20 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 31 tgcagcttga ggtacatctt gggg 24 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 32 cccataggct tgcgcttcag ac 22 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 33 aacttctctc cgccgacctt gat 23 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 34 accccaggag aagttaccgg ac 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 35 gtaaccgacg acaccgatag cg 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 36 ggctttccct tcttgacggt gg 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 37 atatcggtga cggtgggagt g 21 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 38 cgacggagga cttggtgacg ttgt 24 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 39 gatcggcacc agcgcacgac 20 <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 40 ttgaaaccga ttgtggggat ggtggt 26 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 41 tgtgccaagt gagagcatcg tccc 24 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 42 tccgacaaag actcatagcg 20 <210> 43 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 43 tgctgctgac caccgtaaga ctgctggtgg t 31 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 44 gagacgaccg gcgcgaagca tc 22 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 45 tcggatgagg cgcgggtctg c 21 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 46 ccttctgagc gcgggtaaga cg 22 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 47 ctggcggggg gagacaatac g 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 48 gtacagagcg tgaatgatac c 21 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 49 gggaagcacc accgaaggga 20 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 50 aaccgaagta gcaagcaaga ttttc 25 <210> 51 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 51 atgttacgga tgttcttcgg cttgtc 26 <210> 52 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 52 tagacattca tccgctccag ttcttg 26 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 53 gggcaccttg ttgagcttca gcttgtgaac 30 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 54 gtgtgtgtga aaaacgtgcc ca 22 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 55 tctcgaaagt cacggttgcg g 21 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 56 cgctccgttg tggatggagt caacagcaac 30 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 57 tctctgatct ggaaagtgga cg 22 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 58 aacaccacgg attctctgct ca 22 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 59 acttgtcgat gatgccctgc ca 22 <210> 60 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 60 cttgatggtg tagtcgggga tcttga 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Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 66 gtaggcccaa actgtctatg a 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 67 gtaccaaacc ctccgacaag a 21 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 68 acaacgacag caatcttaaa tc 22 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 69 tgcaatggag aagtcaaggg g 21 <210> 70 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 70 ttgtatcctc catcggttga aagtac 26 <210> 71 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 71 ccgggcttat catcatcgtc atcgtcgtcg tcgg 34 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gaaagaacag atcagagctc tccattcttt tggcaacgtt cttagcttct 1080 ctgcactcgg gcactcgttt ggtcttccca attatacata gatcacctta atcttaattc 1140 tacttaccag tctttcccgt caagatg 1167 <210> 77 <211> 476 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 77 atcagactat ggtggttagt tcaagactca tactgccggt caagccccat tcaatatccg 60 acagagcaat gaatgttgga aagtagatta gcctgaaaca tcccatgatt tcgtaggtcg 120 agactgtgat ggtctactta agttgactat cagattccgc attagagtaa aactgtatgg 180 attgcaaatc gtgcgtgcgc acatagcgca caacacgtag aaaatataag aacaatccag 240 gaaagaaaga tccagagcca aaggacagta actcaaatag ccgaccttgt ctgttgatag 300 tagcagttgt agtagaaaag gctgcaagac ttttgctggg gaatcggaat gtccgacacg 360 tgacctggca agagccgcta gggaacaacc ggcatccgac ttcgaccttt gcaactcaaa 420 cacaggtcca agagggatac catcaccgtc gtctcctccc catccattgc aagatg 476 <210> 78 <211> 555 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 78 atcatcactc aggaggaata cgctgccttc tacaagtctc tctccaatga ctgggaggat 60 cacctttgcc gtcaagcact tctccccgtt gagggtcagc tcgagttccg tgccatcctc 120 tatattccta 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gcatcgaaag 720 gattgacaac gtaccgcacg gaattcagcg caccgattct caccgctggg atgattgaac 780 gccactaatt gaagattttg aaagtgccaa atg 813 <210> 83 <211> 858 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 83 atttcaacta tttcccttct atttcctgga cgacaatgcc tccttgggat tatttaaaac 60 tttaatgaaa ccaggcaatt cagacgcctg agaataggat ttgagtatat cgggaaaacc 120 tcgtggtttg ggagcctgac gatttgcctc actggaacaa ctcaagtatg cagtgaacta 180 tggaagtttc tggtttccac ttcggatttg cctccactcg tcagagtgtc ccagagcagt 240 aaaatccatc atggaatttt ttacacttta acaaaagtct ggttacgggg ctataccgaa 300 acgggggcct gaggggaact agccccgaat gggattaaac ggctacgaca tcggatctgc 360 agtcgtactg cggatggagt cgtgactcag caggtcatga atgaatgcct cttccgtata 420 aattgacttt gactgcactg tcgccgctcc ttcttcatct ttgttcttct gcttatctgt 480 tcttcgcttc cattgtcttc ctccggtttg tgtccccttg ccgactctcc cgtctttgcc 540 ttcctatcta acaagtatat atatatagac tccccgtcct tatctgcctc cttatctacc 600 gtcccttccc catacctcct tctcggcgct tcaatctccc ttcaggacgt ccacgtcacc 660 cattcatagc ggccttgcca catcgctctc ttgactcctc actcatcact atttccgtat 720 aacgccggaa attccgtgag tcgctagcaa tcgttcacaa caagccgtaa tccgcctgct 780 ccaactcggc gcttatcggc tcttctccaa cgtcacctcc ttatccggct ccctacttgc 840 caccacccgc tcaacatg 858 <210> 84 <211> 488 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 84 ctgggtccat tagcaaaatt gaacgcatgg cctttgccac caagaattgt gcgcaaatga 60 ttttcagcgg tggagggtaa taagcgccaa caaaaaaggg gatggaaaga tgaaggtcac 120 ccattctaaa taaagcaaag attaaataca caaggccgct ctgacgtcga ccattcattc 180 aactttccgc cccgcttgat cggctcggcg gccccgccga cttgcttgag ctcgaggatg 240 actcgacttt ggacaacaca ctctctttaa cgcttgcggt cctttcaacc cctgcgtcaa 300 tctttagtta cactggttct ttgactttgt atcagttctg gggtgttctt tattcttcga 360 accaagcttc ccagctttca tcatctgacc cagtagagct ccgtctatcc gagagctcct 420 accatctttt tgaattttcc ccttctacac ttgctctccg gtcctttcaa aaacaatctg 480 aaacgatg 488 <210> 85 <211> 881 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 85 ttattcttag caaaacgctg ctcggtatat atccggcgag cttcatcaaa gtttatcctt 60 tggcgtttca tgatcttcat gatttgtcgt ttagcttggt tatccaaccc agccctagtg 120 tcaccatctg caatgttggc ggagaggtca aactgcgttg atgtcagccc cgcctctagg 180 tcatcggcga actagaaggt aggcggtcgt aaatgtaatc aggaactggg actagagaca 240 gccatcgggc ccgtgtaaga tagaggactt tgaactcgtc agcatgatat ccagactcgt 300 aactactttt tggttctgct tgagtgcaat atacctgtac cacaaaccac aacagagatt 360 gccaaaaaat atagaagata gtatgccatg gcaaataggt cagttggatg gctgctaggc 420 tgttcaaacg aaagacagtg ggagatgacg ttaatggctt cccgaatgtt ggatgtgagc 480 ggtaaactgt tgcgaagcgc aagtgatcaa aactctttac tatattcatg aatgagggat 540 tctcggctgg caggtagctg ccatcatcag cagcatatga tgctttaaga tggaaccagg 600 acaacccggt agcctagggg agatctacta gtcacgggga gaactgggaa ggctgcagaa 660 agaggcaagt gggtctgtgg ctgaacattt ctttgctgcc ttcgatctga ggcagcaacc 720 ctgctctcag gcgctatacc taaagtagtc cgcttagcga gattgcggac agccattctt 780 ggcgctggca cacacaatcc accgttcagt ataccagcct ttgtgtcgat tgatttcgat 840 ccgtcctcaa tccaccagcc tgaaagagat aatttacaat g 881 <210> 86 <211> 703 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 86 atcctgacca 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gcatttcctg tcttccccaa ccgccatcca ccggtggaac cccttggggt 360 gtgcaagtaa agagctcccg aattttttta ctcattcgcc ttctcttctt tcgcctctta 420 ccggagcttc cccacccttt tttatttcca tcactttttc ttcctcggtt ctcttgcctc 480 cgtttaaata gtcttcctct tctctccacc tcaccaccgt aactctttca cctatcaaga 540 gggtatccgt caccgtcgac agtctcctcg tcttggttcg ggcatatccg aggtcttcga 600 gaagacgaaa aacaccgaca tcatg 625 <210> 141 <211> 821 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 141 atttatgatt gtattgtgaa tggcgtcact atgtcagcat atctgaccta agcactacta 60 gtatggacca aacaatgtaa gaaataatac tccgtataca aagtatgtta attaacatca 120 gttttctact cttttttttt ccaattttgg gacctgctaa ggggctgcat cagtccaggg 180 attggcaagc taactccagt cgtgttttgg tagactaccg agagatcgac atagatgggt 240 aatggttatc tgatatcgtt tcgcattggg cacgggtagt agggaggtga gaccaccaag 300 gccactaaga atcgtagtcc ctgtgtttac tttggagcct aggtgcaaga tactgaactt 360 cgagccggag aggggataga ttgtggatga gcctggagta gcaaagtacg cttaattgaa 420 taacaacaat catgatatta gtggacaaca gccaacatca gtggagactc gttttgtgga 480 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cttcctttcg ctttaccccc 480 ccccttatcc ctcggtcact cgttcaaaac aaccatcgcc gccggttcct acaatatacc 540 accatattaa cacttctctc tcttaacttc cgtcccacta tataatcatg 590 <210> 143 <211> 544 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 143 actcagtttc cgttgggcct acttggtgag tggtcgttcc cacaaggtac gtagcgataa 60 aaactcttcc aatgttcacg cgatacatac catgtataga aaactgccgg agccaatgac 120 aatgatagta acgcgttttt gtcatcagtc atttattaat ccttgcaatt ggtcggttaa 180 gggtgaggac cttgtgctag tcgcgaatac aggtaccttg caagacgtct tttttagggc 240 acggatggag tacctttgga gtcggaatgg agaccttgtc tcatagacca atcacaagca 300 cgatgataaa ttatatctct atgtatagct gtgaaccttg ggggtgagta tctataccag 360 tatataaata tttgtacata ggatctggtg attgagagcc ttcttctttt tcttcttctt 420 cttttaaatc ttagctcctt tgtgacttta gccctatgcc acgagactac ttaataacct 480 gccagtatga cgatcaactc gggcccagaa actctcgcct ttcctgtgcc caacaacatc 540 aatg 544 <210> 144 <211> 1091 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 144 actggtaagc agccgccaat gcgcaggtac agtaccaact tacagtgtgc atgtatgtgc 60 atgagtgcag ttcccttcat ctatcttgtg atttccgggg tttatcatct gacacggact 120 ctacgcactt gcagcgtaat gatctcacag ctgatgtcta tcacatgaat aggtgcccag 180 gtatgtactg aactgtaggt aacttggtgc taatactacc gggagtacgg agtatttcgg 240 tcatgaagct tccctagaat aggagaatga aaattacatc caaggtaaaa aaagtacaag 300 tttactaatc agtgctaaga atatgggtat ctttcaccct acctgggaga gagaacaaat 360 aatatataga gcccagcatg ctgatatttt tgtttcctaa agccgataca catacaattg 420 gtacaacctg tagtaaatac gagtagtgag atgcccgtgg gtatttgttt acatcttgag 480 aggtatctgg ggcatgaacc tgggaggttg agaggaattt gagacaagga tcgggacagc 540 tcaaccattt ctgtattgcg gtaatgttgg ggggcacccg atttgctccg ttggctcaac 600 tgaggccaat tacaccgccg gaccacactg ggcctagtgc caggactcag gctagaaaga 660 caccaattag gtttagtgcc tccccaatgt ccccgacgtc ggttttgttt ttgcggtttg 720 agggggaacg gcaactggcc ttaggccgtc gagtgcctag tcgggcctag cacctagtta 780 aacttggagt acgtactccg ggtaatccat cctcgtagac tttatatttc caatctttcc 840 tgttctgttt ggctatcact gcttctcctt ccatctctac tttatcggct atttagatcg 900 ccccctcccc 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gtgttgtata gtaagcgtgc ccgatgtaat 300 actcgggagg ccgtccatgc tttgcgtacg gggattatgt cggaaattca agccaaggcg 360 gaagcacaat gaagggcaag accacacaga agaagaggac gtggggtatg agattctcat 420 atcagcaatt ggcgtaggac atgggtcaat aagatcttca agaatgcagt acaagaaaga 480 gagacgaatt tcgaacaggt aatggcatca ttgtagttgt cgggtttgtt tggctgtcat 540 catgtggctg ctgatttatg gatcgaattt tgttgttccg aaaagtcgcg gttttcaccg 600 aaggtagtta gagccgtggt gccagccaat cagcggaagg gtttagccaa ttccaaaccc 660 aagagaaact tgaccgtccg acaacctcaa cttcacctcc aaaagcacat tctccagtgc 720 gcaccacgac cccctccccc tcccctctcc ttcttcctgg ctattgtgcc ttcctgatta 780 tccattgatc agagggttct tgatatcatc agtatg 816 <210> 149 <211> 674 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 149 taaataatta tgcttgcgat ttatgtcggg tatttgggat agactcatgc attattagag 60 acgtgtctca aaaagtgttt ttttccgccc cagacagcgc agagggttat gaagtccctt 120 tcaaaaacgc tcttgttccc tcaagctctt gtataatcat gccttctttc aggttagggc 180 tctcaaaata gaccaggttg tagctctatc atagataaaa tatttgtatt ttcttcttag 240 agtggtttca 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Primer Sequence <400> 152 aaagtcgaca tgttacgtcc tgtagaaac 29 <210> 153 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 153 ccccccgggt cattgtttgc ctccctgctg 30 <210> 154 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 154 gggaagctta acaggcccca aattcaatta 30 <210> 155 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 155 gggaagcttt ggatttccta cgtcttcaat 30 <210> 156 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 156 aacctgcagg ctgaacgctc atggacgagg 30 <210> 157 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 157 aacctgcagg atcagactat 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 163 aacctgcagg atttcaacta tttcccttct attt 34 <210> 164 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 164 aacctgcagg ctgggtccat tagcaaaatt gaac 34 <210> 165 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 165 aacctgcagg ttattcttag caaaacgctg 30 <210> 166 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 166 aacctgcagg atcctgacca agaggttacg 30 <210> 167 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 167 aacctgcagg catactaaag gggacaagaa ctg 33 <210> 168 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 168 aacctgcagg gtaaggcttc agatacgact 30 <210> 169 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 169 aacctgcagg aaggggggga ttgggtcagt 30 <210> 170 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 170 aacctgcagg atctgcgtcg gccatggttg 30 <210> 171 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 171 aacctgcagg aaaaactcat ttccttcggc 30 <210> 172 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 172 aacctgcagg atcagaaacg gtcgctgggc 30 <210> 173 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 173 aacctgcagg aatggtaatc aacatcattc taat 34 <210> 174 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 174 aacctgcagg actttgcgga agtcgtccct 30 <210> 175 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 175 aacctgcagg aaagggaagg cccaatggcc 30 <210> 176 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 176 aacctgcagg aacgaggtcc ttcgacatag 30 <210> 177 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 177 aacctgcagg atcagggtca gtctgcggca 30 <210> 178 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 178 aacctgcagg gaccccagac tgcgtggtgt 30 <210> 179 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 179 aacctgcagg tgacgtagct tgaaaaatag caac 34 <210> 180 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 180 aacctgcagg ggcagttggt ggtatcatct 30 <210> 181 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 181 aacctgcagg atcctcacgg aatgcctctg 30 <210> 182 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 182 aacctgcagg ttttaagtgt agaagataga acag 34 <210> 183 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 183 aacctgcagg gggaaaggtg gatggagaag 30 <210> 184 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 184 aacctgcagg attacatcga atgtcgggtc 30 <210> 185 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 185 aacctgcagg atgtccgtca ttgctcacgg 30 <210> 186 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 186 aacctgcagg attagctgtt agtttacggc 30 <210> 187 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 187 aacctgcagg atctcgtggg ggaacagaaa 30 <210> 188 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 188 aacctgcagg actcaagagc tactcctgta 30 <210> 189 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 189 aacctgcagg atgtacaaac tgctcttcag 30 <210> 190 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 190 aacctgcagg atgccaccaa tggcagccag 30 <210> 191 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 191 aacctgcagg actccccgta gtagagcatg 30 <210> 192 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 192 aacctgcagg ctggaatagc agccgtcaca 30 <210> 193 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 193 aacctgcagg actaacagac ggagccgact 30 <210> 194 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 194 aacctgcagg actacgctat gctcgccaag 30 <210> 195 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 195 aacctgcagg acgccggcgg ctgaatttct 30 <210> 196 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 196 aacctgcagg ttgtgccaag tgagagcatc 30 <210> 197 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 197 aacctgcagg gaatggtgga gcggaacgtt 30 <210> 198 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 198 aacctgcagg agagcatctt ttctccgccg 30 <210> 199 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 199 aacctgcagg tccatcctaa tacgactcac 30 <210> 200 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 200 aacctgcagg ttctcctgca caaattttag 30 <210> 201 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 201 aacctgcagg ggagagctca ccagtagatc 30 <210> 202 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 202 aacctgcagg cgaagagggg tccgtatatc 30 <210> 203 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 203 aacctgcagg actctctggg ggcgattttt 30 <210> 204 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 204 aacctgcagg gagatatgtt agatccatta 30 <210> 205 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 205 aacctgcagg ctgaagatgc ccaggattaa 30 <210> 206 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 206 aacctgcagg tcagtcggga agtaccaaaa 30 <210> 207 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 207 aacctgcagg acttggagta gatttggaaa 30 <210> 208 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 208 aacctgcagg aagcagaaga aagtacgtgt 30 <210> 209 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 209 aacctgcagg atgtattcta accaattcaa 30 <210> 210 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 210 aacctgcagg ccatcctaat acgactcact 30 <210> 211 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 211 aacctgcagg tccttggaag agctctcaaa 30 <210> 212 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 212 aacctgcagg ggaatacgac tagatacttc 30 <210> 213 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 213 aacctgcagg taaacaagga cgtgaaaggc 30 <210> 214 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 214 aacctgcagg tctactaaac agattacttt 30 <210> 215 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 215 aacctgcagg ctgattcata accttgaact 30 <210> 216 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 216 aacctgcagg agggctcgag cgcccgcccg 30 <210> 217 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 217 aacctgcagg acccaatata ttgaagtgcc 30 <210> 218 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 218 aacctgcagg acttcgtagg tactgggcgg 30 <210> 219 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 219 aacctgcagg cttgcgcctt cagctagtat 30 <210> 220 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 220 aacctgcagg agccggacta accgaaacag 30 <210> 221 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 221 aacctgcagg atttatgatt gtattgtgaa 30 <210> 222 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 222 aacctgcagg aaatttaggg gggcgtaatg 30 <210> 223 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 223 aacctgcagg actcagtttc cgttgggcct 30 <210> 224 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 224 aacctgcagg actggtaagc agccgccaat 30 <210> 225 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 225 aacctgcagg ctgcttcagg taccggatcg 30 <210> 226 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 226 aacctgcagg ctgttcctca ggaggcttgg 30 <210> 227 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 227 aacctgcagg cccaggagat attgcaccaa 30 <210> 228 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 228 aacctgcagg atccccagac ggcacttcag 30 <210> 229 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 229 aacctgcagg taaataatta tgcttgcgat 30 <210> 230 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 230 catgtcgacc atcttgacgg gaaagactg 29 <210> 231 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 231 catgtcgacc atcttgcaat ggatgggga 29 <210> 232 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 232 catgtcgacc atgcggggtg acatagtca 29 <210> 233 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 233 catgtcgacc atggtgagat cgatccagt 29 <210> 234 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 234 catgtcgacc attttgatgg ttgggttgg 29 <210> 235 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 235 catgtcgacc atgtcccaaa caacccctc 29 <210> 236 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 236 catgtcgacc atttggcact ttcaaaatct tc 32 <210> 237 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 237 catgtcgacc atgttgagcg ggtggtggc 29 <210> 238 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 238 catgtcgacc atcgtttcag attgtttttg aaa 33 <210> 239 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 239 catgtcgacc attgtaaatt atctctttca ggc 33 <210> 240 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 240 catgtcgacc attttgtgaa ttaggggag 29 <210> 241 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 241 catgtcgacc atcttcttcc ccggcatcg 29 <210> 242 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 242 catgtcgacc atcggcatac ttccagtcc 29 <210> 243 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 243 catctcgagc atcttgacgg agctgcgcg 29 <210> 244 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 244 catgtcgacc attggcgggc agggagagc 29 <210> 245 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 245 catgtcgacc attttgagaa tgctgtaatc gg 32 <210> 246 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 246 catgtcgacc atcgaccgat ggtctagtc 29 <210> 247 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 247 catgtcgacc attgtaaacc caaacagagt gtc 33 <210> 248 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 248 catgtcgacc atcttgacgg ctggtttgtg gtg 33 <210> 249 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 249 catgtcgacc atcggattat ttgattagc 29 <210> 250 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 250 catgtcgacc attttgaatg aaggtggttt tg 32 <210> 251 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 251 catgtcgacc atcctgtcag ctggcattc 29 <210> 252 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 252 catgtcgacc atggcgactt ttctagatag ag 32 <210> 253 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 253 catgtcgacc attgtaaatt gacctgaaca atg 33 <210> 254 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 254 catgtcgacc atcttcgtag agggttcga 29 <210> 255 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 255 catctcgagc atctttagag ataaggtttg atg 33 <210> 256 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 256 catctcgagc atcgaatacc tatgtagag 29 <210> 257 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 257 catgtcgacc atcttgatga aggcctggt 29 <210> 258 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 258 catgtcgacc attgatcttg gagggaacg 29 <210> 259 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 259 catctcgagc atcttcttac ggtcaacac 29 <210> 260 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 260 catgtcgacc atcttgacgg cttttctct 29 <210> 261 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 261 catgtcgacc atttttgcgg gtgttcctc 29 <210> 262 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 262 catgtcgacc atggtgaata atggacgga 29 <210> 263 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 263 catgtcgacc atgtttgctg tttcgaggg 29 <210> 264 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 264 catgtcgacc attgcgccag cgtgggaac 29 <210> 265 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 265 catctcgagc attgggggtt catgattcg 29 <210> 266 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 266 catgtcgacc atgattgcgt ttctgttgg 29 <210> 267 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 267 catctcgagc atgtcggcgg tgttggtgg 29 <210> 268 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Primer Sequence <400> 273 catgtcgacc atatcgaatc atgggctca 29 <210> 274 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 274 catgtcgacc attgtgtggg aggtcgtgc 29 <210> 275 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 275 catgtcgacc atcctagaat cccaaggtt 29 <210> 276 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 276 catgtcgacc atcattttga tcggacctg 29 <210> 277 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 277 catctcgagc atccccgctc aaggaaaac 29 <210> 278 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 278 catgtcgacc atcttgggcg gattatgtt 29 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Synthesized Primer Sequence <400> 289 catgtcgacc atcttgccct tgttctcag 29 <210> 290 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 290 catgtcgacc atagttttat aagatggaa 29 <210> 291 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 291 catgtcgacc attgttatga tggatgttc 29 <210> 292 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 292 catgtcgacc attgttatgt gatttcttc 29 <210> 293 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 293 catgtcgacc atgacgacga tgttgattt 29 <210> 294 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 294 catctcgagc atgatgtcgg 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【図面の簡単な説明】
【図1】 レポーター遺伝子アッセイ用プラスミドpPRO
-GUSの構造を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12P 21/02 C12N 5/00 A (72)発明者 町田 雅之 茨城県つくば市東1−1−1 独立行政法 人産業技術総合研究所つくばセンター内 (72)発明者 佐野 元昭 茨城県つくば市東1−1−1 独立行政法 人産業技術総合研究所つくばセンター内 Fターム(参考) 4B024 AA20 CA01 FA02 HA01 4B064 AG01 CA19 CC24 4B065 AB01 BA02 CA24

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 以下の(a)〜(c)のいずれかに記載
    のプロモーター活性を有するDNA。 (a)配列番号:76〜149のいずれかに記載の塩基
    配列からなるDNA。 (b)配列番号:76〜149のいずれかに記載の塩基
    配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイ
    ブリダイズするDNA。 (c)配列番号:76〜149のいずれかに記載の塩基
    配列において、1または複数の塩基が置換、欠失、付
    加、および/または挿入された塩基配列からなるDN
    A。
  2. 【請求項2】 請求項1に記載のDNAの部分DNAで
    あって、プロモーター活性を有するDNA。
  3. 【請求項3】 アスペルギルス属糸状菌由来である請求
    項1または2に記載のDNA。
  4. 【請求項4】 請求項1〜3のいずれかに記載のDNA
    を含むベクター。
  5. 【請求項5】 請求項1〜3のいずれかに記載のDN
    A、または請求項4に記載のベクターを保持する形質転
    換体。
  6. 【請求項6】 請求項1〜3のいずれかに記載のDNA
    の下流に遺伝子が機能的に結合したDNAを用いること
    を特徴とする、遺伝子の発現方法。
  7. 【請求項7】 請求項6に記載の方法を用いたタンパク
    質の製造方法。
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EP2345726A3 (en) * 2004-04-16 2011-12-14 DSM IP Assets B.V. Fungal promoter for expressing a gene in a fungal cell

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