DE3751564T2 - Verfahren zur Stabilisierung eines Plasmids, das in einem Bakterienstamm enthalten ist und der erhaltene Stamm. - Google Patents

Description

• Bei der praktischen Anwendung der Technologie der rekombinanten DNA auf die Herstellung von interessanten Molekülen durch Mikroorganismen stößt man im allgemeinen auf das Problem der Instabilität der rekombinanten Plasmide.
• Die üblicherweise im Laboratorium verwendeten Klonierungs- und Expressions-Vektoren sind im allgemeinen Multikopie-Plasmide und ihre Deszendenz-stabile Transmission wird gewährleistet durch die große Anzahl von Plasmiden pro Zellgenom (Jones et al., 1980). Die Einführung von Fremdgenen in diese Plasmide bringt jedoch im Verlaufe der Multiplikationszyklen der Bakterien verschiedene Instabilitätsgrade mit sich. Bei industriellen Produktionen können Kulturen von 1000 l erforderlich sein, die mehr als 10¹&sup6; Zellen nach mehr als 50 Generationen umfassen. Es ist daher wesentlich, die Plasmide in den Bakterien zu stabilisieren, um ihre Anwesenheit und somit die Expression des Fremdmoleküls bis zum Ende der Kultivierung in einem Fermenter zu gewährleisten.
• Die Stabilisierung von Plasmiden durch Integration eines Gens, das für die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum codiert, ist ein klassisches Labor-Verfahren, es kann jedoch aus verschiedenen Gründen auf die industrielle Verwendung nicht angewendet werden:
• - die Verwendung eines Bakterienstammes, der gegenüber einem Antibiotikum resistent ist, kann eine Gefahr für die Umwelt darstellen;
• - die während der Kultivierung erforderliche Menge an Antibiotikum erhöht beträchtlich die Herstellungskosten;
• - die Verwendung eines Antibiotikums kann nicht für die Herstellung von Substanzen für die Verwendung in der Human- oder Veterinär-Therapie in Betracht gezogen werden.
• Es ist daher wesentlich, andere Verfahren zur Selektion von Bakterien zu entwickeln, die ein rekombinantes Plasmid tragen. Die verschiedenen Modelle, die bereits angewendet werden, beruhen auf dem gleichen Prinzip: die Wirtszelle wird in der Weise zur Mutation veranlaßt (auxotrophe Mutation oder Einführung eines für das Bakterium letalen Gens), daß ihr Vermehrung in Abwesenheit eines Plasmids, das für eine Eigenschaft codiert, welche das Defizit des Wirts behebt, verhindert wird.
• So wird beispielsweise von Skogman und Nilson (1984 und 1985) die Komplementierung einer wärmeempfindlichen Mutation val S durch das Gen val S angewendet, das von einem Plasmid getragen wird; bei diesem Modell ist die Stabilität der Plasmids, das zwischen dem Operon Tryptophan trägt, nach 200 Generationen bei einer unzulässigen Temperatur vollständig, während man einen Verlust von 1,2% des Plasmids bei jeder Generation unter nicht-selektiven Bedingungen (30ºC) beobachtet.
• Miwa et al. (1984) haben als Wirtsstamm eine Streptomycin-abhängige Mutante von E. coli (Smd) und ein Plasmid, das ein Gen trägt (rpsl eines Stammes SmR), welches den Phänotyp Smd maskiert, verwendet und den Stamm unabhängig von Streptomycin gemacht, unter Gewährleistung einer Stabilität des Plasmids von mehr als 99%.
• Herthberger und Rosteck (1984) haben ein Bakterium für einen Prophagen λ, aus dem sein Repressor deletiert worden ist, lysogen gemacht; die Zelle kann der Lyse nur entgehen in Gegenwart eines Plasmids, das den Repressor λ cI trägt.
• Es wurde nun ein neues Selektionsmodell entwickelt, das auf der Komplementierung einer Chromosomen-Mutation dap&supmin; durch ein Plasmid-Gen dap&spplus; basiert, wodurch das Überleben von einzelnen Zellen, die das Plasmid tragen, gewährleistet wird.
• Die Diaminopimelinsäure (DAP) ist ein Bestandteil der Wand von Bakterien; sie stellt auch ein Zwischenprodukt der Biosynthese des Lysins dar, wobei man von Aspartat ausgeht. Ein Stamm mit einem Defizit an einem Enzym der Biosynthese der DAP ist nicht in der Lage, sich in einem Minimal-Medium zu vermehren; die Zugabe von Lysin zu dem Medium erlaubt das Wachstum, bringt jedoch schnell eine Lysis der Zelle mit sich, die in ihrer Membran keine DAP enthält. (Work 1950 - Davis et al., 1973).
• Das Defizit (der Mangel) an einem Enzym zur Biosynthese kann ausgeglichen werden durch Einführung des entsprechenden Gens auf einem Plasmid und insbesondere auf dem Expressionsvektor des Fremdproteins, dessen Bildung gewährleistet werden soll. Wenn das Bakterium das Plasmid verliert, wird es wieder zu dap&supmin; und kann sich nicht mehr vermehren. Dieses Modell bietet den Vorteil, daß es auf jedes Kulturmedium angewendet werden kann, das frei von DAP ist, d. h. auf jedes industrielle Produktions-Medium und jedes reiche Medium oder Minimalmedium, dem Lysin zugesetzt worden ist.
• Das System bietet auch den Vorteil, daß es die Synthese von DNA, von RNA oder von Proteinen nicht stört.
• Es wurde ein Stamm dapD&supmin; konstruiert (bei dem eines der 9 Gene auf biosynthetischem Wege aus Lysin deletiert wurde, das Gen D, entsprechend der Tetrahydropicolinat-N- succinyl-Transferase) und es wurde das Gen dapD auf einem üblicherweise verwendeten Expressionsplasmid eingeführt (welches das zu exprimierende Gen unter der Kontrolle des Promotors PL trägt). Unter Selektionsbedingungen kann gezeigt werden, daß das Plasmid für mindestens 150 Generationen stabil ist.
• Die Klonierung eines anderen Gens (dapA), das für ein Enzym zur Biosynthese des Lysins codiert, auf einem Plasmid wurde bereits durchgeführt mit dem Ziel, die Bildung von Lysin zu verbessern (Dauce-Le Reverend et al. 1982), diese Autoren konnten jedoch die Stabilität ihres Plasmids nicht sicherstellen.
• Das Gen dapD von E. coli wurde bereits in dem Plasmid pBR322 kloniert und seine Nucleotid-Sequenz wurde von Richaud et al. (1984) veröffentlicht, Ziel dieser Arbeit ist jedoch lediglich die Untersuchung der Regulierung dieses Gens.
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung eines in einem Bakterium enthaltenen Plasmid-Vektors, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Bakterium eine Chromosomen-Mutation dap&supmin; aufweist und daß der Plasmid-Vektor ein Gen dap&spplus; trägt.
• Unter den Chromosomen-Mutationen dap&supmin; verwendet man vorzugsweise dapD&supmin;, es können aber auch andere Gene, die für ein Enzym der Biosynthese von DAP codieren, verwendet werden, wenn man einen Plasmid-Vektor vorsieht, der das entsprechende Gen trägt; im Falle eines Stammes dapD&supmin; ist das in das Plasmid zu inserierende Gen das dapD.
• Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere einen Bakterien-Stamm, der eine Mutation des Gens DapD enthält und durch einen Plasmid-Vektor transformiert worden ist, der ein intaktes Gen dapD trägt, sowie ein Gen, das für ein interessierendes Protein codiert, und die Elemente, die seine Expression in dem Wirts-Bakterium gewährleisten.
• Das Stabilisierungssystem dap stört nicht die Expression des Proteins, es kann daher auf einen beliebigen Expressionsvektor angewendet werden.
• Um die möglichen homologenen Rekoinbinationen zwischen dem Plasmid dapD&spplus; und dem mutierten Gen dapD des Chromosoms zu vermeiden, ist es bevorzugt, eine bedeutende Deletion des Gens dapD des Chromosoms vorzusehen.
• Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen Stamm, wie er vorstehend beschrieben worden ist, der dadurch gekennzeichnet ist, daß die Chromosomen-Mutation dap eine Deletion mindestens eines Teils des Gens dapD ist und daß der Plasmid-Vektor ein intaktes Gen dapD trägt.
• Es ist klar, daß zur Vermeidung jeglicher Rekombination eine Gesamt-Deletion des Gens dapD die am meisten befriedigende Losung ist.
• Ein starkes Selektionssystem, wie stark es auch sei, kann jedoch nicht die Instabilität überwinden, die einem Plasmid eigen ist. Deshalb ist es zur Erhöhung der Stabilität der fraglichen Expressions-Vektoren auf genetischem Wege möglich, in die genannten Vektoren eine Sequenz einzuführen, die sie im Zustand von Monomeren halten, insbesondere die Sequenz "cer".
• Das "cer" (Summers et Sherratt, 1984) ist ein Element, das für kein Protein codiert und dessen Anwesenheit den monomeren Zustand eines Plasmids begünstigt. Wenn das Plasmid sich multimerisiert, nimmt die Anzahl von Einheiten, die auf Tochterzellen verteilbar sind, ab und man erhält leichter Zellen, die frei von dem Plasmid sind. Indirekt stabilisiert das cer deshalb das Plasmid, indem es seinen Monomer-Zustand aufrechterhält.
• Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Plasmid-Vektoren, die außerdem das Gen, das für ein Protein von industriellem Interesse codiert, und die Elemente, die seine Expression in dem Wirts-Bakterium gewährleisten und insbesondere das Gen enthalten, das für ein Hirudin oder eine seiner natürlichen oder synthetischen Varianten, beispielsweise das C2,3O, das Gamma-Interferon oder das u-Antitrypsin codiert, sowie die durch diese verschiedenen Vektoren transformierten Stämme und die Verfahren zur Herstellung der industriellen Proteine durch Kultivierung der genannten transformierten Stämme in einem vollständigen Medium und Abtrennung (Gewinnung) des Proteins nach der Kultivierung.
• Nachstehend umfaßt das Expressionssystem den Links-Promotor des Phagen PL, es kann sich dabei aber auch um einen anderen, in dem fraglichen Bakterium aktiven Promotor handeln. Dies erklärt, warum keine vollständige Beschreibung der Elemente zur Expression des heterologen Proteins folgt, da dieser Plasmid-Typ bereits allgemein bekannt ist. Es genügt einfach, das Gen dapD oder ein anderes Gen an einer nicht-essentiellen Stelle des Plasmid-Vektors zu inserieren.
• Die fraglichen Plasmide können zur Transformation eines beliebigen Stammes E. coli, überführt in dapD&supmin;, verwendet werden.
• Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man Bakterienstämme, in denen die Expressionsplasmide in einem vollständigen Medium stabil sind, ohne daß ein Selektionsdruck durch ein Antibiotikum oder ein spezielles Medium erforderlich ist, das beispielsweise frei von einer Aminosäure ist. Darüber hinaus übt das erfindungsgemäße Verfahren eine Gegenselektion gegenüber den Bakterien aus, die das Plasmid verloren haben.
• Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins von industriellem Interesse, bei dem man von einem Bakterium ausgeht, indem man ein Bakterium, insbesondere ein erfindungsgemäßes Bakterium, kultiviert (züchtet) und das genannte Protein gewinnt (abtrennt).
• Die nachstehenden Beispiele zeigen die Stabilität von Plasmiden, die das Gen dapD in Bakterien dap&supmin; tragen, im Vergleich zu Plasmiden, die das Gen Ampr tragen.
• Diese Plasmide, die das Gen dapD tragen, wurden außerdem verwendet zur Expression der Gene, die für das Hirudin und für das Gamma-Interferon codieren.
• Diese beiden Gene werden unter die Kontrolle des Promotors PL des Phagen λ gestellt und die Wirts-Stämme von E. coli enthalten den wärmeempfindlichen Repressor CI857; dieses System erlaubt die Induktion der Expression des durch PL kontrollierten Gens durch Erhöhung der Temperatur.
• Der Stamm von E. coli TGE 900, der den Repressor CI857 trägt, wurde modifiziert, um ihn in dapD&supmin; zu überführen unter Bildung des Stammes TG7615 oder TGE7214 und der Stamm N5969 wurde modifiziert unter Bildung von TGE7303.
• Die folgenden Plasmide wurden anschließend unter Anwendung der nachstehend angegebenen Schematas hergestellt: Fremd-Protein Fig. 1 Hirudin IFN-Gamma
• Fig. 6 Restriktions-Karte des Fragments HindIII-BamHI von pDB6;
• Fig. 7 Schema der Inserte PstI von pDB6 in M13mp8 und Position der Stellen (Frequenzen) EcoRI, die dort eingeführt worden sind;
• Fig. 8 Restriktions-Karte des Fragments KpnI-BglII von pTG47;
• Fig. 9 Nachweis der Deletion des Gens dap in den Chromosomen DNAs unterschiedlicher Stämme durch "Southern Blot"-Autoradiographie;
• Fig. 9A Sonde = Gen kan®, das von dem Fragment EcoRI von pTG47 getragen wird Banden 6 bis 9 DNA, geschnitten mit PstI
• 10 bis 14 DNA, geschnitten mit BamHI und HindIII
• Banden 6 und 10 = Stämme GC4540
• 7 und 11 TGE7213
• 8 und 12 TGE7214
• 9 und 13 TGE901
• 14 pDB6
• 15 Molekulargewichts-Marker
• Fig. 9B Sonde = 5'-Seite des Gens dapD, das von dem Fragment EcoRI von M13TG620 getragen wird
• Banden 4 bis 7 DNA, geschnitten mit PstI 8 bis 11 DNA, geschnitten mit BamHI und HindIII
• Banden 4 und 8 = Stämme GC4540
• 5 und 9 TGE7213
• 6 und 10 TGE7214
• 7 und 11 TGE901
• Banden 13 Molekulargewichts-Marker
• 1 und 12 pDB6, geschnitten mit PstI oder BamHI und HindIII
• 2 M13TG620, geschnitten mit PstI
• 3 Ml3TG597, geschnitten mit PstI
• Fig. 9C Sonde = flankiernede Regionen des Gens dapD, das von dem Fragment KnpI-BglII von pTG47 getragen wird,
• Chromosomen-DNA, geschnitten mit PstI
• Banden 4 = Stämme GC4540
• 5 TGE7213
• 6 TGE7214
• 7 TGE907
• Banden 8 = Molekulargewichts-Marker
• 1 Fragment BamHI-HindIII von pDB6, geschnitten mit PStI
• 2 M13TG620, geschnitten mit PstI
• 3 M13TG597, geschnitten mit PstI
• Fig. 9D Sonde = flankierende Regionen des Gens dapD, die von dem Fragment KpnI-BglII von pTG47 getragen werden
• Chromosomen-DNA, geschnitten mit PstI
• Banden 4 = Stämme RH5345
• 5 RL58
• 6 TGE76I5
• 1, 2, 3 (wie in 9C)
• 7 = Molekulargewicht-Marker
• Fig. 10 Schema und Restriktionskarte von pTG790
• Fig. 11 Schema und Restriktionskarte von pTG792
• Fig. 12 Schema und Restriktionskarte von pTG7922
• Fig. 13 Schema und Restriktionskarte von pTG769
• Fig. 14 Schema und Restriktionskarte von pTG7406
• Fig. 15 Elektrophorese der durch TGE7213/pTG7407 synthetisierten Proteine auf einem SDS-Acrylamid-Gel, nachgewiesen mit Coomassie-Blau
• Banden 1 und 8 = Molekulargewichts-Marker
• Banden 2 bis 5 = Kultivierung bei 30ºC, 4 h (2 und 3) oder 7 h (4 und 5)
• Banden 6 bis 12: Kultivierung induziert bei 42ºC, 4 h (6, 11 und 12) oder 7 h (7, 9 und 10)
• C = unlösliche Fraktion; 20 ul
• S = lösliche Fraktion; 40 ul
• Fig. 16 Schema und Restriktionskarte von pTG7675
• Fig. 17 Schema und Restriktionskarte von pTG7914.
Verfahren
• Die verschiedenen Enzyme werden, wenn nichts anderes angegeben ist, entsprechend den bekannten Methoden angewendet.
Transformation
• Die kompetenten Zellen wurden nach dem Verfahren von Hanahan (1983) hergestellt. Ihre Kompetenz steigt auf 10&sup4; bis 10&sup5; Transformanden/ug DNA für den Stamm RL58 (Bollen et al. 1979) und auf 10&sup5; bis 106 Transformanden/ug DNA für die Stämme TGE7615, TGE7214 oder TGE 7303.
• Allgemein gibt man zu 0,2 ml eines Vorrats an kompetenten Zellen 1 bis 10 ul einer Lösung, welche die geeignete Verdünnung hat, eines DNA-Präparats zu, welches das Plasmid enthält, das man in den Stamm einführen will. Man läßt die Zellen mit DNA 15 min lang bei 0ºC reagieren, dann inkubiert man sie 90 s lang bei 37ºC. Innerhalb von 5 min bringt man sie wieder auf 0ºC, dann gibt man 0,8 ml LB-Medium zu. Für den Stamm RL58 oder für den Stamm TGE 7615 muß dieses Medium DAP in einer Menge von 8 Gamma/ml enthalten. Dies ist erforderlich für das Wachstum der Zellen dapD&supmin;, selbst derjenigen, die das Plasmid enthalten, welches das Gen dapD trägt. Man inkubiert die Zellen allgemein bei 30ºC (man kann sie aber auch auf 37ºC bringen, wenn das Plasmid keinen Promotor PL enthält). Die Inkubationszeit beträgt 60 min, sie kann jedoch auf 90 min verlängert werden für ein Wachstum bei 30ºC für den Stamm TGE 7615.
• Anschließend werden festgelegte Volumina (0,1 ml) auf dem festen LB-Medium ausgestrichen (verteilt). Für die Plasmide, die das gegenüber Ampicillin resistente Gen enthalten, selektioniert man die Klone durch Zugabe von 100 Gamma/ml Ampicillin; die das Gen dapD enthaltenden Klone werden selektioniert, wobei man von einer Kultur ausgeht, die in ihrer Gesamtheit dapD&supmin; ist, auf dem LB-Medium ohne weitere Zusätze. Die Schalen werden 24 h bei 30ºC inkubiert. Die Kolonien werden anschließend mit Zahnstochern in 3 ml LB-Medium ausgelesen und nach dem Wachsenlassen für eine Nacht bei 30ºC wird das Plasmid isoliert und seine Struktur auf Agarosegel bestätigt, nach der Digestion durch die geeigneten Restriktionsenzyme.
• Die das Gen dapD enthaltenden Plasmide können in einem beliebigen E. coli transformiert werden, das die Mutation dapD&supmin; trägt (beispielsweise in RL58, TGE7615, TGE7214 oder TGE7303); wenn sie außerdem den Promotor PL des Bacteriophagen Lambda (λ) enthalten, müssen sie notwendigerweise in Stämmen von E. coli dapD transformiert werden, die den Repressor C1857 des Bacteriohagen Lambda (λ) exprimieren entweder auf ein Plasmid oder in ein Chromosom, oder das C1 und eine Mutation Rec (beispielsweise RecA441).
Beispiel 1 Einführung eines mutierten Gens dapD&supmin;- in den Stamm E. coli TGE900
• Der Wirtsstamm E. coli TGE900 wurde überführt in dap&supmin; durch eine Konjugation mit einer bekannten Mutanten dapD&supmin;, RL58.
• Der Stamm TGE900 ist ein Derivat des Stammes N4830, der von Gottesman et al. (1980) beschrieben wurde, dessen Charakteristika die folgenden sind: su&supmin;F&supmin; his ilv bio (λ c1857ΔBamΔHI)Smr. Er wird üblicherweise als Wirt für die Expressionsvektoren verwendet, in welche das Fremd-Gen unter der Kontrolle des Promotors PL von Lambda eingeführt wird, weil er die beliebige Induktion der Expression durch Erhöhung der Temperatur (auf mehr als 37ºC) erlaubt, wodurch der wärmeempfindliche Repressor (Lambda c1857), der von dem Bakterium getragen wird, inaktiviert wird.
• Der Stamm dap&supmin; RL58 (met B dapD&sub2; met D279 Hfr P&sub4; X) wurde von Bollen et al. (1979) beschrieben.
• Ausgehend von diesem Stamm selektioniert man eine spontane Mutante, die gegenüber Trimethoprim resistent ist (nach der Verteilung (dem Ausstreichen) des Stammes auf eine Schale, die 2 Gamma/ml Trimethoprin enthält und nach der Bestätigung der Resistenz-Eigenschaft einer Kolonie, die aus einem Medium ausgewählt worden ist, das 4 Gamma/ml Trimethoprin enthält). Das für diese Resistenz codierende Gen ist nämlich genügend nahe bei der Mutation dapD&supmin;, so daß dann, wenn der Empfängerstamm nach der Konjugation resistent gegenüber Trimethoprim wird, dieser ebenfalls zu dapD&supmin; wird.
• Der resistente Stamm wird als TGE755 bezeichnet; seine nutzbaren Charakteristika sind Hfr dapD&supmin; Tmpr.
• Nach der Konjungtion der Stämme TGE900 (F&supmin; Smres dap&spplus;) und TGE755, unterbrochen nach 15 min durch Ausstreichen (Verteilen) von Streptomycin und Trimethoprim auf einem Minimalmedium, das DAP enthält, selektioniert man Kolonien Smr Tmpr; anschließend bestimmt man den dap&supmin;-Charakter der selektionierten Stämme auf LB-Medium und das Vorhandensein von auxotrophen Mutationen des Eltern-Stammes (his ilv) auf Minimalmedium + DAP.
• Es wurde ein Stamm (his ilv dap&supmin;) zurückbehalten: TGE7615.
Beispiel 2 Konstruktion eines Vektor-Plasmids, welches das Gen dapD von E. coli trägt (Fig. 1) a) Konstruktion eines Klonierungsplasmids für die mehrfache Verwendung das einen Polylinker mit 12 Restriktionsstellen enthält
• Die Konstruktion wurde initiiert, ausgehend von dem Plasmid pML&sub2; (Lusky und Botchan, 1981), abgeleitet von pBR322, durch Deletion der Nucleotide 1089 bei 2491. In diesem Plasmid wurden der Replikationsursprung von pBR322 und das Gen der β-Lactamase (Resistenz gegenüber Ampicillin) beibehalten.
• Die Erkennungs-Sequenz den Enzyms PstI wurde eliminiert durch Insertion eines Fragments AhaIII-AhaIII von pUC8, das eine Mutation PstIº trägt, die mit Ethansulfonat (Vieira und Messing, 1982) zwischen zwei Stellen AhaIII von pML&sub2; induziert wurde, wodurch 19 Basenpaare von pML&sub2; deletiert werden. Das resultierende Plasmid pTG190 trägt die Mutation PstIº von pUC8.
• Ein Linker BglII (5'-dCAGATCTG-3'; Collaborative Research), wurde in die einzelne Stelle NruI unter Anwendung des von Lathe et al. 1984 beschriebenen "Linker-Tailing"-Verfahrens inseriert. Die resultierende Konstruktion ist das pTG191.
• Das pTG191 wurde geöffnet durch EcoRI und BglII (wodurch das Gen für die Resistenz gegenüber Tetracyclin deletiert wurde) und mit dem Segment EcoRI-BglII des Phagen M13TG131 relegiert (Kieny et al., 1983), der einen Polylinker mit 12 Erkennungsfrequenzen von Restriktionsenzymen enthält.
• Das resultierende Plasmid ist das pTG192.
b) Klonierung eines Gens dapD in dem Plasmid DTG192
• Das Chromosomen-Gen dapD von E. coli wurde in das Plasmid pACYC184 inseriert, um das pDB6 zu ergeben (Bendiak und Friesen, 1981). Dieses Gen dapD wurde gewonnen (abgetrennt), ausgehend von pDB6 in Form eines Fragments AluI von 1,3 kb und in die Stelle EcoRI von pTG192 inseriert (die Enden EcoRI wurden vorher repariert durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der Polymerase-DNA I).
• Unter den resultierenden Plasmiden wählt man das pTG764 aus, in dem eine einzelne Stelle EcoRI wieder hergestellt ist. Das pTG764 trägt somit das Gen dapD und das Gen für die Resistenz gegenüber Ampicillin von pTG192 (ursprünglich von pUC8).
Beispiel 3 Plasmid zur Expression von Hirudin das die Gene dapD und Ampr enthält (Fig. 2)
• Das in dem französischen Patent Nr. 84 04755 beschriebene Plasmid pTG720 umfaßt im wesentlichen das Gen von Hirudin unter der Kontrolle der Promotors PL von Lambda (λ).
• Das durch BglII und BglI digerierte Plasmid pTG720 ergibt ein Fragment von 2,74 kb, welches das Gen von Hirudin und einen Teil des Gens ampr trägt. Dieses mit Phosphatase behandelte Fragment wird mit dem Fragment BglII-BglI des Plasmids pTG764 relegiert, welches das Gen dapD und ein weiteres Fragment des Gens ampr trägt. Das resultierende Plasmid pTG771 trägt das vollständig wieder hergestellte Gen ampr, das Gen dapD und das für Hirudin codierende Gen.
• Die durch dieses Plasmid transformierten Kolonien von TGE7615 können entweder auf dem Medium LB (Selektion im Hinblick auf die Eigenschaft dap&spplus;) oder auf dem Medium LB + Ampicillin selektioniert werden.
• Nach der Induktion bildet der transformierte Stamm das Hirudin.
Beispiel 4 Plasmid zur Expression von Hirudin, welches das Gen dapD und nicht mehr das Gen Ampr enthält (Fig. 3)
• Das Ausgangs-Plasmid ist das pTG771.
• Man führt eine Digestion mit AhaIII durch, um das kleine Fragment zu eliminieren, welches das 3'-Ende des für Ampr codierenden Gens trägt, und man schließt wieder das Plasmid durch eine Ligation in Gegenwart eines "Linkers" EcoRI:
• CCGAATTCGG
• Man erhält das Plasmid pTG775.
• Eine Digestion von EcoRI, gefolgt von einer Ligation, erlaubt die vollständige Eliminierung des für Ampr codierenden Gens.
• Man erhält das Plasmid pTG776.
• Die durch dieses Plasmid transformierten Bakterien TGE7615 können in dem LB-Medium ohne Zusatz eliminiert werden (Selektion aufgrund der Eigenschaft dap&spplus;).
• Nach der Induktion bildet der transformierte Stamm das Hirudin.
Beispiel 5 Konstruktion von Plasmiden, die das Gen dapD und nicht das Gen Ampr tragen (Fig. 4)
• Das Ausgangs-Plasmid ist das Plasmid pTG192.
• Nach der Digestion mit SmaI und AhaIII und der anschließenden Behandlung mit Phosphatase wird das Fragment des Vektors von 0,95 kb isoliert und mit dem Fragment AluI von 1,3 kb von pDB6, welches das Gen dapD trägt, legiert. Das Gen ampr ist somit vollständig deletiert. Man transformiert den Stamm TGE7615 mit diesem neuen Plasmid und selektioniert auf LB-Medium, wobei man Klone erhält, die das Gen dapD tragen.
• Man erhält Plasmide, die das Gen dap in den beiden Orientierungen tragen; die Orientierung des Inserts kann durch Digestion mit PstI bestimmt werden. Für beide ausgewählten Kandidaten gilt:
• - pTG766 setzt Fragmente von 1,34 kb und 0,9 kb frei
• - pTG767 setzt Fragmente von 1,85 kb und 0,4 kb frei.
Beispiel 6 Plasmid zur Expression von Gamma-Interferon, welches das Gen dapD trägt (Fig. 5)
• Das Plasmid pTG40 (EP-A-0146462) (PED) trägt auf einem Fragment HindIII von 1,2 kb das Gen von Gamma-Interferon unter der Kontrolle des Promotors PL. Nach der Digestion mit HindIII wird dieses Fragment zurückgewonnen (abgetrennt) und in die Stelle HindIII von pTG767 inseriert, die vorher mit Phosphatase behandelt worden ist. Nach der Ligation transformiert man TGE7615 und selektioniert aufgrund der Anwesenheit des Gens dapD in LB-Medium. Man hält zwei Plasmide zurück, die das Insert in entgegengesetzten Orientierungen tragen:
• · pTG7671 (welches den PL proximal zum Replikationsursprung und in der gleichen Orientierung aufweist) und
• - pTG7672.
• Die durch diese Plasmide transformierten Bakterien TGE7615 können in einem LB-Medium ohne Zusatz selektioniert werden (Selektion aufgrund der Eigenschaft dap&spplus;).
• Nach der Induktion bildet der transformierte Stamm Gamma-Interferon.
• Die folgenden Beispiele sollen die Eigenschaften (Charakteristika) der erfindungsgemäß transformierten Stämme zeigen.
• Alle das Gen dapD tragenden Plasmide befinden sich in dem Stamm TGE7615, die anderen befinden sich in dem Stamm TGE900.
• Die Stabilität der verschiedenen Plasmide wurde auf geeigneten Medien getestet:
• - als selektives Medium bezeichnet man das Medium LB für die erfindungsgemäßen Plasmide und das Medium LB + Ampicillin für die Plasmide pTG720 und pTG40;
• - als nicht-selektives Medium bezeichnet man das Medium LB + DAP für die erfindungsgemäßen Plasmide und das Medium LB für die anderen Plasmide.
• Man führt eine Stabilitätsuntersuchung mit 110 Generationen durch durch mehrere aufeinanderfolgende Verdünnungs- und Multiplikations-Cyclen der Bakterien. Am Ende dieser Multiplikationsphase mißt man die Stabilität des Plasmids auf die folgende Weise:
• - man bestimmt die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der Kultur durch geeignete Verdünnung und Auszählung der Zellen in einem nicht-selektiven Agarmedium; und
• - nach einer Wachstumszeit wird eine signifikante Anzahl von Proben dieser Kolonien parallel auf selektiven und nicht-selektiven Agar-Medien aussortiert und der Prozentsatz der Kolonien, die das Plasmid und damit die Fähigkeit, auf einem selektiven Medium zu wachsen, verloren haben, wird bestimmt.
• Die mit den Plasmiden, die das Gen von Interferon tragen, erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Bewertung des Verlustes des Plasmids durch die Bakterien nach 110 Generationen Stamm Plasmid Selektion Medium LB p-/c/Generation* Medium LB + DAP * c = Anzahl der lebensfähigen Zellen p- = Zellen, die das Plasmid verloren haben p-/c/Generation = (Anzahl von p-/Anzahl der getesteten c) x Anzahl der Generationen
• Äquivalente Versuche, die mit den Plasmiden, die das Gen von Hirudin tragen, und mit dem Klonierungsvektor pTG766 nach der Multiplikation der Bakterien während 170 Generationen in dem Medium LB durchgeführt werden, ergeben die folgenden Ergebnisse: Tabelle 2 Bewertung des Verlustes des Plasmids durch die Bakterien nach 170 Generationen in dem Medium LB Stamm Plasmid p+, p-/c/Generation
• Die in den Tabellen 1 und 2 dargestellten Ergebnisse zeigen:
• 1. daß die Stabilität der Vektoren DAP um einen Faktor 10 verbessert ist gegenüber dem Plasmid, welches das Gen ampr trägt;
• 2. daß die Differenz zwischen dem selektiven Medium und dem nicht-selektiven Medium minimal ist;
• 3. daß die Klonierungsvektoren pTG766 und pTG767 einen Verlust von weniger als 5·10&supmin;&sup5; p-/c/Generation aufweisen;
• 4. daß die Stabilität von pTG40 deutlich schlechter ist als diejenige der Vektoren dap&spplus;, es sei jedoch darauf hingewiesen, daß das Phänomen vor allem nach 50 Generationen auftritt; bei Beginn der Kultivierung beträgt der Verlust nur 2,5·10&sup4; p-/c/Generation;
• 5. daß der Verlust der Vergleichs-Plasmide ampr, pTG40 und pTG720, die jeweils die Gene von Interferon und von Hirudin tragen, in der gleichen Größenordnung liegt; dieser Verlust der Plasmide im Verlaufe der Zeit nimmt ab, wenn sie das Gen dapD tragen (pTG766, 767, 7671 und 776).
• Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die Stabilität des Plasmids, welches das Gen dapD und das Gen der Resistenz gegenüber Ampicillin (pTG771) trägt, weniger gut ist und vergleichbar mit demjenigen von pTG720 bleibt. Man interpretiert dieses Ergebnis durch Analyse des Plasmid-Gehalts auf Agarose-Gel; dieser zeigt, daß pTG771 sich tetramerisiert, ein Phänomen, das sich äußert in dem Bereich der Plasmide und das ihren Verlust erhöht (Summers und Sherratt, 1984). Es darf hinzugefügt werden, daß bei einer verminderten Anzahl von Generationen (30) dieses Phänomen der Multimerisation nicht auftritt und daß bei einer Gesamtanzahl von 70 Generationen der Verlust an pTG771 unterhalb 2,8·10&supmin;&sup4; p-/c/Generation bleibt.
• Die Plasmide, die das Gen dapD enthalten, weisen somit eine erhöhte Stabilität gegenüber den Plasmiden auf, die das Gen ampr tragen, und ihr Verlust wird minimal.
Beispiel 7 Stabilität der Plasmide bei 37 oder 42ºC
• Der Einfluß der Temperatur auf die Stabilität der Plasmide kann nicht untersucht werden für diejenigen, die ein Gen enthalten, das für ein Fremd-Protein codiert, das unter der Kontrolle des Promotors PL steht, ohne die Expression dieses Fremd-Proteins zu induzieren. Dennoch sei bemerkt, daß unter den Bedingungen, unter denen man arbeitet, auf die Induktion eine Erhöhung der D.O. von 0,3 auf 3,6 folgt, was 3,6 Generationen entspricht. Die Bakterien weisen somit die größte Anzahl von Generationen bei 30ºC auf vor der Induktion mit einem Verlust, der bereits in dem vorhergehenden Beispiel bestimmt wurde.
• Wenn man die Expression eines Fremd-Proteins (beispielsweise von Hirudin für pTG720 und von Gamma-Interferon für pTG40) induziert, stellt man nach einer bestimmten Zeit (nach 2 bis 4 h) eine Mortalität der Kulturvon E. coli in einem Umfang von 90 bis 95% fest. Es handelt sich dabei um Zellen, die da Plasmid enthalten (da die Wirtszelle p- in der Lage ist, bei 37ºC und 42ºC zu wachsen). Diese Mortalität erhöht stark den Mengenanteil der Zellen p- gegenüber den lebenden Zellen um einen Faktor von 10 bis 20. Wenn die Gesamtanzahl der lebenden Zellen stark vermindert ist und die Zellen p- einen signifikanten Anteil der Population darstellen, bestimmt man die Multiplikation der Zellen p-, wodurch das Verhältnis p+/p- stark vermindert wird (vgl. z. B. Tabelle 3, die nach 5 ½ h und 7 h erhaltenen Ergebnisse).
• Es ist offensichtlich, daß der Parameter p-/Zelle/Generation seine Signifikanz unter diesen Bedingungen verloren hat, da die p+ sich nicht mehr vermehren. Man schlägt den folgenden Parameter vor: p-/ml/Einheit der optischen Dichte (DO), die nur die Zellen p- in jedem Augenblick der Kultivierung mißt. Außerdem erlaubt er den Vergleich von zwei verschiedenen Kulturen in bezug auf ihren Plasmid-Verlust. Dieser Parameter wird nach der folgenden Formel errechnet:
• p-/ml/DO = [1-(%p+/100)] · c. lebensfähige Zellen/ml/DO.
• Schließlich kann man den Prozentsatz der Zellen (Fp-)
• in der Kultur erhalten und den Grad der Kontamination der Kultur durch Zellen p- in jedem Augenblick bestimmen, wenn man diesen Parameter mit der Gesamtanzahl der Zellen ins Verhältnis setzt (dies entspricht unter den herrschenden Bedingungen 4.108). Der Fp- wird auf die folgende Weise errechnet:
• Fp- = 4·10&sup8; c/ml/DO · 100/(p-/ml/DO).
• Der Fp- ist ein objektiver Parameter, der es erlaubt, zu entscheiden, ob eine für die Bildung eines Moleküls bestimmte Kultur ausreichend rein ist, um eine Weiterentwicklung zu rechtfertigen, und der es erlaubt, unterschiedliche Plasmide unter den Induktionsbedingungen miteinander zu vergleichen.
• Man mißt unter den in den folgenden Beispielen beschriebenen Bedingungen die lebensfähigen Zellen, den Prozentsatz an p+ und schließlich errechnet man das Verhältnis p-/ml/DO und den Fp-. Diese Daten sind in Form von Tabellen angegeben.
Beispiel 8 Induktion von Hirudin
• Man präsentiert die Ergebnisse in bezug auf die Induktion von Hirudin in erster Linie mit einem Vektor, der das Gen bezüglich der Resistenz gegenüber Ampicillin enthält, danach mit dem Vektor, der auch das Gen dapD enthält.
1) Stabilität der Plasmide a) Induktion der Expression von Hirudin in einem Vektor, der das Gen für die Resistenz gegenüber Ampicillin enthält (TGE900/pTG720) in LB bei 37ºC
• Typische Ergebnisse für TGE900/pTG720 sind in der Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Stabilitätsparameter der Plasmide während der Expression von Hirudin bei 42ºC in TGE900/PTG720 Zeit in h
• Man sieht, daß nach 3 h die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro Einheit von DO abnimmt gleichzeitig mit dem Mengenanteil an p+. Nach 5 ½ h liegt der Fp- (Prozentsatz von p-, bezogen auf die Gesamtheit der Zellen) in der Größenordnung von 2,35%. Nach 7 h hat sich diese Zahl verdoppelt und es ist wahrscheinlich, daß dies nur auf das Wachstum der p-Zellen zurückzuführen ist.
b) Induktion der Expression von Hirudin in einem Vektor der das Gen dapD enthält (TGE7615/pTG771) in LB bei 37ºC
• Die in der Tabelle 4 angegebenen Ergebnisse sind mit denjenigen vergleichbar, die für pTG720 erhalten wurden. Tabelle 4 Stabilitätsparameter der Plasmide während der Expression von Hirudin bei 42ºC in TGE7615/pTG771 Zeit in h
• Man ersieht aus der Tabelle 4, daß trotz einer Mortalität, die vergleichbar ist mit derjenigen, die für TGE900/pTG771 festgestellt wurde, der Plasmid-Verlust (%p+) gering ist (nach 5 h 98% p+) genau wie die Absolutmenge an Zellen p-(p-/ml/DO). Nach 5 h beläuft sich der Fp- auf 0,04%, der somit 50 mal kleiner ist als für pTG720 im gleichen Augenblick. Dies zeigt die bessere Stabilität von pTG771 gegenüber derjenigen von PTG720. Es sei daran erinnert, daß in einem Induktionsversuch das pTG771 sich nicht tetramerisiert und daß sein Verlust vermutlich niedriger ist als derjenige, der bei 170 Generationen bei 30ºC bestimmt wurde (vgl. Tabelle 2).
• Die Ergebnisse zeigen eine viel größere Stabilität des Plasmids pTG771 als diejenige von pTG720.
2) Plasmid-Gehalt
• Die Plasmide pTG720 und pTG771 wurden zu unterschiedlichen Zeiten während der Induktion isoliert. Allgemein stellt man bei Beginn der Induktion in der exponentiellen Phase einen niedrigen Plasmid-Gehalt pro Zelle fest, der mit dem Ablauf der Zeit deutlich zunimmt. Während der gleichen Periode wird Hirudin gebildet.
• Es ist interessant darauf hinzuweisen, daß diese Zunahme des Plasmid-Gehaltes in einer Population auftritt, in der mehr als 95% der Zellen tot sind.
3) Induzierte Aktivität
• Die Aktivitäten an gebildetem Hirudin, ausgehend von pTC720 oder pTG771, sind nicht signifikant verschieden. Die Werte (in Antithrombin-Einheiten, UAT) betragen 2720 UAT/l/DO für pTG720 und 2380 UAT/l/DO für pTG771 nach 5-stündiger Induktion Zusammenfassend kann man sagen, daß das pTG771 eine erhöhte Stabilität, verglichen mit pTG720, zeigt unter gleichzeitiger Aufrechterhaltung der gleichen Produktionskapazität und der gleichen Eigenschaften in bezug auf die Erhöhung seiner Anzahl von Kopien am Ende der exponentiellen Phase wie pTG720.
Beispiel 9 Induktion von Gamma-Interferon
• Die die Induktion von Gamma-Interferon betreffenden Daten sind in der gleichen Weise angegeben wie diejenigen von Hirudin.
1) Stabilität der Plasmide a) Induktion der Expression von Gamma-Interferon in einem Vektor, der das Gen für die Resistenz gegenüber Ampicillin enthält (TGE900/PTG40) in LB bei 42ºC
• Die in der Tabelle 5 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß der Verlust der Plasmide vergleichbar ist mit demjenigen von pTG720 und daß nach 5 h der Fp- auf 6% steigt. Im Unterschied zu pTG720 geht die Lebensfähigkeit jedoch schneller verloren und nach 3 h ist bereits eine minimale Anzahl von lebensfähigen Zellen erreicht (im Vergleich zu 5 h, die bei pTG720 beobachtet wurden); darüber hinaus bleiben die in der Kultur vorhandenen Zellen p- lebensfähig und teilen sich bereits signifikant nach 3 h und tragen zu diesem Fp- von 6% nach 5 h bei. Tabelle 5 Stabilitätsparameter der Plasmide während der Expression von Interferon bei 42ºC in TGE900/pTG40 Zeit in h (Anzahl der getesteten Kolonien)
b) Induktion der Expression von Interferon in einem Vektor, der das Gen dapD enthält (TGE7615/pTG7671) in LB bei 42ºC
• In der Tabelle 6 sind die Daten in bezug auf die Induktion von TGE615/pTG7671 bei 42ºC in LB angegeben. Man stellt fest, daß die maximale Mortalität erst nach 5 h erreicht wird und daß in diesem Augenblick, obgleich der Prozentsatz an p+ vergleichbar mit demjenigen von pTG40 ist (10%), die Anzahl der Zellen p-. (p-/ml/DO) 5 mal niedriger ist als diejenige, die man nach 3 h bei pTG40 erhält. Nach 5 h beträgt der Fp- nämlich 0,3%, während der Fp- für pTG40 dann bereits 6% beträgt. Es besteht somit eine Differenz um einen Faktor 20, der die erhöhte Stabilität von pTG7671 reflektiert, eine Beobachtung, welche die Stabilitätsdaten bei 30ºC bestätigt (vgl. Tabelle 1). Tabelle 6 Stabilitätsparameter der Plasmide während der Expression von Interferon bei 42ºC in TGE7615/TG7671 Zeit in h (Anzahl der getesteten Kolonien)
• Unter den Induktionsbedingungen von TGE7615/pTG7671 bei 42ºC ist die Stabilität des Plasmids praktisch identisch in einem selektiven Medium und in einem nicht-selektiven Medium, wobei die Stabilität von pTG7671 sehr gut ist in Abwesenheit einer Selektion. Der Verlust des Plasmids ist somit vermindert auf einen sehr zufriedenstellend den Wert und ist kompatibel mit einer industriellen Herstellung.
2) Plasmid-Gehalt
• Die Analyse des Plasmid-Gehalts auf Agarosegel zeigt, daß die durch die Plasmide pTG40 und pTG7671 transformierten Stämme äquivalente Mengen an Material enthalten und daß dieser Plasmid-Gehalt pro Zelle im Verlaufe der Zeit während der Induktion ansteigt. pTG40 liegt in Form des Dimeren vor (wie auf dem Agarosegel gezeigt).
3) Selektion der Zellen p+, die das Gen dapD enthalten
• Um das Selektionsvermögen des Systems dapD zu zeigen unter Berücksichtigung des Wachstums der Zellen p-, die nicht mehr gebildet werden, sobald der Hauptteil der Zellen seine Lebensfähigkeit verloren hat, führt man eine Induktion durch, während der die Kultur um einen Faktor 5 verdünnt wird, in drei Wiederholungen in einem Abstand von 2 h, danach läßt man diese Kultur die stationäre Phase erreichen. Die Ergebnisse für die Induktion bei 42ºC von TGE7615/pTG7671 sind in der Tabelle 7 für ein Wachstum in dem selektiven Medium LB angegeben und sie sind in der Tabelle 8 für ein Wachstum in dem nicht-selektiven Medium LB + DAP angegeben. Tabelle 7 Stabilitätsparameter der Plasmide während der Expression von Interferon bei 42ºC in TGE7615/pTG7671 in dem selektiven Medium LB Zeit in h (Anzahl der getesteten Kolonien) Tabelle 8 Stabilitätsparameter der Plasmide während der Expression von Interferon bei 42ºC in TGE7615/pTG7671 in dem Medium LB + DAP Zeit in h (Anzahl der getesteten Kolonien)
• Aus der Tabelle 8 ist zu ersehen, daß nach 9-stündiger Induktion in dem selektiven Medium LB die lebensfähigen Zellen alle Plasmid enthalten (die Anwesenheit des Plasmids wird bestätigt durch positive Minipräparationen aus 30 Kolonien von insgesamt 60 positiven Kolonien auf LB und die Identifizierung des Plasmids durch Elektrophorese auf Agarosegel). In einem nicht-selektiven Medium ist dagegen die Lebensfähigkeit 5 mal höher, die Kultur enthält jedoch nicht mehr als 5% Zellen, die das Plasmid behalten haben. Diese höhere Lebensfähigkeit in LB + DAP als in LB zeigt das Wachstum der Zellen p- in einem mit DAP versetzten Medium und um so mehr die Mortalität der Zellen p- in dem selektiven Medium. Das Medium LB erlaubt somit eine wirksame Gegenselektion der Zellen p-.
4) Bildung von Interferon
• Das pTG7671 behält die gleiche Fähigkeit zur Bildung von Gamma-Interferon wie das ursprüngliche Plasmid pTG40.
Beispiel 10 Deletion des Gens dapD aus dem Chromosom des Bakteriums
• Subklonierung des Gens dapD auf 2 Fragmenten PstI Das Plasmid pDB6 und das M13mp8 werden mit PstI geschnitten und legiert. Man sortiert aus (reichert an) die M13, die das 5'-Ende und das 3'-Ende des Gens enthalten, durch Oligonucleotide, die für diese Regionen spezifisch sind TG596 (GCGCTTAATAACGAGTTG) und TG598 (TGTGCATACTTTAGTC). Die Kandidaten SB96 und SB98 werden zurückbehalten und die Insertion der gewünschten Fragmente wird durch Sequenzierung bestätigt (vgl. das Schema der Fig. 6).
Einführung einer Stelle (Sequenz) EcoRI in die 5'- und 3'-Enden des Gens dapD
• Die Stellen (Frequenzen) EcoRI werden in SB96 und SB98 durch punktuelle Mutation eingeführt:
• - in SB98 mit dem Oligonucleotid TG597:
• GTACGCAGGAATTCCTTAATGCCG
• - das sich mit der 3'-Region des Endes des Gens paart, jedoch vor einem angenommenen Transkriptionsterminator;
• - in SB96 mit dem Oligonucleotid TG620:
• AGAGGCCCGAATTCCAAACG
• das sich mit der 5'-Region stromaufwärts von dem angenommenen Promotor des Gens dapD paart.
• Die Transformanden werden mit den gleichen Sonden analysiert, die zur Einführung der Stellen (Frequenzen) EcoRI gedient habe. Die Anwesenheit dieser Stelle (Frequenz) EcoRI wird bestätigt durch Minipräparation von DNA und anschließend durch Sequenzierung der zurückbehaltenen Kanditaten M13 (vgl. das Schema gemäß Fig. 7).
Konstruktion eines Deletionsvektors
• Das gegenüber Kanamycin resistente Gen des Plasmids pUC-4K (erhältlich von der Firma Pharmacia) wird in Form des Fragments EcoRI zurückgewonnen. Die M13TG597 und 620 werden mit EcoRI und PstI geschnitten, wodurch jeweils das 3'-Ende des Gens dapD (ohne den vermuteten Terminator) und das 5'-Ende des Gens (mit seinem vermuteten Promotor) freigesetzt werden.
• Der Klonierungsvektor pTG192 (wie er in Beispiel 2a) beschrieben ist) wird mit PstI geschnitten.
• Die Gesamtheit dieser Fragmente wird legiert. Nach der Transformation der Zellen 5K und nach der Ausbreitung (dem Ausstreichen) auf LB + 0,1 ug/ml Ampicillin + 0,02 ug/ml Kanamycin klassiert (sortiert) man die Kolonien mit dem Oligonucleotid TG596.
• Es wurde eine Konstruktion selektioniert: pTG47. Ihre Struktur wird durch Minipräparation von DNA und die Orientierung des Gens für die Resistenz gegenüber Kanamycin analysiert und bestimmt durch Digestion des Plasmids mit HindIII, wodurch zwei Banden einer Größe von 5,3 und 4,0 kb freigesetzt werden. Die Orientierung des Gens für die Resistenz gegenüber Kanamycin in pTG47 ist die gleiche wie diejenige des Gens dapD in pDB6 (bei der anderen Orientierung hätte man Banden der Größe 4,9 und 4,4 kb erhalten). Das Schema von pTG47 ist in Fig. 8 dargestellt.
Deletion des Gens dapD aus dem Chromosom Deletion des Gens dapD aus dem Chromosom eines Intermediär-Stammes
• Die Zellen RH5345, deren Kompetenz auf 2,5 · 10&supmin;&sup7; Transformanden/ug DNA von pTG47 steigt, werden mit dem Plasmid pTG47 transformiert, das vorher mit KnpI und BglII geschnitten worden ist (vgl. Fig. 8). Durch diese Digestion wird ein Fragment freigesetzt, das die flankierenden Regionen des Gens dapD enthält, wobei das Gen selbst durch das Gen für die Resistenz gegenüber Kanamycin ersetzt wird.
• Nach dem Ausbreiten (Ausstreichen) auf LB + DAP + 0,01 ug/ml Kanamycin selektioniert man 9 Kandidaten: TGE721 bis TGE729, deren Phänotyp dap&supmin;, kan® bestätigt wird.
• Das Fehlen des Gens dapD wird nach der Transformation dieser Stämme durch pTG764 bestätigt durch ihre Fähigkeit, sich in dem Medium LB zu vermehren.
Deletion des Gens dapD des Stammes TGE901 und N5969
• Die Deletion dapD des Stammes TGE721 wird anschließend auf die Stämme TGE901 und N5969 übertragen durch den Transduktor-Phagen Plvir/TGE721 und die Rekombinanten dap&supmin;, die aufgrund ihrer Resistenz gegenüber 0,01 ug/ml Kanamycin selektioniert worden sind.
• Die zurückbehaltenen Kandidaten sind jeweils TGE7213, 7214 und TGE7303. Der Bedarf des Mutter-Stammes TGE901 an ile, val, his über die Eigenschaft dap&supmin; kan® hinaus, wurde auf geeigneten Medien für einen Kandidaten bestätigt TGE7214.
Beispiel 11 Bestätigung der Deletion des Gens dap in verschiedenen Stämmen durch Chromosomen-"Blot"
• Es wurden die folgenden verschiedenen Stämme analysiert:
• - die Elternstämme TGE901 und RH5345, dapD&spplus;,
• - die deletierten Stämme TGE7213 und 7214,
• - der Eltern-Stamm RL58, der zur Einführung der Mutation dapD in TGE901 verwendet worden war, und die Mutante dapD&supmin;, TGE7615, die sich davon ableitet,
• - ein Stamm GC4540, der gegenüber Kanamycin resistent ist, durch Integration von Tn5, während sich in den Stämmen TG das Gen für die Resistenz gegenüber Kanamycinderivat von Tn903 ableitet (die beiden Gene dürfen keine Überkreuzhybridisierung ergeben wegen eines Mangels an Homologie - Beck et al. 1982).
• Die Auswahl der Restriktionsenzyme basiert auf der Sequenz von pDB6; ein Schneiden mit:
• - BamHI und HindIII setzt im Falle der Wild-Stämme ein Chromosomen-Fragment von 9 kb frei, welches das Gen dapD und seine flankierenden Regionen enthält; im Falle der deletierten Stämme muß das Resistenz-Gen durch Digestion mit BamHI freigesetzt und durch Digestion mit HindIII in zwei Fragmente zerschnitten werden;
• - PstI setzt im Falle der Wild-Stämme zwei Fragmente frei, die jeweils einen Teil des Gens dapD enthalten (2,8 kb der 5'-Region und 3,4 kb der 3'-Region); für den Fall der deletierten Stämme werden durch Digestion mit PstI das Gen für die Resistenz gegenüber Kanamycin und die beiden flankierenden Regionen freigesetzt (auf der 5'-Seite ein Fragment von 2,4 kb und auf der 3'-Seite ein Fragment von 2,8 kb) (vgl. die Fig. 6 und 8).
• Die Sonden wurden ausgewählt, um das Gen dap oder seine flankierenden Regionen oder das Gen kan® zu untersuchen:
• - zur Untersuchung des Gens für die Resistenz gegenüber Kanamycin isoliert man ein Fragment EcoRI von pTG47, das nur dieses Resistenz-Gen enthält (Fig. 8),
• - zur Untersuchung des Gens dapD verwendet man ein Fragment EcoRI von 2,4 kb von M13TG620, das nur die 5'-Region des Gens dapD enthält und das in TGE721, 7213, 7214 vollständig deletiert sein muß (Fig. 7),
• - zur Untersuchung des Chromosomen-Gens DapD und seiner flankierenden Regionen verwendet man ein Fragment KpnI-BglII von pTG47, welches das Gen für die Resistenz gegenüber Kanamycin und die beiden Regionen (der 5'-Seite und der 3'-Seite) des Chromosoms enthält, welche das Gen dapD flankieren (Fig. 8).
• Es bleibt somit noch zu untersuchen bzw. man erwartet das Auftreten
• - in den Wild-Stämmen einer Bande von 2,8 kb, die der 5'-Region des Gens dapD entspricht, und einer Bande von 3,4 kb, die der 3'-Region dieses Gens entspricht (Fig. 6),
• - in den deletierten Stämmen das Gen für die Resistenz gegenüber Kanamycin, die flankierende 5'-Region des Gens dapD, die bestehen bleibt (2,4 kb), und die flankierende 3'-Region des Gens dapD, die bestehen bleibt (2,8 kb) (Fig. 8).
Nachweis der Einarbeitung des Gens für die Resistenz gegenüber Kanamycin
• Man vergleicht die Chromosomen-DNAs von GC4540, TGE7213, TGE7214 und TGE901, die mit PstI oder BamHI und HindIII geschnitten und durch das Fragment EcoRI von pTG47 untersucht worden sind.
• PstI setzt die Bande von 1,3 kb frei; eine Restriktion mit BamHI und HindIII ergibt zwei Fragmente von 0,7 und 0,6 kb nur bei den deletierten Stämmen. Es tritt keine Bande auf in TGE901 noch in GC4540 (Fig. 9A).
• Diese Ergebnisse beweisen, daß das Gen für die Resistenz gegenüber Kanamycin dem Chromosom der deletierten Stämme einverleibt worden ist und daß dieses Gen aus pUC-4K stammt.
Nachweis der Deletion des Gens dapD aus dem Chromosom
• Die Chromosomen-DNAs von GC4540, TGE7213, 7214 und TGE901 werden verglichen mit den Kontrollen M13TG620, M13TG597, dem Fragment BamHI-HindIII von pDB6 und dem gleichen Fragment, das mit PstI geschnitten worden ist (Fig. 6).
• Die Chromosomen-DNAs werden mit PstI oder BamHI und HindIII geschnitten.
• Man isoliert das durch EcoRI geschnittene M13TG620 aus der Bande, die Spezifisch die 5'-Seite des Gens dapD enthält, um sie als Sonde zu verwenden (Fig. 9B).
• Nach der Digestion mit PstI sieht man, daß in den Wild-Stämmen eine Bande von 2,8 kb, die dem 5'-Bereich des Gens dapD entspricht, aber auch eine unerwartete Bande von 1,7 kb auftritt.
• Nach der Digestion mit BamHI und HindIII erhält man eine Bande von etwa 12 kb, die größer ist als die Bande (von 9 kb), die aus pDB6 stammt. Darüber hinaus ist auch eine zusätzliche Bande von 2,5 kb in den Wild-Stämmen vorhanden (Fig. 9B).
• Es ist keine signifikante Homologie erkennbar für die deletierten Stämme in keinem Digestions-Fragment. Diese Beobachtungen zeigen, daß
• - eine Sonde, die den 5'-Abschnitt des Gens dapD bedeckt, keine Bande in dem Chromosom der Stämme TGE7213, 7214 ergibt, was die Deletion der 5'-Seite dieses Gens zeigt,
• - da in den Wild-Stämmen über die erwartete Bande hinaus eine zweite Bande auftritt, die spezifisch ist für das Gen dapD, es scheint, daß dieses Gen in diesen Stämmen dupliziert (kopiert) worden ist.
• Da eine Duplikation des Gens dapD unerwartet war, wurde diese Duplikation in bestimmten Wild-Stämmen bestätigt und es wurde die Deletion des Gens dap der 3'-Seite über die 5'-Seite hinaus bestätigt.
• Nach der Digestion mit PstI wurden die gleichen Chromosomen-DNAs und Kontrollen verwendet (Fig. 8).
• Die Sonde ist das pTG47, das mit KpnI und BglII geschnitten wurde. Diese Sonde sollte mindestens eine Bande von 1,7 kb ergeben über die Bande hinaus, die bereits weiter oben genannt wurden. Tatsächlich enthält das pTG47 300 pb und 100 pb, die Homologe sind zu dem Gen dapD auf der 5'-Steite bzw. der 3'-Seite und die in den deletierten Stämmen auftreten sollten.
• Die Fig. 9C zeigt, daß:
• - man Banden von 2,8 und 2,4 kb in den deletierten Stämmen und Banden von 3,4 und 2,8 kb in den Wild-Stämmen feststellt; darüber hinaus stellt man eine Bande von 1,3 kb fest, die dem Gen für die Resistenz gegenüber Kanamycin entspricht. Dies beweist die Deletion in den Stämmen TGE7213 und 7214;
• - man auch zwei weniger starke Banden nur in den Wild-Stämmen feststellt, die auf das duplizierte (kopierte) Gen dapD zurückzuführen sind. Da man weiß, daß die Bande von 1,7 kb mit dem 5'-Abschnitt auftritt, muß die Bande von 2,1 kb aus der 3'-Seite stammen. Dies beweist, daß diese Stämme tatsächlich eine Duplikation enthalten, die in den deletierten Stämmen verschwunden war.
• Es wurden verglichen die mit PstI geschnittene Chromosomen-DNA der Stämme RH5345 und RL58 sowie die durch Konjugation von RL58 mit TGE901 erhaltene Mutante dapD Diese DNAs werden untersucht mit dem Fragment KpnI, BglII, das aus pTG47 isoliert wurde, welches das Gen für die Resistenz gegenüber Kanamycin enthält (das überhaupt nicht auftreten dürfte) und die flankierenden Regionen des Gens dapD.
• Die Fig. 9D zeigt, daß in RH5345 nur Banden von 3,4 und 2,8 kb auftreten und keine Banden, die auf die Duplikation des Gens zurückzuführen sind,. die in GC4540 und TGE901 vorhanden sind. Darüber hinaus stellt man nur eine Bande von 7 kb für RL58 und TGE7615 fest, was einen Verlust einer Stelle (Frequenz) PstI anzeigt; dies beweist, daß diese beiden Mutanten identisch sind und sich mindestens in der Stelle PstI des Gens dapD berühren.
• Zusammenfassend zeigten diese Versuche, daß:
• - die Stämme TGE7213, 7214 in bezug auf das Gen dapD deletiert sind und daß sie das Gen für die Resistenz gegenüber Kanamycin enthalten,
• - die Mutation dapD&supmin; von RL58 und TGE7615 mindestens im Bereich der Stelle (Frequenz) PstI des Gens dapD vorhanden ist,
• - bestimmte Stämme von E. coli eine Duplikation des Gens dapD aufweisen und daß diese Duplikaton in den deletierten Stämmen nicht vorliegt.
• Da es durch Transduktion gelingt, die beiden Gene dapD aus dem Empfänger-Stamm zu deletieren, kann man daraus schließen, daß das duplizierte Gen sich in der Nähe des ersten Gens dapD (bei weniger als 2' auf der Chromosomen-Karte von E. coli) befinden muß.
Beispiel 12 Klonierung des Gens cer
• Das Gen cer wird gewonnen aus dem Plasmid ColE1, dessen Sequenz von Chan et al. (1985) publiziert worden ist, in Form eines Fragments HaeII von 1,85 kb.
• Das Fragment HaeII wird anschließend mit HpaII geschnitten, nach Klenow behandelt und man erhält eine Bande von 0,4 kb. Das M13mp130 wird mit EcoRV geschnitten und mit Phosphatase behandelt. Man legiert das Fragment von 0,4 kb von ColE1 in M13mp130 und führt es in den Stamm JM103 ein. Die Anwesenheit des Fragments cer von ColE1 wurde bestätigt durch Sequenzierung der durch Schneiden mit SmaI und HindIII freigesetzten Bande von 0,4 kb.
• Dieses in den Polylinker von M13mp131 inserierte Gen cer wird anschließend nach der Digestion mit SmaI und HindIII isoliert und in dem Vektor pTG720 legiert (der das Gen Hirudin trägt, vgl. Fig. 2), mit BglII geschnitten und nach Klenow behandelt. Das resultierende Plasmid ist das pTG720cer.
Beispiel 13 Konstruktion von Klonierungsvektoren, die das Gen cer und das Gen dapD enthalten Umkehrung der Richtung des Polylinkers von M13mp131 in einem Vektor, der für die Resistenz gegenüber Ampicillin codiert
• Das pTG192 (Fig. 1) wird mit EcoRI und BglII geschnitten, um den Polylinker von M13mp131 freizusetzen, und durch Digestion mit HaeIII gekürzt. Man verwendet ein Plasmid, welches das Gen für die Resistenz gegenüber Ampicillin trägt, beispielsweise pTG730 (der Expressionsvektor von Hirudin, wie in den französischen Patent 86.16723 beschrieben); dieses Plasmid wird mit BglII und EcoRI geschnitten und mit dem Fragment EcoRI-BglII von pTG192 ligiert. Auf diese Art verliert man den Expressions-Block, der PL und das Struktur-Gen für Hirudin von pTG730 enthält, das man durch den Polylinker von M13mp131 ersetzt. Dieses neue Plasmid bezeichnet man als pTG790 (Fig. 10).
Einführung des Fragments cer in einen Klonierungsvektor
• Das pTG790 wird mit SstI und KpnI geschnitten und mit Phosphatase behandelt. Das resultierende Fragment dieser Digestion wird mit pTG720cer legiert, mit SstI und KpnI geschnitten (wodurch das Fragment cer freigesetzt wird) und durch Digestion mit BglII gekürzt. Der resultierende Vektor pTG792 enthält das Fragment cer (Fig. 11).
Einführung des Gens dapD in einen Vektoren, der das Fragment cer enthält
• Das pTG792 wird mit EcoRI geschnitten, nach Klenow behandelt und mit Phosphatase behandelt. Das resultierende Fragment wird mit dem Fragment AluI von 1,3 kb, das aus pDB6 stammt, welches das Gen dapD enthält, legiert (Fig. 6). Daraus resultieren zwei Plasmide pTG7922 und pTG7923, die sich nur durch die Orientierung des Gens dapD unterscheiden, das zwischen zwei Stellen (Frequenzen) EcoRI angeordnet ist. Bei dem pTG7922 sind die Promotoren der drei Gene, des Replikationsursprungs, der Resistenz gegenüber Ampicillin und dapD in gleicher Weise orientiert (Fig. 12).
Deletion von Gens für die Resistenz gegenüber Ampicillin
• - Die folgenden Konstruktionen haben ein mehrfaches Ziel:
• das Gen für die Resistenz gegenüber Ampicillin aus den Vektoren, die das Gen dapD enthalten, zu deletieren;
• - einen Klonierungsvektor dapD zu erhalten, der das Gen cer enthält;
• - einen Klonierungsvektor dapD zu erhalten, der den Polylinker von M13mp131 enthält (abzüglich der Stelle (Frequenz) EcoRV, die für die Klonierung von cer verwendet wird);
• - einen Vektor dapD mit einer einzigen Stelle (Frequenz) EcoRI zu erhalten.
• Man gewinnt ein Fragment PstI von pTG7922 und von pTG7923, das jeweils den 3'-Abschnitt und den 5'-Abschnitt des Gens dapD enthält, sowie das Gen cer für die Einführung in einen Vektor dap, der ein analoges Fragment enthält, jedoch nicht die Stelle (Frequenz) EcoRI oder AvaI noch das cer. Die analogen Vektoren sind jeweils das pTG767 und das pTG766, die weiter oben beschrieben wurden.
• Das pTG7922 und das pTG7923 werden mit PstI geschnitten, durch Digestion mit BglII gekürzt und jeweils legiert in pTG767 und pTG766, die mit PstI geschnitten und mit Phosphatase behandelt worden sind. Die Klonierungsvektoren, die daraus resultieren, sind jeweils pTG769 und pTG768 (pTG769 ist in der Fig. 13 dargestellt).
Beispiel 14
• Anwendung des Modells dap auf die Konstruktion von Expressionsvektoren für die Brenzkatechin-2,3-Oxygenase (C2,3O).
Vektor ohne Stelle (Frequenz) BamHI stromaufwärts von C2,3O
• Das Struktur-Gen von C2,3O wird gewonnen aus pTG444, um in den Vektor dap pTG7671 eingeführt zu werden (wie oben beschrieben).
• Das pTG444 ist identisch mit pTG445, das von Zukowski et al (1984) beschrieben wurde, mit Ausnahme einer nichtregenerierten Stelle (Frequenz) XmaIII. Das pTG444 wird mit BamHI und HindIII geschnitten und mit pTG769 legiert, das mit BamHI und HindIII geschnitten und mit Phosphatase behandelt worden ist. Das resultierende Plasmid, als pTG7401 bezeichnet, enthält das Strukturgen von C2,3O.
• Das pTG7671 enthält zwei Stellen (Frequenzen) BglII: eine Stelle (Frequenz) stromaufwärts von PL, die Teil des Polylinkers ist, und eine Stelle (Frequenz) stromabwärts von PL, die in der Bindungs-Frequenz der Ribosomen angeordnet ist, stromaufwärts von dem Strukturgen von Gamma-Interferon. Das pTG7671 wird mit BglII geschnitten und durch Digestion mit KpnI gekürzt. Die resultierende Mischung wird in dem pTG7401 legiert, in seinem Polylinker mit BglII und BamHI geschnitten und mit Phosphatase behandelt. Durch diese Ligation stellt man die Stelle (Frequenz) BglII wieder her, die mit BglII legierte Stelle (Frequenz) BamHI ist jedoch verloren. Es sind zwei Orientierungen von PL in bezug auf das Strukturgen von C2,3O möglich. Um die Konstruktion, in der das C2,3O unter der Kontrolle von PL steht, zu unterscheiden, schneidet man mit BamHI und BglII (für die gewünschte Orientierung befindet sich nämlich eine Stelle (Frequenz) BamHI in der Nähe der Stelle (Frequenz) BglII und die Digestion ergibt praktisch nur eine Bande von 4,3 kb;. in der anderen Orientierung wird durch die Digestion eine Bande bei 3,9 kb und eine Bande von 0,4 kb freigesetzt).
• Das zurückbehaltene Plasmid pTG7407, welches das C2,3O unter der Kontrolle von PL enthält, hat eine Struktur ähnlich derjenigen von pTG7406, die weiter unten beschrieben wird (vgl. die Fig. 14), es hat jedoch die Stelle (Frequenz) BamHI stromaufwärts von C2,3O verloren.
Vektor mit einer Stelle (Frequenz) BamHI stromaufwärts von C2,3O
• Das pTG769 wird mit BglII und BamHI geschnitten, mit Phosphatase behandelt und mit einem Fragment BamHI-BglII eines beliebigen Expressions-Plasmids (pTG907), das PL und das vollständige Gen N von Lambda enthält, legiert. Daraus resultiert eine Konstruktion, das pTG7400, das durch Schneiden mit BamI und BglII identifiziert werden kann, wodurch zwei Banden freigesetzt werden: bei 2,6 kb und 1,3 kb. Diese Konstruktion enthält den PL und das vollständige Gen N.
• Das pTG7400 wird anschließend mit HpaI geschnitten und man inseriert einen Linker BamHI (vertrieben von der Firma BRL) CCGGATCCGG, der phosphoryliert und hybridisiert worden ist. Dieser ergibt das pTG7402, das seine Stelle (Frequenz) HpaI verloren hat, das jedoch zwei Stellen BamHI enthält.
• Das pTG7402 wird mit BamHI geschnitten und relegiert unter Bildung von pTG7404. Durch diese Manipulation eliminiert man eine Stelle (Frequenz) BamHI und verstümmelt (stutzt) das Gen N.
Einführung des Gens von CO2,3 in einen Vektor dap-cer
• Das pTG7402 wird mit BamHI und HindIII geschnitten, mit Phosphatase behandelt und das Fragment BamHI-HindIII von pTG444 wird eingeführt unter Bildung von pTG7406 (vgl. Fig. 14). Es unterscheidet sich von pTG7407 durch die Tatsache, daß man das Gen von C2,3O durch einen Schnitt mit BamHI, HindIII herausholen kann zur Gewinnung des aus pTG444 eingeführten Fragments.
Expression von CO in den durch das Plasmid PTG7407 transformierten Stämmen von E. coli dap&supmin;-
• Die Expression des Gens C2,3O in den Bakterien TGE7213/pTG7407 wurde bei 30ºC nach 4-stündiger und 7-stündiger Kultivierung und im Verlaufe der Induktion bei 42ºC nach 4 h und nach 7 h gemessen.
• Für jede Bestimmung wird eine Probe aus der Kultur entnommen und zentrifugiert; der Zentrifugenrückstand wird gewaschen und in einem Phosphatpuffer aufgenommen (wie von Zukowski et al. 1983 beschrieben), dann mit Ultraschall 3 mal 20 s lang behandelt.
• Nach 10-minütigem Zentrifugieren mit 10 000 g betrachtet man den Zentrifugenrückstand als die unlösliche Fraktion (C) und den Überstand als die lösliche Fraktion (S).
• Die in jeder Fraktion vorhandenen Proteine werden durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-SDS-Gel analysiert. Die Banden werden nachgewiesen durch Färbung mit Coomassie-Blau. Die Ergebnisse sind in der Fig. 15 dargestellt. Man bestimmt die Intensität der Bande von PM 35 000, insbesondere nach 7-stündiger Induktion bei 42ºC.
• Das "Scanning" des Gels ergibt etwa 64% und 75% C2,3O in den jeweiligen Fraktionen S und C.
• In der reicheren Probe (S, 7 h bei 42ºC) wurde die spezifische Aktivität von C2,3O (nach dem von Zukowski et al. 1983 beschriebenen Verfahren) bestimmt durch Zugabe von Brenzkatechin als Substrat. Man mißt eine spezifische Aktivität von 28 bis 35 U/mg.
• Die spezifische Aktivität eines reinen Enzympräparats beträgt 280 U/mg, die analysierten Extrakte enthalten etwa 12% aktive C2,3O.
Beispiel 15 Einführung des Fragments cer in einen Vektor zur Expression von Gamma-Interferon
• Das oben beschriebene pTG7671 wird im Bereich seines Polylinkers mit SstI (identisch mit SacI) und KpnI geschnitten, dann mit Phosphatase behandelt und mit den Fragmenten von pTG720cer legiert, das mit Sst und KpnI geschnitten worden ist. Nach der Transformation in TGE7615 behält man einen Kandidaten pTG7675 zurück, der nach der Digestion mit SstI und KpnI zwei Fragmente von 400 pb und 3,4 kb freisetzt (Fig. 16).
Beispiel 16
• Nachweis der Stabilität der Plasmide im Verlaufe der Induktion der Expression von Gamma-Interferon.
a) Induktion der Expression von Gamma-Interferon in dem Medium LB bei 42ºC für einen Vektor, der das Gen für die Resistenz gegenüber Ampicillin trägt: TGE901/pTG40
• Die Ergebnisse sind in der Tabelle 9 zusammengefaßt. Man mißt die Gesamtanzahl der Zellen/ml/Einheit von DO, um festzustellen, daß der Verlust an Lebensfähigkeit ein reales Phänomen und nicht beispielsweise eine Volumenänderung der Zellen ist. Diese Daten sind ebenfalls in der Tabelle 9 zusammengefaßt. Der Fp&supmin; wurde im Beispiel 7 definiert und verbindet die Anzahl der Zellen p&supmin; mit der Gesamtanzahl der Zellen, die in einem gegebenen Augenblick vorhanden sind.
• Man stellt fest, daß der Fp&supmin; nach 7 ½-stündiger Induktion einen Wert von nahe bei 2% erreicht. Er ist somit weniger hoch als in dem vorhergehenden Versuch (vgl. Beispiel 9), was auf einen Unterschied in der Struktur des Plasmids pTG40 in diesen beiden Versuchen zurückgeführt werden kann: obgleich die Plasmid-Menge äquivalent ist in den unterschiedlichen Augenblicken der Induktion, lag nämlich in dem ersten Versuch das Plasmid in dimerer Form vor, während in dem hier beschriebenen Versuch es hauptsächlich in monomerer Form vorliegt (wie eine Analyse auf einem Gel zeigt). Der Zustand des Plasmids beeinflußt nicht die Bildung von Gamma-Interferon, erläutert jedoch auf konkrete Weise den Stabilitätsverlust, wenn die monomere Form eines Plasmids nicht aufrechterhalten wird.
b) Induktion der Expression von Gamma-Interferon in einem mutierten Stamm für das Gen dap, der durch einen Vektor transformiert worden ist, der das Gen dapD und das Gen cer enthält, TGE76151/TG7675
• Die Ergebnisse sind in der Tabelle 10 zusammengefaßt. Man bestimmt die Gesamtanzahl der Zellen/ml/Einheit von DO; es gibt keinen merklichen Unterschied gegenüber TGE901/pTG40. Man bestätigt somit einen realen Verlust an Lebensfähigkeit; nach 7 ½-stündiger Induktion bleiben nur 0,02% der Kultur lebensfähig. Dies ist zu vergleichen mit TGE901/pTG40, bei dem der erhaltene Wert 2,4% betrug. Dies zeigt sich im Bereich des Fp&supmin;, der im Falle von TGE7615/pTG7675 um einen Faktor 1000 vermindert ist gegenüber TGE901/pTG40. Dennoch bleiben immer einige Zellen p zurück, die am Ende der Induktion auftreten. Der Plasmid-Gehalt zeigt die gleichen Charakteristiken wie vorher, d. h. eine Zunahme der Anzahl von Kopien am Ende des Wachstums, die multimeren Formen, die in mehr oder weniger großer Anzahl bei den Plasmiden ohne cer vorhanden sind, fehlen jedoch hier praktisch. Die Bildung von Gamma-Interferon ist etwas höher als diejenige, die mit pTG40 erhalten wird.
c) Induktion der Expression von Gamma-Interferon in einer Wirtszelle, aus der das Gen dapD deletiert worden ist und die durch einen Vektor, der das Gen dapD und cer enthält, transformiert worden ist: TGE7213/pTG7675
• Die Ergebnisse sind in der Tabelle 11 zusammengefaßt. Die Schlußfolgerungen sind identisch mit denjenigen, die aus dem Vergleich zwischen TGE901/pTG40 und TGE7615/pTG7675 gezogen worden sind: die Mortalität erreicht einen Faktor von 3,5 · 10&supmin;&sup4;, die Gesamtmenge der Zellen/ml/Einheit von DO ändert sich nicht signifikant während der Induktion. Dagegen treten selbst nach 7 ½-stündiger Induktion keine Zellen p&supmin; auf (nach 24 h ist für TGE901/pTG40 die gesamte Kultur zu p&supmin; geworden und für TGE7213/pTG7675 ist sie zu 100% bei p&spplus; geblieben). Der Plasmid-Gehalt ist vergleichbar mit demjenigen von TGE7615/pTG7675 durch das Fehlen von Multimeren. Die Bildung von Gamma-Interferon ist etwas höher als diejenige, die mit TGE7615/pTG7675 erhalten wird. Tabelle 9 Induktion von TGE901/pTG40 bei 42ºC in dem Medium LB Gesamtmenge Fußnote: Fp&supmin; ist der Prozentsatz an p&supmin;, bezogen auf die Gesamtmenge der in einem gegebenen Augenblick vorhandenen Zellen Tabelle 10 TGE7615 bei 42ºC in dem Medium LB Gesamtmenge Tabelle 11 Induktion von TGE7214/pTG7675 bei 42ºC in dem Medium LB Gesamtmenge
Beispiel 17 Anwendung des Modells dap auf die Konstruktion eines Expressions-Vektors für 1α-Antitrypsin
• Das Fragment PstI, das den Block zur Expression von 1α-Antitrypsin, d. h. den Promotor PL des Phagen Lambda, das verstümmelte Gen N, eine Bindungsstelle der Ribosomen und das Strukturgen von 1α-Antitrypsin (Arg³&sup5;&sup8;), das aus pTG2901 stammt (verstümmeltes Derivat von pTG983, beschrieben in dem französischen Patent 85.07393), enthält, wird in pTG792 eingeführt (wie weiter oben beschrieben), mit PstI geschnitten und mit Phosphatase behandelt.
• Der resultierende Expressionsvektor pTG7913 wird anschließend mit BglII und SstI geschnitten und der das 1α-Antitrypsin und das Gen cer enthaltende Expressionsblock wird in pTG767 eingeführt, mit BgIII und SstI geschnitten und mit Phosphatase behandelt.
• Das resultierende Plasmid pTG7914 enthält das Gen dapD, das Gen cer und den Block zur Expression von 1α-Antitrypsin (Arg³&sup5;&sup8;) (Fig. 17).
Hinterlegung von repräsentativen Stämmen der Erfindung
• Die folgenden Stämme wurden bei der Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (25, Rue du Dr. Roux, Paris) hinterlegt:
• - TGE 7615/pTG7671 unter der Nr. I-586
• - TGE 7615/pTG771 unter der Nr. I-585 } am 25.07.86
• - TGE7214, Coli-Stamm mit deletiertem Gen dapD unter der Nr. I-652 am 10.03.87
• - TGE7303, Coli-Stamm mit deletiertem Gen dapD unter der Nr. I-653 am 10.03.87
• (die beiden Stämme wurden durch das Plasmid pTG768 transformiert, welches das Gen dapD und cer trägt),
• - TGE7214/pTG7407, Stamm dapD&supmin;, der durch das Plasmid zur Expression von C2,3O transformiert worden ist, unter der Nr. I-655 am 10.03.87
Literaturstellen
• 1. I.M. Jones, S.B. Primrose, A. Robinson, D.C. Ellwood (1980) "Mol. Gen. Genet.", 180, 579-584.
• 2. J. Nilsson, G. Skogman (1985), European patent application Nr. 84850313.2.
• 3. G. Skogman, J. Nilsson (1984), "Gene", 31, 117-122.
• 4. K. Miwa, S. Nakamori, K. Sano, H. Momose (1984), "Agric. Biol. Chem.", 48, 2233-2237.
• 5. K. Miwa, S. Nakamori, K. Sano, H. Momose (1984), "Gene", 31, 275-277.
• 6. C.L. Hershberger, P.R. Rosteck (1984), US-Patent Nr. 4 436 815.
• 7. E. Work (1950), "Nature", 165, 74-75.
• 8. B.D. Davis, R. Dulbecco, H.N. Eisen, H.S. Ginsberg, W.B. Wood (2nd Ed. 1973), "Microbiology Ed. Harper International", S. 72.
• 9. B. Dauce-Le Reverend, M. Boitel, A.M. Deschamps, J-M. Lebeault, K. Sano, K. Takinami, J-C. Patte (1982), "European J. Appl. Microbiol. Biotechnol.", 15, 227-231.
• 10. C. Richaud, F. Richaud, C. Martin, C. Haziza, J-C. Patte (1984), "J. Biol. Chem." 259, 14824-14828.
• 11. D. Hanahan (1983), "J. Mol. Biol.", 166, 557-580.
• 12. A. Bollen, R. Lathe, A. Herzog, D. Denicourt, J-P. Lecocq, L. Demarez, R. Lavalle (1979), "J. Mol. Biol.", 132, 219-233.
• 13. M.E. Gottesman, S. Adhya, A. Das (1980), "J. Mol. Biol.", 140, 57-75.
• 14. M. Lusky, M. Botchan (1981), "Nature", 293, 79-81.
• 15. J. Vieira, J. Messing (1982), "Gene", 22, 259-268.
• 16. R. Lathe, M.P. Kieny, S. Skory, J-P. Lecocq (1984), "DNA 3", 173-182.
• 17. M-P. Kieny, R. Lathe, J-P. Lecocq (1983), "Gene", 26, 91-99.
• 18. D.S. Bendiak, J.D. Friesen (1981), "Mol. Gen. Genet.", 181, 356-362.
• 19. D.J. Summers, D.J. Sherratt (1984), "Cell", 36, 1097-1103.
• 20. E. Beck, G. Ludwig, E.A. Auerswald, B. Reiss & M. Schaller, "Gene" 19, 327-336 (1982).
• 21. D.S. Bendiak & J.D. Friesen, "Mol Gen. Genet.", 181, 356-362 (1981).
• 22. A. Bollen, R. Lathe, A. Herzog, D. Denicourt, J.P. Lecocq, L. Desmarez & R.J. Lavallee "J. Mol. Biol." 132, 219- (1979).
• 23. A.I. Bukhari & A.L. Taylor, "J. Bacteriol.", 105, 844-854 (1971).
• 24. P.T. Chan, H. Ohmori, J.I. Tomizawa & J. Lebowitz, "J. Biol. Chem.", 260, 8925-8935 (1985).
• 25. R. D'Ari & O. Huisman, "J. Bacteriol.", 156, 243-250 (1983).
• 26. C. Richaud, F. Richaud, C. Martin, C. Haziza & J. Patte, "J. Biol. Chem.", 259, 14824-14828, 1984.
• 27. D.K. Summers & Spherratt, "Cell", 36, 1097-1103 (1984).
• 28. M.M. Zukowski, D.F. Gaffney, D. Speck, M. Kauffmann, A. Findeli, A. Wisecup & J.P. Lecocq, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 80, 1101-1105 (1983).
• 29. M.M. Zukowski, D. Speck, M. Kauffmann, J.P. Lecocq, "Genetics and Biotechnology of Bacilli", 309-319 (1984).

Claims (11)

1. Bakterienstamm, der eine Mutation des Gens dapD enthält und durch einen Plasmid-Vektor transformiert worden ist, der ein intaktes Gen dapD sowie ein Gen, das für ein interessierendes Protein codiert, und die Elemente, die seine Expression in dem Wirtsbakterium gewährleisten, trägt.

2. Bakterienstamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromosomen-Mutation dapD eine Deletion mindestens eines Teils des Gens dapD ist und daß der Plasmid-Vektor ein intaktes Gen dapD trägt.

3. Bakterienstamm nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Deletion eine Gesamtdeletion des Gens dapD ist.

4. Bakterienstamm nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasmid-Vektor eine Sequenz trägt, die ihn im monomeren Zustand hält.

5. Bakterienstamm nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Sequenz eine Sequenz "cer" ist.

6. Bakterienstamm nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Wirts-Bakterium ein Stamm von E. coli ist.

7. Bakterienstamm nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein von industriellem Interesse ausgewählt wird aus Hirudin, Gamma-Interferon, Brenzkatechin-2,3-Oxygenase und α-Antitrypsin.

8. Verfahren zur Herstellung eines Proteins von industriellem Interesse, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kultiviert und das genannte interessierende Protein abtrennt (gewinnt).

9. Verfahren zur Herstellung von C2,3O, dadurch gekennzeichnet, daß man auf einem vollständigen Medium einen Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kultiviert, in dem das Gen, das für die Expression eines Proteins von industriellem Interesse codiert, das Gen ist, das für C2,3O codiert.

10. Verfahren zur Herstellung von Hirudin, dadurch gekennzeichnet, daß man auf einem vollständigen Medium einen Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kultiviert, in dem das Gen, das für die Expression eines Proteins von industriellem Interesse codiert, das Gen ist, das für ein Hirudin oder eine seiner natürlichen oder künstlichen Varianten codiert.

11. Verfahren zur Herstellung von Gamma-Interferon, dadurch gekennzeichnet, daß man auf einem vollständigen Medium einen Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kultiviert, in dem das Gen, das für die Expression eines Proteins von industriellem Interesse codiert, das Gen ist, das für Gamma-Interferon codiert.