JPH08511161A - 酵母プロモーターおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 翻訳プロモーター活性を有するＤＮＡ配列、これらの配列を含有する発現ベクター及び組み換え遺伝子を発現するためのこれらの配列の使用が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 酵母プロモーターおよびその使用 本発明は、分子生物学の分野に関する。より具体的には、それは、転写プロモ ーター活性をもつ新規なＤＮＡ配列、この配列を含む発現ベクター、および組み 換えタンパク質、例えば異種タンパク質の生産のためのその使用に関する。また 、本発明は、このＤＮＡ配列を含む組み換え細胞にも関する。 分子生物学の分野において達成された進歩は、微生物を改変し、その微生物に 、異種タンパク質を生産させることを可能にした。特に、いくつかの遺伝的研究 が、細菌Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において実施されてきた。しかしながら、こ れらの新規な生産方法の工業的応用は、特に、これらの組み換え微生物における 遺伝子の発現効率の問題により、なお制限される。それに加えて、これらの生産 系の働きを増大する目的で、異種タンパク質の高レベルの発現を可能とする強力 なプロモーターを単離するための研究が実施されてきた。Ｅ．コリに関しては、 トリプトファンおよびラクトースオペロンのプロモーターを、特に挙げることが できる。 最近では、酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における研究は 、解糖に関与する遺伝子から得られるプロモーターに関するものであった。３− ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ＰＧＫのプロモーター（Dobson et al.，Nuc leic Acid Res．10，1982，2625; Hitzeman et al.，Nucleic Acid Research 19 82，7791）、グリセルアルデヒド− ３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＡＰＤＨのプロモーター（Holland et al. ，J．Biol．Chem．254，1979，9839; Musti et al.，Gene 25，1983，133）、ア ルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子ＡＤＨ１のプロモーター（Bennentzen et al .，J．Biol．Chem．257，1982，3018; Denis et al.，J．Biol．Chem．25，1983 ，1165），エノラーゼ１遺伝子ＥＮＯ１のプロモーター（Uemura et al.，Gene 45 ，1986，65）、ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター（Johnston and D avis，Mol．Cell．Biol．4，1989，1440），またはＣＹＣ１遺伝子のプロモータ ー（Guarente and Ptashne，PNAS 78（1981）2199）に関する研究を、特に挙げ ることができる。 近年、種々の遺伝的道具が、組み換えタンパク質生産の宿主細胞として酵母ク ルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）を使用するために、開発された 。Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）に由来する２ミク ロンタイプのプラスミド（プラスミドｐＫＤ１−欧州特許第241 435号）の発見 は、組み換えタンパク質生産用の非常に効率的な宿主／ベクター系を確立させる ことができた（欧州特許第361 991号）。しかしながら、この系で使用されるプ ロモーターは、今までは、まだ最適なものになっていなかった。特に、それらは 、本質的に異種のプロモーター、すなわち特にＳ．セレビシエのような他の微生 物に由来するプロモーターである。このことは、種々の不都合をもたらすであろ うし、そして、特に、転写機構のある要素（例えば、トランス−アクチベーター ）の不在により、プロモーターの活性を制限し、制御不在による宿主細胞に対す るある種の毒性の原因になるか、ベクターの安定性に影響を与える。 これらの条件下で、クルイベロミセスの場合における強い相同プロモーターの 欠如は、この発現系の工業的利用における制限因子となっている。 ここに、本発明者は、転写プロモーター活性をもつクルイベロミセス・ラクチ ス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）のゲノム領域を同定し、クロ ーン化し、そして配列を決定した（配列番号：１の配列、参照）。より正確には 、この領域は、糖の輸送に関与するタンパク質の遺伝子プロモーターに対応する 。この領域、またはその誘導体もしくは断片は、クルイベロミセス属酵母におけ る組み換えタンパク質の生産に対して、非常に効率的な方法で使用することがで きる。この配列は、また他の宿主生物にも使用できると考えられる。 さらに、得られたプロモーター活性の１つの優位性は、それが、制御できると いう事実にある。その結果、使用の条件に応じて、プロモーターの活性を調節し 、それにより組み換え遺伝子の発現を引き起こしたり、抑制したりすることが可 能である。 したがって、本発明は、配列番号：１の配列、またはその相補鎖、またはその 誘導体の全部もしくは一部を含み、そして転写プロモーター活性を有するＤＮＡ 配列に関する。 本発明の文脈上、誘導体とは、プロモーター活性を保持している遺伝的および ／または化学的性質の改変によって、配列番号：１の配列から得られるすべての 配列をも意味すると理解される。遺伝的および／または化学的性質の改変は、１ つ以上のヌクレオチドの突然変異、欠失、置換、付加および／または改変のいか なるものも意味すると理解される。そのような改変は、種々の目的、特に、ポー タブルプロモーターを調製 するために、または特殊なベクターもしくは宿主タイプでの発現に好適なプロモ ーターを調製するために、または転写プロモーターについてそのサイズを縮小し 、その活性を増大させるために実施されて、誘導可能なプロモーターを生成した り、調節レベルを改良したり、または調節の性質を変化させることができるであ ろう。そのような改変は、例えば、イン・ビトロでの突然変異誘発によって、付 加的な調節要素もしくは合成配列の導入によって、または元の調節要素の欠失も しくは置換によって、実施されるであろう。 前記のような誘導体が得られれば、その転写プロモーター活性は、数種の方法 、特に、発現が検出できるレポーター遺伝子を問題の配列の制御下に置くことに よって実証されるであろう。当業者に既知のいかなる他の技術も、もちろん、こ の実施のために使用されるであろう。 配列番号：１の配列は、実施例記載の方法により、Ｋ．ラクチスのゲノム２３ ５９／１５２の断片とＥ．コリの遺伝子ｌａｃＺ間の融合体バンク（ｂａｎｋ） から得られた。当業者は、配列番号：１の配列またはその相補鎖の全部もしくは 一部を含むプローブによるハイブリダイゼーションによって、この領域を単離で きることは明らかである。次いで、本発明による誘導体は、実施例に示されるよ うに、この配列から作製できる。 また、本発明は、図３に記載の３ｋｂＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の全部もし くは一部を含み、転写プロモーター活性を担持するＤＮＡ断片に関する。 また、本発明は、前記ＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡに関する。 この組み換えＤＮＡは、例えば、プロモーター配列番号：１の配列ま たは、この配列の“ポータブル”プロモーターとしての使用を可能にするために 、その配列に制限酵素部位が挿入されるその誘導体を含んでもよい。 好ましくは、また、この組み換えＤＮＡは、１つ以上の構造遺伝子を含有する 。特に、これらは、医薬的もしくは農産栄養的興味のあるタンパク質をコードし ている遺伝子であってもよい。例として、酵素類（例えば、特にスーパーオキシ ドジスムターゼ、カタラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キモシン等 ）、血液誘導物（例えば、血清アルブミン、α−もしくはβ−グロブリン、ファ クタ−ＶＩＩＩ、ファクターＩＸ、フォンビルブランド因子，フィブロネクチン 、１−α−アンチトリプシン等）、インシュリンおよびその変異体、リンホカイ ン（例えば、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子［Ｇ−Ｃ ＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ・・・］、ＴＮＦ、ＴＲＦ、等）、増殖因子（ 例えば、成長ホルモン、エリスロポイエチン、ＦＧＦ，ＥＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧ Ｆ、等）、アポリポタンパク質、ワクチン（肝炎、サイトメガロウイルス、エプ スタイン・バール、ヘルペス、等）生産のための抗原ポリペプチド、あるいはま た、特に、安定化部分に融合された活性部分を含む融合体のようなポリペプチド 融合体（例えば、アルブミンもしくはアルブミン断片、およびウイルスレセプタ ーもしくはウイルスレセプターの一部分［ＣＤ４、等］との融合体）を挙げるこ とができる。 なお一層好ましくは、また、その組み換えＤＮＡは、該１つ以上の構造遺伝子 の発現産物の分泌を可能にするシグナルを含む。これらのシグナルは、問題のタ ンパク質の本来の分泌シグナルに対応しているが、それらは、また異なる起源の ものであってもよい。特に、キラー毒素（St ark and Boyd，EMBO J．5（1986）1995）もしくはαフェロモン（Kurjan and He rskowitz，Cell 30（1982）933; Brake et al.，Yeast 4（1988）S436）の遺伝 子の分泌シグナルのように、酵母遺伝子由来の分泌シグナルが使用できる。 本発明の特定の態様においては、組み換えＤＮＡは、自律的にもしくは組み込 まれて複製できる発現プラスミドの一部である。 特に、自律複製ベクターは、選ばれた宿主の自律複製配列を用いることによっ て得ることができる。特に、酵母の場合には、これらは、プラスミド（ｐＫＤ１ 、２μ、等）もしくは染色体配列（ＡＲＳ）由来の複製起点であってもよい。 組み込みベクターは、特に、相同組み換えによって、そのベクターの組み込み を可能にする宿主ゲノムのある領域に相同な配列を用いて得ることができる。 また、本発明は、前記ＤＮＡ配列を含む組み換え細胞に関する。 有利には、その細胞は、酵母の中から、なお一層好ましくは、クルイベロミセ ス属の酵母の中から選ばれる。しかしながら、本発明は、真核細胞でもまた原核 細胞であっても、本発明のプロモーター領域が活性をもつ全ての組み換え細胞を 包含すると理解される。かくして、真核細胞には、植物もしくは動物細胞、酵母 もしくは真菌類を挙げることができる。特に、酵母に関しては、サッカロミセス （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュワニオミセス （Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）もしくはハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ） 属の酵母を挙げることができる。動物細胞に関しては、細胞ＣＯＳ，ＣＨＯ、Ｃ １２７、等を挙げることができる。真菌類では、より具体的には、アス ペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種もしくはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏ ｄｅｒｍａ ）種を挙げることができる。使用できる原核生物宿主は、エシェリヒ ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような細菌類、またはコリネ バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ ）もしくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属するものが使 用される。 これらの種々の宿主における本発明による配列の転写プロモーター 活性は、例えば、問題のプロモーター配列の制御下で、問題の宿主中で発現が実 証されるリポーター遺伝子を含む組み換えＤＮＡを、問題の宿主細胞中に導入す ることによって証明できるであろう。 本発明の組み換え細胞は、外来ＤＮＡを細胞中に導入させ得るいかなる方法に よっても得ることができる。これは、特に、形質転換、エレクトロポレーション 、接合、プロトプラストの融合、または当業者により既知の他のいかなる技術で あってもよい。形質転換に関しては、種々の方法が、先行技術文献に記載されて いる。特に、それは、Ito et al.（J．Bacteriol．153（1983）163-168）記載の 技術による酢酸リチウムおよびポリエチレングリコールの存在下で、またはDurr ens et al．（Curr．Genet．18（1990）7）の技術によりエチレングリコールお よびジメチルスルホキシド存在下で、細胞全体を処理することによって実施され る。また、その他の方法は、欧州特許第361 991号明細書にも記載されている。 エレクトロポレーションに関しては、これは、Becker and Guarentte（in: Meth ods in Enzymolgy vol.194（1991）182）の方法により実施される。 また、本発明は、組み換え遺伝子の発現のための前記配列の使用に関 する。本発明によるそのＤＮＡ配列は、実際に、組み換えタンパク質を高レベル で生産させることができる。 有利には、本発明の配列は、医薬的もしくは農産栄養的興味のあるタンパク質 をコードしている遺伝子の発現のために使用できる。例としては、先に列挙した タンパク質を挙げることができる。 また、本発明は、前記のような組み換え細胞を培養し、生産されたタンパク質 を回収することにより、組み換えタンパク質の生産方法を実現できる。例として は、先に列挙したタンパク質を挙げることができる。 さらに、本発明の特に有利な態様は、プロモーター活性の制御の可能性である 。事実、本発明者らは、配列番号：１の配列のプロモーターが、グルコースによ って抑制され、ラクトースの存在下で活性であることを証明した。したがって、 菌株ＳＤ６（実施例Ｉ／Ｂ．１．参照）においては、配列番号：１の配列のプロ モーターは、グルコースの存在下よりもラクトースの存在下で５０〜１００倍活 性がある。この結果は、細胞増殖期が、目的の組み換え遺伝子の発現期と離れて いる組み換えタンパク質の生産方法の実施を可能にするので重要である。したが って、グルコース培地においては、組み換え細胞は、定常期に達するまで細胞分 裂をする。この点で、培養培地のグルコース濃度は、明瞭に低下し、その結果、 問題の遺伝子の発現の抑制を取り払う。 好ましくは、本発明の方法は、ヒト血清アルブミンもしくはその分子変異体の 一つを生産するために応用できる。アルブミンの分子変異体は、アルブミンの多 形性による天然の変異体、端の切り取られた形、またはアルブミンに基づく全て のハイブリッドタンパク質を意味すると理解される。 本発明のその他の優位性は、続く実施例を読むことにより明らかにされるであ ろうが、その実施例は、例示として、また限定されないものとして考慮されるべ きである。 図の説明 配列番号：Ｎｏ．１ Ｋ．ラクチスの糖輸送遺伝子のプロモーターに対応す る１．３ｋｂの断片のヌクレオチド配列。 図１： トランスポゾンｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１の作製。 図２： トランスポゾンｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１の制限酵素地図。 図３： クローン２Ｃ５の制限酵素地図。 図４： 配列番号：１の配列を担持する３ｋｂの断片ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ の制限酵素地図。 一般的クローニング技術 分子生物学において使用される慣用の方法、例えば、プラスミドＤＮＡの調製 的抽出、塩化セシウム濃度勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、アガロースゲ ルもしくはアクリルアミドゲルにおける電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の 精製、フェノールもしくはフェノール／クロロホルムによるタンパク質の抽出、 エタノールもしくはイソプロパノールによる塩水中でのＤＮＡ沈殿、エシェリヒ ア・コリ等における形質転換は、当業者にとって周知であり、広く文献に記述さ れている［Maniatis T．et al.，“Molecular Cloning，a Laboratory Manual” ，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982; Ausubel F.M．et al.，（editors），“Current Protocols in Molecular Biology”，J ohn Wiley & Sons，New York，1987］。 制限酵素は、New England Biolabs（Biolabs），もしくはPharmaciaによって 供給され、供給先の指示に従って使用される。 タイプｐＢＲ３２２およびｐＵＣのプラスミドは、市販のものである（Bethes da Research Laboratoies）。 連結反応のためには、ＤＮＡ断片が、アガロースゲルもしくはアクリルアミド ゲルの電気泳動によってサイズに従って分離され、フェノールもしくはフェノー ル／クロロホルム混合液を用いて抽出され、エタノールを用いて沈殿され、次い で供給先の指示に従ってファージＴ４のＤＮＡリガーゼ（Boehringer）の存在で インキュベートされる。 突出した５’末端のフィリング・イン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）は、供給先の 指示に従ってＥ．コリのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Boehri nger）によって実施される。突出した３’の末端の破壊は、製造者の指示に従っ て使用されるファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Biolabs）の存在で実施でき る。突出した５’末端の破壊は、ヌクレアーゼＳ１により管理された処理によっ て実施される。 合成オリゴデオキシヌクレオチドによるイン・ビトロでの部位特異的変異誘発 は、Taylor et al．［Nucleic Acids Res．13（1985）8749-8764］により開発さ れた方法に従って実施される。 いわゆるＰＣＲ技術［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉ ｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Saiki R.K．et al.，Science 230（1985）1350-1354; M ullis K.B．and Faloona F．A.，Meth．Enzym．155（1987）335-350］によるＤ ＮＡ断片の酵素的増幅は、製造者の指示に従い、“ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ ｃ ｙｃｌｅｒ”（Perkin Elmer Cetus）を用いて実施できる。 ヌクレオチド配列の確認は、Sanger et al．［Proc．Natl．Acad．Sci．USA，74 （1977）5463-5467］により開発された方法によって実施される。 Ｋ．ラクチスの形質転換は、当業者に既知のいかなる技術によっても実施され 、その実施例は本明細書中に示される。 別に述べられる場合以外は、使用される細菌菌株は、Ｅ．コリＤＨ１（Hanaha n D.，J．Mol．Biol．166（1983）557）もしくはＥ．コリＪＭ１０９：：（Ｍｕ ｃｔｓ）（Daignan-Fornier and Bolotin-Fukuhara，Gene 62（1988）45）であ る。 使用される酵母菌株は、出芽酵母、より具体的には、クルイベロミセス属酵母 に属する。菌株Ｋ．ラクチス２３５９／１５２およびＫ．ラクチスＳＤ６が、特 に使用された。 プラスミドによって形質転換された酵母の菌株は、三角フラスコもしくは２ｌ 容パイロットファーメンター（SETRIC，Franoe）中で、２８℃で一定の撹拌をし つつ高栄養培地（ＹＰＤ：１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％グルコー ス；またはＹＰＬ；１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％ラクトース）に おいて培養される。 実施例 Ｉ − Ｋ．ラクチスの３ｋｂ断片ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩの単離 配列番号：１の配列は、Ｋ．ラクチスのゲノム２３５９／１５２の断片とＥ． コリｌａｃＺ遺伝子間の融合体バンクから単離された。この実施例は、（Ａ）融 合体バンクの作製、（Ｂ）Ｋ．ラクチスのプロモーター配列番号：１の配列を担 持するこのバンクのクローンの選択および特定、において記載する。 Ａ／融合体バンクの作製 Ａ．１．ｍｉｎｉ−ｍｕトランスポゾンＭｕｄＩＩＺＫ１（図１および図２） の作製。 ｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１は、Daignan-Fornier and Bolotin-Fukuha ra（Gene 62（1988）45）により記されたｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＺ１か ら構築された。それは、ｍｉｎｉトランスポゾンＭｕｄＩＩＺＺ１の複製起点を 、クルイベロミセスにおける機能性複製起点：プラスミドｐＫＤ１の複製起点で 置換することによって得られた（欧州特許第231 435号）。 Ａ．１．１．プラスミドｐＫＤ１の複製起点を担持するカセットの構築（断片 Ｓ１１）。 次に続く操作を容易にするために、その断片Ｓ１１（プラスミドｐＫＤ１の複 製起点を担持する）が、ＮｏｔＩカセット形の中に置かれた。このために、プラ スミドｐＵＣ１８の誘導体は、クローニング多重部位（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥ ｃｏＲＩ部位）の外側部位が、ＮｏｔＩ部位に変えられて構築された。これは、 対応する酵素による消化、クレノウ酵素の作用およびＮｏｔＩ部位に対応する合 成オリゴヌクレオチド［オリゴｄ（ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ）；Biolabs］との連 結によって行われた。得られたプラスミドは、ｐＧＭ６７と名付けられる。次に 、プラスミドＫＥｐ６（Chen et al.，Nucl．Acids Res．114（1986）4471）の 酵素Ｓａｕ３Ａによる消化によって得られた９６０ｂｐの断片Ｓ１１が、プラス ミドｐＧＭ６７の適合するＢａｍＨＩ部位に挿入された。このようにして得られ たプラスミドは、ｐＧＭ６８と命名され、ＮｏｔＩカセットの形で、断片Ｓ１１ を含む。 Ａ．１．２．トランスポゾンＭｕｄＩＩＺＺ１の複製起点２μのサプレッショ ン。 ｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＺ１（Daignan-Fornier and Bolotin-Fukuhara 、前出）を担持するプラスミドｐＧＭ１５は、酵素ＳａｌＩによる消化によって ２μ領域を欠失された。このようにして得られた単一のＳａｌＩ部位は、次いで 、クレノウ酵素の作用の後、ＮｏｔＩ部位に対応する合成オリゴヌクレオチドの 連結によって、ＮｏｔＩ部位に転換された。得られたプラスミドは、ｐＧＭ５９ と呼ばれる。 Ａ．１．３．断片Ｓ１１の挿入 改変されたプラスミドｐＵＣ１８由来のプラスミドｐＫＤ１の複製起点を担持 するカセットＮｏｔＩ（断片Ｓ１１）は、次いで、プラスミドｐＧＭ５９の唯一 のＮｏｔＩ部位中に導入された。 得られたプラスミドは、ｐＧＭ８３と命名され、酵母クルイベロミセス・ラク チスに適切であるＭｕｄＩＩＺＫ１と呼ばれるｍｉｎｉ−ｍｕ、ならびにＫ．ラ クチスにおけるｌｅｕ２変異を相補できるＳ．セレビシ urr．Genet．19（1991）109）。ｍｉｎｉ-ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１の制限酵素地 図は、図２に示される。 Ａ．２．ｍｕヘルパーＪＭ１０９：：（Ｍｕｃｔｓ）を担持するＥ．コリ菌株 中へのｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１の導入： 菌株ＪＭ１０９：：（Ｍｕ ｃｔｓ）：：（ＭｕｄＩＩＺＫ１）が得られる。 菌株ＪＭ１０９：：（Ｍｕｃｔｓ）は、塩化カルシウムの存在で、ｍｉｎｉ− ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１を含むプラスミドｐＧＭ８３によって形質転換された。 形質転換後、転位が、Castilho et al.（J．Bacteriol．158 （1984）488）記載の技術に従い、熱ショックによって誘導された。次いで、 誘発後得られたファージ溶菌液が、菌株ＪＭ１０９：：（Ｍｕｃｔｓ）の二次感 染のために使用される。菌株ＪＭ１０９：：（Ｍｕｃｔｓ）は、ｒｅｃＡである ので、ファージによって包膜された直鎖状ＤＮＡは、再閉鎖して複製するプラス ミドを生成することができない。かくして、組み込みユニット［菌株ＪＭ１０９ ：：（Ｍｕｃｔｓ）：：（ＭｕｄＩＩＺＫ１）］は、クロラムフェニコール耐性 （Ｃｍ^R）、アンピシリン感受性（Ａｍｐ^S）クローンとして選択される。 Ａ．３．Ｅ．コリＤＨ１におけるＫ．ラクチスのゲノムバンクの調製 高分子量のＤＮＡが、Ｋ．ラクチス２３５９／１５２株から調製され、酵素Ｓ ａｕ３Ａによって部分的に消化された。サイズ４〜８ｋｂの断片が、ＬＭＰ（“ 低融点”、SEAKAM）アガロースゲル上で回収され、ＢａｍＨＩにより直鎖化され たプラスミドｐＢＲ３２２中にクローン化され、コウシ腸ホスファターゼ（Biol abs）の作用で脱リン酸された。このようにして、Ｅ．コリＤＨ１における１０ ００コロニーをもつ３５プールが得られた。各プールの１０００コロニーは、ア ンピシリン耐性およびテトラサイクリン感受性であり、このことは、それらが、 ｐＢＲ３２２中に、Ｋ．ラクチスのゲノムＤＮＡ断片を全て挿入したことを示し ている。 Ａ．４．融合体バンクの作製 Ａ．４．１．菌株ＪＭ１０９：：（Ｍｕｃｔｓ）：：（ＭｕｄＩＩＺＫ１）中 へのＫ．ラクチスのゲノムバンクの導入。 ＤＨ１において作製された各プールのプラスミドＤＮＡが抽出される（Maniat is）。次いで、このＤＮＡが、塩化カルシウムの存在下、菌株Ｊ Ｍ１０９：：（Ｍｕｃｔｓ）：：（ＭｕｄＩＩＺＫ１）を、形質転換するために 使用される。ゲノムバンクの各プールに含まれる１０００コロニーを代表させる ために、プール当たり３０００クローン以上が、形質導入されている菌株ＪＭ１ ０９：：（Ｍｕｃｔｓ）：：（ＭｕｄＩＩＺＫ１）において回収された。 Ａ．４．２．ｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１の転位 融合体バンクは、Ｋ．ラクチスのゲノムＤＮＡバンクを形成するプラスミド上 へのｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１の広範な転位によって得られる。ミニ・ ミューダクション（ｍｉｎｉ−ｍｕｄｕｃｔｉｏｎ）は、Castilho et al．（J ．Bacteriol．158（1984）488）に記載の方法により実施され、形質導入体が、 ＬＢＡＣ選択培地（アンピシリン５０ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ ／ｍｌを補足されたＬＢ培地（Gibco BRL））上で、プラスミドによって与えら れたマーカーＡｍｐ^Rおよびｍｉｎｉ−ｍｕによるマーカーＣｍ^Rについて、選択 された。各プールについて、その転位は、連続して行われ、プール当たり１０， ０００〜２０，０００の形質導入体が回収される。形質導入体のＤＮＡは、次に 、調製物１００ｍｌから抽出され、ポリエチレングリコールを用いる沈殿によっ て精製され（Maniatis et al.，1989）、そして水１００μｌに再懸濁される。 次いで、このＤＮＡは、Ｋ．ラクチスを形質転換し、プロモーターを担持するク ローンを選択するために使用される。 Ｂ／Ｋ．ラクチスのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の単離 上記のように作製された融合ＤＮＡは、エレクトロポレーションによって、Ｋ ．ラクチスの受容菌株を形質転換するために使用された。この受容菌株は、ＳＤ ６と呼ばれ、変異ｌｅｕ２（ｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩ ＩＺＫ１の選択マーカーに対応する）およびｌａｃ４−８をもっている。この後 者の変異は、その菌株が、唯一の炭素源としてラクトースを含有する培地上で増 殖するのを妨げるが、それは、β−ガラクトシダーゼをコードしているＥ．コリ のｌａｃＺ遺伝子の過発現によって相補される（Chen et al.，J．Bacic Microb iol．28（1988）211）。それ故、β−ガラクトシダーゼに融合したタンパク質の 発現は、形質転換後のラクトースでのＳＤ６株の増殖を可能にする。このポジテ ィブスクリーンは、強力なプロモーターをもつクローンの迅速な選択に使用され た。 Ｂ．１．受容菌株Ｋ．ラクチスＳＤ６の構築。 菌株ＳＤ６（Chen et al.，Mol．Gen．Genet．233（1992）97）は、菌株Ｋ． ラクチスＣＸＪ１−７Ａ（ａ，ｌａｃ４−８、ｕｒａ３Ａ，ａｄｅｌ−１，ｋ１ ，ｋ２，ｐＫＤ１）（Chen and Fukuhara，Gene 69（1988）181）を、菌株ＡＷ Ｊ−１３７（ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ホモタリッ 伝子型ＡＤＥ⁺，ｕｒａＡ，ｌｅｕ２，ｌａｃ４−８をもつ胞子を選択して得ら れた。得られた胞子は、プロトプラストによる形質転換後には再生することがで きないので、戻し交雑は、菌株ＣＸＪ１−７Ａを用いて行われた。一緒に胞子形 成後、選択された遺伝子型の胞子が、塩化リチウム中で、Ito et al.（J．Bacte riol．153（1983）163）（ＬｉＣｌ濃度２０ｍＭ、すなわち、Ｓ．セレビシエに ついてItoによって使用された濃度の１０倍未満）記載の技術からの方法により 、プラスミドＫＥｐ６を用いる形質転換によって試験された。菌株ＣＸＪ１−７ Ａは、形質転換対照株として使われた。 これらの基準で選択された菌株ＳＤ６は、正確に形質転換され：ＤＮ Ａ１μｇ当たり１〜３ｘ１０⁴の形質転換株、そして形質転換株は十分安定であ る：非選択培地で６代継代後、コロニーの３０〜４０％が表現型［Ｕｒａ⁺］を 保持している。 Ｂ．２．ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の単離 菌株ＳＤ６は、Becker and Guarante（Methods in Enzymology vol.194（1991 ）182）（Ｊｏｕａｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ；２５００Ｖ／ｃｍ； ８０−１０ ０ｎｇＤＮＡ／形質転換）によるエレクトロポレーションによって、Ａ．４．２ ．において得られた形質導入体の１１プールのＤＮＡ（Ｅ．コリにおける１１， ０００クローンのバンクに対応）を用いて形質転換された。ＹＰＤ培地（酵母エ キス１０ｇ／ｌ；ペプトン１０ｇ／ｌ；グルコース２０ｇ／ｌ）で５時間再生後 、その細胞は、最少ラクトース培地に撒かれた。ラクトース上で増殖可能な形質 転換株が、各コロニーについて再びストリーク培養され、そして各クローンにつ いて、そのプラスミドが、抽出され、Ｅ．コリで増幅され、そしてそのベクター の制限酵素地図およびｍｉｎｉ−ｍｕの素早い確認の後、酵母ＳＤ６を再形質転 換するために使用された。再形質転換後、得られたＫ．ラクチスのクローンの中 で、その一つ、クローン２Ｃ５が、制限酵素（図３、参照）によって、またＫ． ラクチスのタンパク質とβ−ガラクトシダーゼとの接合体の配列の分析によって 研究された。このために、ｍｉｎｉ−ｍｕのｌａｃＺ末端から始まる接合体の配 列（二本鎖配列）が、接合体から−５９ヌクレオチドに位置する次のオリゴヌク レオチド： ５′−ＣＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＡＧＣＧＣＧ−３′ を用いる配列決定によって決定された。 他の酵母もしくは真核生物（Ｇｅｎｂａｎｋ，ＭＩＰＳ，ＥＭＢＬ， 等）のタンパク質バンクの配列との比較によって、このように得られたヌクレオ チド配列から由来するタンパク質配列の解析は、クローン２Ｃ５によってもたら された配列が、糖の輸送に関与する遺伝子に対応することを示している。次いで 、融合体の上流領域を含む３ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片が、ベクターＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Stratagene）中にサブクローン化され、制限酵素 地図が作られ（図４）、そしてその配列が、１ｋｂ以上の逐次欠失によって決定 された（配列番号：Ｎｏ．１）。また、配列要素の収得により、当業者は特異的 なプローブを作製でき、そして分子生物学の慣用技術によるハイブリダイゼーシ ョンによって、本発明のプロモーター領域を再クローン化できる。 ＩＩ−クルイベロミセスの形質転換。 酵母中にＤＮＡを導入させる種々の技術が使用される。 有利には、使用されるクルイベロミセスの種々の菌株が、Ito et al．（J．Ba cteriol．153（1983）163-168）記載の技術に従って、酢酸リチウムおよびポリ エチレングリコールの存在下で、細胞全体を処理することによって形質転換され た。エチレングリコールおよびジメチルスルホキシドを用いるDurrens et al． （Curr．Genet．18（1990）7）記載の形質転換技術も、同様に使用された。また 、例えば、Karube et al.（FEBS Letters 182（1985）90）記載の方法により、 エレクトロポレーションによって酵母を形質転換することもできる。 その他の方法は、既に欧州特許出願第361 991号に詳細に記載されている。 ＩＩＩ − 配列番号：１のプロモーターの使用による異種遺伝子の発現。 配列番号：１の配列に記載のＫ．ラクチスの領域の転写プロモーター活性は、 菌株ＳＤ６のｌａｃ４−８変異の相補を導く能力によって、その単離の時におい ても例証された。事実、この能力は、Ｅ．コリのｌａｃＺ遺伝子の発現の結果で あり、異種遺伝子の発現能をこれによって例証する。 ＩＶ − ポータブルプロモーターの構築 ポータブルプロモーターは、ＡＴＧコドンに関して位置＋１における制限酵素 部位を、３ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片へ挿入することによって、ＰＣＲ によって作製される。 この部位の挿入は、プロモーター領域を含む断片を生産し、そして、このよう に得られたプロモーターの下流に、発現が望まれるいかなる遺伝子をも導入する ことを可能にする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号：１の配列、またはその相補鎖、またはそれらの誘導体の全部 もしくは一部を含み、そして転写プロモーター活性を有するＤＮＡ断片。 ２． 図４に表されるＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片３ｋｂの全部もしくは一部 を含むＤＮＡ断片。 ３． 請求の範囲１または２記載のＤＮＡ断片を含む組み換えＤＮＡ。 ４． 組み換えＤＮＡが、１つ以上の構造遺伝子も含むことを特徴とする、請 求の範囲３記載の組み換えＤＮＡ。 ５． 組み換えＤＮＡが、該構造遺伝子の発現生産物を分泌させるシグナルも 含むことを特徴とする、請求の範囲４記載の組み換えＤＮＡ。 ６． 該構造遺伝子が、医薬的または農産栄養的興味のあるタンパク質をコー ドしていることを特徴とする、請求の範囲４および５記載の組み換えＤＮＡ。 ７． 該構造遺伝子が、酵素類（例えば、特にスーパーオキシドジスムターゼ 、カタラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キモシン等）、血液誘導物 （例えば、血清アルブミン、α−もしくはβ−グロブリン、ファクターＶＩＩＩ 、ファクターＩＸ、フォンビルブランド因子，フィブロネクチン、１−α−アン チトリプシン等）、インシュリンおよびその変異体、リンホカイン（例えば、イ ンターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−Ｃ ＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ・・・）、ＴＮＦ、ＴＲＦ、等）、増殖因子（例えば、成長ホ ルモン、エリスロポイエチン、ＦＧＦ，ＥＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦ、等）、アポ リポタンパク質、ワクチン（肝炎、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バ ール、ヘルペス、等）の生産のための抗原ポリペプチド、あるいは特に、安定化 部分に融合された活性部分を含有する融合体のようなポリペプチド融合体（例え ば、アルブミンもしくはアルブミン断片とウイルスレセプターもしくはウイルス レセプターの一部分（ＣＤ４、等）との融合体）から選ばれるタンパク質もコー ドしていることを特徴とする、請求の範囲６記載の組み換えＤＮＡ。 ８． 組み換えＤＮＡが、自律的にもしくは組み込まれて複製できる発現プラ スミドの一部であることを特徴とする、請求の範囲２〜７のいずれか１つに記載 の組み換えＤＮＡ。 ９． 前記請求の範囲のいずれか１つに記載のＤＮＡ配列、または組み換えＤ ＮＡを含む組み換え細胞。 １０．組み換え細胞が酵母であることを特徴とする、請求の範囲９記載の組み 換え細胞。 １１．組み換え細胞が、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属 の酵母であることを特徴とする、請求の範囲１０記載の組み換え細胞。 １２．組み換え遺伝子の発現のための、請求の範囲１〜８のいずれか１つに記 載のＤＮＡ配列の使用。 １３．医薬的または農産栄養的興味のあるタンパク質をコードしている遺伝子 の発現のための、請求の範囲１２記載の使用。 １４．請求の範囲９〜１１のいずれか１つに記載の組み換え細胞が培養され、 そして生産されたタンパク質が回収されることを特徴とする、組み換えタンパク 質の製造方法。 １５．医薬的または農産栄養的興味のあるタンパク質の製造のための、 請求の範囲１４記載の方法。 １６．タンパク質が、好ましくは、ヒト血清アルブミンまたはその分子変異体 の１つであることを特徴とする、請求の範囲１５記載の方法。