DE69611794T2

DE69611794T2 - Stabilisierung von plasmiden

Info

Publication number: DE69611794T2
Application number: DE69611794T
Authority: DE
Inventors: Alexis Hanak; John Sherratt; Geraint Williams
Original assignee: Cobra Therapeutics Ltd
Current assignee: Cobra Biologics Ltd
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 2001-08-02
Anticipated expiration: 2016-09-07
Also published as: AU710494B2; KR19990044525A; AU6885596A; EP0851932A1; CA2231784C; JPH11511985A; KR100356581B1; JP3416888B2; CA2231784A1; DE69611794D1; ES2155620T3; GB9518395D0; US5972708A; WO1997009435A1; EP0851932B1; ATE199168T1; PT851932E; DK0851932T3; GR3035806T3

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Diese Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die stabile Erhaltung eines Plasmids und insbesondere auf ein Plasmid, das ein in der Gentherapie nützliches Gen enthält.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die stabile Erhaltung eines Plasmids, insbesondere bei einer hohen Kopienzahl, ist essentiell zur Herstellung einer DNS, die ein therapeutisches Gen trägt, zur Verwendung in der Gentherapie. In Wirtszellen getragene extrachromosomale DNS ist jedoch in Zellkulturen von Natur her instabil, da kultivierte Zellen, die Plasmide enthalten, im Vergleich zu plasmidfreien segreganten Zellen normalerweise eine erhöhte metabolische Last aufweisen. Um die Plasmidstabilität zu erhalten und die metabolische Last zu erleichtern, wurden routinemäßig Plasmide verwendet, die so geschaffen waren, daß sie dominante, selektierbare Markersubstanzen enthalten konnten. Während der Scaleup-Fermentation von Bakterien- oder Hefewirtszellenstämmen verhindert die Gegenwart des Selektionsgens übermäßigen Plasmidverlust und - zunahme durch Zellen, die nicht durch die Replikations- und Erhaltungsbemühungen der Plasmid-DNS belastet sind.
Zum Beispiel sind Antibiotikaresistenz-Gene, die Widerstand gegenüber Antibiotika, wie etwa Ampicillin, Kanamycin oder Tetrazyklin kodieren, die am weitesten verbreiteten dominanten, selektierbaren Markersubstanzen, die bei der Klonierungs- und Fermentierungsverfahren der Molekularbiologie zur Herstellung von rekombinanten Proteinen oder Plasmid-DNS verwendet werden. Bei fortlaufender Fermentation in der Gegenwart eines Antibiotikum geht der selektive Druck verloren, da das Antibiotikum über längere Zeit hinweg aufgrund der Kulturverdünnung oder Zerlegung durch die Wirtszelle an Aktivität verliert. Daher verwenden einige der erfolgreicheren Verfahren zur Erhaltung von Plasmiden keine Antibiotikaselektion sondern zählen auf einen mutierten Wirt, der nichtfähig ist, Aminosäure zu synthetisieren und fügen das Gen, welches für die Synthese im Plasmid sorgt, ein. Weitere Lösungen zur Verhinderung der Übernahme einer Kultur durch plasmidfreie Segreganten bestehen darin, eine Genkodierung für ein toxisches Erzeugnis in das Chromosom zu geben und dann ein entsprechendes Repressorsystem in das Plasmid einzuschließen. Plasmidfreie Zellen werden bei der Segregation wirksam getötet.
Plasmidfreie Zellen können jedoch sogar bei selektivem Druck aufgrund des Auslaufens des Komplementärproduktes des selektiven Gens aus Plasmid tragenden Zellen weiter wachsen. Zudem haben die Verwendung von Genen zur Antibiotikaresistenz oder anderer dominanter, selektierbarer Markersubstanzen auf zur Gentherapie bestimmten Vektoren zu potentiellen Problemen hinsichtlich der Expression jener Gene in der Target-Säugetierzelle oder in Wirts-Säugetierorganismen geführt. Die Expression jener Zellen in der Target-Säugetierzelle kann zu ihrer Zerstörung und/oder zu einer Antigenreaktion auf das Generzeugnis in dem Säugetier führen. Es bestehen auch Bedenken hinsichtlich der Kontaminierung des Endproduktes mit dem zur Plasmidselektion in der Kultur verwendeten Antibiotikum, was eine ernsthafte Immunreaktion auf das Antibiotikum hervorrufen kann, z. B. anaphylaktischen Schock. Die weitverbreitete Verwendung von bakteriellen Genen zur Antibiotikaresistenz führt schließlich ebenfalls zu ihrem Übergang in die gesamte Bakterienpopulation. Daher besteht Bedarf an einem Verfahren zur Plasmiderhaltung, das nicht der Gegenwart von von Plasmid übertragenen Genen oder Antibiotikaselektion bedarf.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung beruht auf der Entdeckung eines Plasmiderhaltungssystems, das nicht der Verwendung einer von Plasmid übertragenen, dominanten, selektierbaren Markersubstanz bedarf sondern ein Repressortitrationssystem verwendet.
Die Erfindung bezieht sich auf eine transformierte Wirtszelle in einem Kultursubstrat, wobei die Wirtszelle aus folgendem besteht:
einem Plasmid, das einen Operator enthält, der empfänglich für das Binden durch einen Repressor ist,
einem auf dem Chromosom vorhandenen ersten Gen, das für den Repressor kodiert, und
einem auf dem Chromosom vorhandenen zweiten Gen, das funktionell mit dem Operator verbunden und für das Zeliwachstum in dem Substrat wesentlich ist,
wobei das Plasmid in der Zelle in genügender Menge vorhanden ist, um den Repressor zu titrieren, so daß das wesentliche Gen exprimiert wird, wodurch das Zellwachstum ermöglicht wird, vorausgesetzt, daß das zweite chromosomale Gen kein Antibiotikaresistenz-Gen ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine transformierte Wirtszelle in einem Kultursubstrat, wobei die Wirtszelle aus folgendem besteht: einem Plasmid, das einen Operator enthält, der empfänglich für das Binden durch einen Repressor ist,
einem auf dem Chromosom vorhandenen ersten Gen, das für den Repressor kodiert, und
einem auf dem Chromosom vorhandenen zweiten Gen, das funktionell mit dem Operator verbunden und für das Zellwachstum in dem Substrat wesentlich ist,
wobei das Plasmid in der Zelle in genügender Menge vorhanden ist, um den Repressor zu titrieren, so daß das wesentliche Gen exprimiert wird, wodurch das Zeliwachstum ermöglicht wird, und wobei das zweite chromosomale Gen zur Biosynthese eines Zellmetabolits, eines Kohlenstoffmetabolismus, zur Biosynthese oder Regulation von Makromolekülen oder für DNS- und/oder RNS-Synthese- und Replikationsfunktionen erforderlich ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine transformierte Wirtszelle in einem Kultursubstrat, wobei die Wirtszelle aus folgendem besteht:
einem Plasmid, das einen Operator enthält, der empfänglich für das Binden durch einen Repressor ist,
einem auf dem Chromosom vorhandenen ersten Gen, das für den Repressor kodiert, und
einem auf dem Chromosom vorhandenen zweiten Gen, das funktionell mit dem Operator verbunden und für das Zellwachstum in dem Substrat wesentlich ist,
wobei das Plasmid in der Zelle in genügender Menge vorhanden ist, um den Repressor zu titrieren, so daß das wesentliche Gen exprimiert wird, wodurch das Zeliwachstum ermöglicht wird, und wobei das zweite chromosomale Gen ein Wirtszellengen ist oder einem Wirtszellengen entspricht und für das Zeliwachstum wesentlich ist.
Wie es hier verwendet wird, bedeutet "funktionell verbunden" oder "operativ verbunden" hinsichtlich einer Operatorsequenz und einem damit verbundenen Gen, daß der Operator in cis-Stellung mit dem Gen verbunden ist, so daß die Expression des Gens beim Binden eines Repressors an den Operator repressionsempfindlich ist.
Es versteht sich für einen Experten auf dem Gebiet, daß der Begriff Operator verwendet wird, um eine Nucleinsäurensequenz zu definieren, an die sich ein Repressor bindet, um eine Transkription von einem damit verbundenen Promotor zu verhindern. Die auf dem Plasmid vorhandene Operatorsequenz muß nicht eine mit der Operatorsequenz auf dem chromosomalen Gen identische Sequenz sein, so daß der Plasmidoperator nur aus den Mindestsequenzen bestehen muß, die zum Binden des Repressors, der die Transkription des chromosomalen Gens unterdrückt, nötig sind. Es versteht sich auch, daß gemäß der Erfindung auch mutierte Operatorsequenzen nützlich sind, wie etwa Sequenzen, bei denen ein oder mehrere Nukleotide eingeführt, gelöscht oder substituiert worden ist/sind, was zu einer erhöhten oder herabgesetzten Affinität für den entsprechenden Repressor führt.
Wie es hier verwendet wird, bezieht sich "Zeliwachstum" auf eine steigende Anzahl Zellen in einem Kultursubstrat über eine gewisse Zeitspanne hinweg und auch auf das Überleben der Zellen, wo die Anzahl Zellen mit der Zeit nicht steigt sondern eher, wo die Anzahl lebender Zellen mit der Zeit nicht abnimmt.
Vorzugsweise kodiert das Regulatorgen für einen der folgenden Repressoren: den E. coli lac-Repressor, den X-Repressor, den E. coli trp- Repressor, den E. coli galR-Repressor, den E. coli araC-Repressor, den E. coli ArgRNV-Repressor (Burke et al., (1994) Mol. Microbiol., 13, 609-618) oder den E. coli Tet-Repressor. Wie oben beschrieben, ist jeder Repressor in trans-Stellung mit einer trans-verbundenen Operatorsequenz, die in dem Chromosom und auf dem Plasmid vorhanden ist, wirksam. Die Erfindung zieht die Gegenwart eines oder mehrerer Regulatorgene auf dem Wirtschromosom, z. B. ein, zwei oder drei Regulatorgene, in Betracht, um da Plasmidstabilität zu garantieren, wo ein chromosomales Regulatorgen mutiert oder gelöscht wird.
Bevorzugte Operatorsequenzen umfassen daher den lac-Operator, den X- Operator, den trp-Operator, den gal-Operator, den ara-Operator, den Arg- Operator und den Tet-Operator. Bei Bedarf kann der entsprechende Promotor funktionell mit seinem Operator verbunden werden.
Die Wirtszelle kann irgendeine Zelle, einschließlich einer tierischen Zelle wie etwa eine Säugetierzelle oder eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, eine Pilzzelle, wie etwa Hefe und Bakterien sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Bakterienzelle, die entweder gram-negativ oder gram-positiv ist, zum Beispiel E. coli, Salmonella, Bazillus, Streptomyces und Lactobazillus.
Wenn die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist, werden vorzugsweise die Lac- und Tet-Repressoren und deren entsprechende Operatoren verwendet. Die Verwendung von Lac- und Tet-Repressoren zur Regulierung der Genexpression bei eukaryotischen Zellen, einschließlich Hefe, Dictiostellum, Pflanzenzellen und Tabakpflanzen, wird von Gossen et al. ((1994) Current Opinions in Biotechnology, 5, 516-520) beschrieben.
Es kann mehr als ein unterschiedliches, essentielles chromosomales Gen, das funktionell mit dem Operator verbunden ist, in dem Zellchromosom vorhanden sein, wobei das essentielle Gen mit einem Operator verbunden ist und daher empfindlich für Repression durch den Repressor ist, um vor Verlust von Repressorempfindlichkeit bei einem chromosomalen Operator zu schützen. Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Gen kodierende Repressorprotein in zwei oder drei Ausführungen an unterschiedlichen Stellen im Chromosom vorhanden, um vor Verlust von Repressorexpression an einer chromosomalen Stelle zu schützen.
Bevorzugte essentielle Gene, die auf dem Wirtschromosom angeordnet sind, umfassen Gene der folgenden Kategorien, sind jedoch nicht darauf begrenzt: Gene, die Erzeugnisse kodieren, welche mit der Biosynthese von Zellmetaboliten wie etwa Zellwandpräkursoren verbunden sind, Gene, deren Erzeugnisse in Kohlenmetabolismus involviert sind und Gene, die Biosynthese oder Regulation von Makromolekülen kodieren, z. B. Gene, die für DNS- und/oder RNS-Synthese und Replikationsfunktionen essentiell sind.
Vorzugsweise umfaßt das Plasmid einen Replikationsursprung, der die Replikation von ungefähr 20 Kopien des Plasmids pro Wirtszelle oder bis zu ungefähr 200 Kopien des Plasmids pro Wirtszelle ermöglicht. Beispiele solcher Plasmide umfassen, sind jedoch nicht darauf begrenzt, pBR322 und die pUC-Reihe der Plasmide, wie von Vieira & Messing (1982, Gene, 19(3), 259-268) und Yanisch-Perron et al. (1985, Gene 33(1), 103-119) beschrieben und werden hierin als pUC bezeichnet.
Es wird bevorzugt, daß das Plasmid eine Klonierungsstelle zum Einführen eines gewünschten Gens umfaßt.
Bei einer speziell bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt das Plasmid ferner ein gewünschtes Gen. Vorzugsweise ist das gewünschte Gen in einer Säugetier-, vorzugsweise einer menschlichen Zelle, exprimierbar. Beispiele solcher Gene sind auf dem bisherigen Stand der Technik bekannt und werden hier offenbart. Bei Bedarf wird das gewünschte Gen in dem Wirtsstamm nicht exprimiert. Wenn der Wirtszellenstamm eine Bakterie ist, kann dies erreicht werden, indem kein bakterieller Promotor in das gewünschte Gen eingeschlossen wird. Zudem kann das gewünschte Gen bei Bedarf mit der Plasmidoperatorsequenz verbunden werden, so daß die Expression dieses Gens beim Wachstum der mit Plasmid transformierten Wirtszelle unterdrückbar ist. Diese dienen dazu, die metabolische Last der Wirtszelle zur Produktion des kodierten Interessenproteins zu reduzieren. Andernfalls, wenn die Expression des gewünschten Gens erwünscht ist, z. B. dort, wo die Produktion und Isolierung des kodierten Erzeugnisses erwünscht ist, muß der Operator nicht so positioniert werden, daß er die Expression des gewünschten Gens beim Zellwachstum unterdrückt, und die Expression des gewünschten Gens kann durch einen in der Wirtszelle aktiven Promotor angetrieben werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die oben genannte Wirtszelle, wobei das Plasmid lediglich diejenigen Sequenzen umfaßt, die für dessen Replikation und Erhaltung in der Wirtszelle nötig sind. Das heißt, das Plasmid besteht im wesentlichen aus einem Operator, der auf das Binden durch einen Repressor, der in trans-Stellung exprimiert wird, empfindlich ist, einem Replikationsursprung und einer Klonierungsstelle zum Einführen eines gewünschten Gens.
Die Erfindung bezieht sich auch auf das oben genannte minimale Plasmid, d. h., das im wesentlichen aus einem Operator, der auf das Binden durch einen Repressor, der in trans-Stellung exprimiert wird, empfindlich ist, einem Replikationsursprung und einer Klonierungsstelle zum Einführen eines gewünschten Gens besteht. Wie es hier verwendet wird, bedeutet "besteht im wesentlichen aus", daß das Plasmid lediglich die Sequenzen, die zur Erhaltung des Plasmids in dem Wirtsstamm nötig sind, und eine Klonierungsstelle zum Einführen eines therapeutischen Gens enthält. Das heißt, daß das Plasmid keine Sequenzen enthält, die für sein Überleben in der Wirtszelte nicht nötig sind. Wie es hier verwendet wird, bezieht sich "Replikationsursprung" auf jene Sequenzen auf dem Plasmid, die zur Erhaltung des Plasmids bei einer gewissen Kopienzahl pro Zellen nötig sind.
Vorzugsweise weist dieses minimale Plasmid eine Länge von ungefähr 1000 Bp auf. Noch besser weist das minimale Plasmid eine Länge von ungefähr 2 kb auf, wobei die in dem Plasmid enthaltene DNS, die keine Operatorsequenz, kein Replikationsursprung und keine Klonierungsstelle ist, nicht kodierende DNS ist.
Es ist insbesondere vorzuziehen, daß das minimale Plasmid ferner ein gewünschtes Gen enthält, das operativ mit den Kontrollsequenzen zur Expression in der Targetzelle verbunden ist. Vorzugsweise ist die Targetzelle eine Säugetierzelle und noch besser eine menschliche Zelle.
Das minimale Plasmid verfügt über den erheblichen Vorteil, daß es lediglich minimale, fremde DNS-Sequenzen wie bakterielle Sequenzen enthält und daher die Probleme, die mit der Einführung fremder DNS- Sequenzen in Säugetierzellinien, zum Beispiel wo ein Plasmid als Vektor für Gentherapie dienen soll, verhindert. Daher umfassen die Probleme, die erfindungsgemäß umgangen werden können, die Expression von Genen, die von Plasmiden getragen werden, wie etwa Bakterien- oder Hefegene in einer Säugetier-Targetzelle, die zur Zerstörung der Targetzelle oder des Säugetierwirts selbst führen können oder die zur Förderung einer Immunreaktion auf die fremde DNS oder auf Erzeugnisse, die durch solche Sequenzen kodiert sind, führen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Erhaltung eines Plasmids in einer Wirtszelle, welches den Schritt des Kultivierens der oben beschriebenen transformierten Zelle über einen gewissen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichen, um das Wachstum der Zelle zu ermöglichen, umfaßt.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung der Plasmid-DNS, welches das Kultivieren der oben beschriebenen transformierten Zelle über einen gewissen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichen, um das Wachstum der Zelle zu ermöglichen, sowie das Isolieren der Plasmid-DNS von der kultivierten Zelle, umfaßt.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, welches das Kultivieren der oben beschriebenen transformierten Wirtszelle über einen gewissen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichen, um das rekombinante Protein herzustellen, umfaßt. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren ferner das Isolieren des rekombinanten Proteins. Vorzugsweise ist das rekombinante Protein ein Protein, das dem Menschen von therapeutischem Nutzen ist.
Die Herstellung eines rekombinanten Proteins unter Verwendung des hierin beschriebenen Repressortitrationssystems stellt insofern eine reduzierte metabolische Last auf der Wirtszelle bereit, als der einzige kodierende Bereich auf dem Plasmid das Gen ist, welches für das rekombinante Protein kodiert. Daher muß die Wirtszelle nicht die Herstellung von Plasmid kodierenden Proteinen, die nicht das rekombinante Protein sind, unterstützen. Zudem ermöglicht das hierin beschriebene Repressortitrationssystem die Herstellung eines rekombinanten Proteins ohne ein Antibiotikum, wodurch der Verlust von Plasmidsefektion aufgrund des Verlustes antibiotischer Aktivität in der Kultur umgangen wird. Außerdem wird das isolierte rekombinante Protein so nicht mit einem Antibiotikum kontamintiert.
Das hierin beschriebene Repressortitrationssystem ermöglicht das stabile Erhalten des Plasmids bei einer mittleren oder hohen Kopienzahl ohne die Verwendung der Plasmid kodierenden, dominanten, selektierbaren Markersubstanzen, wie etwa zur Antibiotikaresistenz, und kann mit jedem Wirt verwendet werden, der ein in trans-Stellung wirkendes Repressor- /Operatorsystem unterstützen kann. Ein Vorteil der Erfindung liegt darin, daß sie auf der Plasmid-Erhaltung ohne Antibiotikaselektion von Plasmid tragenden Zellen basiert. Das heißt, es kommt zu keinem Verlust von selektivem Druck während der Fermentation aufgrund des Verlusts der Aktivität eines Antibiotikums. Es ist auch insofern ein Vorteil, daß auf dem Plasmid keine dominanten selektierbaren Markersubstanzen, wie etwa die hierin beschriebenen Antibiotikaresistenzgene, befindlich sind, als potentiell ernsthafte Probleme im Zusammenhang mit der Expression solcher Gene in einer Target-Säugetierzelle verhindert werden. Die Erfindung verhindert somit auch die Kontaminierung eines für die Gentherapie bestimmten Erzeugnisses mit dem zur Selektion des Gentherapievektors verwendeten Antibiotikum. Zudem verhindert die Erfindung die potentielle Induktion einer ernsthaften Immunreaktion auf solche Antibiotika, z. B. anaphylaktischen Schock.
Ein bedeutender Vorteil des hierin beschriebenen Plasmid- Stabilisierungssystems besteht darin, daß es die weitverbreitete Verwendung von Antibiotikaresistenz kodierenden Bakteriengenen, deren Verwendung den Transfer solcher Gene in die gesamte Bakterienpopulation zu fördern neigt, umgeht.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform und den Ansprüchen ersichtlich.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Zeichnung einer erfindungsgemäßen mit Plasmid transformierten Wirtszelle;
Fig. 2 ist eine schematische Zeichnung eines erfindungsgemäßen minimalen Plasmids;
Fig. 3 zeigt das Wachstum des E. coli-Stamms Hfr 3000 YA694, nicht transformiert und transformiert mit pUC18 auf einem minimalen Substrat, das Lactose oder Glucose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, A) Hfr 3000 YA694 (Min/Gluc/B1), B) Hfr 3000 YA694 (Min/Lac/B1), C) Hfr 3000 YA694-pUC18 (Min/GIucI/Ap), D) Hfr 3000 YA694-pUC18 (MinlLac/BI/Ap);
Fig. 4 zeigt die Plasmid-DNS von Zellen, die auf einem minimalen Substrat, das Glucose und Ampicillin enthält, gewachsen sind und dann in das minimale Substrat inokuliert werden, das aus folgendem besteht a) Lactose und Ampicillin, b) Lactose, c) Glucose; wobei Spur 1 λHindIII Standards ist, Spur 2 EcoRl begrenzte Inokulumplasmid-DNS ist, Spuren 3 bis 6 EcoRI begrenzte Plasmid-DNS sind, die nach dem Wachstum jeweils ungefähr 15, 36, 55 bzw. 72 Zellgenerationen lang isoliert worden sind;
Fig. 5 zeigt das derepressionierbare Wachstum von JC7623 IacZ-kan mit Kanamycin;
Fig. 6 zeigt das derepressionierbare Wachstum von DH1 lacZ-kan mit Kanamycin;
Fig. 7 zeigt das derepressionierbare Wachstum von JC7623 dapDkan IacZdapD ohne Diaminopimelat.

BESCHREIBUNG

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden nicht einschränkenden Beispiele dargestellt, wobei die nachfolgenden Materialien und Verfahren verwendet werden. Die gesamte Offenbarung jeder hierin zitierten Literaturquelle wird hier unter Bezugnahme eingeschlossen.
Die Erfindung beruht auf transformierten Wirtszellen, Plasmiden und Verfahren zur verbesserten Herstellung und Erhaltung eines Plasmids in einer Wirtszelle unter Verwendung eines neuartigen Systems der Repressortitration (Fig. 1). Die erfindungsgemäß erzeugte Plasmid-DNS ist in der Gentherapie nützlich. Das Plasmid selbst kann aus gewissen, wie in Fig. 2 dargestellten, minimalen Sequenzen bestehen und kann ein therapeutisches gewünschtes Gen tragen. Das neuartige Repressortitrationssystem funktioniert wie folgt.
Das wie in Fig. 1 und 2 dargestellte Systemverwendet eine Wirtszelle 10, die mit einer durch Plasmid übertragenen, Repressorprotein bindenden Sequenz 16 transformiert worden ist, d. h. einem Operator und einer chromosomalen Kopie eines Gens, das für ein Repressorprotein 12 kodiert. Ein weiteres chromosomales Gen 14, dessen Erzeugnis für das Wachstum oder das Überleben der Wirtszelle essentiell ist; ist operativ mit einem Operator 16 verbunden (d. h. unter dessen Kontrolle gegeben), der mit dem Repressorprotein bindet. Ohne das Plasmid 15 verhindert das Binden des Repressors mit dem chromosomalen Operator die Expression des essentiellen Gens; und die Zelle kann nur mit einem Induktor wachsen. Die darauffolgende Einführung eines Plasmids, das eine Bindestelle für das Repressorprotein enthält, führt zur Titration des Repressorproteins von dem chromosomalen Operator weg, wodurch die Expression des essentiellen Gens ermöglicht wird. Daher wachsen ohne den Induktoren lediglich jene Zellen, die das Plasmid enthalten. Dies geschieht, da die Operatorsequenz auf dem Plasmid ein Titrieren des Repressors durch das Plasmid ermöglicht, wodurch die Repressormoleküle, die ansonsten zum Binden mit dem chromosomalen Operator vorhanden wären, entfernt werden. Die Titration des Repressors durch Plasmidoperatorsequenzen ermöglicht die Expression des essentiellen chromosomalen Gens und das Wachstum von lediglich jenen Zellen, die Plasmid enthalten. Wenn der Wirtsstamm so konstruiert ist, daß der Repressor bei einer hohen Kopienzahl synthetisiert wird, wird das Plasmid bei einer noch höheren Kopienzahl erhalten.
Wie aus Fig. 2 ersichtlich, muß das Plasmid 15 lediglich Sequenzen zur Bindung des Operators 16 und einen Replikationsursprung 18 und eine Klonierungsstelle 20 enthalten.
Repressor-/Operatorsysteme, die gemäß der Erfindung nützlich sind.
Die Erfindung kann mit jedem in trans-Stellung wirkenden Repressor- /Operatorsystem verwendet werden. Zum Beispiel kann das hierin beschriebene Repressortitrationssystem jeden beliebigen Repressor umfassen, der genügend Affinität mit seiner DNS bindenden Sequenz aufweist, daß er die Expression eines essentiellen chromosomalen Gens verhindern kann, jedoch auch durch eine durch Plasmid übertragene, DNS bindende Sequenz titrierbar ist.
Das essentielle chromosomale Gen, das auf Repression durch den Repressor empfindlich ist, wird für Repression empfindlich gemacht, indem es unter Kontrolle eines Operators/Promotors, der mit dem Repressor bindet, gegeben wird, oder die Repressor bindende Sequenz (d. h. der Operator) in den natürlichen Promotor des essentiellen Gens so eingeführt oder mit ihm verbunden wird, daß er bei dem Binden durch den Repressor die Transkription verhindern kann, jedoch die Fähigkeit des natürlichen Promotors, die Transkription des essentiellen Gens ohne das Repressorbinden einzuleiten, nicht stört.
Es kann mehr als ein unterschiedliches essentielles Gen in dem Chromosom vorhanden sein, z. B. zwei oder drei Gene, wobei jedes funktionell mit einer Operatorsequenz verbunden ist und daher für die Repression durch den Repressor empfindlich ist. Die Gegenwart von verschiedenen für den Repressor empfindlichen essentiellen Genen auf dem Chromosom, vorzugsweise an verschiedenen Positionen in dem Chromosom, verringert die Möglichkeit des Verlusts von Plasmidstabilität durch Mutieren oder Löschen, was zu einem Verlust der Repression eines essentiellen chromosomalen Gens führt.
Der Repressor ist durch ein chromosomales Gen kodiert. Erfindungsgemäß befinden sich eine oder mehr, vorzugsweise eine, zwei oder drei Kopien des chromosomalen Regulatorgens in der Wirtszelle. Das chromosomale Regulatorgen kann ein natürlich vorkommendes Gen sein, das nicht modifiziert worden ist, oder es kann eine genetische Mutation enthalten, die das Repressormolekül von höherer oder niedrigerer Affinität hinsichtlich der Bindungsstärke an seinen entsprechenden Operator macht. Solche Mutationen sind aus dem bisherigen Stand der Technik bekannt, die Affinität des lac-Repressors für seinen Operator kann zum Beispiel durch einfache Aminosäureveränderungen verbessert werden (siehe Betz, (1986) Gene, 42, 283-292 und Khoury et al., (1991) J. Mol. Biol., 219, 623-634). Andernfalls können mehr oder weniger Kopien der Operator bindenden Stelle in das Plasmid eingeführt werden oder es können mehr oder weniger Kopien des Regulatorgens in das Chromosom oder in eine alternative Ausführungsform, die auf einem Plasmid getragen wird, eingeführt werden.
Als Alternative dazu können die Sequenzen, welche die Expression des Regulatorgens verbessern, wie etwa Promotoren, Enhancer etc. mutiert oder gentechnisch verändert werden, so daß eine höhere oder niedrigere Anzahl von Repressormolekülen in der Zelle hergestellt werden. Zum Beispiel kann die Anzahl Kopien des Iaclq-Repressors durch das Einführen der lacIq-Mutation (siehe Carlos (1978) Nature 274, 762-765) erhöht werden. Die Anzahl in der Zelle befindlichen Repressormoleküle wird mit der Kopienzahl des Plasmids, das die entsprechende Operatorsequenz trägt, verknüpft. Gemäß dem Repressortitrationssystem der Erfindung ist die Konzentration des in der Wirtszelle befindlichen Repressors so, daß das essentielle gewünschte Gen ohne das Plasmid nicht exprimiert wird, jedoch mit dem Plasmid der Repressor von dem essentiellen Gen wegtitriert wird. Wo mehr als eine Kopie des Regulatorgens in dem Chromosom vorhanden ist, z. B. zwei oder drei Kopien, wird die Anzahl des in der Zelle hergestellten Repressorproteins relativ zum Vorhandensein eines Gens erhöht; diese Erhöhung wird in Betracht gezogen, wenn ein entsprechender Plasmid- Replikationsursprung ausgewählt wird und indem die Anzahl der in der Zelle befindlichen; chromosomalen Operator-Iessentiellen Gene ausgewählt wird.
Die Stärke des Operators und die Affinitäten des Repressors können verändert werden, um das System auf die Verwendung mit Plasmiden unterschiedlicher Kopienzahlen zuzuschneiden. Zum Beispiel kann das Ausmaß der Repression des lac-Operons durch das Einführen eines optimal angeordneten idealen Hilfs-lac-Operators (d. h. eines lac- Operators mit einer verbesserten Repressoraffinität) oder das Einführen eines idealen Operators in den Promotor verbessert werden (Muller et al., (1996) Mol. Biol., 257, 21-29 und Lewis et al., (1996) Science 271, 1247- 1254). Als Alternative dazu kann die Stärke des Operators herabgesetzt werden, indem ein nicht-idealer Operator eingeführt wird, der Operator nicht optimal angeordnet wird oder ein Hilfsoperator eliminiert wird (Muller et al., (1996) Mol. Biol., 257, 21-29 und Oehler et al., (1990) EMBO J. 219, 973-979). Zum Beispiel kann die Affinität des lac-Repressors für seinen Operator durch einzelne Aminosäureveränderungen verbessert werden (Betz, (1986) Gene, 42, 283-292).
Repressorsysteme, die gemäß der Erfindung nützlich sind, umfassen das Nachfolgende, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Der E. coli lac- Repressorwird in "The Lactose Operon", J. Beckwith, in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, Hrsg., J. L. Ingraham et al., 1987 Amer. Soc. Micro., S. 1444-1452, und Dickson et al., 1975, Science 187 : 27-35 beschrieben. Der lac-Operon wird wie folgt reguliert. Bei nicht induzierenden Bedingungen (wie etwa Wachstum auf Glucose) bindet LacI mit dem Operator des Lac-Operons und verhindert die Transkription von /i-Galactosidase (LacZ), Lactose-Permease (LacY) und einer Transacetylase (LacA). Bei induzierenden Bedingungen (wie etwa Wachstum auf Lactose oder Addition von IPTG, einem nicht metabolisierbaren Analog) bindet der Repressor nicht mehr mit dem Operator und die Transkription findet statt. Die Expression des Operons kann leicht durch einen Assay für β-Galactosidase erfaßt werden. Andere Repressorsysteme, die gemäß der Erfindung nützlich sind, umfassen das oben beschriebene lac-Repressorsystem und das tet-Repressorsystem zur Verwendung für die Regulierung der Genaktivität in eukaryotischen Zellen (Gossen et al., (1994) Current Opinions in Biotechnology, 5, 516- 520). Das tet-Repressorsystem ist in Hefe-, Dictiostellum-, Pflanzenzellen und Tabakpflanzen verwendet worden. Ein weiteres Repressorsystem, das gemäß der Erfindung nützlich ist, ist das ArgRNV-Repressorsystem (Burke et al., (1994) Mol. Microbiol. 13, 609-618). Der ArgR-Repressor bindet normalerweise nur mit seinem Operator in der Gegenwart eines Arginin. Der mutierte ArgRNV-Repressor bindet jedoch mit dem Operator in der Abwesenheit des Arginin und bleibt in der Gegenwart des Arginin gebunden und hat eine transdominante Wirkung. Eine idealisierte ArgR bindende Stelle (Operator) mit zwei symmetrischen Arg-Kästchen kann so konstruiert werden, daß es ein gewünschtes Plasmid wird, um die Titration von ArgRNV von einem essentiellen Gen weg, dessen Expression durch die ArgR bindende Stelle gesteuert wird, zu ermöglichen.
Es versteht sich für einen Experten auf dem Gebiet, daß an dem hierin beschriebenen Repressor-Titrationssystem gewisse Modifikationen vorgenommen werden können, die dazu dienen, das System einem gegebenen Protokoll anzupassen. Zum Beispiel können da, wo das Wachstumsmedium Komponenten enthält, welche die Repression des Operators eher induzieren anstatt nur ermöglichen, wobei induzierende Bedingungen während des Wachstums nicht erwünscht sind, Operator- oder Repressormutanten verwendet werden, um die Induktion zu überwinden und die Repression zu ermöglichen. Ein Beispiel eines Mutantenrepressors ist ein LacI-Mutant des lac-Repressors. Ein LacI- Mutant weist die Fähigkeit, mit dem Induktor zu binden, nicht mehr auf. Beispiele von LacI-Mutanten umfassen z. B. LacIs-Mutanten (Beyreuthe, 1978, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY) und andere Mutanten wie etwa Asp276 --> Asn274 (Chang et al., 1994, Biochem. 22 : 3607-3616). Indem der Repressor des Wildtyps mit einem Mutantenrepressor, der gegenüber dem Induktor unempfindlich ist, ersetzt wird, kann der Repressor während des Wachstums mit dem Operator binden und das Plasmid wird in der Wirtszelle sogar unter Bedingungen, die normalerweise den Repressor induzieren, erhalten.
Der E. coli trp-Repressor ist gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls nützlich (siehe "The tryptophan operon", Yanofsky und Crawford, in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, Hrsg., J. L. Ingraham et al., 1987, Amer. Soc. Micro., S. 1453-1472). Der trp-Repressor ist bei ungefähr 50 Kopien/Zelle vorhanden und erfordert Tryptophan in dem Fermentationsmedium als Induktor der Repressorbindung. Der E. coli galR-Repressor ist gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls nützlich (siehe "The Galactose Operon", S. Adhya, in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Hrsg., J. L. Ingraham et al., 1987, Amer. Soc. Micro., S. 1503-1512). Der E. coli aracC-Repressor ist gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls nützlich (siehe "The L-Arabinose Operon", R. Schlief, in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Hrsg., J. L. lngraham et al., 1987, Amer. Soc. Micro., S. 1473-1481; Dunn et al., 1984, Proc. Nat. Aca. Sci. 81; 5017-5020). Der aracC-Repressor hat seine Bindungsaffinität in der Gegenwart von Arabinose erhöht. Schließlich ist der X-Repressor gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich (lntroduction to Lambda Phages, in Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel, et al., 1994, Abschnitt III, Einheit 1.9; Hochschild et al., 1986, Cell 47(5); 807-816).
Plasmide, die gemäß der Erfindung nützlich sind.
Die Erfindung kann vorteilhaft mit einem Plasmid-Replikationsursprung verwendet werden, der die Replikation von zumindest 10, vorzugsweise zumindest 20-100 und am besten zumindest 200-500 Kopien des Plasmids per Wirtszelle ermöglicht. Jene Replikationsursprünge, welche die Replikation von mittleren (d. h. 20-50) bis hohen Plasmidkopienzahlen (d. h. 200-500) ermöglichen, sind insbesondere nützlich, da die mittleren bis hohen Plasmidkopienzahlen leicht Repressormoleküle titrieren können. Es kann natürlich bei Bedarf auch ein Plasmid mit einer Kopienzahl von bis zu 1000-2000 Kopien pro Zelle verwendet werden.
Plasmide mit niedrigen Kopienzahlen (d. h. 10 Kopien oder weniger) werden gemäß der Erfindung am ehesten nach der Mutation verwendet, um eine höhere Kopienzahl zu erreichen (J. Scott, 1984, Microbial Reviews 48 : 1-23). Von den häufig verwendeten Replikationsursprüngen ist pBR322 (20 Kopien/Zelle) gemäß der Erfindung nützlich und pUC (bei 200 Kopien/Zelle) wird bevorzugt. Obgleich es nicht bevorzugt wird, sind andere Plasmide, die gemäß der Erfindung nützlich sind, solche, die zur Replikation für ein Plasmid kodiertes Protein benötigen, zum Beispiel pT181-, FII- und FI-Replikationsursprünge.
Beispiele von Replikationsursprüngen, die gemäß der Erfindung in E. coli und S. Typhimurium nützlich sind, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, pMB1 (25 oder mehr Kopien pro Zelle, Bolivar et al., 1977, Gene 2 : 95-113), ColE1 (15 oder mehr Kopien pro Zelle, Kahn et al., 1979, Methods Enzymol. 68 : 268-280), p15A (ungefähr 15 Kopien pro Zelle, Chang et al., 1978, J. Bacteriol. 134 : 1141-1156); pSC101 (ungefähr 6 Kopien pro Zelle, Stoker et al., 1982, Gene 18 : 335-341); R6K (weniger als 15 Kopien pro Zelle, Kahn et al., 1979, oben); R1 (von der Temperatur abhängender Replikationsursprung, Uhlin et al., 1983, Gene 22 : 255-265); lambda dv (Jackson et al., 1972, Proc. Nat. Aca. Sci. 69 : 2904-2909). Ein Beispiel eines in Staphylococcus nützlichen Replikationsursprungs ist pT181 (ungefähr 20 Kopien pro Zelle, J. Scott, 1984, Microbial Reviews 48: 1-23). Von den oben genannten Replikationsursprüngen werden pMB1, p15A und ColE1 bevorzugt, da diese Ursprünge zur Replikation keine für Plasmid kodierte Proteine benötigen.
Wirtszellen, die gemäß der Erfindung nützlich sind.
Die Erfindung ist auf alle Zelltypen anwendbar, einschließlich Tierzellen, wie etwa Säugetierzellen und Insektenzeilen, Pflanzenzellen, Pilze, wie etwa Hefe und die meisten Bakterienstämme, zum Beispiel gram-positive und gram-negative Bakterienstämme, vorausgesetzt, es existiert ein Plasmid, das in der Wirtszelle bei einer mittleren bis hohen Kopienzahl erhalten werden kann.
Gram-negative Spezies, die gemäß der Erfindung nützlich sind, umfassen E, coli und Salmonella, z. B. S. Typhimurlum, sind aber nicht darauf beschränkt.
Gram-postive Bakterien, die gemäß der Erfindung nützlich sind, umfassen Bazillus, Streptomyces, Lacfobazillus und Lacfococcus, für welche schon Plasmide mit hohen Kopienzahlen vorhanden sind, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispiele von Plasmiden, die gemäß der Erfindung in Lactococcus nützlich sind, umfassen pNZ2123 und pIL253 (Simon et al., Biochimie 70 : 559, 1988)). Das (actocokale Lactoseoperon wurde verwendet, um die Expression von heterologen Proteinen zu steuern (Wells et al., 1993, Mol. Microbiol. 8(6): 1155-1162). Dieses Operon verwendet den lacR-Repressor (von Rooigen et al., J. Biol. Chem. 265: 18499-18503, 1990), um die Expression der T7-Polymerase zu steuern, die ihrerseits die Expression des heterologen Proteins steuert. Beispiele von Plasmiden, die gemäß der Erfindung in Bazillus nützlich sind, umfassen pC194, pUB110 und pT181.
Im Bazillus, z. B. B. subtilis, wurde der X-Repressor verwendet, um die Expression heterologer Proteine zu steuern. Der X-Repressor ist unter Kontrolle des sak42D-Promotors gestellt worden, welcher wirksam in den B. subtilis übertragen werden kann (Breitling et al., 1990, Gene 93(1): 35- 40).
Hefen sind gemäß der Erfindung nützlich, da Plasmide mit hohen Kopienzahlen in Hefen erhalten sind. Beispiele solcher Plasmide umfassen die YRp-Plasmide (auf der Grundlage von autonom replizierenden Sequenzen (ARS)), die Kopienzahlen von bis zu 100 Kopien pro Zelte aufweisen und die YEp-Plasmide (auf der Grundlage des 2 Mikronkreises) mit einer Kopienzahl von 50-100 pro Zelle. (Siehe Sikorski, "Extrachromosomal cloning vectors of Saccharomyces cervisiae", in Plasmids, A Practical Approach, Hrsg. K. G. Hardy, IRL Press, 1993; und Yeast Cloning Vectors and Genes, Abschnitt II, Einheit 13.4, Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg., Ausubel et al., 1994). Hefen können das E. coli lacZ-Gen exprimieren, daher wird gemäß der Erfindung in Betracht gezogen, das lac-Repressortitrationssystem zur Steuerung der Expression von essentiellen Hefegenen, wie etwa ura3 oder leu2, Genen, die zur Erhaltung des Plasmids in Hefen verwendet worden sind, zu verwenden (Gunge, 1983, Ann. Rev. Micro. 37 : 253-276).
Essentielle Gene, die gemäß der Erfindung nützlich sind.
Die Erfindung kann in Zusammenhang mit einer Anzahl verschiedener essentieller chromosomaler Wirtsgene zur stabilen Erhaltung des Plasmids verwendet werden. Diese essentiellen Gene umfassen folgende Kategorien, sind jedoch nicht auf diese beschränkt, z. B. Gene, die Erzeugnisse kodieren, die mit der Biosynthese der Zellmetaboliten verbunden sind, Gene, deren Erzeugnisse mit dem Kohlenstoffmetabolismus zu tun haben und Gene, welche die Biosynthese oder Regulierung von Makromolekülen z. B. Gene, die für die DNS- und/oder RNS-Synthese- und Replikationsfunktionen essentiell sind, kodieren.

1. Essentielle Gene, die mit der Synthese von Komponenten der Zellstruktur verbundene Erzeugnisse kodieren.

Gewisse Gen, die Enzyme kodieren, die mit der Zufuhr von Zellkomponenten zu tun haben, insbesondere der Zufuhr von Zellwandpräkursoren, sind ebenfalls essentiell für das Wachstum der Wirtszelle und sind gemäß der Erfindung nützlich, Die Bakterienzellwand enthält zum Beispiel Meso-Diamiopimelinsäure (DAP) und die Unfähigkeit, diese Komponente zu synthetisieren führt zur Zellyse. Es ist schon gezeigt worden, daß die Mutanten, in denen das asd-Gen (Aspartat βsemialdehyddehydrogenase) oder das dapD-Gen (Succinyl- Diaminopimelat-Aminotransferase) gelöscht ist, zur Erhaltung von Plasmiden, die eine komplette Kopie jenes Gens auf dem Plasmid tragen, verwendet werden können. (Nakayama et al., Bio/technology 6 : 693-697, 1988; DeGryse, U. S. Pat. Nr. 5,198, 343). Eine Anzahl anderer Gene auf dem DAP = Biosynthesepfad könnte auch verwendet werden, nämlich dapA-, dapB-, dapC- und dapE-Gene. dapA und dapB sind geklont und sequenziert worden und dapB ist als einzelnes Cistron erhältlich (Richaud et al., J. Bacteriol. 166 : 297-300, 1986; Bouvier et al., J. Biot. Chem. 259: 14829-14834, 1984). Die in der Biosynthese von anderen Zellwandkomponenten involvierten Gene, wie etwa D-Alanin-Biosynthese, sind gemäß der Erfindung ebenfalls nützlich (Walsh, 1989, J. Biol. Chem. 264 (5): 2393-2396). Eine DNS-Sequenz, die eine Komponente für D-Aianin kodiert, wurde zur Stabilisierung von Plasmiden ohne die Verwendung von Antibiotika verwendet (siehe EP 851309020).
Die Erfindung zieht die Verwendung einer Repressionstitration zusammen mit solchen Genen in Betracht. Das gewünschte Gen wird zuerst von dem Wirtsstamm gelöscht, so daß der Wirt nun Bedarf an dem Erzeugnis jenes Gens hat (Winans et al., 1985, J. Bact. 161(3): 1219-1221; Jasin et al., 1984, J. Bact. 159(2): 783-786). Dann wird unter Verwendung herkömmlicher Klonierungsverfahren eine Kopie des Gens hergestellt, so daß dessen Expression durch den Promotor/Operator, der das ausgewählte Repressorprotein bindet, gesteuert wird. Diese Konstruktion wird dann in das Chromosom des Wirtszellenstamms eingeführt, der das Repressorprotein synthetisiert (Winans et al., 1985, J. Bact. 161 (3): 1219- 1221; Jasin et al., 1984, J. Bact. 159(2): 783-786). Die Transformation des Stamms mit einem die Repressorbindesequenz enthaltenden Plasmid, führt zur Titration des Repressors von dem biosynthetischen Gen weg, wodurch die Expression des essentiellen Gens ermöglicht wird.

2. Gene, die für das Zeliwachstum essentiell sind.

Das Repressor-Titrationsverfahren der Erfindung kann mit Genen verwendet werden, die bei der Verwendung von Kohlenstoffquellen involviert sind. Das Verfahren kann insbesondere mit dem Lactose- Operon und der Verwendung von Lactose als einziger Kohlenstoffquelle, wie hierin beschrieben, verwendet werden. Weitere Modifikationen werden dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein. Es existieren Mutanten des lac-Repressors, die nicht mehr fähig sind, mit dem Induktor (Allolactose) zu binden und bleiben in normalen Induzierbedingungen mit dem lac-Operator gebunden. Diese werden durch die lacIs-Mutanten typisiert; es existieren jedoch noch weitere Mutanten, die nicht fähig sind, mit dem Induktor zu binden, jedoch in allen anderen Funktionen normal sind (Chang et al., Biochem. 33 : 3607-3616 (1994)). Stämme, die solche Mutanten tragen, wären nicht dazu fähig, die Gene des lac-Operons zu exprimieren und daher nicht fähig, mit Lactose als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Die Transformation solcher Stämme mit lac-Operon-Sequenzen des Wildtyps, die Plasmide mit einer hohen Kopienzahl enthalten, titrieren den Repressor vom lac-Operon weg und ermöglichen das Wachsturn auf der Lactose.
Glutaminsynthetase ist ein essentielles Gen für eukariotische Zellen, wie etwa die NSO-Myelom-Zellinie (Bebbington et al., (1992) Bio/Technology 10, 169-175) und wird vorzugsweise verwendet, wenn die Wirtszelle eine eukariotische Zelle ist.

3. Gene, welche die Synthese von Nukleinsäure kodieren.

Die Erfindung kann auch in Zusammenhang mit essentiellen Genen, die DNS- und/oder RNS-Synthese oder Replikationsproteine der Wirtszeile kodieren, verwendet werden. Beispiele solcher Gene hinsichtlich dieser essentiellen Funktionen in Bakterien, wie etwa E. coli und Salmonella, werden in McMacken et al. (in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, Hrsg. Neidhardt et al., Amer. Soc. Micro., Wash. D. C., 1987, S. 564-612) bereitgestellt und umfassen folgende Gene, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: dnaA, dnaß, dnaC, ssb, dnaG, polC (dnaE), dnaQ (mutD), dnaN, dnaZX, gyrA, gyrB, polA, lig, dnaT, rpoA, rpoß, rpoC und rpoD.
In Beispiel I wird die Erfindung unter Verwendung des lac-Repressor- /Operatorsystems in Experimenten, die die Fähigkeit von Plasmid übertragenen Sequenzen, den Repressor vom chromosomalen Gen weg zu titrieren, veranschaulichen.

Beispiel I

Der E. coli-Stamm DH1 (Hanahan, J. Molec. Biol. 166 : 557-580, 1983) verfügt über ein intaktes Lactose-Operon, das von der Steuerung durch das Lactose-Repressorprotein (LacI) abhängt. LacI ist bei 10-20 Kopien pro Zelle vorhanden und bindet mir hoher Affinität (kd 1 · 10-14).
E. coli DH1 wurde mit pUCIBtet (einem Plasmid auf pUC&sub1;&sub8;-Basis, das Ampicilfin- und Tetracylinresistenzgene enthält und bei ungefähr 100-200 Kopien pro Zelle vorhanden ist) transformiert. pUClBtet enthält den lac- OperatorlPromotor, enthält jedoch kein LacI-Gen, welches für das, Repressorprotein kodiert. Das Plasmid enthält ebenfalls den pUC-· Replikationsursprung und einen Polylinker (oder mehrfache Klonierungsstelle) zur Einfügung eines therapeutischen Gens. Für Plasmid kodierte Ampicillin- und Tetracylinresistenz ist für die Repressortitration nicht nötig und eine Plasmid enthaltende nicht- Antibiotikaresistenz wird gemäß der Erfindung bevorzugt und kann einfach mit pUCIBtet ersetzt werden.
DH1 und DH1:: pUClBtet wurden auf einem M9 minimalen Salzmedium mit Lactose (10 mM) oder Glucose (10 mM) als Kohlenstoffquellen gezüchtet und wo nötig mit Ampicillin (50 ug/ml) ergänzt. Die Zelten wurden während des 10 g-Wachstums entnommen und hinsichtlich fJ-Galactosidasenaktivität untersucht (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY). Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, wurden bei auf Glucose und Lactose gezüchtetem DH1: pUClBtet vergleichbare β-Galactosidasenaktivitäten beobachtet, wohingegen bei auf Glucose im Vergleich zu Lactose gezüchtetem DH1 viel geringere Aktivitäten ersichtlich sind. Die Gegenwart des Plasmids titriert daher den lac-Repressor vom lac-Operon weg, wobei die Expression von β-Galactosidase ermöglicht wird.

Tabelle 1

Die Expression von β-Galactosidase in E. coli DH1 in der Gegenwart und Abwesenheit von pUCIBtet, wenn sie unter induzierenden und nichtinduzierenden Bedingungen gezüchtet wird.
Die Ergebnisse stammen von drei voneinander unabhängigen Experimenten und sind in jedem Experiment in Einheiten und als Prozentsatz des für auf Lactose gezüchteten DH1 erhaltenen Wertes ausgedrückt.

Beispiel II

Veranschaulichung der Repressortitration.
Der E. coli-Stamm Hfr 3000 YA694 (CGSC 6378) lac1694, relA1, spoTl, thi- 1, X, wurde auf EMB-Agar aufgebracht und über Nacht gezüchtet, woraus rosa Kolonien entstanden, was darauf hinweist, daß der Stamm unfähig ist, Lactose zu fermentieren und den lacIs-Genotyp aufweist, d. h. für einen Repressor kodiert, der gegenüber dem Induktor unempfindlich ist (Wison et al., (1964) J. Mol. Biol. 8 : 582). Es wurde eine einzelne Kolonie gezüchtet und für die Transformation funktionsfähig gemacht. Dieser Stamm wurde dann mit pUC18 (das den lac-Operator enthält und weiter oben beschrieben ist) transformiert und auf EMB-Agar, das Ampicillin enthält, aufgebracht. Die daraus entstehenden Kolonien waren schwarz, was darauf hinweist, daß die Lactose fermentiert war aufgrund der Titration des lacIs-Repressors von dem lac-Operon weg, wodurch die Expression des β-Galactosidase-Gens ermöglicht wird. Eine einzige Kolonie wurde in 5 ml LB-Ampicillin inokuliert und bis zu einem halben log gezüchtet und exprimierte β-Galactosidasenaktivität.
Der E. coli-Stamm Hfr 3000 YA694, der nicht transformiert und mit pUC18 transformiert ist, wurde auf ein minimales Medium aufgebracht, das Lactose oder Glucose als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, die wo nötig mit Ampicillin ergänzt wurde. Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß das Einführen von pUC18 zu dessen Fähigkeit, auf Lactose zu wachsen, führte.

Beispiel III

Veranschaulichung der Plasmiderhaltung durch Repressortitration.
Der pUC18 enthaltende E. coli-Stamm YA694 wurde in 5 ml M9 minimalen, mit Glucose (0,1 g/l), Ampicillin (50 ug/ml) und Thiamin (0,5 mg/l) ergänztem Medium inokuliert und bei 37ºC 14 h lang gezüchtet. 0,5 ml dieser Kultur wurden dann separat in folgendem inokuliert:
(1) 100 ml mit Glucose ergänztem M9-Medium,
(2) 100 ml mit Lactose ergänztem M9-Medium,
(3) 100 ml mit Lactose und Ampicillin ergänztem M9-Medium.
Die Kulturen wurden dann ungefähr 8 h lang bei 37ºC gezüchtet. Während der Wachstumsperiode wurden OD600-Messungen vorgenommen. Am Ende der Wachstumsperiode wurden 2 OD-Einheiten entfernt, entnommen und gefroren. Dann wurden 0,5 ml jeder Kultur in 100 ml frischem jeweiligem Medium inokuliert und weitere 14 h lang gezüchtet. Das Verfahren wurde dann wiederholt, um ungefähr 72 Wachstumsgenerationen zu erreichen, wobei an geeigneten Stellen Proben entnommen wurden.
Die Plasmid-DNS wurde dann von den entnommenen mit EcoRI digerierten Zellen isoliert und durch Gelelektrophorese analysiert. Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß das Plasmid nach 72 Wachstumsgenerationen bei Zellen, die lediglich in Lactose gezüchtet wurden, in einer höheren spezifischen Ausbeute vorhanden war als bei Zellen, die lediglich in Glucose (Fig. 4) gezüchtet wurden. Dies veranschaulicht, daß, indem das Wachstum von der Herstellung von β-Galactosidase zur Metabolisierung von Lactose abhängig gemacht wird, das Plasmid, das die Expression des β-Galactosidase-Gens ermöglicht, selektiv erhalten wird.

Beispiel N

Veranschaulichung von alternativen Repressoren.
Die Fähigkeit des mutanten Repressors ArgRNV, als Repressor zu wirken, der in dem Repressortitrationssystem verwendet werden kann, wurde untersucht. ArgRNV, ein gentechnisch veränderter Mutant von ArgR (Burke et al., 1994, Mol. Microbiol. 13 (4), 609-618), bleibt mit seiner mit DNS bindenden Stelleinnerhalb des Promotors des Arginin- Biosynthesegens bestehen, auch wenn kein Arginin vorhanden ist. Es hat sich gezeigt, daß die Transformation des E. coli-Stamms DS997 und DS998 mit dem ArgRNV-Gen auf einem Mehrkopienplasmid das Wachstum in einem minimalen Medium verhindert (Burke et all, 1994, Mol. Microbiol. 13 (4), 609-618): Der Repressor weist daher Transdominanz auf. Das Experiment wurde mit E. coli DH1, das mit ArgRNV transformiert wurde, das für ein Plasmid mit hoher Kopienzahl (pSelect, Promega) kodiert ist, wiederholt, und das nachfolgende Wachstum auf einem minimalen Medium kam lediglich in der Gegenwart von Arginin vor, wodurch die Fähigkeit des Repressors, in einem Repressortitrationssystem verwendet werden zu können, aufgezeigt wurde.
Das ArgRNV-Gen könnte in das Chromosom von DH1 gegeben und die Fähigkeit, das Wachstum in dem minimalen Medium zu verhindern, untersucht werden. Die Fähigkeit der ArgR bindende Stelle enthaltenen Plasmide, das ArgRNV von Arginin-Biosynthesegenen oder von einer essentiellen Genfunktionalität, die mit dem Arg-Operator verbunden ist, wegzutitrieren, kann untersucht werden.

Beispiel V

Die Erzeugung einer IacZ-Kanamycin-Fusion.
Eine Inframe-Fusion des N-Terminalbereiches des lacZ-Gens und des Kanamycin-Gens, das als Modell eines essentiellen Gens unter Steuerung des lac-OperatorslPromotors verwendet werden soll, wurde auf folgende Weise hergestellt (das Kanamycin-Gen kann durch irgendein essentielles Gen ersetzt werden). Die Kanamycin-Kassette wurde vom pUC4K (Pharmacia Biotech) durch Digestion mit Xhol und Psfll entfernt, dieses wurde in pUC18, das mit SaH und Psffdigeriert wurde, ligiert. Dies führte zu einer funktionellen Inframe-Fusion des lacZ-Gens mit dem Kanamycin- Gen, so daß die Expression der Kanamycinresistenz unter der Steuerung des lac-Operator-Promotors lag.
Die lac-/Kanamycinkonstruktion wurde durch Digestion mit Haell isoliert, abgeschwächt und in pN1 ligiert, welches mit StyI digeriert und abgeschwächt worden ist. pN1 ist ein auf pUC18 basierendes Plasmid, das 5,5 kb E. coli-Chromosom-DNS enthält, welche den dif-Ort umgibt (Lesije et al., 1995, EMBO J.; 14, 1561-1570). Die Einfügung des laclKanamycin in den dif-Ort auf pNl, ermöglicht schließlich die Rekombination der Konstruktion in ein Chromosom des erwünschten E. coli-Wirts. Das so erhaltene Plasmid wurde mit Saft linearisiert und zur Transformation des E. coli JC7623 verwendet (Winans et al., 1985, J. Bact., 161(3), 1219-1221) und auf Kanamycin-+IPTG-Platten ausgewählt. Kanamycinresistente Klons wurden auf die Nicht-Induzierbarkeit zum Wachstum des IPTG in der Gegenwart von Kanamycin (Fig. 5), den Verlust von Plasmid und die Einfügung der Konstruktion in das Chromosom mittels Southern-Analyse überprüft.
Die Konstruktion wurde dann vom Chromosom von JC7623 in das Chromosom von DH1 mittels P1-Transduktion transferiert. Der entstandene DH1 lac-Ikan-Stamm wurde mittels Southern-Analyse auf die Gegenwart der Konstruktion in dem dif-Ort und die Induzierbarkeit der Kanamycinresistenz (Fig. 6) überprüft. Die Transfektion des DH1 lacZ-kan mit pUCIBtet führt zum Wachstum in Kanamycin ohne daß IPTG die Titration des Repressors für das Kanamycinresistenzgen aufweist. Somit wird die Eignung der Wirtszelle zur Erhaltung des Plasmids in der Gegenwart von Kanamycin veranschaulicht.
Der DH1 lac-/kan-Stamm wurde dann mit einer Anzahl von Plasmiden, die den lac-Operator (pUC18, pUC18Tet und größere von diesen hergeleiteten Plasmide) aufweisen, transformiert und auf folgendes überprüft:
1. Wachstum auf dem Medium, das Kanamycin (60 ug/ml) enthält, unter nicht-induzierenden Bedingungen;
2. Die Erhaltung des Plasmids während des Batchwachstums mittels des Repressortitrationssystems.
Die Titration des lac-Repressors von der lac-/Kanamycinkonstruktion weg wurde somit veranschaulicht und die Erhaltung des Plasmids während des Batchwachstums wurde ebenfalls veranschaulicht.

Beispiel VI

Die Konstruktion und die Einfügung einer lacZdapD-Fusionskonstruktion in den dif-Ort eines E. coli DH1-dapD-Stamms wird vorgenommen, um ein essentielles Gen unter Steuerung des lac-Operators/Promotors bereitzustellen.
Die Konstruktion einer IacZdapD-Fusion
Das dapD-Gen wurde von DH1 mittels Polymerasekettenreaktion, die Primern verwendet, in welche EcoRI-Orte konstruiert wurden, (5'GTGCCCGAATTCCAATTGGCG-3', 5'-CGGCGTGAATTCATCGCTCATCCC-3') geklont. Das Polymerasekettenreaktionserzeugnis wurde mit EcoRI digeriert und in mit EcoRI digeriertem pUCl8 ligiert. Das entstandene Plasmid (pUCIBdapD) wurde verwendet, um den E. coli-Stamm AT982 (dapD4, thi1, relA1, 2-, spoT1) zu transformieren und es hat sich gezeigt, daß es die dapD- Mutation ergänzt, wobei es veranschaulicht, daß das dapD-Gen geklont worden ist. Die Fusion des dapD-Gens mit dem IacZ-Gen von pUCl8 wurde dann durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von pUCIBdapD und folgenden Oligonukleotiden hergestellt:
5'-CAATGCAGAATTCACAGAACATTA-3' und
5'-CGGCGTGAATTCATCGCTCATCCC-3'.
Die Digestion mit EcoRI und die Ligation in pUC18, das auch mit EcoRI digeriert worden ist, erzeugten eine Inframe-Fusion zwischen den IacZ und den dapD-Genen. Diese Konstruktion (pUC18dapD2) erwies sich durch die Restoration des Wachstums von AT982 nach der Transformation wiederum als funktionell.
Die lac/dapD-Fusion wurde als ein Haell-Fragment isoliert, abgeschwächt und in pN1, das mit Sty1 digeriert und dann abgeschwächt worden ist, ligiert. Dieses Plasmid (pN1 daß D2) ergänzte die dapD-Mutation in dem Stamm AT982.
Für einen Experten auf dem Gebiet versteht es sich, daß Modifikationen an den Konstruktionen vorgenommen werden können, einschließlich, zum Beispiel, an den verschiedenen Sequenzen.
Deaktivierung des WT DH1 dapD-Gens.
Vor der Einfügung der lacZdapD-Fusion in das Chromosom von DH1 wurde die Expression des WT-Gens zunächst deaktiviert. Das dapD-Gen wurde durch Polymerasekettenreaktion mit größeren Fragmenten von DNS 5' und 3' zu dem dapD-Gen unter Verwendung der nachfolgenden Oligonukleotiden wieder geklont:
5'-TCATCGGAATTCCCTGGAGTATCGG-3' und 5'-TGAGCTGAATTCCATCGCCGCGCTG-3', um eine wirksamere Rekombination zu ermöglichen. Das entstandene Polymerasekettenreaktionserzeugnis wurde mit EcoRI digeriert und in pUC18 ligiert, in dem-der PstI-Ort gelöscht wurde. Das entstandene Plasmid (pUC 18 dapD3) ergänzte die dapD-Mutation in AT982. Das dapD- Gen wurde dann durch Einfügung deaktiviert, indem die Kanamycinkassette von pUC4K in den PstI-Ort, der sich innerhalb des dapD-Gens befindet, eingeführt wird. Dieses Plasmid (pUC18dapDkan) ergänzte die dapD-Mutation in AT982 nicht mehr. Die Konstruktion wurde in das Chromosom von E. coli JC7623 durch die Transformation mit pUCIBdapDkan, das durch Digestion mit BamHI linearisiert wurde, eingeführt. Die Klons wurden auf die Unfähigkeit, in der Abwesenheit von zusätzlichen Diaminopimelaten zu wachsen, aber auf die Fähigkeit, in der Gegenwart von Kanamycin zu wachsen, gescreent. Die Gegenwart des Kanamycin-Gens innerhalb des dapD-Gens wurde dann durch die Southern-Analyse bestätigt. Das deaktivierte dapD-Gen wurde dann in das Chromosom von DH1 durch P1-Transduktion transferiert, um ein DH1- dapDkan zu erzeugen.
Die lacZdapD-Konstruktion wurde in das Chromosom von JC7623dapDkan mittels Transformation mit pN1dapD2, das mit ScaI linearisiert wurde, eingeführt. Die Klons wurden isoliert und dann wurde die IPTG-Wachstumsinduzierung in der Abwesenheit von Diamonopimelat veranschaulicht (Fig. 7).
Die lac-IdapD-Fusion wurde dann in das DH1dapDkan mittels der P1- Transduktion eingeführt und auf IPTG induzierbares Wachstum gescreent und dessen Stelle wurde innerhalb des dif-Orts durch die Southern- Analyse bestätigt.
Der DH1 dapDkan-lacdapD-Stamm wurde dann mit einem den lac- Operator (pUC18Tet) enthaltenden Plasmid transformiert und es wurden folgende Merkmale veranschaulicht:
1. Das Wachstum von DH1 dapDkan-lacdapD-pUC18Tet auf einem Medium, dem Diaminopimelat fehlt, unter nicht induzierenden Bedingungen, wobei die Titration des lac-Repressors von der lac-/dapD- Konstruktion weg veranschaulicht wird.
2. Die Erhaltung des Plasmids wurde während des Batchwachstums überprüft und die Plasmiderträge mit dem Zeliwachstum in der Gegenwart von Tetracyclin (d. h. um für das Plasmid mittels des Antibiotikaresistenzgens zu selektieren) und dem in der Gegenwart eines lnduktors (IPTG) (d. h. die Bedingungen, bei denen die Erhaltung des Plasmids nicht erfordert wird) verglichen. Die spezifische Ausbeute des Plasmids in der Abwesenheit von Tetracyclin war vergleichbar mit derjenigen, die in der Gegenwart von Tetracyclin beobachtet wurde, wodurch die selektive Erhaltung des Plasmids in der Abwesenheit von Antibiotika veranschaulicht wird. In beiden Fällen war die Ausbeute bedeutend größer als bei Zellen, die in der Gegenwart eines lnduktors gezüchtet wurden.

Beispiel VII

Die erfindungsgemäß in einer Wirtszelle stabil erhaltene Plasmid-DNS wird wie folgt isoliert. Die Zellen werden lysiert und die Plasmid-DNS gemäß den auf dem bisherigen Stand der Technik gut bekannten Verfahren gereinigt, wie in Birnboim et al., 1979, NAR 7 : 1513-1523 und Birnboim, 1983, Methods Enzymol. 100 : 243-255 beschrieben wird, oder indem ein Mini-, Maxi- oder Mega-Qiagen-Plasmidsatz (Qiagen, Chatsworth, CA) verwendet wird. Für die Large-Scale-Reinigung der Plasmid-DNS, z. B. 100 mg oder mehr, siehe Horn et al., 1995, Human Gene Therapy 6 : 565-573.

Beispiel VIII

Wo ein gewünschtes Gen, das für ein rekombinantes Protein kodiert, auf dem Plasmid getragen wird, so daß es unter Kontrolle der Wirtszellen- Regulierungssequenzen ist (d. h. mindestens ein Promotor, der in der Wirtszelle wirksam ist), kann das rekombinante Protein während des Zellwachstums hergestellt werden und dann gemäß auf dem bisherigen Stand bekannten Verfahren wie folgt isoliert werden. Die Herstellung und Reinigung des rekombinanten Proteins in E. coli wird wie im folgenden beschrieben durchgeführt: Das, 1990, "Overproduction of proteine in E. coli: Vectors, host and strategies", Methods in Enzymol. 182 : 93-112; Marston et al., 1990, "Solubilization of protein aggregates", Methods in Enzymol. 182 : 265-276; und Thatcher et al., 1994, "Protein folding in biotechnology", in Mechanisms of Protein Folding, Hrsg. R. H. Pain, Frontiere in Molecular Biology Series, IRL Press, Oxford University, UK.
Die Herstellung und Reinigung von löslichen und periplasmischen rekombinanten Proteinen in E. coli kann wie in folgendem beschrieben, durchgeführt werden: Hart et al., 1994, BioITechnology 11 : 1113-1117; Schein, 1989, Bio/Technology 7 : 1141-1149; und Lavallie et al., 1993, Bio/Technology 11 : 187-193.
Die Herstellung und Reinigung rekombinanter Proteine in S. cervisiae kann wie in Romanos et al., 1992, "Foreign gene expression in yeast; a review", in Yeast 8 : 423488 beschrieben, durchgeführt werden.
Die Herstellung und Reinigung rekombinanter Proteine in der Hefe Pichia pastoris kann wie in Sreekrishna et al., 1989, Biochemistry 28 : 41174125 beschrieben, durchgeführt werden.
Die Herstellung und Reinigung rekombinanter Proteine in Säugetierzellen kann wie in Reff, 1993, Curr. Opin. Biotech., 4, 573-576 oder in Cartwright, 1994, Animal Cells as Bioreactors, Cambridge Studies in Biotechnology, 11, Cambridge University Press beschrieben, durchgeführt werden.

Verwendung und Verabreichung

Die erfindungsgemäß hergestellte Plasmid-DNS ist in der Gentherapie nützlich, wenn das Plasmid ein therapeutisches Gen enthält. Ein therapeutisches Gen ist eines, das in einer Säugetierzelle, vorzugsweise einer humanen Zelle, exprimierbar ist und für RNS oder ein Polypeptid kodiert, das einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, von therapeutischem Nutzen ist. Beispiele solcher Gene sind auf dem bisherigen Stand der Technik gut bekannt und umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, das β-Glucocerebrosidase-Gen, das Bruton- Thymidinkinase-Gen, Gen kodierende Cytokine, wie etwa TNF, Interleukine 1-12, Interferone (α, β, λ), Fc-Rezeptor und T-Zellenrezeptor. Weitere Beispiele umfassen Gen kodierende Inhibitoren von HIV, z. B. TAT- oder REV-Mutanten, die als Konkurrenzinhibitoren der natürlichen Proteine dienen. Die Plasmid-DNS kann auch Markergene umfassen, wie etwa arzneimittelresistente Gene, das β-Galactosidase-Gen, das Dihydrofolat-Reductase-Gen und das Chloramphenicol-Acetyl- Transferase-Gen.
Die intravitale oder extravitale Verwendung solcher DNS, wo das therapeutische Gen für ein physiologisch essentielles Erzeugnis kodiert, wie etwa das Auswechseln eines defekten Gens oder eine zusätzlich potentiell vorteilhafte Genfunktion, soll eine langzeitliche genetische Modifikation auf die Zellen übertragen und in der Behandlung von Krankheiten wirksam sein.
Die ein therapeutisches Gen enthaltende Plasmid-DNS wird unter Verwendung einer viralen oder nicht-viralen Art der intravitalen oder extravitalen Gentherapie verabreicht. Die Verabreichungsart ist gemäß der Erfindung nicht entscheidend und kann die Verwendung von einer Genkanone zur Verabreichung von nackter DNS, Rezeptor vermittelter Gentherapie, z. B. das Verwenden von Liposom-/Antikörperkomplexen, und viralen Vektoren umfassen.
Zum Beispiel kann ein Patient, der eine virale oder genetische Krankheit hat, mittels erfindungsgemäßen intravitalen und extravitalen Verfahren behandelt werden. Zum Beispiel kann dem Patienten bei intravitalen Behandlungen die Plasmid-DNS der Erfindung verabreicht werden, vorzugsweise in einer biologisch kompatiblen Lösung oder einer pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanz, mittels Ingestion, Injektion, Inhalation oder einer beliebigen Anzahl anderer Verfahren. Die verabreichten Dosierungen hängen von dem Patienten ab; eine "therapeutisch wirksame Dosis" wird durch den Grad an Funktionsverbesserung des transferierten genetischen Materials, der gegen mögliche Risiken oder gesundheitsschädliche Nebenwirkungen abgewägt wird, bestimmt werden. Das Überwachen des Grads an Geneinführung, Genexpression und/oder die Gegenwart oder Grade des kodierten Erzeugnisses, werden bei der Wahl und dem Einstellen der verabreichten Dosierungen behilflich sein. Im Allgemeinen wird eine Zusammensetzung, die eine Trägersubstanz umfaßt, in einer einzigen Dosis in dem Bereich von 10 ng-100 uglkg Körpergewicht, vorzugsweise in dem Bereich von 100 ng-10 ug/kg Körpergewicht, verabreicht, so daß zumindest eine Kopie des therapeutischen Gens an jede Targetzelle geliefert wird.
Die extravitale Behandlung wird innerhalb der Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen. Zellbestände können von dem Patienten entfernt oder anderweitig bereitgestellt werden, mit einem Plasmid, das ein erfindungsgemäßes therapeutisches Gen enthält, transduziert und dann wieder in den Patienten eingeführt werden.
Die zum erfindungsgemäßen extravitalen Transfer ins Auge gefassten Zellen umfassen Zellen, von denen es erwünscht ist, daß ihnen das therapeutische Gen zugeführt wird, zum Beispiel Zellen des Immunsystems, wie etwa T-Zellen, B-Zellen und Macrophage, hematopoietische Zellen und dendritische Zellen. Unter Verwendung bewährter Technologien können Stammzellen zum Zellentransfer nach Bereicherungsverfahren verwendet werden. Als Alternative dazu können die nicht getrennten hematopoietischen Zellen- und Stammzellenpopulationen wie hierin beschrieben für DNS-Annahme empfindlich gemacht werden.
Zwei repräsentative Plasmide werden weiter unten zur Behandlung von humanen genetischen Krankheiten beschrieben. Ein erfindungsgemäßes Plasmid kann zur Behandlung von Xgebundener β-Globulinemie verwendet werden. Dieses Plasmid wird die minimalen hierin beschriebenen Sequenzen aufweisen, d. h. einen Replikationsursprung in einer Bakterien- oder Hefewirtszelle, eine Operatorsequenz und eine Stelle zur Einführung eines therapeutischen Gens. Das pUCIBtet kann zum Beispiel als minimales Plasmid verwendet werden, vorzugsweise wenn das tet-Gen gelöscht ist. Das therapeutische Gen kann das Bruton- Kinase-Gen (Vetrie et al., 1993, Nature 361 : 226-233) sein und wird auf folgenden DNS-Fragmenten getragen, die unter Verwendung von Verfahren, die auf dem bisherigen Stand der Technik gut bekannt sind, zusammengeklont sind. Das Bruton-Tyrosin-Kinase-Humangen wird auf einem Fragment von 2,1 kb getragen, das durch die PvuI-Stelle bei Position (+33) und der HindIII-Stelle bei der Position (+2126) aufgezeichnet wird. Bei Bedarf kann das Plasmid auch Sequenzen umfassen, welche die von der Position unabhängige, gewebespezifische Genexpression übertragen, wie in PCTIGB88100655 gelehrt wird. Das therapeutische Gen kann auch eine gespleißte Stelle und einen Poly-A- Schwanz, der Teile des menschlichen β-Globin-Ortspleiß und Poly-A- Signale umfassen kann, enthalten; d. h. eine BamHI - XbaI 2,8 kb 3' Spleiß/Poly-A-Flankensequenz, die Exon 2 - NSII - Exon 3 - PolyA- Sequenzen enthält.
Die Plasmid-DNS kann wie hierin beschrieben zubereitet werden und verwendet werden, um X-gebundene /3-Globulinemie zu behandeln, indem die Konstruktion direkt in den Patienten zur intravitalen Gentherapie oder in pre-B-Zellen zur extravitalen Therapie eingeführt wird, wie in Martensson et al., Eur. Jour. Immunol. 1987, 17 : 1499; Okabe et al., Eur. Jour. Immunol. 1912, 22 : 37; und Banerji et al., Cell 33 : 729, 1983, beschrieben und die transfizierten pre-B-Zelten einem Patienten, der an Xgebundener β-Globulinemie leidet, verabreicht werden.
Die erfindungsgemäß zubereitete Plasmid-DNS kann auch zur Behandlung der Gaucher-Erkrankung verwendet werden. Die Gaucher-Erkrankung kommt von einer von zwei verschiedenen genetischen Mutationen. Die Gaucher-Krankheit Typ I ist eine CGG --> CAG-Mutation, was zu einer Arg --> Gln-Substitution bei der Position 119 des β-Glucocerebrosidase- Polypeptids (Graves, DNA 7 : 521, 1988) führt. Die Gaucher-Krankheit Typ II ist eine CTG --> CCG-Mutation, die zu einer Leu --> Pro-Substitution bei der Position 444 des β-Glucocerebrosidase-Polypeptids (Tsuji, NEJM 316: 570, 1987) führt. Es wird angenommen, daß die Gegenwart eines Polypeptids des Wildtyps, das für ein β-Glucocerebrosidase-Gen kodiert die Gaucher-Erkrankung im wesentlichen korrigiert. Daher ist ein anderes Plasmid, das gemäß der Erfindung nützlich ist, eines, das die minimalen, hierin beschriebenen Elemente (d. h. einen Replikationsursprung, eine Operatorsequenz und eine Klonierungsstelle) und den Lysozymgenpromotor und das β-Glucocerebrosidasetrans-Gen, wie in Horowitz et al., 1989, Genomics 4 : 87-96 beschrieben, enthält. Das Plasmid ist wie folgt konstruiert.
Das humane β-Glucocerebrosidase-Gen wird, wie in Horowitz et al. offenbart, auf einem 9722 Basispaarfragment getragen, das sich von den einer BamHI-Stelle in Exon 1 zu einer EcoRV-Stelle 3' zur Polyadenylationsstelle erstreckt. Dieses Fragment enthält 11 Exone und alle intervenierenden Sequenzen, wobei der Translationsbeginn bei Exon 2 ist.
Sequenzen, die von der Position unabhängige und gewebespezifische Genexpression übertragen, können in der Konstruktion eingeschlossen werden und werden auf einem 11,8 kb XhoI- SacI-Fragment von der pll.lyx-Konstruktion wie in Bonifer et al., 1990, Euro. Mol. Biol. Org. Jour. 9; 2843 beschrieben, getragen.
Plasmid-DNS wird wie hierin beschrieben vorbereitet und dann verwendet, um die Gaucher-Erkrankung zu behandeln, indem die DNS zur intravitalen Behandlung direkt in den Wirt oder zur extravitalen Behandlung in die Macrophagen eingeführt wird, wie in Immunology and Cell Biology, 1993, Band T1, Seiten 75-78 beschrieben wird und die transfizierten Macrophagen in einen Patienten, der an der Gaucher-Erkrankung leidet, eingeführt werden. Die Expression des Wildtyptransgens bei einem Patienten, der an der Gaucher-Erkrankung leidet, sollte zur Korrektur des kranken Zustandes führen.

WEITERE AUSFÜHRUNGSFORMEN

Weitere Ausführungsformen werden den Experten auf dem Gebiet offensichtlich sein. Es versteht sich, daß die vorhergehende Beschreibung lediglich zwecks Klarheit bereitgestellt ist und nur als Beispiel dient. Der Bereich der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die oben genannten Beispiele beschränkt wird aber in den nachfolgenden Ansprüchen festgelegt.

Claims

1. Eine transformierte Wirtszelle in einem Kultursubstrat, wobei die Wirtszeile aus folgendem besteht:

einem Plasmid, das einen Operator enthält, der empfänglich für das Binden durch einen Repressor ist,

einem auf dem Chromosom vorhandenen ersten Gen, das für den Repressor kodiert, und

einem auf dem Chromosom vorhandenen zweiten Gen, das funktionell mit dem Operator verbunden und für das Zellwachstum in dem Substrat wesentlich ist,

wobei das Plasmid in der Zelle in genügender Menge vorhanden ist, um den Repressor zu titrieren, so daß das wesentliche Gen exprimiert wird, wodurch das Zeliwachstum ermöglicht wird, vorausgesetzt, daß das zweite chromosomale Gen kein Antibiotikaresistenz-Gen ist.

2. Eine transformierte Wirtszelle in einem Kultursubstrat, wobei die Wirtszelle aus folgendem besteht:

wobei das Plasmid in der Zeile in genügender Menge vorhanden ist, um den Repressor zu titrieren, so daß das wesentliche Gen exprimiert wird, wodurch das Zellwachstum ermöglicht wird, und wobei das zweite chromosomale Gen zur Biosynthese eines Zellmetabolits, eines Kohlenstoffmetabolismus, zur Biosynthese oder Regulation von Makromolekülen oder zu DNS- und/oder RNS- Synthese- und Replikationsfunktionen erforderlich ist.

3. Eine transformierte Wirtszelle in einem Kultursubstrat, wobei die Wirtszelle aus folgendem besteht:

wobei das Plasmid in der Zelle in genügender Menge vorhanden ist, um den Repressor zu titrieren, so daß das wesentliche Gen exprimiert wird, wodurch das Zellwachstum ermöglicht wird, und wobei das zweite chromosomale Gen ein Wirtszellengen ist oder einem Wirtszellengen entspricht und für das Zeliwachstum wesentlich ist.

4. Wirtszelle gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Repressor aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus folgendem besteht: dem E. coli lac-Repressor, dem Ä-Repressor, dem E. coli trp-Repressor, dem E. coli galR-Repressor, dem E. coli araC- Repressor; dem E. coli tet-Repressor und dem E. coli ArgRNV- Repressor.

5. Wirtszelle gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wirtszelle eine tierische Zelle wie etwa eine Säugetierzelle oder eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, eine Pilzzelle, wie etwa eine Hefezelle, oder eine Bakterienzelle ist.

6. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zelle eine Bakterienzelle ist.

7. Wirtszelle gemäß Anspruch 6, wobei die Zelle eine gram-negative Bakterienzelle ist.

8. Wirtszelle gemäß Anspruch 7, wobei die Zelle E. coli ist.

9. Wirtszelle gemäß Anspruch 7, wobei die Zelle Salmonella ist.

10. Wirtszelle gemäß Anspruch 6; wobei die Zelle eine gram-positive Bakterienzelle ist.

11. Wirtszelle gemäß Anspruch 10, wobei die Zelle Bazillus ist.

12. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zelle eine Hefezelle ist.

13. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zelle eine Säugetierzelle ist.

14. Wirtszelle gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Plasmid einen Replikationsursprung aufweist, der eine Replikation von 10-50 Kopien des Plasmids pro Wirtszelle ermöglicht.

15. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Plasmid einen Replikationsursprung aufweist, der eine Replikation von 100- 200 Kopien des Plasmids pro Wirtszelle ermöglicht.

16. Die Wirtszelle in einem Kultursubstrat gemäß Anspruch 14, wobei das Plasmid pBR322 ist.

17. Wirtszelle in einem Kultursubstrat gemäß Anspruch 15, wobei das Plasmid pUC ist.

18. Wirtszelle in einem Kultursubstrat gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Plasmid eine Klonierungsstelle zum Einführen eines gewünschten Gens umfaßt.

19. Wirtszelle in einem Kultursubstrat gemäß Anspruch 18, wobei das Plasmid ferner ein gewünschtes Gen umfaßt, das mit Kontrollsequenzen zur Expression in einer Zelle operativ verbunden ist.

20. Wirtszelle in einem Kultursubstrat gemäß Anspruch 19, wobei das Plasmid eine ungefähre Länge von 1000 Bp aufweist.

21. Ein Verfahren zur Erhaltung eines Plasmids in einer Wirtszelle, bestehend aus dem Schritt zum Kultivieren der Wirtszelle in einem Kultursubstrat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20 über eine gewisse Zeit und unter Bedingungen, die genügen, um das Wachstum der Wirtszelle zu ermöglichen.

22. Ein Verfahren zur Herstellung von Plasmid-DNS, bestehend aus dem Kultivieren der Wirtszelle in einem Kultursubstrat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20 über eine gewisse Zeit und unter Bedingungen, die genügen, um das Wachstum der Zelle zu ermöglichen, und wobei die Plasmid-DNS von der kultivierten Wirtszelle isoliert wird.

23. Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, bestehend aus dem Kultivieren der Wirtszelle in einem Kultursubstrat gemäß einem der Ansprüche 19 bis 20 über eine gewisse Zeit und unter Bedingungen, die genügen, um das Wachstum der Wirtszelle zu ermöglichen, und wobei das rekombinante Protein von der kultivierten Wirtszelle isoliert wird.