JP3416888B2

JP3416888B2 - プラスミド安定化

Info

Publication number: JP3416888B2
Application number: JP51099497A
Authority: JP
Inventors: デイビッドジョンシェラット，; スティーブンジェライントウィリアムズ，; ジュリアンアレクシスジョンハナック，
Original assignee: セレクシスリミテッド
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 2003-06-16
Anticipated expiration: 2016-09-06
Also published as: JPH11511985A; GB9518395D0; ATE199168T1; US5972708A; PT851932E; CA2231784A1; AU6885596A; AU710494B2; ES2155620T3; CA2231784C; DE69611794T2; KR100356581B1; GR3035806T3; DE69611794D1; KR19990044525A; DK0851932T3; WO1997009435A1; EP0851932B1; EP0851932A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、一般に、プラスミドの安定な維持に関し、
そして特に、遺伝子治療において有用な遺伝子を含むプ
ラスミドに関する。

発明の背景プラスミドの安定な維持（特に、高コピー数におけ
る）は、遺伝子治療における使用のための治療的遺伝子
を有するDNAの調製のために重要である。しかし、宿主
細胞中に保有される染色体外DNAは、本来細胞培養にお
いて不安定である。なぜなら、プラスミドを含有する培
養細胞は、通常、プラスミドを含まない分離体（segreg
ant）細胞に比較して、増大した代謝負担を有するから
である。プラスミド安定性を維持し、そして代謝負担を
減少させる努力において、優性選択マーカーを含むよう
に操作されたプラスミドが、慣例的に使用されている。
細菌または酵母宿主株のスケールアップ発酵の間、選択
薬剤の存在はプラスミドの消失、ならびにプラスミドDN
Aの複製および維持の努力を負担していない細胞の過剰
増殖を防止する。

抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン、カナマ
イシンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対す
る耐性をコードする）は、分子生物学クローニングおよ
び組換えタンパク質またはプラスミドDNAの生産のため
の発酵手順において使用される、最も一般的な優性選択
マーカーである。抗生物質の存在下における連続発酵に
ついては、選択圧は失われる。なぜなら、培養物の希釈
または宿主細胞による分解によって、抗生物質は経時的
に活性を失うからである。それゆえ、プラスミドを維持
するためのより成功する方法のいくつかは、抗生物質選
択を利用せず、むしろアミノ酸を合成し得ない変異体宿
主およびこの合成を提供する遺伝子をプラスミド中に挿
入することに依存する。プラスミドを含まない分離体に
よる培養物の乗っ取り（takeover）を防止するその他の
解決法は、毒性産物をコードする遺伝子を染色体中に配
置し、次いで対応するリプレッサー系をプラスミド中に
含ませることを含む。プラスミドを含まない細胞は、分
離の際に効率的に死滅される。

しかし、選択圧を有してさえも、プラスミドを含まな
い細胞は、プラスミドを有する細胞由来の選択遺伝子の
相補する産物の漏れによって、増殖をし続け得る。さら
に、遺伝子治療のために意図されるベクター上の抗生物
質耐性マーカー遺伝子または他の優性選択マーカー遺伝
子の使用は、標的哺乳動物細胞または宿主哺乳動物生物
におけるそれらの遺伝子の発現に関連する潜在的な問題
を引き起こした。標的哺乳動物細胞におけるそれらの遺
伝子の発現は、哺乳動物におけるその破壊および／また
は遺伝子産物に対する抗原性応答へ導き得る。抗生物質
に対する重篤な免疫応答の可能な誘導（例えば、アナフ
ィラキシーションク）を伴う、培養物におけるプラスミ
ド選択のために使用された抗生物質での最終産物の汚染
に関する懸念もまた存在する。抗生物質耐性細菌遺伝子
の広範な使用はまた、最終的に、全体としての細菌集団
へのその移入を生じる。それゆえ、プラスミドが有する
遺伝子の存在も抗生物質選択も必要としないプラスミド
維持の方法についての必要性が存在する。

発明の要旨本発明は、プラスミドが有する優性選択マーカーの使
用を必要とせず、リプレッサー滴定（titration）の系
を利用するプラスミド維持系を見出したことに基づく。

本発明は、トランスに発現させるリプレッサーによる
結合に感受性のオペレーターを含むプラスミド、リプレ
ッサーをコードする第１の染色体遺伝子、およびオペレ
ーターと機能的に結合しており、そして細胞増殖に必須
な第２の染色体遺伝子を含む形質転換された宿主細胞を
包含する。ここで、プラスミドは細胞中にリプレッサー
を滴定するに十分な数で存在し、その結果必須遺伝子が
発現され、それにより細胞増殖を可能にする。

オペレーター配列および結合する遺伝子に関して本明
細書中で使用される「機能的に結合した」または「作動
可能に結合した」は、オペレーターが遺伝子にシスに連
結されており、その結果遺伝子の発現がリプレッサーの
オペレーターへの結合に際しての抑制に感受性であるこ
とを意味する。

用語オペレーターが、リプレッサーが結合して、結合
されたプロモーターからの転写を防止する任意の核酸配
列を定義するために使用されることは、当業者により理
解される。プラスミドのオペレーターが、染色体遺伝子
の転写を抑制するリプレッサーを結合するために必要な
最小の配列からなる必要のみがあるという点で、プラス
ミド上に存在するオペレーター配列は、染色体上のオペ
レーター配列と同一である配列である必要はない。変異
されたオペレーター配列（例えば、対応するリプレッサ
ーに対する増加したまたは減少した親和性を生じる、挿
入、欠失、または置換された１つ以上のヌクレオチドを
有する配列）もまた本発明に従って有用であることもま
た理解される。

本明細書中で使用される「細胞増殖」は、培養培地中
の経時的な細胞数の増加をいい、そしてまた細胞数は経
時的に増加しないが、むしろ生存細胞数は経時的に減少
しない場合の細胞生存をいう。

好ましくは、リプレッサー遺伝子は、E.coli lacリプ
レッサー、λリプレッサー、E.coli trpリプレッサー、
E.coli galRリプレッサー、E.coli araCリプレッサー、
E.coli ArgRNVリプレッサー（Burkeら（1994）Mol.Micr
obiol.,13,609−618）およびE.coli Tetリプレッサーの
１つをコードする。上記のように、各リプレッサーは、
染色体中およびプラスミド上の両方に存在するトランス
に結合するオペレーター配列とトランスに作動可能であ
る。本発明は、１つの染色体リプレッサー遺伝子が変異
されるかまたは欠失されるようになる場合にプラスミド
の安定性を確実にするためには、宿主染色体上の１つ以
上のリプレッサー遺伝子（例えば、１つ、２つ、または
３つのリプレッサー遺伝子）の存在を意図する。

それゆえ、好ましいオペレーター配列は、lacオペレ
ーター、λオペレーター、trpオペレーター、galオペレ
ーター、araオペレーター、ArgオペレーターおよびTet
オペレーターを含む。所望であれば、対応するプロモー
ターが、そのオペレーターと機能的に結合され得る。

宿主細胞は、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞および
昆虫細胞）、植物細胞、菌類（例えば、酵母）ならびに
細菌を含む任意の細胞であり得る。

好ましい実施態様において、宿主細胞は、グラム陰性
または陽性のいずれかであり得る細菌細胞（例えば、E.
coli、Salmonella、Bacillus、StreptomycesおよびLact
obacillus）である。

宿主細胞が真核生物細胞である場合、LacおよびTetリ
プレッサーおよびその対応するオペレーターが好ましく
使用される。酵母、タマホコリカビ（dictiosteliu
m）、植物細胞およびタバコ植物を含む真核生物細胞に
おける遺伝子発現を調節するためのLacおよびTetリプレ
ッサーの使用は、Gossenら（（1994）Current Opinions
in Biotechnology,5,516−520）に記載されている。

オペレーターと機能的に結合している１つより多い異
なる必須染色体遺伝子が、細胞染色体中に存在して（こ
こで、必須遺伝子はオペレーターに連結されており、そ
してそれゆえリプレッサーによる抑制に対して感受性で
ある）、１つの染色体オペレーターにおけるリプレッサ
ー感受性の消失に対して予防し得る。本発明の１つの好
ましい実施態様において、リプレッサータンパク質をコ
ードする遺伝子が染色体中の異なる位置において２つま
たは３つのコピーが存在して、１つの染色体位置におけ
るリプレッサー発現の消失に対して予防する。

宿主染色体上に配置される好ましい必須遺伝子は、以
下のカテゴリー内に分けられる遺伝子を含むがそれらに
限定されない：細胞壁前駆体のような細胞代謝物の生合
成に関連する産物をコードする遺伝子、その産物が炭素
代謝に関与する遺伝子、抗生物質耐性をコードする遺伝
子、および高分子の生合成または調節をコードする遺伝
子（例えば、DNAおよび／またはRNA合成ならびに複製機
能のために必須な遺伝子）。

好ましくは、プラスミドは、宿主細胞当たり約20コピ
ーのプラスミド、または宿主細胞当たり約200コピー程
のプラスミドの複製を可能にする複製起点を含む。この
ようなプラスミドの例は、pBR322、ならびにVieiraおよ
びMessing（1982,Gene,19（３）,259−268）ならびにYa
nisch−Perronら（1985,Gene,33（１）,103−119）に記
載のようなpUCシリーズのプラスミド（本明細書におい
てpUCという）を含むが、それらに限定されない。

プラスミドが、目的の遺伝子の挿入のためのクローニ
ング部位を含むことが好ましい。

本発明の１つの特に好ましい実施態様において、プラ
スミドは、目的の遺伝子をさらに含む。好ましくは、目
的の遺伝子は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）細胞にお
いて発現可能である。そのような遺伝子の例は当該分野
において公知であり、そして本明細書中に開示される。
所望であれば、目的の遺伝子は、宿主株において発現さ
れない。宿主株が細菌である場合、これは、目的の遺伝
子に細菌プロモーターを含ませないことにより達成され
得る。さらに、所望であれば、目的の遺伝子は、プラス
ミドのオペレーター配列に結合され得、その結果この遺
伝子の発現がプラスミドで形質転換された宿主細胞の増
殖に際して抑制される。これらは、宿主細胞に対する、
コードされる目的のタンパク質の生産の、代謝負担を軽
減させるように作用する。あるいは、目的の遺伝子の発
現が所望される場合（例えば、コードされるタンパク質
を生産および単離することが所望される場合）、細胞増
殖に際して目的の遺伝子の発現を抑制するようにオペレ
ーターが配置される必要はなく、そして目的の遺伝子の
発現は、宿主細胞中で活性なプロモーターにより駆動さ
れ得る。

本発明はまた、プラスミドが宿主細胞におけるその複
製および維持のために必要な配列のみを含む、上記の宿
主細胞を包含する。すなわち、プラスミドは本質的に、
トランスに発現されるリプレッサーによる結合に感受性
であるオペレーター、複製起点、および目的の遺伝子の
挿入のためのクローニング部位からなる。

本発明はまた、上記の最小プラスミド（すなわち、ト
ランスで発現されるリプレッサーによって結合されやす
いオペレーター、複製起点、および目的の遺伝子の挿入
のためのクローニング部位から本質的になる）を包含す
る。本明細書で使用する「から本質的になる」は、プラ
スミドが、宿主株においてプラスミドを維持するために
必要な配列、および治療的遺伝子の挿入のためのクロー
ニング部位のみを含むことを意味する。すなわち、プラ
スミドは、宿主細胞での生存に不要な配列を含まない。
本明細書で使用する「複製起点」は、１細胞あたり所定
のコピー数でプラスミドを維持するのに必要なプラスミ
ド上の配列をいう。

好ましくは、この最小プラスミドは約1000bp長であ
る。より好ましくは、この最小プラスミドは、約2Kb長
であり、ここで、プラスミドに含まれる、オペレーター
配列、複製起点、およびクローニング部位以外のDNA
は、非コードDNAである。

この最小プラスミドが、標的細胞内での発現のための
制御配列と作動可能に会合している目的の遺伝子をさら
に含むことは、特に好ましい。好ましくは、標的細胞は
哺乳動物細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。

この最小プラスミドは、細菌の配列のような最小の外
来DNA配列のみを含むという顕著な利点を有し、従っ
て、例えば、プラスミドが遺伝子治療のためのベクター
として意図される場合の、哺乳動物細胞株への外来DNA
配列の導入に関連する問題が顕著に減少する。従って、
本発明によって回避される問題には、哺乳動物標的細胞
における、細菌または酵母の遺伝子のようなプラスミド
由来の遺伝子の発現が含まれる。この発現によって、標
的細胞または哺乳動物宿主それ自体の破壊が導かれる
か、または外来DNAまたはこのような配列にコードされ
る産物に対する免疫応答の発達が導かれる。

本発明はまた、プラスミドを宿主細胞内で維持する方
法を包含し、本方法は、上記の形質転換された細胞を、
細胞が増殖するのに十分な時間および条件下で、培養す
る工程を包含する。

本発明はまた、プラスミドDNAを生成する方法を包含
し、本方法は、上記の形質転換された細胞を、細胞が増
殖するのに十分な時間および条件下で培養する工程、お
よび培養した細胞からプラスミドDNAを単離する工程を
包含する。

本発明はまた、組換えタンパク質を産生する方法を包
含し、本方法は、上記の形質転換された宿主細胞を、組
換えタンパク質を産生するのに十分な時間および条件下
で培養する工程を包含する。好ましくは、本方法は、組
換えタンパク質を単離する工程をさらに包含する。好ま
しくは、組換えタンパク質は、ヒトに対して治療的に有
益なタンパク質である。

本明細書中に記載するリプレッサー滴定系を使用する
組換えタンパク質の産生は、プラスミド上のコード領域
のみが組換えタンパク質をコードする遺伝子であるとい
う点で、宿主細胞での代謝負荷を減少させる。従って、
宿主細胞は、組換えタンパク質以外のプラスミドコード
タンパク質の産生を支持する必要はない。さらに、本明
細書中に記載されるリプレッサー滴定系により、抗生物
質の非存在下での組換えタンパク質の産生が可能にな
り、従って、培養物における抗生物質の活性の喪失に起
因するプラスミド選択の喪失が避けられる。さらに、単
離された組換えタンパク質には、抗生物質が混入しな
い。

本明細書中に記載するリプレッサー滴定系は、プラス
ミドコード優性選択マーカー（例えば、抗生物質耐性の
ためのマーカー）を用いることなく、中程度のコピー数
または高コピー数でのプラスミドの安定な維持を可能に
し、そしてトランス作用リプレッサー／オペレーター系
を支持し得る任意の宿主と共に使用され得る。本発明の
１つの利点は、プラスミド保有細胞の抗生物質選択以外
によるプラスミド維持の信頼性である。すなわち、抗生
物質の活性の喪失に起因する、発酵の間の選択圧力の喪
失が無い。本明細書中に記載するように、プラスミドに
優性選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）が存
在しないことはまた、標的哺乳動物細胞におけるこれら
の遺伝子の発現に関連する非常に深刻な問題を避けると
いう点で、有利である。従って、本発明はまた、遺伝子
療法を意図する産物に、遺伝子治療ベクターの選択のた
めに使用する抗生物質が混入することを避ける。さら
に、本発明は、このような抗生物質に対する重篤な免疫
応答（例えば、アナフィラキシーショック）の潜在的な
誘導を避ける。

本明細書中に記載するプラスミド安定系の１つの顕著
な利点は、抗生物質耐性をコードする細菌の遺伝子の広
範囲の使用を避けることであり、この使用により、全体
として細菌集団におけるこのような遺伝子の移入が促進
される傾向がある。

本発明の他の特性および利点は、以下の好ましい実施
態様の説明および請求の範囲から明らかである。

図面の簡単な説明図１は、本発明のプラスミドで形質転換した宿主細胞
の概略図である；図２は、本発明の最小プラスミドの概略図である；図３は、唯一の炭素供給源としてラクトースまたはグ
ルコースを含む最小培地での、pUC18で形質転換してい
ない、および形質転換したE.coli株Hfr3000 YA694の増
殖を示す。Ａ）Hfr 3000 YA694（Min/Gluc/B1）、Ｂ）H
fr 3000 YA694（Min/Lac/B1）、Ｃ）Hfr 3000 YA694−p
UC18（Min/Gluc/B1/Ap）、Ｄ）Hfr 3000 YA694−pUC18
（Min/Lac/B1/Ap）；図４は、アンピシリンおよびグルコースを含有する最
小培地で増殖させ、次いでａ）ラクトースおよびアンピ
シリン、ｂ）ラクトース、ｃ）グルコースを含む最小培
地中に接種した細胞のプラスミドDNAを示す；ここで、
トラック１ λHind III標準、トラック２ EcoR I制限
接種プラスミドDNA、トラック３〜６それぞれ、約1
5、36、55、および72細胞世代の増殖の後に単離したEco
R I制限プラスミドDNA; 図５は、カナマイシンの存在下でのJC7623 lacZ−kan
の活性化可能増殖を示す；図６は、カナマイシンの存在下でのDH1 lacZ−kanの
活性化可能増殖を示す；図７は、ジアミノピメレートの非存在下でのJC7623 d
apD−kan lacZ−dapDの活性化可能増殖を示す。

説明本発明は、以下の制限しない実施例によって例証され
る。ここで、以下の材料および方法が用いられる。本明
細書中以下で援用される各参考文献の全開示は、参考と
して本明細書中に援用される。

本発明は、新規なリプレッサー滴定（図１）の系を使
用する、宿主細胞におけるプラスミドの生成および維持
を改善するための、形質転換した宿主細胞、プラスミ
ド、および方法に基づく。本発明によって生成されたプ
ラスミドDNAは、遺伝子治療において有用である。プラ
スミドそれ自体は、図２に示すように、特定の最小の配
列からなり得、そして目的の治療的遺伝子を保有し得
る。新規なリプレッサー滴定系は以下のように働く。

図１および２に示す系は、配列16（すなわち、オペレ
ーター）に結合しているプラスミド由来のリプレッサー
タンパク質を用いて形質転換した宿主細胞10、およびリ
プレッサータンパク質12をコードする遺伝子の宿主染色
体コピーを利用する。別の染色体遺伝子14は、その産物
は宿主細胞の増殖または生存に必須であり、リプレッサ
ータンパク質に結合しているオペレーター16に作動可能
に会合している（すなわち、オペレーター16の制御下に
位置している）。プラスミド15の非存在下では、染色体
オペレーターへのリプレッサーの結合によって必須遺伝
子の発現が妨げられ、そして細胞は、インデューサーの
存在下でしか増殖し得ない。続いてリプレッサータンパ
ク質の結合部位を含むプラスミドを導入することによっ
て、染色体オペレーターから離れるリプレッサータンパ
ク質の滴定が生じ、従って、必須遺伝子の発現が可能に
なる。従って、インデューサーの非存在下では、プラス
ミドを含有する細胞のみが増殖する。これは、プラスミ
ド上のオペレーター配列の存在によってプラスミドがリ
プレッサーを滴定することが可能になり、従って、そう
でなければ染色体オペレーターに結合するために利用し
得るリプレッサー分子を除去するからである。プラスミ
ドオペレーター配列によるリプレッサーの滴定は、必須
染色体遺伝子の発現、およびプラスミドを含む細胞のみ
の増殖を可能にする。宿主株が、リプレッサーが高コピ
ー数で合成されるように操作されると、プラスミドは高
コピー数でさえ維持される。

図２に示すように、プラスミド15は、オペレーター16
に結合する配列、および複製起点18、およびクローニン
グ部位20を含むことのみが必要である。

本発明に有用なリプレッサー／オペレーター系本発明は、任意のトランス作用リプレッサー／オペレ
ーター系と共に使用され得る。例えば、本明細書中に記
載されるリプレッサー滴定系は、そのDNA結合配列に対
して十分な親和性を有する任意のリプレッサーを含み
得、その結果、必須染色体遺伝子の発現を妨げ得るが、
また、プラスミド由来DNA結合配列によって滴定され得
る。

リプレッサーによる抑制を受けやすい必須染色体遺伝
子は、リプレッサーに結合しているオペレーター／プロ
モーターの制御下に置かれているという点で抑制を受け
やすくなるか、または、リプレッサー結合配列（すなわ
ち、オペレーター）は、リプレッサーに結合されたとき
に転写を妨げ得るが、天然のプロモーターの、結合して
いるリプレッサーの非存在下で必須遺伝子の転写を開始
する能力を破壊しない様式で、必須遺伝子の天然のプロ
モーターに挿入されているかまたはこれに会合してい
る。

１つより多い異なる必須遺伝子（例えば、２つまたは
３つの遺伝子）が染色体に存在し得、各遺伝子はオペレ
ーター配列に機能的に連結され、従ってリプレッサーに
よる抑制に対して感受性である。染色体における（好ま
しくは、染色体の異なる位置における）異なるリプレッ
サー感受性必須遺伝子の存在は、変異または欠失による
プラスミド安定性の喪失の可能性を減じて、必須染色体
遺伝子の抑制の喪失をもたらす。

リプレッサーは、染色体遺伝子によってコードされ
る。本発明によると、１つ以上（好ましくは、１つ、２
つまたは３つ）のコピーの染色体リプレッサー遺伝子
が、宿主細胞に存在する。染色体リプレッサー遺伝子
は、改変されていない天然に生じた遺伝子であり得る
か、または染色体リプレッサー遺伝子は、その対応する
オペレーターに結合する強さに関して高いかまたは低い
親和性のリプレッサー分子を与える遺伝的変異を含み得
る。このような変異は先行技術分野に公知であり、例え
ば、lacリプレッサーのそのオペレターに対する親和性
が単一のアミノ酸変化によって増強され得る（Betz、
（1986）Gene、42、283−292、およびKhouryら、（199
1）J.Mol.Biol.、219、623−634を参照のこと）。ある
いは、より多いかもしくはより少ないコピーのオペレー
ター結合部位がプラスミド中に導入され得るか、また
は、より多いかもしくはより少ないコピーのリプレッサ
ー遺伝子が染色体上、またはプラスミドで実施される他
の実施態様中に導入され得る。

あるいは、プロモーター、エンハンサーなどのような
リプレッサー遺伝子の発現を開始する配列は、多数もし
くは少数のリプレッサー分子が細胞中に作製されるよう
に、変異され得るか、または遺伝子操作され得る。例え
ば、lacIリプレッサーのコピー数は、lacIq変異の導入
によって増加され得る（Carlos（1978）Nature 274、76
2−765を参照のこと）。細胞中に存在するリプレッサー
分子の数は、対応するオペレーター配列を有するプラス
ミドのコピー数に関連する。本発明のリプレッサー滴定
系によれば、宿主細胞中に存在するリプレッサー濃度
は、プラスミドの非存在下では、目的の必須遺伝子は発
現されないが、しかしプラスミドの存在下では、リプレ
ッサーが必須遺伝子から離れて滴定されるような濃度で
ある。１コピーより多い（例えば、２または３コピー）
リプレッサーが染色体中に存在する場合、細胞中で作製
されるリプレッサータンパク質の量は、１つの遺伝子の
存在に比例して増加する；この増加は、対応するプラス
ミドの複製起点を選択する際、および細胞中に存在する
染色体のオペレーター／必須遺伝子の数を選択する際に
考慮される。

オペレーターの強さおよびリプレッサーの親和性は、
異なるコピー数のプラスミドとともに使用するための系
を作製するために改変され得る。例えば、lacオペロン
の抑制程度は、最適に配置された、補助的な理想的lac
オペレーター（すなわち、増強されたリプレッサー親和
性を有するlacオペレーター）の導入、またはプロモー
ター内での理想的オペレーターの導入によって増強され
得る（Mullerら、（1996）Mol.Biol.、257、21−29、お
よびLewisら、（1996）Science 271、1247−1254）。あ
るいは、オペレーターの強さは、非理想的オペレーター
の導入、オペレーターの非最適配置、または補助的オペ
レータの除去によって低減され得る（Mullerら、（199
6）Mol.Biol.、257、21−29、およびOehlerら、（199
0）EMBO J.219、973−979）。例えば、lacリプレッサー
のそのオペレーターに対する親和性は、単一のアミノ酸
変化によって増強され得る（Betz、（1986）Gene、42、
283−292）。

本発明によって有用なリプレッサー系は、以下を含む
が、これに限定されない。E.coli lacリプレッサーは：
「ラクトースオペロン」、J.Beckwith、Escherichia co
li and Salmonella typhimurium、J.L.Ingrahamら編、1
987 Amer.Soc.Micro.、1444−1452頁、およびDickson
ら、1975、Science 187:27−35に記載される。lacオペ
ロンは以下のように調節される。非誘導条件下（例え
ば、グルコースでの増殖）では、LacIはlacオペロンの
オペレーターに結合し、そしてβ−ガラクトシダーゼ
（LacZ）、ラクトースペルミアーゼ（LacY）、およびト
ランスアセチラーゼ（LacA）の転写を妨害する。誘導条
件下（例えば、ラクトースでの増殖または代謝不可能な
アナログであるIPTGの添加）では、リプレッサーはもは
やオペレーターに結合せず、そして転写は生じない。オ
ペロンの発現は、β−ガラクトシダーゼについてのアッ
セイによって容易に検出される。本発明によって有用な
他のリプレッサー系は、上記のlacリプレッサー系、お
よび真核生物細胞中の遺伝子活性の調節に使用されるte
tリプレッサー系（Gossenら、（1994）Current Opinion
s in Biotechnology、５、516−520）を含む。tetリプ
レッサー系は、酵母、タマホコリカビ（dictiosteliu
m）、植物細胞、およびタバコ植物に使用されてきた。
本発明によって有用なさらなるリプレッサー系は、ArgR
NVリプレッサー系（Burkeら、（1994）Mol.Microbiol.1
3、609−618）である。ArgRリプレッサーは通常、アル
ギニンの存在下で、そのオペレーターにのみ結合する。
しかし、変異ArgRNVリプレッサーは、アルギニンの非存
在下でオペレーターに結合し、そしてアルギニンの存在
下で結合したままであり、そしてトランス優性（transd
ominant）効果を有する。２つの対称的なArgボックスを
有する理想化されたArgR結合部位（オペレーター）は、
目的のプラスミド中に操作され得て、発現がArgR結合部
位によって制御される必須遺伝子から離れて、ArgRNVの
滴定を可能にする。

特定の改変が、所定のプロトコルに系を適合させるた
めに供される、本明細書中で記載されるリプレッサー滴
定系に作製され得ることを、当業者は理解する。例え
ば、増殖培地がオペレーターの抑制を可能にするという
よりもむしろ誘導する成分を含有し、そして増殖の間は
誘導条件が望ましくない場合に、オペレーターまたはリ
プレッサー変異体は、誘導を克服し、そして抑制を可能
にするために使用され得る。変異リプレッサーの１例
は、lacリプレッサーのLacI変異体である。LacI変異体
は、もはやインデューサーに結合する能力を有しない。
LacI変異体の例は、例えばLacI^S変異体（Beyreuthe、19
78、Cold Spring Harbor Laboratory、CSH、NY）、およ
びAsp276−−＞Asn274のような他の変異体（Changら、1
994、Biochem.22:3607−3616）を含む。野生型リプレッ
サーをインデューサーに対して非感受性の変異リプレッ
サーで置換することによって、リプレッサーは増殖の間
にオペレーターに結合し得、そしてプラスミドは、通常
ではリプレッサーを誘導する条件下でさえ宿主細胞中に
維持される。

E.coli trpリプレッサーはまた、本発明により有用で
ある（「トリプトファンオペロン」、YanofskyおよびCr
awford、Escherichia coli and Salmonella typhimuriu
m、J.L.Ingrahamら編、1987、Amer.Soc.Micro.、1453−
1472頁を参照のこと）。trpリプレッサーは、約50コピ
ー／細胞で存在し、そしてリプレッサー結合のインデュ
ーサーとしての、発酵培地中のトリプトファンの存在を
必要とする。E.coli GalRリプレッサーはまた、本発明
により有用である（「ガラクトースオペロン」、S.Adhy
a、Escherichia coli and Salmonella typhimurium、J.
L.Ingrahamら編、1987、Amer.Soc.Micro.、1503−1512
頁を参照のこと）。E.coli araCリプレッサーはまた、
本発明により有用である（「Ｌ−アラビノースオペロ
ン」、R.Schlief、Escherichia coli and Salmonella t
yphimurium J.L.Ingrahamら編、1987、Amer.Soc.Micr
o.、1473−1481頁;Dunnら、1984、Proc.Nat.Aca.Sci.8
1;5017−5020を参照のこと）。araCリプレッサーは、ア
ラビノースの存在下で増加した結合親和性を有する。最
後に、λリプレッサーはまた、本発明により有用である
（λファージへの導入、Current Protocols in Molecul
ar Biology、Ausubelら編、1994、第III節、第1.9部;Ho
chschildら、1986、Cell 47（５）;807−816を参照のこ
と）。

本発明による有用なプラスミド本発明は、宿主細胞１個あたり、少なくとも10、好ま
しくは少なくとも20〜100、および最も好ましくは少な
くとも200〜500コピーのプラスミドの複製を可能にす
る、プラスミドの複製起点に有利に利用され得る。中程
度（すなわち、20〜50）から高い（すなわち、200〜50
0）プラスミドコピー数の複製を可能にする複製起点
は、中程度から高いプラスミドコピー数がリプレッサー
分子を容易に滴定し得る点で特に有用である。もちろ
ん、所望であれば、細胞１個あたり1000〜2000コピーも
の高いコピー数を有するプラスミドもまた使用され得
る。

低いコピー数（すなわち、10コピー以下）を有するプ
ラスミドは、コピー数の増加をもたらすための変異後、
本発明に従って最も有利に使用される（J.Scott、198
4、Microbial Reviews 48:1−23）。頻繁に使用される
複製起点の中でも、pBR322（20コピー／細胞）は、本発
明に従って有用であり、そして、pUC（200コピー／細
胞）が好ましい。好ましいわけではないが、本発明に従
って有用である他のプラスミドは、複製のためにプラス
ミドにコードされるタンパク質の存在を必要とするプラ
スミド（例えばpT181、F II、およびF I複製起点）であ
る。

E.coliおよびS.typhimuriumにおいて本発明に従って
有用である複製起点の例は、以下を含むがこれらに限定
されない:pMB1（細胞１個あたり25コピー以上、Bolivar
ら、1977、Gene 2:95−113）、ColE1（細胞１個あたり1
5コピー以上、Kahnら、1979、Methods Enzymol.68:268
−280）、p15A（細胞１個あたり約15コピー、Changら、
1978、J.Bacteriol.134:1141−1156）;pSC101（細胞１
個あたり約６コピー、Stokerら、1982、Gene 18:335−3
41）;R6K（細胞１個あたり15コピー未満、Kahnら、197
9、上記）;R1（温度依存性の複製起点、Uhlinら、198
3、Gene 22:255−265）：λdv（Jacksonら、1972、Pro
c.Nat.Aca.Sci.69:2904−2909）。Staphylococcusにお
いて有用な複製起点の例は、pT181である（細胞１個あ
たり約20コピー、J.Scott、1984、Microbial Reviews 4
8:1−23）。上記の複製起点の中でも、pMB1、p15A、Col
E1が好ましい。なぜなら、これらの起点は、プラスミド
にコードされるタンパク質を複製のために必要としない
からである。

本発明により有用な宿主細胞。

本発明は、宿主細胞において中〜高コピー数で維持さ
れ得るプラスミドが存在する場合、動物細胞（例えば、
哺乳動物細胞および昆虫細胞、植物細胞、菌類（例え
ば、酵母）、およびほとんどの細菌株（例えば、グラム
陽性細菌株）およびグラム陰性細菌株）を含む全ての細
胞型に適用可能である。

本発明により有用なグラム陰性細菌には、E.coliおよ
びSalmonella（例えば、S.typhimurium）が挙げられる
が、これらに限定されない。

本発明により有用なグラム陽性種には、高コピー数の
プラスミドが既に存在する、Bacillus、Streptomyces、
Lactobacillus、およびLactococcusが挙げられるが、こ
れらに限定されない。Lactococcusにおいて本発明によ
り有用なプラスミドの例は、pNZ2123およびpIL253（Sim
onら,Biochimie 70:559,1988）である。ラクトコッカス
のラクトースオペロンは、異種タンパク質の発現を制御
するために用いられてきた（Wellsら,1993,Mol.Microbi
ol.8（６）:1155−1162）。このオペロンは、T7ポリメ
ラーゼの発現を制御するために、lacRリプレッサー（Va
n Rooigenら,J.Biol.Chem.265:18499−18503,1993）を
利用する。T7ポリメラーゼは次いで、異種タンパク質の
発現を制御する。Bacillusにおいて本発明により有用な
プラスミドの例は、pC194、pUB110、およびpT181であ
る。

Bacillus（例えば、B.Subtilis）において、λリプレ
ッサーは、異種タンパク質の発現を制御するために用い
られてきた。λリプレッサーは、sak42Dプロモーターの
制御下に置かれた。このプロモーターは、B.subtilisに
おいて効率的に転写され得る（Breitlingら,1990,Gene
93（１）:35−40）。

酵母は、高コピー数のプラスミドが酵母中で維持され
るので、本発明により有用である。このようなプラスミ
ドの例は、１細胞あたり約100コピーまでのコピー数を
有する（自律複製性配列（ARS）に基づく）YRpプラスミ
ド、および１細胞あたり50〜100コピー数を有する（２
ミクロン環に基づく）YEpプラスミドが挙げられる。（S
ikorski,「Saccharomyces cerevisiaeの染色体外クロー
ニングベクター」,Plasmids,A Practical Approach,K.
G.Hardy編,IRL Press,1993;およびYeast Cloning Vecto
rs and Genes,第II章,13.4部,Current Protocols in Mo
lecular Biology,Ausubelら編,1994を参照のこと）。酵
母は、E.coliのlacZ遺伝子を発現し得る。その結果、本
発明によれば、必須な酵母遺伝子（例えば、ura3または
leu2）、酵母におけるプラスミドの維持のために用いら
れてきた遺伝子の発現を制御するためにlacリプレッサ
ー滴定系を使用することが意図される（Gunge,1983,An
n.Rev.Micro.37:253−276）。

本発明により有用な必須遺伝子。

本発明は、プラスミドの安定的な維持のために、多く
の異なる必須の染色体宿主遺伝子と一緒に用いられ得
る。これらの必須遺伝子は、以下のカテゴリーを包含す
るが、これらに限定されない：例えば、細胞代謝の生合
成に関連する産物をコードする遺伝子、その産物が炭素
代謝に関連する遺伝子、抗生物質耐性をコードする遺伝
子、および高分子の生合成または調節をコードする遺伝
子（例えば、DNAおよび／またはRNAの合成および複製機
能に必須の遺伝子）。

1.細胞構造の成分の合成に関連する産物をコードする必
須遺伝子。

細胞成分の供給（特に細胞壁前駆体の供給）に関与す
る酵素をコードする特定の遺伝子はまた、宿主細胞の増
殖に必須であり、そして本発明により有用である。例え
ば、細菌細胞壁は、meso−ジアミノピメリン酸（DAP）
を含み、そしてこの成分が合成できないと、細胞溶解が
生じる。asd遺伝子（アスパラギン酸β−セミアルデヒ
ドデヒドロゲナーゼ）またはdapD遺伝子（スクシニルジ
アミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ）が欠失し
た変異は、プラスミド上にこの遺伝子の完全なコピーを
有するプラスミドの維持のために用いられ得ることが実
証されている。（Nakayamaら,Bio/technology 6:693−6
97,1988;DeGryse,米国特許第5,198,343号）。DAP生合成
経路における多くの他の遺伝子、すなわち、dapA、dap
B、dapC、およびdapEの遺伝子もまた用いられ得る。dap
AおよびdapBはクローン化および配列決定され、そしてd
apBは単一のシストロンとして入手可能である（Richaud
ら,J.Bacteriol.166:297−300,1986;Bouvierら,J.Biol.
Chem.259:14829−14834,1984）。他の細胞壁成分の合成
（例えば、Ｄ−アラニン生合成）に関与する遺伝子もま
た、本発明により有用である（Walsh,1989,J.Biol.Che
m.264（５）:2393−2396）。Ｄ−アラニンのための成分
をコードするDNA配列は、抗生物質を用いることなくプ
ラスミドの安定化のために用いられた（EP 85/309020を
参照のこと）。

本発明は、このような遺伝子と一緒のリプレッサー滴
定の使用を意図する。目的の遺伝子は、次に宿主がこの
遺伝子の産物を必要とするように、最初に宿主株から欠
失される（Winansら,1985,J.Bact.161（３）:1219−122
1;Jasinら,1984,J.Bact.159（２）:783−786）。次い
で、この遺伝子のコピーが従来のクローニング技術を用
いて構築され、その結果、その発現は、選択されたリプ
レッサータンパク質を結合するプロモーター／オペレー
ターにより指揮される。次いで、この構築物は、リプレ
ッサータンパク質を合成する宿主株の染色体に導入され
る（Winansら,1985,J.Bact.161（３）:1219−1221:Jasi
nら,1984,J.Bact.159（２）:783−786）。リプレッサー
結合配列を含有するプラスミドでの株の形質転換は、必
須遺伝子の発現を可能にする生合成遺伝子とは別のリプ
レッサーの滴定をもたらす。

2.細胞増殖に必須の遺伝子。

本発明のリプレッサー滴定方法は、炭素源の利用に関
連する遺伝子とともに用いられ得る。特に、この方法
は、ラクトースオペロンとともに、そして本明細書中に
記載されるような唯一の炭素源としてのラクトースの利
用とともに用いられ得る。他の改変は、当業者には明ら
かである。もはやインデューサー（アロラクトース）に
結合し得ず、そして正常な誘導条件下でlacオペレータ
ーに結合し続けるlacリプレッサーの変異体が存在す
る。これらはlacI^S変異体により類型化される；しか
し、インデューサーに結合する能力を有さないが、他の
全ての機能において正常である他の変異が存在する（Ch
angら,Biochem.33:3607−3616（1994））。これらの変
異を有する株は、lacオペロンの遺伝子を発現し得ず、
それゆえ、唯一の炭素源としてのラクトースにより増殖
し得ない。野生型lacオペレーター配列を含有する高コ
ピー数プラスミドでのこのような株の形質転換は、lac
オペロンとは別にリプレッサーを滴定し、そしてラクト
ースでの増殖を可能にする。

グルタミンシンセターゼは、真核生物細胞（例えば、
NSO骨髄腫細胞株）にとって必須遺伝子であり（Bebbing
tonら，（1992）Bio/Technology 10,169−175）、そし
て好ましくは、宿主細胞が真核生物細胞である場合に使
用される。

3.核酸の合成をコードする遺伝子。

本発明はまた、宿主細胞のDNAおよび／またはRNAの合
成または複数のタンパク質をコードする必須遺伝子と一
緒に用いられ得る。E.coliおよびSalmonellaのような細
菌におけるこれらの必須機能に関するこのような遺伝子
の例は、McMackenら（Escherichia coli and Salmonell
a typhimurium,Cellular and Molecular Biology,Neidh
ardtら編,Amer.Soc.Micro,Wash.D.C.,1987,564−612
頁）において提供され、そして以下の遺伝子が挙げられ
るがこれらに限定されない:dnaA、dnaB、dnaC、ssb、dn
aG、polC（dnaE）、dnaQ（mutD）、dnaN、dnaZX、gry
A、gryB、polA、lig、dnaT、rpoA、rpoB、rpoC、および
rpoD。

4.抗生物質耐性をコードする遺伝子。

本発明はまた、抗生物質耐性と一緒に用いられ得る。
耐性遺伝子は、その発現が、所望のリプレッサータンパ
ク質を結合するプロモーター／オペレーターの制御下に
あるように構築される。次いで、この構築物は、宿主株
の染色体中に挿入される。リプレッサー結合配列を含有
するプラスミドでのこの株の形質転換は、抗生物質耐性
遺伝子からのリプレッサーを滴定し、そしてこの抗生物
質の存在下での発現、従って増殖を可能にする。抗生物
質耐性遺伝子は、大規模な発酵プロセスにおいて用いら
れた抗生物質からプラスミド産物を精製するために注意
を払わなければならないが、本発明の実施者が宿主の必
須遺伝子として抗生物質耐性を選択し得るような有用な
選択マーカーである。

実施例Ｉでは、実験においてlacリプレッサー／オペ
レーター系を用いて本発明を適用する。この実験は、染
色体遺伝子とは別のリプレッサーを滴定するためのプラ
スミド性の配列の能力を実証する。

実施例Ｉ E.coli DH1株（Hanahan,J.Molec.Biol.166:557−580,
1983）は、ラクトースリプレッサータンパク質（LacI）
による制御に供されるインタクトなラクトースオペロン
を有する。LacIは、１細胞あたり10〜20コピーで存在
し、そして高い親和性（kd 1×10−14）で結合する。

E.coli DH1を、pUC18tet（アンピシリンおよびテトラ
サイクリンの耐性遺伝子を含有する、１細胞あたり約10
0〜200コピーで存在するpUC18に基づくプラスミド）で
形質転換した。pUC18tetは、lacオペレーター／プロモ
ーターを含有するが、リプレッサータンパク質をコード
するLacI遺伝子を含有しない。プラスミドはまた、pUC
の複製起点および治療遺伝子の挿入のためのポリリンカ
ー（またはマルチクローニング部位）を含有する。プラ
スミドにコードされるアンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性は、リプレッサー滴定のために必要ではなく、
そして抗生物質耐性を含有しないプラスミドは、本発明
によれば好ましく、そしてpUC18tetと容易に置き換えら
れ得る。

DH1およびDH1::pUC18tetを、炭素源としてラクトース
（10mM）またはグルコース（10mM）を有し、必要に応じ
てアンピシリン（50μg/ml）を補充したM9最少塩培地上
で増殖させた。細胞を対数増殖の間に回収し、そしてβ
−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした（Mille
r,1972,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spri
ng Harbor Laboratory,CSH,NY）。表１に示すように、
匹敵するβ−ガラクトシダーゼ活性が、グルコースで増
殖させたDH1:pUC18tetおよびラクトースで増殖させたDH
1:pUC18tetで観察される。一方、グルコース上で増殖さ
せたDH1では、ラクトースと比較して非常に低い活性が
見られる。従って、プラスミドの存在は、lacオペロン
とは別のlacリプレッサーを滴定し、β−ガラクトシダ
ーゼの発現を可能にする。

結果は、３つの独立した実験の結果であり、そして単
位として、そして各実験のラクトースにより増殖された
DH1について得られた値の割合として示される。

実施例II リプレッサー滴定の証明 E.coli Hfr 3000 YA 694株（CGSC 6378）lacI694,rel
A1,spoT1,thi−1,λを、EMB寒天上にプレーティング
し、そして一晩増殖させて、その株がラクトースを発酵
し得ず、そしてlacI^S遺伝子型を有する（すなわち、誘
導物質非感受性であるリプレッサーをコードする）こと
を示すピンク色のコロニーを得た（Wisonら、（1964）
J.Mol.Biol,8:582）。単一のコロニーを増殖させ、そし
て形質転換についてコンピテントにした。次いで、この
株を、pUC18（lacオペレーターを含む、上述）で形質転
換し、そしてアンピシリンを含むEMB寒天上にプレーテ
ィングした。得られたコロニーは、lac^Sリプレッサーが
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を可能にするlacオ
ペロンから離れて滴定された結果として、ラクトースが
発酵されたことを示す黒色であった。単一のコロニー
は、5mlのLBアンピシリンに接種し、そして対数中期（m
id log）まで増殖させ、そしてβ−ガラクトシダーゼ活
性を発現することを示した。

pUC18による形質転換および非形質転換のE.coli Hfr
3000 YA694株を、適用可能な場合アンピシリンを補充し
た、唯一の炭素供給源としてラクトースまたはグルコー
スを含む最小培地上にプレーティングした。pUC18の導
入はラクトース上で増殖する能力をもたらすことを図３
において示し得る。

実施例III リプレッサー滴定によるプラスミド維持の証明 pUC18を含むE.coli YA694株を、グルコース（0.1g/
l）、アンピシリン（50μg/ml）およびチアミン（0.5mg
/l）を補充した5mlのM9最小培地に接種し、そして37℃
で14時間増殖させた。次いで、0.5mlのこの培養物を、
以下のものに別々に接種した：（１）グルコースを補充した100mlのM9培地（２）ラクトースを補充した100mlのM9培地（３）ラクトースおよびアンピシリンを補充した100ml
のM9培地次いで、この培養物を37℃で約８時間増殖させた。OD
600測定を、増殖期間を通じて行った。２つのODユニッ
トを増殖期間の終わりに取り出し、採集し、そして凍結
した。次いで、0.5mlの各培養物を、100mlの新鮮なそれ
ぞれの培地に接種し、そしてさらに14時間増殖させた。
次いで、手順を繰り返して、約72世代の増殖を達成し、
サンプルを適切な時点で採取した。

次いで、プラスミドDNAを採集された細胞から単離
し、EcoR Iで消化し、そしてゲル電気泳動により分析し
た。結果は、約72世代の増殖後、プラスミドは、グルコ
ースのみで増殖させた細胞よりラクトースのみで増殖し
た細胞において、高い比収量で存在することを示した
（図４）。このことは、ラクトースを代謝するβガラク
トシダーゼの産生に増殖を依存させることにより、βガ
ラクトシダーゼ遺伝子の発現を可能にするプラスミドが
選択的に維持されることを証明する。

実施例IV 代替的なリプレッサーの証明リプレッサー滴定系において使用され得るリプレッサ
ーとして作用する変異リプレッサーArgRNVの能力を調査
した。ArgRの遺伝子操作された変異体であるArgRNV（Bu
rkeら、1994,Mol.Microbiol.13（４）,609−618）は、
アルギニンの非存在下でさえ、アルギニン生合成遺伝子
のプロモーター内のそのDNA結合部位に結合したままで
ある。マルチコピープラスミド上のArgRNV遺伝子でのE.
coli DS997株およびDS98株の形質転換により、最小培地
において増殖を妨げることが示された（Burkeら、1994,
Mol.Microbiol.138（４）,609−618）。従って、リプレ
ッサーは、トランス優性を示す。この実験を、高コピー
数プラスミド（pSelect,Promega）上にコードされたArg
RNVで形質転換されたE.coli DH1を用いて繰り返し、続
く最小培地上の増殖は、アルギニンの存在下のみで生じ
た。これは、このリプレッサーの能力がリプレッサー滴
定系において使用されることを証明する。

ArgRNV遺伝子はDH1の染色体に配置され得、そして最
小培地における増殖を妨げる能力を調べた。アルギニン
生合成遺伝子またはArgオペレーターに機能的に結合し
た必須遺伝子から離れてArgRNVを滴定するために、ArgR
結合部位を含むプラスミドの能力を調査し得る。

実施例Ｖ lacZカナマイシン融合の生成 lacオペレーター／プロモーターの制御下での必須遺
伝子のモデルとして使用されたlacZ遺伝子およびカナマ
イシン遺伝子のＮ末端領域のインフレーム融合を、以下
の様式において構築した（カナマイシン遺伝子は、任意
の必須遺伝子により置換され得る）。カナマイシンカセ
ットを、Xho IおよびPst Iでの消化によりpUC4K（Pharm
acia Biotech）から取り除き、これをSal IおよびPst I
で消化したpUC18に連結した。これは、カナマイシン耐
性の発現はlacオペレータープロモーターの制御下にあ
るように、lasZ遺伝子とカナマイシン遺伝子との機能的
なインフレーム融合を生成した。

lac/カナマイシン構築物をHae IIでの消化によって単
離し、平滑化し、そしてSty Iで消化して平滑化したpN1
に連結した。pN1は、dif遺伝子座の周りの5.5kbのE.col
i染色体DNAを含むpUC18ベータのプラスミドである（Les
lieら、1995,EMBO J.,14,1561−1570）。pN1のdif遺伝
子座へのlac/カナマイシンの挿入は、最終的に所望のE.
coli宿主の染色体への構築物の組換えを可能にする。得
られたプラスミドSal Iで線状化し、そしてこれを用い
てE.coli JC7623（Winansら、1985,J.Bact.,161（３）,
1219−1221）を形質転換し、そしてカナマイシン＋IPTG
プレート上で選択した。カナマイシン耐性コロニーを、
カナマイシン存在下の増殖のIPTG誘導性（図５）、プラ
スミドの消失、およびサザン分析による染色体中への構
築物の挿入について試験した。

次いで、構築物を、P1形質導入によりJC7623の染色体
からDH1の染色体に移した。得られたDH1 lac/kan株を、
サザン分析によりdif遺伝子座内の構築物の存在につい
ておよびカナマイシン耐性の誘導性について分析した
（図６）。pUC18Tet内のDH1 lacZ−kanのトランスフェ
クションは、IPTGの非存在下でのカナマイシンにおける
増殖をもたらした。これは、カナマイシン耐性遺伝子の
リプレッサーの滴定を証明する。従って、カナマイシン
の存在下におけるプラスミドの維持についての宿主細胞
の適合性を証明する。

次いで、DH1 lac/kan株を、lacオペレーターを所有す
る多数のプラスミド（pUC18、pUC18Tet、およびこれら
に由来するより大きなプラスミド）を用いて形質転換
し、そして以下について試験した： 1.非誘導条件下でのカナマイシン（60μg/ml）を含む培
地上での増殖； 2.リプレッサー滴定系によるバッチ増殖の間のプラスミ
ドの維持。

lac/カナマイシン構築物から離れたlacリプレッサー
の滴定を証明し、そしてバッチ増殖の間のプラスミドの
維持もまた証明した。

実施例VI lacオペレーター／プロモーターの制御下で必須遺伝
子を提供するためにE.coli DH1 dapD株のdir遺伝子座へ
のLacZdapD融合構築物の構築および挿入を行う。

LacZdapD融合の構築 EcoR I部位を操作されているプライマー（5'−GTGCCC
GAATTCCAATTGGCG−3'、5'−CGGCGTGAATTCATCGCTCATCCC
−3'）を用いて、dapD遺伝子をPCRによってDH1からクロ
ーン化した。PCR産物をEcoR Iで消化し、そしてEcoR I
消化したpUC18に連結した。得られたプラスミド（pUC18
dapD）を用いてE.coli AT982株（dapD4、thi1、relA1、
λ−、spoT1）を形質転換し、そしてこのプラスミドはd
apD変異を相補することを示し、このことはdapD遺伝子
がクローニングされていることを示す。次いで、pUC18
のlacZ遺伝子とdapD遺伝子との融合物を、pUC18dapDお
よび以下のオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより作製
した： EcoR Iでの消化、およびEcoR Iで消化したpUC18への連
結により、lacZとdapD遺伝子との間にインフレーム融合
物を作製した。この構築物（pUC18dapD2）は、形質転換
後のAT982の増殖の回復により、再び機能的になること
が示された。

lac/dapD融合物をHae IIフラグメントとして単離し、
平滑化し、そしてSty1で消化して平滑化したpN1に連結
した。このプラスミド（pN1 dap D2）は、AT982株のdap
D変異を相補した。

当業者に明らかなように、改変は、例えば、種々のコ
ントロール配列への改変を含む構築物を作製し得る。

WT DH1 dapD遺伝子の不活化。

DH1の染色体へのLacZdapD融合物の挿入の前に、最初
に、WT遺伝子の発現を不活化した。dapD遺伝子を、オリ
ゴヌクレオチド： 5'−TCATCGGAATTCCCTGGAGTATCGG−3'および 5'−TGAGCTGAATTCCATCGCCGCGCTG−3'を用いる、dapD遺
伝子に対して5'および3'DNAのより大きなフラグメント
を用いたPCRにより再クローン化してより効率的な組換
えを可能にした。得られたPCR産物をEcoR Iで消化し、
そしてPst I部位を欠失させたpUC18に連結した。得られ
たプラスミド（pUC18 dapD3）は、AT982のdapD変異を相
補した。次いで、pUC4K由来のカナマイシンカセット
の、dapD遺伝子内に位置するPst I部位への導入によっ
て、dapD遺伝子を挿入により不活化した。このプラスミ
ド（pUC18dapDkan）はもはやAT982のdapD変異を相補し
なかった。この構築物を、BamH Iでの消化により直鎖状
にしたpUC18dapDkanでの形質転換により、E.coli JC762
3の染色体に導入した。クローンを、補充のジアミノピ
メリン酸の非存在下で増殖し得ないが、カナマイシンの
存在下で増殖し得ることについてスクリーニングした。
dapD遺伝子内のカナマイシン遺伝子の存在を、サザン分
析によって確認した。次いで、不活化したdapD遺伝子を
P1形質導入によりDH1の染色体に転移させて、DH1 dapDk
anを産生させた。

lacZdapD構築物を、Sca Iで直鎖状にしたpN1dapD2で
の形質転換により、JC7623dapDkanの染色体に導入し
た。クローンを単離し、次いで、ジアミノピメリン酸の
非存在下における増殖のIPTG誘導性を示した（図７）。

次いで、lac/dapD融合物を、P1形質導入の手段により
DH1dapDkanに導入し、そしてIPTG誘導性増殖についてス
クリーニングし、そしてサザン分析によってdif遺伝子
座中のその位置を確認した。

次いで、DH1 dapDkan−lacdapD株をlacオペレーター
を有するプラスミド（pUC18Tet）で形質転換し、そして
以下の特徴を示した： 1.非誘導性条件下で、ジアミノピメリン酸を欠く培地上
でのDH1 dapDkan−lacdapD−pUC18Tetの増殖、このこと
は、lac/dapD構築物とは別のlacリプレッサーの滴定を
示す； 2.プラスミドの保持を、バッチ増殖中に試験し、そして
プラスミドの収量を、テトラサイクリンの存在下（すな
わち、抗生物質耐性遺伝子の手段によりプラスミドを選
択するため）で増殖させた細胞、およびインデューサー
（IPTG）の存在下（すなわち、プラスミドの保持が必要
とされない条件）で増殖させた細胞と比較した。テトラ
サイクリンの非存在下でのプラスミドの特異的な収量
は、テトラサイクリンの存在下で観察されたプラスミド
の収量に匹敵し、従って、このことは抗生物質の非存在
下でのプラスミドの選択的な保持を示す。両方の場合に
おいて、収量は、インデューサーの存在下で増殖させた
細胞よりも顕著により多かった。

実施例VII 本発明による宿主細胞で安定に保持されるプラスミド
DNAを以下のように単離した。細胞を溶解し、そして当
該分野に周知の方法、およびBrinboimら、1979,NAR 7:1
513−1523ならびにBirnboim,1983,Methods Enzymol.10
0:243−255に記載されるような方法に従って、またはQi
agen plasmid mini、maxi、もしくはmegaキット（Qiage
n,Chatsworth,CA）を用いてプラスミドDNAを精製する。
プラスミドDNAの大規模な（例えば、100mg以上）精製に
ついては、Hornら、1995,Human Gene Therapy 6:565−5
73を参照のこと。

実施例VIII 組換えタンパク質をコードする目的の遺伝子が宿主細
胞調節配列（すなわち、最小限には、宿主細胞中で機能
するプロモーター）の制御下でそれが存在するようにプ
ラスミド上に所有される場合、組換えタンパク質が細胞
増殖中に産生され得、次いで以下のように、当該分野で
公知の方法に従って単離される。E.coliでの組換えタン
パク質の産生および精製が以下に記載されるように達成
される:Das,1990,「E.coli中でのタンパク質の過剰発
現：ベクター、宿主およびストラテジー」、Methods in
Enzymol.182:93−112;Marstonら、1990、「タンパク質
凝集体の可溶化」、Methods in Enzymol.182:264−276;
およびThatcherら、1994、「バイオテクノロジーにおけ
るタンパク質の折り畳み」、Mechanisms of Protein Fo
lding、R.H.Pain編、Frontiers in Molecular Biology
Series,IRL Press,Oxford University,UK。

E.coli中での、可溶性および／またはペリプラズム
（periplasm）の組換えタンパク質の産生および精製
は、Hartら、1994、Bio/Technology 11:1113−1117;Sch
ein,1989,Bio/Technology 7:1141−1149;およびLavalli
eら、1993,Bio/Technolory 11:187−193に記載されるよ
うに行われ得る。

S.cerevisiae中での組換えタンパク質の産生および精
製は、Romanosら、1992「酵母中の外来遺伝子発現；概
説」、Yeast 8:423−488に記載されるように行われ得
る。

酵母Phichia pastoris中での組換えタンパク質の産生
および精製は、Sreekrishnaら、1989,Biochemistry 28:
4117−4125に記載されるように行われ得る。

哺乳動物細胞中での組換えタンパク質の産生および精
製は、Reff、1993,Curr.Opin.Biotech.４.573−576、ま
たはCartwright,1994,Animal Cells as Bioreactors,Ca
mbridge Studies in Biotechnology,11,Cambridge Univ
ersuty Pressに記載されるように行われ得る。

使用および投与本発明に従って産生したプラスミドDNAは、プラスミ
ドが治療的遺伝子を含む場合、遺伝子治療に有用であ
る。治療的遺伝子は、哺乳動物（好ましくはヒト）細胞
においで発現可能であり、そして哺乳動物（好ましくは
ヒト）に治療的に有用なRNAまたはポリペプチドをコー
ドする遺伝子である。このような遺伝子の例は、当該分
野で周知であり、そしてβ−グルコセレブロシダーゼ遺
伝子、Brutonのチミジンキナーゼ遺伝子、TNFのような
サイトカインコード遺伝子、インターロイキン１〜12、
インターフェロン（α，β、γ）、Fcレセプター、およ
びＴ細胞レセプターが挙げられるが、これらに限定され
ない。他の例としては、HIVのインヒビターをコードす
る遺伝子（例えば、天然のタンパク質の競合インヒビタ
ーとして作用するTATまたはREV変異体）が挙げられる。
プラスミドDNAはまた、薬剤耐性遺伝子、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、お
よびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子のようなマーカー遺伝子を含み得る。

治療的遺伝子が、欠損遺伝子の置換またはさらなる潜
在的に有用な遺伝子の機能のような生理学的に重要な産
物をコードする場合、このようなDNAのインビボまたは
エキソビボでの使用は、細胞に長期間遺伝的な改変を付
与すること、および疾患の処置において有効であること
が期待される。

治療的遺伝子を含むプラスミドDNAは、インビボまた
はエキソビボ遺伝子治療のウイルス性または非ウイルス
性の様式を用いて投与される。この投与の様式は、本発
明について重要ではなく、そして裸のDNA、遺伝子治療
を媒介するレセプター（例えば、リポソーム／抗体複合
体を用いる）、およびウイルスベクターの投与のために
遺伝子銃の使用を包含し得る。

例えば、ウイルス疾患または遺伝病を罹患する患者
は、インビボまたはエクスビボ法を介して本発明に従っ
て処置され得る。例えば、インビボ処置において、本発
明のプラスミドDNAは、好ましくは生物学的に適合性の
溶液または薬学的に受容可能な送達ビヒクルで、経口摂
取、注射、吸入、または任意の他の多くの方法によっ
て、患者に投与され得る。投与される投薬量は、患者に
よって変化する；「治療的に有効な用量」は、任意のリ
スクまたは有害な副作用に対して均衡のとれた導入され
る遺伝物質の機能の増大レベルによって決定される。遺
伝子導入、遺伝子発現のレベル、および／あるいはコー
ドされた産物の存在またはレベルを監視することは、投
与される投薬量を選択および調節することを援助する。
一般に、送達ビヒクルを含む組成物は、10ng〜100μg/k
g体重の範囲において、好ましくは100ng〜10μg/kg体重
の範囲において単回用量で投与され、それにより少なく
とも１つのコピーの治療遺伝子が各標的細胞に送達され
る。

エクスビボ処置はまた、本発明の範囲内で意図され
る。細胞集団は、患者から取り出されるかまたは別の方
法で提供され、本発明による治療遺伝子を含むプラスミ
ドで形質導入され、その後、患者に再導入され得る。

本発明によるエクスビボ遺伝子導入のために標的され
た細胞は、治療遺伝子の送達が所望される任意の細胞
（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージのよ
うな免疫系の細胞、造血細胞、ならびに樹状突起細胞）
を含む。確立された技術を用いて、幹細胞が富化手順
（enrichment procedure）の後に遺伝子導入のために使
用され得る。あるいは、分離されていない造血細胞およ
び幹細胞集団は、本明細書中に記載のDNA取り込み（upt
ake）に対して感受性にされ得る。

ヒト遺伝病の処置のための２つの代表的なプラスミド
を以下に記載する。本発明によるプラスミドは、Ｘ架橋
したβ−グロブリネミア（β−globulinemia）を処置す
るために使用され得る。このプラスミドは、本明細書中
に記載される最小配列（つまり、細菌宿主細胞または酵
母宿主細胞における複製のための複製起点、オペレータ
ー配列、および治療遺伝子のための挿入部位）を含む。
例えば、pUC18tetプラスミドは、好ましくは、欠失した
tet遺伝子を有する最小プラスミドとして使用される。
治療遺伝子は、Brutonのキナーゼ遺伝子（Vetrieら、19
93、Nature 361:226−233）であり得、そして以下のDNA
フラグメントに配置され、これは、当該分野で周知の手
順を共に用いてクローン化される。Brutonのチロシンキ
ナーゼヒト遺伝子は、（＋33）位でのPvu I部位および
（＋2126）位でのHind III部位によって示された2.1kb
フラグメントに位置する。所望ならば、プラスミドはま
た、PCT/GB88/00655に教示されるように、位置独立的な
組織特異的遺伝子発現を付与する配列を含み得る。治療
遺伝子はまた、スプライス部位およびポリＡテールをコ
ードし得、これは、ヒトβグロビン遺伝子座スプライス
の一部およびポリＡシグナル；すなわち、エキソン２−
IVS II−エキソン３−ポリＡ配列を含むBamH I−Xba I
2.8kb 3'スプライス／ポリＡ隣接配列を含み得る。

プラスミドDNAは、本明細書中に記載されるように調
製され、そしてMartenssonら、Eur.Jour.Immunol.1987,
17:1499;Okabeら、Eur.Jour.Immunol.1912,22:37;およ
びBanerjiら、Cell 33:729,1983に記載のように、イン
ビボ遺伝子治療のために患者に直接、またはエクスビボ
治療のためにプレＢ細胞に構築物を導入すること、およ
びトランスフェクトしたプレ−Ｂ細胞をＸ架橋したβ−
グロブリネミアに罹患いた患者に投与することによって
Ｘ架橋したβ−グロブリネミアを処置するために使用さ
れ得る。

本発明により調製されたプラスミドDNAはまた、ゴシ
ェ病の処置のために使用され得る。ゴシェ病は、２つの
異なる遺伝子変異の１つに由来する。ゴシェＩ型は、CG
G−−＞CAG変異であり、これは、β−グルコセレブロシ
ダーゼポリペプチドの119位でのArg−−＞Gln置換を生
じる（Graves,DNA 7:521,1988）。ゴシェII型は、CTG−
−＞CCG変異であり、これは、β−グルコセレブロシダ
ーゼポリペプチドの444位でのLeu−−＞Pro置換を生じ
る（Tsuji,NEJM 316:570,1987）。野生型ポリペプチド
をコードするβ−グルコセレブロシダーゼ遺伝子の存在
は、実質的にゴシェ病を癒すと考えられている。従っ
て、本発明による別の有用なプラスミドは、本明細書中
に記載される最小エレメント（すなわち、複製起点、オ
ペレーター配列、およびクローニング部位）ならびにHo
rowitzら、1989,Genomics 4:87−96に記載のようなリゾ
チーム遺伝子プロモーターおよびβ−グルコセレブロシ
ダーゼトランスジーンを含むプラスミドである。このプ
ラスミドは、以下のように構築される。

Horowitzらに開示のように、ヒトβ−グルコセレブロ
シダーゼ遺伝子は、エキソン１のBamH I部位からポリア
デニル化部位の3'側のEcoR V部位まで伸びる9722塩基対
フラグメントに位置する。このフラグメントは、エキソ
ン２における翻訳開始とともに、11のエキソンおよび全
ての介在配列を有する。位置独立的な遺伝子発現および
組織特異的遺伝子発現を付与する配列は、構築物中に含
まれ得、そしてBoniferら、1990,Euro.Mol.Biol.Org.Jo
ur.9;2843に記載されるように、pIII.lyx構築物由来の1
1.8kb Xho I−Sac Iフラグメントに位置する。

プラスミドDNAは、本明細書中に記載のように調製さ
れ、次いで、Immunology and Cell Biology,1993,第71
巻、75〜78頁に記載のように、インビボ処置のために宿
主に直接またはエクスビボ治療のためのマクロファージ
に、DNAを導入することにより、そしてトランスフェク
トされたマクロファージをゴシェ病に罹患した患者に導
入することによりゴシェ病を処置するために使用され
る。ゴシェ病に罹患した患者における野生型トランスジ
ーンの発現は、罹患状態の治癒をもたらす。

他の実施態様他の実施態様は、当業者に明らかである。前述の詳細
な説明は、明瞭のみのために提供され、そして単に例示
であることが理解されるべきである。本発明の範囲は、
上記の実施例に制限されないが、以下の請求の範囲によ
り規定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｒ 1:07）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ウィリアムズ，スティーブンジェライントイギリス国シーダブリュー９８エルエイチチェシャー，デイベナム，ロンドンロード 609 (72)発明者ハナック，ジュリアンアレクシスジョンイギリス国エスケイ11 ７イーエフチェシャー，マックレスフィールド，ブレイクロウロード 138 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 7/08 C12P 21/00 - 21/08 ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】形質転換された宿主細胞であって、該宿主
細胞は、リプレッサーをコードする第１の染色体遺伝子、該リプレッサーに結合し得る第１のオペレーターに機能
的に結合しており、そして細胞増殖に必須な第２の染色
体遺伝子、および該リプレッサーに結合し得る第２のオペレーターを含む
プラスミド、を含み、ここで、該プラスミドは、該細胞中に該リプレッサーを
滴定するのに充分な数で存在し、その結果、該必須な遺
伝子が発現され、これにより細胞増殖を可能にする、形質転換された宿主細胞。
【請求項２】前記リプレッサーが、E.coli lacリプレッ
サー、γリプレッサー、E.coli trpリプレッサー、E.co
li galRリプレッサー、E.coli araCリプレッサー、E.co
li tetリプレッサー、およびE.coli ArgRNVリプレッサ
ーからなる群から選択される、請求項１に記載の宿主細
胞。
【請求項３】前記宿主細胞が、哺乳動物細胞または昆虫
細胞のような動物細胞、植物細胞、酵母細胞のような菌
類あるいは細菌細胞である、請求項１または２に記載の
宿主細胞。
【請求項４】前記細胞が細菌細胞である、請求項１また
は２に記載の宿主細胞。
【請求項５】前記細胞がグラム陰性細菌細胞である、請
求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】前記細胞がE.coliである、請求項５に記載
の宿主細胞。
【請求項７】前記細胞がSalmonellaである、請求項５に
記載の宿主細胞。
【請求項８】前記細胞がグラム陽性細菌細胞である、請
求項４に記載の宿主細胞。
【請求項９】前記細胞がBacillusである、請求項８に記
載の宿主細胞。
【請求項１０】前記細胞が酵母細胞である、請求項１ま
たは２に記載の宿主細胞。
【請求項１１】前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項
１または２に記載の宿主細胞。
【請求項１２】前記プラスミドが、宿主細胞あたり該プ
ラスミドの約10〜50コピーの複製を可能にする複製起点
を含む、請求項１〜11のいずれか１項に記載の宿主細
胞。
【請求項１３】前記プラスミドが、宿主細胞あたり該プ
ラスミドの約100〜200コピーの複製を可能にする複製起
点を含む、請求項１〜11のいずれか１項に記載の宿主細
胞。
【請求項１４】前記プラスミドがpBR322である、請求項
12に記載の宿主細胞。
【請求項１５】前記プラスミドがpUCである、請求項13
に記載の宿主細胞。
【請求項１６】前記プラスミドが、目的の遺伝子の挿入
のためのクローニング部位を含む、請求項１〜15のいず
れか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】前記プラスミドが、哺乳動物細胞におけ
る発現のための制御配列に作動可能に結合した目的の遺
伝子をさらに含む、請求項16に記載の宿主細胞。
【請求項１８】前記プラスミドが、本質的に、リプレッ
サーに結合し得るオペレーター、複製起点、および目的
の遺伝子の挿入のためのクローニング部位からなる、請
求項１〜17のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】前記プラスミドが、約1000bpの長さであ
る、請求項18に記載の宿主細胞。
【請求項２０】宿主細胞中のプラスミドを維持する方法
であって、以下の工程：請求項１〜19のいずれか１項に記載の形質転換細胞を、
該細胞が増殖するのを可能にするに充分な時間および条
件下で培養する工程、を包含する、方法。
【請求項２１】プラスミドDNAを産生する方法であっ
て、以下の工程：請求項１〜19のいずれか１項に記載の形質転換細胞を、
該細胞が増殖するのを可能にするに充分な時間および条
件下で培養する工程、ならびにプラスミドDNAを該培養細胞から単離する工程、を包含する、方法。
【請求項２２】組換えタンパク質を産生する方法であっ
て、以下の工程：請求項17〜19のいずれか１項に記載の形質転換細胞を、
該細胞が増殖するのを可能にするに充分な時間および条
件下で培養する工程、ならびに該組換えタンパク質を該培養細胞から単離する工程、を包含する、方法。