JP2844191B2 - 外来性プラスミドを安定に有する細菌を用いる蛋白質の製造方法 - Google Patents
外来性プラスミドを安定に有する細菌を用いる蛋白質の製造方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、バクテリア中に含
まれるプラスミドベクターを安定化させる方法及び該方
法により得られる安定化発現プラスミドベクターを含有
する細菌に関する発明を基礎とするものであって、該細
菌を完全培地中で培養することを特徴とする産業上有用
な蛋白質の製造方法に関する。
まれるプラスミドベクターを安定化させる方法及び該方
法により得られる安定化発現プラスミドベクターを含有
する細菌に関する発明を基礎とするものであって、該細
菌を完全培地中で培養することを特徴とする産業上有用
な蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】組換えＤＮＡの技術を微生物による目的
分子の生産に実際に適用してみると、一般に組換えプラ
スミドが不安定であるという問題がある。
分子の生産に実際に適用してみると、一般に組換えプラ
スミドが不安定であるという問題がある。
【０００３】実験室で通常用いられるクローニング及び
発現ベクターは、通常マルチコピープラスミドであり、
それらの後代への安定した伝達は１つの細胞ゲノムあた
りの多数のプラスミドにより確保される（ジョーンズ(J
ones)ら、１９８０）。しかし、外来遺伝子のこれらの
プラスミドへの導入は、バクテリアの増殖サイクルの期
間に種々の程度の不安定性をもたらす。従って、工業的
生産工程では、１０００Ｌの培養物が必要であり、５０
世代以上の世代交代後の１０16個以上の細胞が必要とな
る。従って、バクテリア中のプラスミドの存在、ひいて
は外来分子（foreign molecule）の発現を確実にするた
めに、醗酵器内での培養が終了するまでバクテリア中の
プラスミドを安定化させることが必須である。
発現ベクターは、通常マルチコピープラスミドであり、
それらの後代への安定した伝達は１つの細胞ゲノムあた
りの多数のプラスミドにより確保される（ジョーンズ(J
ones)ら、１９８０）。しかし、外来遺伝子のこれらの
プラスミドへの導入は、バクテリアの増殖サイクルの期
間に種々の程度の不安定性をもたらす。従って、工業的
生産工程では、１０００Ｌの培養物が必要であり、５０
世代以上の世代交代後の１０16個以上の細胞が必要とな
る。従って、バクテリア中のプラスミドの存在、ひいて
は外来分子（foreign molecule）の発現を確実にするた
めに、醗酵器内での培養が終了するまでバクテリア中の
プラスミドを安定化させることが必須である。
【０００４】抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子
を組み込むことによりプラスミドを安定化させること
は、実験室で通常行なわれているが、下記の如き理由
で、工業的スケールでは適用できない。即ち、(i) 抗
生物質耐性菌株の使用は、環境に対して危険を呈する可
能性がある、(ii) 培養中に必要な抗生物質の量は生産
コストを有意に増加させる、(iii)抗生物質の使用は、
ヒト及び動物の治療で用いられる物質の生産においては
考えられない。
を組み込むことによりプラスミドを安定化させること
は、実験室で通常行なわれているが、下記の如き理由
で、工業的スケールでは適用できない。即ち、(i) 抗
生物質耐性菌株の使用は、環境に対して危険を呈する可
能性がある、(ii) 培養中に必要な抗生物質の量は生産
コストを有意に増加させる、(iii)抗生物質の使用は、
ヒト及び動物の治療で用いられる物質の生産においては
考えられない。
【０００５】従って、組換えプラスミドを保有するバク
テリアの選択のために他の方法を開発することが必要で
ある。既に使用されている数種のモデルは、同一の原理
に基づいている。即ち、宿主の欠失を補う性質をコード
するプラスミドの不存在下に宿主細胞が増殖することを
防ぐため、宿主細胞に突然変異（栄養素要求性突然変異
又はバクテリアに対して致死的な遺伝子の導入）を起こ
させるものである。
テリアの選択のために他の方法を開発することが必要で
ある。既に使用されている数種のモデルは、同一の原理
に基づいている。即ち、宿主の欠失を補う性質をコード
するプラスミドの不存在下に宿主細胞が増殖することを
防ぐため、宿主細胞に突然変異（栄養素要求性突然変異
又はバクテリアに対して致死的な遺伝子の導入）を起こ
させるものである。
【０００６】例えば、スコグマン(Skogman)及びニルソ
ン(Nilson)（１９８４及び１９８５）はプラスミドによ
り保有されるval S遺伝子による温度感受性val S突然変
異の相補性(complementation)を用いた。このモデルで
は、トリプトファンオペロンを保有するプラスミドの安
定性は非許容温度下で２００世代後も完全である。一
方、非選択温度条件下（３０℃）では、各世代に１．２
％のプラスミドの消失(loss)が観察される。
ン(Nilson)（１９８４及び１９８５）はプラスミドによ
り保有されるval S遺伝子による温度感受性val S突然変
異の相補性(complementation)を用いた。このモデルで
は、トリプトファンオペロンを保有するプラスミドの安
定性は非許容温度下で２００世代後も完全である。一
方、非選択温度条件下（３０℃）では、各世代に１．２
％のプラスミドの消失(loss)が観察される。
【０００７】ミワ(Miwa)等（１９８４）は、宿主株とし
て、ストレプトマイシン依存性（Ｓｍd）大腸菌（Ｅ．c
oli）突然変異体、及び表現型Ｓｍdを不顕化してストレ
プトマイシン非依存性株とする遺伝子を有するプラスミ
ド（ＳｍR株の ｒｐｓｌ）を用いて、９９％以上のプラ
スミド安定性を確立した。
て、ストレプトマイシン依存性（Ｓｍd）大腸菌（Ｅ．c
oli）突然変異体、及び表現型Ｓｍdを不顕化してストレ
プトマイシン非依存性株とする遺伝子を有するプラスミ
ド（ＳｍR株の ｒｐｓｌ）を用いて、９９％以上のプラ
スミド安定性を確立した。
【０００８】ハーシュバーガー(Hershberger)及びロス
テック(Rosteck)（１９８４）は、リプレッサーが欠失
されているプロファージλを溶原化するバクテリアを作
った。該細胞は、λｃＩリプレッサーを有するプラスミ
ドの存在下でのみ細胞溶解を免れることができる。
テック(Rosteck)（１９８４）は、リプレッサーが欠失
されているプロファージλを溶原化するバクテリアを作
った。該細胞は、λｃＩリプレッサーを有するプラスミ
ドの存在下でのみ細胞溶解を免れることができる。
【０００９】新規な選択モデルを、ｄａｐ+プラスミド
遺伝子と染色体突然変異体ｄａｐ-との相補性に基づき
開発した。該モデルはプラスミドを有する細胞のみの生
存を確保するものである。
遺伝子と染色体突然変異体ｄａｐ-との相補性に基づき
開発した。該モデルはプラスミドを有する細胞のみの生
存を確保するものである。
【００１０】ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、バクテ
リア細胞壁の成分であり、又アスパラギン酸塩からリジ
ンを生合成する過程での中間体でもある。ＤＡＰ生合成
のための酵素が欠失している細胞株は、最少培地では増
殖できない。リジンを培地へ添加すると増殖を開始する
が、しかし、細胞膜にＤＡＰを取り込まない細胞の溶解
をすぐにもたらす（ワーク（Work）１９５０−デービス
（Davis）等、１９７３）。
リア細胞壁の成分であり、又アスパラギン酸塩からリジ
ンを生合成する過程での中間体でもある。ＤＡＰ生合成
のための酵素が欠失している細胞株は、最少培地では増
殖できない。リジンを培地へ添加すると増殖を開始する
が、しかし、細胞膜にＤＡＰを取り込まない細胞の溶解
をすぐにもたらす（ワーク（Work）１９５０−デービス
（Davis）等、１９７３）。
【００１１】ＤＡＰ生合成のための酵素の欠失は、プラ
スミド上に、特に生産されるべき外来蛋白の発現ベクタ
ー上に、対応する遺伝子を導入することにより補償する
ことができる。バクテリアが該プラスミドを失う場合、
該バクテリアはｄａｐ-となり、もはや増殖できなくな
る。このモデルは、ＤＡＰを含有しない任意の培地、即
ち工業的スケールの生産に使用される任意の培地或いは
リジンが添加された任意の最少又は富培地にも適用でき
るという利点を有する。
スミド上に、特に生産されるべき外来蛋白の発現ベクタ
ー上に、対応する遺伝子を導入することにより補償する
ことができる。バクテリアが該プラスミドを失う場合、
該バクテリアはｄａｐ-となり、もはや増殖できなくな
る。このモデルは、ＤＡＰを含有しない任意の培地、即
ち工業的スケールの生産に使用される任意の培地或いは
リジンが添加された任意の最少又は富培地にも適用でき
るという利点を有する。
【００１２】又、このシステムはＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋
白質の合成を妨げないという利点がある。
白質の合成を妨げないという利点がある。
【００１３】ｄａｐＤ-株（テトラヒドロピコリン酸−
Ｎ−コハク酸転移酵素に対応する、リジンの生合成過程
の９種の遺伝子の１つ、遺伝子Ｄが欠失している）が構
築され、通常用いられる発現プラスミド（プロモーター
ＰL のコントロール下に発現する遺伝子を有する）上の
ｄａｐＤ遺伝子が導入される。選択条件下で該プラスミ
ドは少くとも１５０世代安定である。
Ｎ−コハク酸転移酵素に対応する、リジンの生合成過程
の９種の遺伝子の１つ、遺伝子Ｄが欠失している）が構
築され、通常用いられる発現プラスミド（プロモーター
ＰL のコントロール下に発現する遺伝子を有する）上の
ｄａｐＤ遺伝子が導入される。選択条件下で該プラスミ
ドは少くとも１５０世代安定である。
【００１４】リジンの生合成のための酵素をコードする
他の遺伝子（ｄａｐＡ）のプラスミド上でのクローニン
グは、リジンの生産増加を目的として既に実施されてい
る（ダウス−ル レヴェレンド（Dauce-Le Reverend）
等、１９８２）。しかし、該文献の著者等は、プラスミ
ドの安定性をコントロールすることは出来なかった。
他の遺伝子（ｄａｐＡ）のプラスミド上でのクローニン
グは、リジンの生産増加を目的として既に実施されてい
る（ダウス−ル レヴェレンド（Dauce-Le Reverend）
等、１９８２）。しかし、該文献の著者等は、プラスミ
ドの安定性をコントロールすることは出来なかった。
【００１５】大腸菌のｄａｐＤ遺伝子は、プラスミドｐ
ＢＲ３２２中に既にクローン化されており、そのヌクレ
オチド配列はリチャウド(Richaud）等（１９８４）によ
り公表されている。しかし、この研究の目的は遺伝子ｄ
ａｐＤの調節を研究することだけであった。
ＢＲ３２２中に既にクローン化されており、そのヌクレ
オチド配列はリチャウド(Richaud）等（１９８４）によ
り公表されている。しかし、この研究の目的は遺伝子ｄ
ａｐＤの調節を研究することだけであった。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、当該発明者
の発明であるバクテリア中に含まれるプラスミドベクタ
ーを安定化させる方法に基づいて、該方法によって得ら
れるプラスミドベクターを安定に含有するバクテリアか
ら産業上有用な蛋白質を製造する方法を提供することを
目的とする。
の発明であるバクテリア中に含まれるプラスミドベクタ
ーを安定化させる方法に基づいて、該方法によって得ら
れるプラスミドベクターを安定に含有するバクテリアか
ら産業上有用な蛋白質を製造する方法を提供することを
目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
重ねた結果、宿主バクテリアとして ｄａｐ-染色体変異
を含むものを用い、且つプラスミドベクターとしてｄａ
ｐ+遺伝子及び産業上有用な蛋白質の発現を確実にする
要素を有するものを用いることによって、バクテリア中
にプラスミドベクターを安定化させることができること
を見出し、更にかかる方法に基づいて上記課題を解決す
ることができることを見出して本発明を完成するに至っ
た。
重ねた結果、宿主バクテリアとして ｄａｐ-染色体変異
を含むものを用い、且つプラスミドベクターとしてｄａ
ｐ+遺伝子及び産業上有用な蛋白質の発現を確実にする
要素を有するものを用いることによって、バクテリア中
にプラスミドベクターを安定化させることができること
を見出し、更にかかる方法に基づいて上記課題を解決す
ることができることを見出して本発明を完成するに至っ
た。
【００１８】即ち、本発明は産業上有用な蛋白質をコー
ドする遺伝子、特にヒルジン又はその天然或いは合成の
変異型（variant）の１つ、カテコール２，３オキシゲ
ナーゼ（以下、単にＣ2,3Ｏともいう。）、γ−インタ
ーフェロン又はα−アンチトリプシンをコードする遺伝
子及び宿主バクテリア中で該遺伝子を発現させる要素を
更に有するプラスミドベクター、並びにこれらの種々の
ベクターにより形質転換された細胞株に関し、さらに該
形質転換株を完全培地中で培養し、培養後に蛋白質を回
収することによる産業上有用な工業的蛋白質の製造法に
関する。
ドする遺伝子、特にヒルジン又はその天然或いは合成の
変異型（variant）の１つ、カテコール２，３オキシゲ
ナーゼ（以下、単にＣ2,3Ｏともいう。）、γ−インタ
ーフェロン又はα−アンチトリプシンをコードする遺伝
子及び宿主バクテリア中で該遺伝子を発現させる要素を
更に有するプラスミドベクター、並びにこれらの種々の
ベクターにより形質転換された細胞株に関し、さらに該
形質転換株を完全培地中で培養し、培養後に蛋白質を回
収することによる産業上有用な工業的蛋白質の製造法に
関する。
【００１９】より具体的には、本発明は次の項１〜８を
含む産業上有用な蛋白質の製造方法である。
含む産業上有用な蛋白質の製造方法である。
【００２０】項１．ｄａｐＤ染色体遺伝子の変異を含む
細菌であって、インタクトなｄａｐＤ遺伝子、産業上有
用な蛋白質をコードする遺伝子及び宿主細菌中での発現
を確保するための要素を含有するプラスミドベクターに
よって形質転換されてなる細菌を、完全培地中で培養す
ることを特徴とする当該産業上有用な蛋白質を製造する
方法。
細菌であって、インタクトなｄａｐＤ遺伝子、産業上有
用な蛋白質をコードする遺伝子及び宿主細菌中での発現
を確保するための要素を含有するプラスミドベクターに
よって形質転換されてなる細菌を、完全培地中で培養す
ることを特徴とする当該産業上有用な蛋白質を製造する
方法。
【００２１】項２．ｄａｐＤ染色体の変異がｄａｐＤ遺
伝子の少なくとも一部の欠失であり、プラスミドベクタ
ーがインタクトなｄａｐＤ遺伝子を含有するものである
ことを特徴とする、項１記載の産業上有用な蛋白質を製
造する方法。
伝子の少なくとも一部の欠失であり、プラスミドベクタ
ーがインタクトなｄａｐＤ遺伝子を含有するものである
ことを特徴とする、項１記載の産業上有用な蛋白質を製
造する方法。
【００２２】項３．欠失がｄａｐＤ遺伝子の全欠失であ
ることを特徴とする、項２記載の産業上有用な蛋白質を
製造する方法。
ることを特徴とする、項２記載の産業上有用な蛋白質を
製造する方法。
【００２３】項４．プラスミドベクターがモノマー状態
を保持する配列を有するものであることを特徴とする、
項１乃至３のいずれかに記載の産業上有用な蛋白質を製
造する方法。
を保持する配列を有するものであることを特徴とする、
項１乃至３のいずれかに記載の産業上有用な蛋白質を製
造する方法。
【００２４】項５．モノマー状態を保持する配列が“ｃ
ｅｒ”配列であることを特徴とする項４記載の産業上有
用な蛋白質を製造する方法。
ｅｒ”配列であることを特徴とする項４記載の産業上有
用な蛋白質を製造する方法。
【００２５】項６．宿主細菌がＥ．ｃｏｌｉ株であるこ
とを特徴とする項１乃至５のいずれかに記載の産業上有
用な蛋白質を製造する方法。
とを特徴とする項１乃至５のいずれかに記載の産業上有
用な蛋白質を製造する方法。
【００２６】項７．産業上有用な蛋白質をコードする遺
伝子が、ヒルジン類、γ−インターフェロン、カテコー
ル２，３−オキシゲナーゼ及びα−アンチトリプシンか
らなる群から選択されるいずれかの蛋白質をコードする
遺伝子であることを特徴とする項１乃至６のいずれかに
記載の産業上有用な蛋白質を製造する方法。
伝子が、ヒルジン類、γ−インターフェロン、カテコー
ル２，３−オキシゲナーゼ及びα−アンチトリプシンか
らなる群から選択されるいずれかの蛋白質をコードする
遺伝子であることを特徴とする項１乃至６のいずれかに
記載の産業上有用な蛋白質を製造する方法。
【００２７】項８．前記ヒルジン類をコードする遺伝子
が、ヒルジン又はその天然若しくは人工的な変異型をコ
ードする遺伝子であることを特徴とする項７記載の産業
上有用な蛋白質を製造する方法。
が、ヒルジン又はその天然若しくは人工的な変異型をコ
ードする遺伝子であることを特徴とする項７記載の産業
上有用な蛋白質を製造する方法。
【００２８】
【発明の実施の形態】本発明は、バクテリア中に含まれ
るプラスミドベクターを安定化させる方法を基礎とする
ものである。当該方法は、該バクテリアがｄａｐ-染色
体変異を含み、プラスミドベクターがｄａｐ+遺伝子を
有することを特徴とする方法である。
るプラスミドベクターを安定化させる方法を基礎とする
ものである。当該方法は、該バクテリアがｄａｐ-染色
体変異を含み、プラスミドベクターがｄａｐ+遺伝子を
有することを特徴とする方法である。
【００２９】ここでｄａｐ-染色体変異としては、ｄａ
ｐＤ-を用いることが望ましい。しかしＤＡＰ生合成の
ための酵素をコードする他の遺伝子も、対応する遺伝子
を保有するベクタープラスミドを用いる限り使用でき
る。ｄａｐＤ-株の場合、プラスミドに挿入されるべき
遺伝子はｄａｐＤである。
ｐＤ-を用いることが望ましい。しかしＤＡＰ生合成の
ための酵素をコードする他の遺伝子も、対応する遺伝子
を保有するベクタープラスミドを用いる限り使用でき
る。ｄａｐＤ-株の場合、プラスミドに挿入されるべき
遺伝子はｄａｐＤである。
【００３０】当該ｄａｐ安定化システムは、蛋白質の発
現を妨げない。従って、どのような発現ベクターをも用
いることができる。
現を妨げない。従って、どのような発現ベクターをも用
いることができる。
【００３１】ｄａｐＤ+プラスミドと染色体の変異され
たｄａｐＤ遺伝子との間の相同性組換えの可能性を回避
するためには、ｄａｐＤ遺伝子を染色体から実質的に欠
失させることが望ましい。
たｄａｐＤ遺伝子との間の相同性組換えの可能性を回避
するためには、ｄａｐＤ遺伝子を染色体から実質的に欠
失させることが望ましい。
【００３２】従って、上記のプラスミド安定化方法は、
より詳細には、ｄａｐ染色体変異がｄａｐＤ遺伝子の少
くとも一部の欠失であり、プラスミドベクターがインタ
クトなｄａｐＤ遺伝子を有することを特徴とする方法で
ある。
より詳細には、ｄａｐ染色体変異がｄａｐＤ遺伝子の少
くとも一部の欠失であり、プラスミドベクターがインタ
クトなｄａｐＤ遺伝子を有することを特徴とする方法で
ある。
【００３３】いかなる組換えをも回避するためには、ｄ
ａｐＤ遺伝子の完全な欠失が最も好ましい解決法である
ことは明らかである。
ａｐＤ遺伝子の完全な欠失が最も好ましい解決法である
ことは明らかである。
【００３４】しかし、選択システムは、それがいかに強
力であっても、プラスミドの内在的な不安定性を克服す
ることはできない。このため、遺伝学的方法により発現
ベクターの安定性を増大させるためには、該ベクターを
モノマー状態に維持する配列、特に、“cer”配列をベ
クターに導入することができる。
力であっても、プラスミドの内在的な不安定性を克服す
ることはできない。このため、遺伝学的方法により発現
ベクターの安定性を増大させるためには、該ベクターを
モノマー状態に維持する配列、特に、“cer”配列をベ
クターに導入することができる。
【００３５】上記“cer”（サマーズ（Summers）及びシ
ャーラット(Sherrat），１９８４）は、いかなる蛋白質
もコードせず、これが存在するとプラスミドをモノマー
状態に維持することを促進させる要素である。プラスミ
ドが多量体（multimer）を形成する場合、嬢細胞（daug
hter cells）に分配され得るユニット数が減少し、プラ
スミドを持たない細胞が得られ易くなる。従って、cer
はモノマー状態にプラスミドを維持することにより、プ
ラスミドを間接的に安定化させる。
ャーラット(Sherrat），１９８４）は、いかなる蛋白質
もコードせず、これが存在するとプラスミドをモノマー
状態に維持することを促進させる要素である。プラスミ
ドが多量体（multimer）を形成する場合、嬢細胞（daug
hter cells）に分配され得るユニット数が減少し、プラ
スミドを持たない細胞が得られ易くなる。従って、cer
はモノマー状態にプラスミドを維持することにより、プ
ラスミドを間接的に安定化させる。
【００３６】以下の記載において、発現システムはファ
ージλの左向きのプロモーターＰLを含有する。しか
し、本発明のバクテリア中で活性であるのは別のプロモ
ーターであってもよい。異種蛋白質（heterologous pro
tein）の発現要素について完全な記載を行なっていない
のはこのためである。この種のプラスミドは現在広く知
られている。単に、ｄａｐＤ又は他の遺伝子をプラスミ
ドベクターの非本質的部位に挿入することが望ましい。
ージλの左向きのプロモーターＰLを含有する。しか
し、本発明のバクテリア中で活性であるのは別のプロモ
ーターであってもよい。異種蛋白質（heterologous pro
tein）の発現要素について完全な記載を行なっていない
のはこのためである。この種のプラスミドは現在広く知
られている。単に、ｄａｐＤ又は他の遺伝子をプラスミ
ドベクターの非本質的部位に挿入することが望ましい。
【００３７】本発明に記載するプラスミドは、ｄａｐＤ
-とされた任意の大腸菌株を形質転換するのに使用する
ことができる。
-とされた任意の大腸菌株を形質転換するのに使用する
ことができる。
【００３８】本発明に記載する方法によれば、発現プラ
スミドが完全培地中で、例えば抗生物質による選択圧、
又は特定のアミノ酸を含有しない培地を必要とせずに安
定である細菌株が得られる。更に、本発明に記載する方
法はプラスミドを失ってしまったバクテリアに対し、対
向選択（counter selection）を及ぼす。
スミドが完全培地中で、例えば抗生物質による選択圧、
又は特定のアミノ酸を含有しない培地を必要とせずに安
定である細菌株が得られる。更に、本発明に記載する方
法はプラスミドを失ってしまったバクテリアに対し、対
向選択（counter selection）を及ぼす。
【００３９】本発明は、ｄａｐ+遺伝子及び産業上有用
な蛋白質の発現を確実にする要素を持つプラスミドベク
ターにより形質転換された菌株、特にｄａｐ-大腸菌株
（Ｅ．coli）に関する。
な蛋白質の発現を確実にする要素を持つプラスミドベク
ターにより形質転換された菌株、特にｄａｐ-大腸菌株
（Ｅ．coli）に関する。
【００４０】従って、本発明は、バクテリアから産業上
有用な蛋白質を製造する方法であって、上記プラスミド
ベクターにより形質転換されたバクテリアを完全培地中
で培養することを特徴とする方法である。当該プラスミ
ドベクターは、更に該産業上有用な蛋白質をコードする
遺伝子及び宿主バクテリア中でのこの蛋白質発現のため
の調節シグナルを有する。
有用な蛋白質を製造する方法であって、上記プラスミド
ベクターにより形質転換されたバクテリアを完全培地中
で培養することを特徴とする方法である。当該プラスミ
ドベクターは、更に該産業上有用な蛋白質をコードする
遺伝子及び宿主バクテリア中でのこの蛋白質発現のため
の調節シグナルを有する。
【００４１】下記実施例は、ｄａｐ-バクテリア中での
ｄａｐＤ遺伝子を有するプラスミドの安定性を、Ａｍｐ
r遺伝子を有するプラスミドと比較して示すものであ
る。
ｄａｐＤ遺伝子を有するプラスミドの安定性を、Ａｍｐ
r遺伝子を有するプラスミドと比較して示すものであ
る。
【００４２】更に、ｄａｐＤ遺伝子を保有するこれらプ
ラスミドは、ヒルジン及びγ−インターフェロンをコー
ドする遺伝子を発現するために用いることもできた。
ラスミドは、ヒルジン及びγ−インターフェロンをコー
ドする遺伝子を発現するために用いることもできた。
【００４３】これら２種の遺伝子はファージλプロモー
ターＰLの制御下に置かれており、宿主大腸菌は温度感
受性リプレッサーＣＩ８５７を有する。このシステム
は、温度を上げることにより、ＰLによりコントロール
された遺伝子の発現を誘導（induce）する。
ターＰLの制御下に置かれており、宿主大腸菌は温度感
受性リプレッサーＣＩ８５７を有する。このシステム
は、温度を上げることにより、ＰLによりコントロール
された遺伝子の発現を誘導（induce）する。
【００４４】リプレッサーＣＩ８５７を有する大腸菌株
ＴＧＥ９００をｄａｐＤ-になるよう変異させ、菌株Ｔ
ＧＥ７６１５又はＴＧＥ７２１４を得た。また、株Ｎ５
９６９を変異させ、ＴＧＥ７３０３とした。
ＴＧＥ９００をｄａｐＤ-になるよう変異させ、菌株Ｔ
ＧＥ７６１５又はＴＧＥ７２１４を得た。また、株Ｎ５
９６９を変異させ、ＴＧＥ７３０３とした。
【００４５】次いで、下記プラスミドを添付図面に従い
調製した。
調製した。
【００４６】
【表１】
【００４７】なお、プラスミドｐＴＧ７９０、ｐＴＧ７
９２、ｐＴＧ７９２２、ｐＴＧ７６９、ｐＴＧ７４０
６、ｐＴＧ７６７５及びｐＴＧ７９１４のダイアグラム
及び制限酵素地図をそれぞれ、図１０、図１１、図１
２、図１３、図１４、図１６及び図１７に示す。
９２、ｐＴＧ７９２２、ｐＴＧ７６９、ｐＴＧ７４０
６、ｐＴＧ７６７５及びｐＴＧ７９１４のダイアグラム
及び制限酵素地図をそれぞれ、図１０、図１１、図１
２、図１３、図１４、図１６及び図１７に示す。
【００４８】方法
特に断らない限り、各種酵素は公知の方法に従って用い
られる。
られる。
【００４９】形質転換
コンピテント細胞がハナハン(Hanahan)(１９８３）の方
法に従って製造された。その受容能は、細胞株ＲＬ５８
で１０4〜１０5形質転換体／μｇＤＮであり（ボレン(B
ollen）等、１９７９）、ＴＧＥ７６１５、ＴＧＥ７２
１４又はＴＧＥ７３０３株で１０5〜１０8形質転換体／
μｇＤＮである。
法に従って製造された。その受容能は、細胞株ＲＬ５８
で１０4〜１０5形質転換体／μｇＤＮであり（ボレン(B
ollen）等、１９７９）、ＴＧＥ７６１５、ＴＧＥ７２
１４又はＴＧＥ７３０３株で１０5〜１０8形質転換体／
μｇＤＮである。
【００５０】一般に、細胞株に導入されるべきプラスミ
ドを含有するＤＮＡ試料の適当に希釈された１〜１０μ
ｌ溶液を、コンピテント細胞株のストック０．２ｍｌに
添加する。該コンピテント細胞を０℃で、１５分間ＤＮ
Ａと反応させ、次いで３７℃で９０秒間インキュベート
する。５分間０℃に戻し、ＬＢ培地０．８ｍｌを添加す
る。細胞株ＲＬ５８又はＴＧＥ７６１５については、該
培地は８γ／ｍｌの割合でＤＡＰを含有していなければ
ならない。このことは、ｄａｐＤ-細胞の増殖に必要で
あり、ｄａｐＤ遺伝子を持つプラスミドを含有している
細胞についてさえも必要である。細胞は一般に強く攪拌
しながら３０℃でインキュベートされる。（但し、プラ
スミドがプロモーターＰLを有しない場合は３７℃に保
持される）。インキュベーション時間は６０分間である
が、株ＴＧＥ７６１５を３０℃で培養する場合は９０分
間に延長できる。
ドを含有するＤＮＡ試料の適当に希釈された１〜１０μ
ｌ溶液を、コンピテント細胞株のストック０．２ｍｌに
添加する。該コンピテント細胞を０℃で、１５分間ＤＮ
Ａと反応させ、次いで３７℃で９０秒間インキュベート
する。５分間０℃に戻し、ＬＢ培地０．８ｍｌを添加す
る。細胞株ＲＬ５８又はＴＧＥ７６１５については、該
培地は８γ／ｍｌの割合でＤＡＰを含有していなければ
ならない。このことは、ｄａｐＤ-細胞の増殖に必要で
あり、ｄａｐＤ遺伝子を持つプラスミドを含有している
細胞についてさえも必要である。細胞は一般に強く攪拌
しながら３０℃でインキュベートされる。（但し、プラ
スミドがプロモーターＰLを有しない場合は３７℃に保
持される）。インキュベーション時間は６０分間である
が、株ＴＧＥ７６１５を３０℃で培養する場合は９０分
間に延長できる。
【００５１】次に、決められた容量（０．１ｍｌ）をＬ
Ｂ固体培地上に塗布する。アンピシリン耐性のための遺
伝子を有するプラスミドの場合、クローンは１００γ／
ｍｌのアンピシリンを添加することにより選択される。
ｄａｐＤ遺伝子を有するクローンは概してｄａｐＤ-で
ある培養物から、他の添加物を含有しないＬＢ培地上で
選択される。ディッシュは、３０℃で２４時間インキュ
ベートされる。次いで、コロニーをつまようじで３ｍｌ
のＬＢ培地に移し、３０℃で一夜増殖させた後、プラス
ミドを単離し、適当な制限酵素で消化後、アガロースゲ
ル上でその構造を確認する。
Ｂ固体培地上に塗布する。アンピシリン耐性のための遺
伝子を有するプラスミドの場合、クローンは１００γ／
ｍｌのアンピシリンを添加することにより選択される。
ｄａｐＤ遺伝子を有するクローンは概してｄａｐＤ-で
ある培養物から、他の添加物を含有しないＬＢ培地上で
選択される。ディッシュは、３０℃で２４時間インキュ
ベートされる。次いで、コロニーをつまようじで３ｍｌ
のＬＢ培地に移し、３０℃で一夜増殖させた後、プラス
ミドを単離し、適当な制限酵素で消化後、アガロースゲ
ル上でその構造を確認する。
【００５２】ｄａｐＤ遺伝子を有するプラスミドは、ｄ
ａｐＤ-変異を保有する任意の大腸菌（例えばＲＬ５
８、ＴＧＥ７６１５、ＴＧＥ７２１４又はＴＧＥ７３０
３）中で形質転換することができる。該プラスミドが更
にバクテリオファージλプロモーターＰLを有する場合
は、プラスミド上又は染色体中のいずれかでバクテリオ
ファージλリプレッサーｃＩ８５７或いはｃＩ及びＲｅ
ｃ突然変異（例えばＲｅｃＡ４４１）を発現するｄａｐ
Ｄ-大腸菌株中で必然的に形質転換されねばならない。
ａｐＤ-変異を保有する任意の大腸菌（例えばＲＬ５
８、ＴＧＥ７６１５、ＴＧＥ７２１４又はＴＧＥ７３０
３）中で形質転換することができる。該プラスミドが更
にバクテリオファージλプロモーターＰLを有する場合
は、プラスミド上又は染色体中のいずれかでバクテリオ
ファージλリプレッサーｃＩ８５７或いはｃＩ及びＲｅ
ｃ突然変異（例えばＲｅｃＡ４４１）を発現するｄａｐ
Ｄ-大腸菌株中で必然的に形質転換されねばならない。
【００５３】
【実施例】以下、本発明の内容を以下の実施例を用いて
具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定される
ものではない。
具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定される
ものではない。
【００５４】実施例１ 大腸菌株ＴＧＥ９００における変異されたｄａｐＤ -遺
伝子の導入 大腸菌宿主ＴＧＥ９００を既知のｄａｐＤ-変異株ＲＬ
５８と接合（conjugation ）させて、ｄａｐ-とした。
伝子の導入 大腸菌宿主ＴＧＥ９００を既知のｄａｐＤ-変異株ＲＬ
５８と接合（conjugation ）させて、ｄａｐ-とした。
【００５５】株ＴＧＥ９００はゴッテスマン(Gottesma
n）等（１９８０）により記載された株Ｎ４８３０の誘
導体であり、その特性は次の如くである： su- Ｆ- his ilv bio（λ cＩ８５７Δ Ｂam
Δ ＨＩ）Ｓmr。
n）等（１９８０）により記載された株Ｎ４８３０の誘
導体であり、その特性は次の如くである： su- Ｆ- his ilv bio（λ cＩ８５７Δ Ｂam
Δ ＨＩ）Ｓmr。
【００５６】該株は、外来遺伝子がλプロモーターＰL
の制御下におかれている発現ベクター用の宿主として一
般に用いられている。これは、該バクテリアが有する温
度感受性リプレッサー（λcＩ８５７）を不活性化させ
る温度上昇（３７℃以上）により、自由に発現を誘導で
きるものである。
の制御下におかれている発現ベクター用の宿主として一
般に用いられている。これは、該バクテリアが有する温
度感受性リプレッサー（λcＩ８５７）を不活性化させ
る温度上昇（３７℃以上）により、自由に発現を誘導で
きるものである。
【００５７】ｄａｐ-ＲＬ５８（met Ｂ ｄａｐＤ2 me
t Ｄ２７９ Ｈfr Ｐ4 Ｘ ）株は、ボレン（Bolle
n）等（１９７９）により記載されている。
t Ｄ２７９ Ｈfr Ｐ4 Ｘ ）株は、ボレン（Bolle
n）等（１９７９）により記載されている。
【００５８】この菌株を出発原料として、トリメトプリ
ム耐性の自然突然変異体が選択された（トリメトプリム
２ガンマ／ｍｌを含有するディッシュ上に該菌株を塗り
広げ、４ガンマ／ｍｌのトリメトプリムを含有する培地
より選択されたコロニーの耐性を確認した後に）。事
実、この耐性をコードする遺伝子は、ｄａｐＤ-突然変
異に充分類似しているので、接合後、受容株がトリメト
プリム耐性となった場合は、それは同時にｄａｐＤ-と
もなる。
ム耐性の自然突然変異体が選択された（トリメトプリム
２ガンマ／ｍｌを含有するディッシュ上に該菌株を塗り
広げ、４ガンマ／ｍｌのトリメトプリムを含有する培地
より選択されたコロニーの耐性を確認した後に）。事
実、この耐性をコードする遺伝子は、ｄａｐＤ-突然変
異に充分類似しているので、接合後、受容株がトリメト
プリム耐性となった場合は、それは同時にｄａｐＤ-と
もなる。
【００５９】耐性菌株はＴＧＥ７５５と称された。その
特徴は、Ｈfr ｄａｐＤ- Ｔｍｐrである。
特徴は、Ｈfr ｄａｐＤ- Ｔｍｐrである。
【００６０】ＴＧＥ９００株（Ｆ- Ｓｍres ｄａｐ+）
及びＴＧＥ７５５の接合後（１５分間後に停止）、ＤＡ
Ｐ、ストレプトマイシン及びトリメトプリムを含有する
最少培地に塗布することにより、Ｓｍr Ｔｍｐrコロニ
ーが選択される。選択された株のｄａｐ-の性質及びＤ
ＡＰを含有する最少培地中の親株（his ilv）における
栄養素要求性変異の存在が、ＬＢ培地上で確認される。
及びＴＧＥ７５５の接合後（１５分間後に停止）、ＤＡ
Ｐ、ストレプトマイシン及びトリメトプリムを含有する
最少培地に塗布することにより、Ｓｍr Ｔｍｐrコロニ
ーが選択される。選択された株のｄａｐ-の性質及びＤ
ＡＰを含有する最少培地中の親株（his ilv）における
栄養素要求性変異の存在が、ＬＢ培地上で確認される。
【００６１】一つの菌株（his ilv dap-）が選択され
た：ＴＧＥ７６１５。
た：ＴＧＥ７６１５。
【００６２】実施例２ 大腸菌ｄａｐＤ遺伝子を有するプラスミドベクターの構
築（図１） ａ）１２の制限部位をもつポリリンカーを有する多回使
用のクローニングプラスミドの構築 構築は、ヌクレオチド１０８９から２４９１を除去する
ことにより、ｐＢＲ３２２から誘導されたｐＭＬ2プラ
スミド（ラスキー(Lusky）及びボッチャン(Botchan），
１９８１）を出発物質として開始した。該プラスミドは
ｐＢＲ３２２の複製起点及びβ−ラクタマーゼ遺伝子
（アンピシリン耐性）を有していた。
築（図１） ａ）１２の制限部位をもつポリリンカーを有する多回使
用のクローニングプラスミドの構築 構築は、ヌクレオチド１０８９から２４９１を除去する
ことにより、ｐＢＲ３２２から誘導されたｐＭＬ2プラ
スミド（ラスキー(Lusky）及びボッチャン(Botchan），
１９８１）を出発物質として開始した。該プラスミドは
ｐＢＲ３２２の複製起点及びβ−ラクタマーゼ遺伝子
（アンピシリン耐性）を有していた。
【００６３】ＰstＩ酵素認識配列は、エタンスルホネー
トで誘発されたＰstＩ°突然変異（ヴイエィラ(Vieir
a）及びメシング(Messing）、１９８２）を有するｐＵ
Ｃ８のＡhaIII−ＡhaIIIフラグメントを、ｐＭＬ2の２
つのＡhaIII部位の間に挿入することにより除かれた。
これにより、ｐＭＬ2から１９塩基対が欠失される。得
られたプラスミドｐＴＧ１９０は、ｐＵＣ８のＰstＩ°
変異を保有する。
トで誘発されたＰstＩ°突然変異（ヴイエィラ(Vieir
a）及びメシング(Messing）、１９８２）を有するｐＵ
Ｃ８のＡhaIII−ＡhaIIIフラグメントを、ｐＭＬ2の２
つのＡhaIII部位の間に挿入することにより除かれた。
これにより、ｐＭＬ2から１９塩基対が欠失される。得
られたプラスミドｐＴＧ１９０は、ｐＵＣ８のＰstＩ°
変異を保有する。
【００６４】ＢglIIリンカー（５′−ｄＣＡＧＡＴＣＴ
Ｇ−３′；コラボラテイブ リサーチ(Collaborative R
esearch））を、ラセ(Lathe）等（１９８４）により記
載された“リンカー テイリング(linker tailing)”法
により、ＮruＩ部位にのみ挿入した。得られた構築物
は、ｐＴＧ１９１である。
Ｇ−３′；コラボラテイブ リサーチ(Collaborative R
esearch））を、ラセ(Lathe）等（１９８４）により記
載された“リンカー テイリング(linker tailing)”法
により、ＮruＩ部位にのみ挿入した。得られた構築物
は、ｐＴＧ１９１である。
【００６５】ｐＴＧ１９１を、ＥcoＲＩ及びＢglIIで開
環し（これはテトラサイクリン耐性遺伝子を欠失す
る）、１２の制限酵素認識配列を含有するポリリンカー
を持つファージＭ１３ＴＧ１３１（キーニー(Kieny）
他、１９８３）のＥcoＲＩ−ＢglIIセグメントと再リゲ
ートした。
環し（これはテトラサイクリン耐性遺伝子を欠失す
る）、１２の制限酵素認識配列を含有するポリリンカー
を持つファージＭ１３ＴＧ１３１（キーニー(Kieny）
他、１９８３）のＥcoＲＩ−ＢglIIセグメントと再リゲ
ートした。
【００６６】得られたプラスミドは、ｐＴＧ１９２であ
る。
る。
【００６７】ｂ）ｐＴＧ１９２プラスミドにおけるｄａ
ｐＤ遺伝子のクローニング 大腸菌のｄａｐＤ染色体遺伝子をプラスミドｐＡＣＹＣ
１８４内に挿入し、ｐＤＢ６を得た（ベンディアク(Ben
diak）及びフリーセン(Friesen）、１９８１）。該ｄａ
ｐＤ遺伝子を、１.３−kb ＡluＩフラグメントの形で
ｐＤＢ６から回収し、ｐＴＧ１９２のＥcoＲＩ部位に挿
入した（ＥcoＲＩ末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノー(Klenow）フラグメントで予め処理され、修復され
ている）。
ｐＤ遺伝子のクローニング 大腸菌のｄａｐＤ染色体遺伝子をプラスミドｐＡＣＹＣ
１８４内に挿入し、ｐＤＢ６を得た（ベンディアク(Ben
diak）及びフリーセン(Friesen）、１９８１）。該ｄａ
ｐＤ遺伝子を、１.３−kb ＡluＩフラグメントの形で
ｐＤＢ６から回収し、ｐＴＧ１９２のＥcoＲＩ部位に挿
入した（ＥcoＲＩ末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレ
ノー(Klenow）フラグメントで予め処理され、修復され
ている）。
【００６８】得られたプラスミドより、単一のＥcoＲＩ
部位が再構築されているｐＴＧ７６４を選択する。こう
して、ｐＴＧ７６４は、ｄａｐＤ遺伝子及びｐＴＧ１９
２の（当初はｐＵＣ８の）アンピシリン耐性遺伝子を持
つ。
部位が再構築されているｐＴＧ７６４を選択する。こう
して、ｐＴＧ７６４は、ｄａｐＤ遺伝子及びｐＴＧ１９
２の（当初はｐＵＣ８の）アンピシリン耐性遺伝子を持
つ。
【００６９】実施例３ ｄａｐＤ及びＡｍｐ r遺伝子を有するヒルジンの発現プ
ラスミド（図２） フランス国特許第８４／０４７５５号に記載のｐＴＧ７
２０プラスミドは、λプロモーターＰLのコントロール
下にあるヒルジン遺伝子を本来有する。
ラスミド（図２） フランス国特許第８４／０４７５５号に記載のｐＴＧ７
２０プラスミドは、λプロモーターＰLのコントロール
下にあるヒルジン遺伝子を本来有する。
【００７０】プラスミドｐＴＧ７２０をＢglII及びＢgl
Ｉで消化し、ヒルジン遺伝子及びａｍｐr遺伝子の一部
を保有する２.７４−kbのフラグメントを得る。該フラ
グメントをホスファターゼで処理し、ｄａｐＤ遺伝子及
び上記ａｍｐr遺伝子のもう片方のフラグメントを持つ
プラスミドｐＴＧ７６４のＢglII−ＢglＩフラグメント
と再リゲートする。得られたプラスミドｐＴＧ７７１
は、再構築された完全なａｍｐr遺伝子、ｄａｐＤ遺伝
子及びヒルジンをコードする遺伝子を含有する。
Ｉで消化し、ヒルジン遺伝子及びａｍｐr遺伝子の一部
を保有する２.７４−kbのフラグメントを得る。該フラ
グメントをホスファターゼで処理し、ｄａｐＤ遺伝子及
び上記ａｍｐr遺伝子のもう片方のフラグメントを持つ
プラスミドｐＴＧ７６４のＢglII−ＢglＩフラグメント
と再リゲートする。得られたプラスミドｐＴＧ７７１
は、再構築された完全なａｍｐr遺伝子、ｄａｐＤ遺伝
子及びヒルジンをコードする遺伝子を含有する。
【００７１】該プラスミドにより形質転換されたＴＧＥ
７６１５のコロニーをＬＢ培地（ｄａｐ+性に対する選
択）又はＬＢ＋アンピシリン培地上で選択する。
７６１５のコロニーをＬＢ培地（ｄａｐ+性に対する選
択）又はＬＢ＋アンピシリン培地上で選択する。
【００７２】誘導（induction）後、上記形質転換体は
ヒルジンを産生する。
ヒルジンを産生する。
【００７３】実施例４ ｄａｐＤ遺伝子を含有し、Ａｍｐ r遺伝子を含有しない
ヒルジンの発現プラスミド（図３） 出発プラスミドはｐＴＧ７７１である。
ヒルジンの発現プラスミド（図３） 出発プラスミドはｐＴＧ７７１である。
【００７４】Ａｍｐrをコードする遺伝子の３′末端を
含有する小さなフラグメントを除去するため、ＡhaIII
で消化を行ない、ＥcoＲＩ“リンカー”（ＣＣＧＡＡＴ
ＴＣＧＧ）の存在下リゲーションによりプラスミドを再
び閉じる。こうして、プラスミドｐＴＧ７７５を得る。
含有する小さなフラグメントを除去するため、ＡhaIII
で消化を行ない、ＥcoＲＩ“リンカー”（ＣＣＧＡＡＴ
ＴＣＧＧ）の存在下リゲーションによりプラスミドを再
び閉じる。こうして、プラスミドｐＴＧ７７５を得る。
【００７５】ＥcoＲＩ消化後、リゲーションにより、Ａ
ｍｐrをコードする遺伝子が完全に除去される。こうし
てプラスミドｐＴＧ７７６を得る。
ｍｐrをコードする遺伝子が完全に除去される。こうし
てプラスミドｐＴＧ７７６を得る。
【００７６】このプラスミドにより形質転換されたバク
テリアＴＧＥ７６１５は、無添加のＬＢ培地上で選択さ
れる（ｄａｐ+に対する選択）。誘導後、この形質転換
株はヒルジンを産生する。
テリアＴＧＥ７６１５は、無添加のＬＢ培地上で選択さ
れる（ｄａｐ+に対する選択）。誘導後、この形質転換
株はヒルジンを産生する。
【００７７】実施例５
（１）ｄａｐＤ遺伝子を有し、Ａｍｐ r遺伝子を有しな
いプラスミドの構築（図４） 出発プラスミドは、プラスミドｐＴＧ１９２である。
いプラスミドの構築（図４） 出発プラスミドは、プラスミドｐＴＧ１９２である。
【００７８】ＳmaＩ及びＡhaIIIで消化し、ホスファタ
ーゼで処理後、０.９５−kbのベクターフラグメントを
単離し、ｄａｐＤ遺伝子を含有するｐＤＢ６の１.３−k
b ＡluＩフラグメントとリゲートする。従って、ａｍ
ｐr遺伝子は完全に欠失される。ＴＧＥ７６１５株をこ
の新しいプラスミドで形質転換し、ＬＢ培地上で選択を
行ない、ｄａｐＤ遺伝子を保有するクローンを得る。
ーゼで処理後、０.９５−kbのベクターフラグメントを
単離し、ｄａｐＤ遺伝子を含有するｐＤＢ６の１.３−k
b ＡluＩフラグメントとリゲートする。従って、ａｍ
ｐr遺伝子は完全に欠失される。ＴＧＥ７６１５株をこ
の新しいプラスミドで形質転換し、ＬＢ培地上で選択を
行ない、ｄａｐＤ遺伝子を保有するクローンを得る。
【００７９】２つのオリエンテーション（orientatio
n）でｄａｐ遺伝子を保有するプラスミドが得られる。
挿入物のオリエンテーションはＰstＩによる消化により
決定できる。選択された下記２種のプラスミドについ
て：ｐＴＧ７６６は１.３４−kb及び０.９−kbのフラグ
メントを遊離し、ｐＴＧ７６７は１.８５−kb及び０.４
−kbのフラグメントを遊離する。
n）でｄａｐ遺伝子を保有するプラスミドが得られる。
挿入物のオリエンテーションはＰstＩによる消化により
決定できる。選択された下記２種のプラスミドについ
て：ｐＴＧ７６６は１.３４−kb及び０.９−kbのフラグ
メントを遊離し、ｐＴＧ７６７は１.８５−kb及び０.４
−kbのフラグメントを遊離する。
【００８０】（２）ｄａｐＤ遺伝子を保有するγ−イン
ターフェロンの発現プラスミド（図５） ｐＴＧ４０（ＰＥＤ）（ＥＰ−Ａ−０１４６４６２）プ
ラスミドは、１.２−kbのＨind IIIフラグメント上に、
プロモーターＰLのコントロール下にあるγ−インター
フェロン遺伝子を持つ。
ターフェロンの発現プラスミド（図５） ｐＴＧ４０（ＰＥＤ）（ＥＰ−Ａ−０１４６４６２）プ
ラスミドは、１.２−kbのＨind IIIフラグメント上に、
プロモーターＰLのコントロール下にあるγ−インター
フェロン遺伝子を持つ。
【００８１】Ｈind IIIによる消化後、このフラグメン
トを回収し、フォスファターゼで予め処理したｐＴＧ７
６７のＨind III部位に挿入する。リゲーション後、Ｔ
ＧＥ７６１５を形質転換し、ｄａｐＤ遺伝子の存在に対
する選択をＬＢ培地上にて行なう。反対のオリエンテー
ョンで挿入物を保有する２つのプラスミド、ｐＴＧ７６
７１（複製起点の近傍に且つ同一オリエンテーョンでＰ
Lを有する）及びｐＴＧ７６７２が選択される。
トを回収し、フォスファターゼで予め処理したｐＴＧ７
６７のＨind III部位に挿入する。リゲーション後、Ｔ
ＧＥ７６１５を形質転換し、ｄａｐＤ遺伝子の存在に対
する選択をＬＢ培地上にて行なう。反対のオリエンテー
ョンで挿入物を保有する２つのプラスミド、ｐＴＧ７６
７１（複製起点の近傍に且つ同一オリエンテーョンでＰ
Lを有する）及びｐＴＧ７６７２が選択される。
【００８２】これらプラスミドにより形質転換されたＴ
ＧＥ７６１５バクテリアは、無添加のＬＢ培地上で選択
できる（ｄａｐ+性についての選択）。
ＧＥ７６１５バクテリアは、無添加のＬＢ培地上で選択
できる（ｄａｐ+性についての選択）。
【００８３】誘導後、上記形質転換株はγ−インターフ
ェロンを産生する。
ェロンを産生する。
【００８４】下記の実施例は、本発明に従って形質転換
された菌株の特性を示すものである。
された菌株の特性を示すものである。
【００８５】ｄａｐＤ遺伝子を有する全てのプラスミド
は、ＴＧＥ７６１５株中にあり、その他はＴＧＥ９００
株中にある。
は、ＴＧＥ７６１５株中にあり、その他はＴＧＥ９００
株中にある。
【００８６】種々のプラスミドの安定性が適当な培地中
で試験された。
で試験された。
【００８７】“選択培地”とは、本発明のプラスミドの
場合はＬＢ培地のことであり、プラスミドｐＴＧ７２０
及びｐＴＧ４０の場合はＬＢ＋アンピシリン培地であ
る。
場合はＬＢ培地のことであり、プラスミドｐＴＧ７２０
及びｐＴＧ４０の場合はＬＢ＋アンピシリン培地であ
る。
【００８８】“非選択培地”とは、本発明のプラスミド
の場合はＬＢ培地＋ＤＡＰであり、他のプラスミドの場
合はＬＢ培地である。
の場合はＬＢ培地＋ＤＡＰであり、他のプラスミドの場
合はＬＢ培地である。
【００８９】１１０世代に亘る安定性の試験を、バクテ
リアの希釈と増殖を数度繰返し行なう。この増殖期の終
わりに、プラスミドの安定性を下記のように測定する：
培養物中の生菌数を適当に希釈して、非選択性寒天培地
内の細胞を計数することにより測定する；増殖時の後、
これらコロニーの有意な試料を選択及び非選択寒天培地
に移し、プラスミドを消失したコロニーの百分率、即ち
選択培地での増殖を測定する。
リアの希釈と増殖を数度繰返し行なう。この増殖期の終
わりに、プラスミドの安定性を下記のように測定する：
培養物中の生菌数を適当に希釈して、非選択性寒天培地
内の細胞を計数することにより測定する；増殖時の後、
これらコロニーの有意な試料を選択及び非選択寒天培地
に移し、プラスミドを消失したコロニーの百分率、即ち
選択培地での増殖を測定する。
【００９０】インターフェロン遺伝子を有するプラスミ
ドについて得られた結果を表２に示す。
ドについて得られた結果を表２に示す。
【００９１】
【表２】
【００９２】＊Ｃ ＝ 生菌数
ｐ- ＝プラスミドを失なった細胞
ｐ-／Ｃ／世代＝（ｐ-の数／試験したＣの数）×世代数
同様の試験を、ＬＢ培地中で１７０世代に亘るバクテリ
ア増殖後に、ヒルジン遺伝子を有するプラスミド及びク
ローニングベクターｐＴＧ７６６について行なった。そ
の結果を表３に示す。
ア増殖後に、ヒルジン遺伝子を有するプラスミド及びク
ローニングベクターｐＴＧ７６６について行なった。そ
の結果を表３に示す。
【００９３】
【表３】
【００９４】表２及び表３の結果は、下記のことを示
す。
す。
【００９５】１）dap ベクターの安定性は、ａｍｐr遺
伝子を有するプラスミドに対して１０のファクターで増
加する； ２）選択培地と非選択培地との間での相異は最少であ
る； ３）クローニングベクターｐＴＧ７６６及びｐＴＧ７６
７は５×１０-5ｐ-／Ｃ／世代未満の消失である； ４）ｐＴＧ４０の安定性は、ｄａｐ+ベクターの安定性
よりも有意に小さい。しかし、この減少は５０世代後に
特に顕著になり、培養の初期段階での消失はわずか２.
５×１０-4ｐ-／Ｃ／世代である；及び ５）ａｍｐrコントロールプラスミドｐＴＧ４０及びｐ
ＴＧ７２０（各々インターフェロン及びヒルジン遺伝子
を持つ）の消失は同程度である。経時的なプラスミドの
消失は、プラスミドがｄａｐＤ遺伝子を有する場合に減
少する（ｐＴＧ７６６、７６７、７６７１及び７７
６）。
伝子を有するプラスミドに対して１０のファクターで増
加する； ２）選択培地と非選択培地との間での相異は最少であ
る； ３）クローニングベクターｐＴＧ７６６及びｐＴＧ７６
７は５×１０-5ｐ-／Ｃ／世代未満の消失である； ４）ｐＴＧ４０の安定性は、ｄａｐ+ベクターの安定性
よりも有意に小さい。しかし、この減少は５０世代後に
特に顕著になり、培養の初期段階での消失はわずか２.
５×１０-4ｐ-／Ｃ／世代である；及び ５）ａｍｐrコントロールプラスミドｐＴＧ４０及びｐ
ＴＧ７２０（各々インターフェロン及びヒルジン遺伝子
を持つ）の消失は同程度である。経時的なプラスミドの
消失は、プラスミドがｄａｐＤ遺伝子を有する場合に減
少する（ｐＴＧ７６６、７６７、７６７１及び７７
６）。
【００９６】しかし、ｄａｐＤ遺伝子及びアンピシリン
耐性をコードする遺伝子を持つプラスミド（ｐＴＧ７７
１）の安定性は他に比べて低く、ｐＴＧ７２０のそれと
同等のままである。この結果は、アガロースゲル中でプ
ラスミド含量の分析をすることにより説明される。即
ち、ｐＴＧ７７１は四量体を形成することが示され、こ
の現象はプラスミドの分割（partition）に影響を与え
消失を増大させる（サマーズ(Summers）とシャーラット
(Sherratt）、１９８４）。更に、より少ない数の世代
（３０）に亘る場合、この多量体化現象は出現せず、計
７０世代に亘る場合のｐＴＧ７７１の消失は２.８×１
０-4ｐ-／Ｃ／世代以下のままである。
耐性をコードする遺伝子を持つプラスミド（ｐＴＧ７７
１）の安定性は他に比べて低く、ｐＴＧ７２０のそれと
同等のままである。この結果は、アガロースゲル中でプ
ラスミド含量の分析をすることにより説明される。即
ち、ｐＴＧ７７１は四量体を形成することが示され、こ
の現象はプラスミドの分割（partition）に影響を与え
消失を増大させる（サマーズ(Summers）とシャーラット
(Sherratt）、１９８４）。更に、より少ない数の世代
（３０）に亘る場合、この多量体化現象は出現せず、計
７０世代に亘る場合のｐＴＧ７７１の消失は２.８×１
０-4ｐ-／Ｃ／世代以下のままである。
【００９７】従って、ｄａｐＤ遺伝子を有するプラスミ
ドの安定性は、ａｍｐr遺伝子を有するプラスミドに比
し増大し、その消失は最小となる。
ドの安定性は、ａｍｐr遺伝子を有するプラスミドに比
し増大し、その消失は最小となる。
【００９８】実施例７ ３７℃又は４２℃におけるプラスミドの安定性
プラスミド類がプロモーターＰLの制御下にある外来蛋
白質をコードする遺伝子を含む場合には、該蛋白質の発
現を誘導（induce）させることなく、これらプラスミド
類の安定性を調べることは出来ない。それにも拘らず、
作業条件下には、誘導に引き続いて、Ｏ.Ｄ.が０.３か
ら３.６に増大し、これは３.６世代に相当することを指
摘しておくべきである。従って、事実、バクテリアは、
誘導に先立って、先行の実施例で既に決定された消失を
伴って、３０℃で最大数の世代を形成しする。
白質をコードする遺伝子を含む場合には、該蛋白質の発
現を誘導（induce）させることなく、これらプラスミド
類の安定性を調べることは出来ない。それにも拘らず、
作業条件下には、誘導に引き続いて、Ｏ.Ｄ.が０.３か
ら３.６に増大し、これは３.６世代に相当することを指
摘しておくべきである。従って、事実、バクテリアは、
誘導に先立って、先行の実施例で既に決定された消失を
伴って、３０℃で最大数の世代を形成しする。
【００９９】外来蛋白質の発現が生じる場合（例えば、
ｐＴＧ７２０についてはヒルジン、ｐＴＧ４０について
はγ−インターフェロン）には、一定時間（２〜４時
間）経過後に、９０〜９５％の割合の大腸菌培養物の死
滅率が観察された。これらは、プラスミドを含む細胞群
である（何故ならば、ｐ-宿主細胞は、３７〜４２℃で
生育可能だからである）。必然的に、この死滅率は、生
存細胞に対するｐ-細胞の割合を１０乃至２０のファク
ターで増大させる。生存細胞の全体数が有意的に減少
し、ｐ-細胞が個体数の大きな割合を占める様になる
と、ｐ-細胞の増殖が決定され、これがｐ+／ｐ-比を有
意的に減少させる（例えば、５時間３０分及び７時間後
に得られた結果を示す表４を参照）。
ｐＴＧ７２０についてはヒルジン、ｐＴＧ４０について
はγ−インターフェロン）には、一定時間（２〜４時
間）経過後に、９０〜９５％の割合の大腸菌培養物の死
滅率が観察された。これらは、プラスミドを含む細胞群
である（何故ならば、ｐ-宿主細胞は、３７〜４２℃で
生育可能だからである）。必然的に、この死滅率は、生
存細胞に対するｐ-細胞の割合を１０乃至２０のファク
ターで増大させる。生存細胞の全体数が有意的に減少
し、ｐ-細胞が個体数の大きな割合を占める様になる
と、ｐ-細胞の増殖が決定され、これがｐ+／ｐ-比を有
意的に減少させる（例えば、５時間３０分及び７時間後
に得られた結果を示す表４を参照）。
【０１００】ｐ-／細胞／世代というパラメーターは、
ｐ+細胞が最早増殖しないので、この様な条件下では、
その意義を失っていることが明らかである。従って、以
下のパラメーターを提案する：即ち、各培養期間に於け
るｐ-細胞のみを測定するｐ-／ｍｌ／光学密度単位であ
る。更に、これは、２つの異なる培養物をそのプラスミ
ドの消失について比較することを可能とする。このパラ
メーターは、以下の式に従って計算される： ｐ-／ｍｌ／ＯＤ＝｛１−（％ｐ+／100）｝×生存細胞
／ｍｌ／ＯＤ。
ｐ+細胞が最早増殖しないので、この様な条件下では、
その意義を失っていることが明らかである。従って、以
下のパラメーターを提案する：即ち、各培養期間に於け
るｐ-細胞のみを測定するｐ-／ｍｌ／光学密度単位であ
る。更に、これは、２つの異なる培養物をそのプラスミ
ドの消失について比較することを可能とする。このパラ
メーターは、以下の式に従って計算される： ｐ-／ｍｌ／ＯＤ＝｛１−（％ｐ+／100）｝×生存細胞
／ｍｌ／ＯＤ。
【０１０１】最後に、若し、このパラメーターが、細胞
の全数（現在の条件下では、４×１０8である）を基準
として表現されるならば、培地中の細胞パーセンテージ
（Ｆｐ-）を得ること、及び各期間に於けるｐ-細胞によ
る培地の汚染度合いを決定することが可能となる。Ｆｐ
-は、以下のようにして計算される： Ｆｐ-＝４×１０8ｃ／ｍｌ／ＯＤ×１００（ｐ-／ｍｌ
／ＯＤ） Ｆｐ-は、分子の生産のための培養物が十分に純粋でそ
れ以上の培養に値するか否かを決定することを可能と
し、且つ誘導条件下に異なるプラスミドを互いに比較す
ることを可能とする客観的パラメーターである。
の全数（現在の条件下では、４×１０8である）を基準
として表現されるならば、培地中の細胞パーセンテージ
（Ｆｐ-）を得ること、及び各期間に於けるｐ-細胞によ
る培地の汚染度合いを決定することが可能となる。Ｆｐ
-は、以下のようにして計算される： Ｆｐ-＝４×１０8ｃ／ｍｌ／ＯＤ×１００（ｐ-／ｍｌ
／ＯＤ） Ｆｐ-は、分子の生産のための培養物が十分に純粋でそ
れ以上の培養に値するか否かを決定することを可能と
し、且つ誘導条件下に異なるプラスミドを互いに比較す
ることを可能とする客観的パラメーターである。
【０１０２】以下の実施例に示す誘導において、生存細
胞の数及びｐ+のパーセンテージが決定され、次いで、
ｐ-／ｍｌ／ＯＤ及びＦｐ-が計算される。これらのデー
タは、表として呈示される。
胞の数及びｐ+のパーセンテージが決定され、次いで、
ｐ-／ｍｌ／ＯＤ及びＦｐ-が計算される。これらのデー
タは、表として呈示される。
【０１０３】実施例８ ヒルジンの誘導
ヒルジン誘導の結果は、先ず、アンピシリン耐性遺伝子
を含むベクターに関して、次いで、ｄａｐＤ遺伝子を更
に含むベクターに関して、呈示する。
を含むベクターに関して、次いで、ｄａｐＤ遺伝子を更
に含むベクターに関して、呈示する。
【０１０４】１）プラスミドの安定性
ａ）３７℃のＬＢ培地におけるアンピシリン耐性遺伝子
を含むベクター（ＴＧＥ９００／ｐＴＧ７２０）内での
ヒルジンの発現誘導 ＴＧＥ９００／ｐＴＧ７２０についての代表的な結果を
表４に示す。
を含むベクター（ＴＧＥ９００／ｐＴＧ７２０）内での
ヒルジンの発現誘導 ＴＧＥ９００／ｐＴＧ７２０についての代表的な結果を
表４に示す。
【０１０５】
【表４】
【０１０６】３時間後には、ＯＤ単位当たりの生存細胞
の数は、ｐ+細胞の割合とともに、平行的に減少してい
ることが明らかである。５時間３０分後には、Ｆｐ
-（細胞の全数に対するｐ-細胞の％）２.３５％のオー
ダーである。７時間後には、この数は、二倍となるであ
ろう。おそらくこれは、ｐ-の成長にのみよるものであ
る。
の数は、ｐ+細胞の割合とともに、平行的に減少してい
ることが明らかである。５時間３０分後には、Ｆｐ
-（細胞の全数に対するｐ-細胞の％）２.３５％のオー
ダーである。７時間後には、この数は、二倍となるであ
ろう。おそらくこれは、ｐ-の成長にのみよるものであ
る。
【０１０７】ｂ）３７℃のＬＢ培地におけるｄａｐＤ遺
伝子を含むベクター（ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７７１）
内でのヒルジンの発現の誘導 表５に示す結果は、ｐＴＧ７２０について得られた結果
に比較し得るものである。
伝子を含むベクター（ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７７１）
内でのヒルジンの発現の誘導 表５に示す結果は、ｐＴＧ７２０について得られた結果
に比較し得るものである。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】表５から、以下のことが判る。即ちＴＧＥ
９００／ｐＴＧ７７１について記録された死滅率に匹敵
する死滅率を呈しているにもかかわらず、プラスミド
（％ｐ+）の喪失は低い（５時間後に９８％のｐ+）。こ
れは、ｐ-細胞の絶対量（ｐ-／ｍｌ／ＯＤ）についても
同様である。５時間後のＦｐ-の量は、０.０４％であ
り、これは、同一期間におけるｐＴＧ７２０の場合の1/
50以下である。このことは、ｐＴＧ７２０に比して、ｐ
ＴＧ７７１がより大きい安定性を有することを示してい
る。誘導実験において、ｐＴＧ７７１は、四量体を形成
せず、又、その消失は、３０℃で１７０世代に亘り測定
された消失（表３参照）よりも小さいものと思われるこ
とを指摘しておく。
９００／ｐＴＧ７７１について記録された死滅率に匹敵
する死滅率を呈しているにもかかわらず、プラスミド
（％ｐ+）の喪失は低い（５時間後に９８％のｐ+）。こ
れは、ｐ-細胞の絶対量（ｐ-／ｍｌ／ＯＤ）についても
同様である。５時間後のＦｐ-の量は、０.０４％であ
り、これは、同一期間におけるｐＴＧ７２０の場合の1/
50以下である。このことは、ｐＴＧ７２０に比して、ｐ
ＴＧ７７１がより大きい安定性を有することを示してい
る。誘導実験において、ｐＴＧ７７１は、四量体を形成
せず、又、その消失は、３０℃で１７０世代に亘り測定
された消失（表３参照）よりも小さいものと思われるこ
とを指摘しておく。
【０１１０】結果は、ｐＴＧ７２０に比して、プラスミ
ドｐＴＧ７７１の安定性がより大きいことを示してい
る。
ドｐＴＧ７７１の安定性がより大きいことを示してい
る。
【０１１１】２）プラスミド含有量
誘導期間中に数回に亘り、プラスミドｐＴＧ７２０とｐ
ＴＧ７７１とを単離した。一般に、誘導の初期段階の対
数増殖期に、細胞当りプラスミド含有量が低いことが観
察されたが、時間の経過とともに実質的に増大した。ヒ
ルジンは、この期間中に生成された。
ＴＧ７７１とを単離した。一般に、誘導の初期段階の対
数増殖期に、細胞当りプラスミド含有量が低いことが観
察されたが、時間の経過とともに実質的に増大した。ヒ
ルジンは、この期間中に生成された。
【０１１２】興味深いことに、このプラスミド濃度の増
大は、９５％以上の細胞が死滅した集団で生じていた。
大は、９５％以上の細胞が死滅した集団で生じていた。
【０１１３】３）誘導された活性
ｐＴＧ７２０及びｐＴＧ７７１から得られたヒルジンの
活性は、有意差を示さなかった。その値（アンチトロン
ビン単位、ＡＴＵ）は、誘導５時間後に、ｐＴＧ７２０
については２７２０ＡＴＵ／Ｌ／ＯＤであり、ｐＴＧ７
７１については２３８０ＡＴＵ／Ｌ／ＯＤであった。
活性は、有意差を示さなかった。その値（アンチトロン
ビン単位、ＡＴＵ）は、誘導５時間後に、ｐＴＧ７２０
については２７２０ＡＴＵ／Ｌ／ＯＤであり、ｐＴＧ７
７１については２３８０ＡＴＵ／Ｌ／ＯＤであった。
【０１１４】結論として、ｐＴＧ７７１は、ｐＴＧ７２
０に比して安定性が大きく、同時に、対数増殖期の終わ
りに、ｐＴＧ７２０と同じ生産能及びそのコピー数増大
と言う点で同じ特性を維持していると言うことができ
る。
０に比して安定性が大きく、同時に、対数増殖期の終わ
りに、ｐＴＧ７２０と同じ生産能及びそのコピー数増大
と言う点で同じ特性を維持していると言うことができ
る。
【０１１５】実施例９ γ−インターフェロンの誘導
γ−インターフェロンの誘導についてのデータも、ヒル
ジンについてと同様にして提示されている。
ジンについてと同様にして提示されている。
【０１１６】（１）プラスミドの安定性
ａ）４２℃のＬＢ培地におけるアンピシリン耐性遺伝子
を含むベクター（ＴＧＥ９００／ｐＴＧ４０）内でのγ
−インターフェロンの発現誘導 表６の結果は、プラスミドの消失は、ｐＴＧ７２０の消
失と同等であり、５時間後にＦｐ-は６％に増大するこ
とを示している。しかしながら、ｐＴＧ７２０とは異な
って、生存の低下はより急速で、生存細胞数の最小値は
３時間後にすでに生じている（これに対し、ｐＴＧ７２
０の場合には５時間後に観察されている）。更に、培養
物中に存在するｐ-細胞は、生存し続け、３時間後には
すでに著しく分裂しており、５時間後のこのＦｐ-６％
に貢献している。
を含むベクター（ＴＧＥ９００／ｐＴＧ４０）内でのγ
−インターフェロンの発現誘導 表６の結果は、プラスミドの消失は、ｐＴＧ７２０の消
失と同等であり、５時間後にＦｐ-は６％に増大するこ
とを示している。しかしながら、ｐＴＧ７２０とは異な
って、生存の低下はより急速で、生存細胞数の最小値は
３時間後にすでに生じている（これに対し、ｐＴＧ７２
０の場合には５時間後に観察されている）。更に、培養
物中に存在するｐ-細胞は、生存し続け、３時間後には
すでに著しく分裂しており、５時間後のこのＦｐ-６％
に貢献している。
【０１１７】
【表６】
【０１１８】ｂ）４２℃のＬＢ培地におけるｄａｐＤ遺
伝子を含むベクター（ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７
１）内でのインターフェロンの発現誘導 ＬＢ培地中４２℃でのＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７１
発現データを表７に示す。
伝子を含むベクター（ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７
１）内でのインターフェロンの発現誘導 ＬＢ培地中４２℃でのＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７１
発現データを表７に示す。
【０１１９】
【表７】
【０１２０】表７から以下のことが明らかである。５時
間が経過するまでは最大死滅率には達しない。この期間
中、％ｐ+は、ｐＴＧ４０についての値（１０％）に比
肩し得るがｐ-細胞の数（ｐ-／ｍｌ／ＯＤ）は、ｐＴＧ
４０について３時間後に得られた値の1/5 である。事
実、５時間後には、Ｆｐ-は０.３％であるのに対し、ｐ
ＴＧ４０についてのＦｐ-はすでに６％となっている。
従って、２０倍にも達する相違があり、これは、ｐＴＧ
７６７１の増大した安定性を反映しており、３０℃にお
ける安定性データを確認するものである（表２参照）。
間が経過するまでは最大死滅率には達しない。この期間
中、％ｐ+は、ｐＴＧ４０についての値（１０％）に比
肩し得るがｐ-細胞の数（ｐ-／ｍｌ／ＯＤ）は、ｐＴＧ
４０について３時間後に得られた値の1/5 である。事
実、５時間後には、Ｆｐ-は０.３％であるのに対し、ｐ
ＴＧ４０についてのＦｐ-はすでに６％となっている。
従って、２０倍にも達する相違があり、これは、ｐＴＧ
７６７１の増大した安定性を反映しており、３０℃にお
ける安定性データを確認するものである（表２参照）。
【０１２１】４２℃におけるＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７
６７１誘導条件下に、選択及び非選択培地中で、プラス
ミドの安定性は実質上同一であった。一方、ｐＴＧ７６
７１の安定性は、選択の不存在下においても極めて高い
ものであった。従って、プラスミドの消失は、極めて満
足すべき、工業的スケールでの生産に適したレベルにま
で下げられた。
６７１誘導条件下に、選択及び非選択培地中で、プラス
ミドの安定性は実質上同一であった。一方、ｐＴＧ７６
７１の安定性は、選択の不存在下においても極めて高い
ものであった。従って、プラスミドの消失は、極めて満
足すべき、工業的スケールでの生産に適したレベルにま
で下げられた。
【０１２２】（２）プラスミド含有量
アガロースゲル上でのプラスミド含有量の分析は、プラ
スミドｐＴＧ４０及びｐＴＧ７６７１により形質転換さ
れた細胞株が等量の材料を含んでいること、及びこの細
胞当りのプラスミド含有量が誘導期間中に時間とともに
増大することを示している。ｐＴＧ４０は、二量体型で
存在する（アガロースゲルに示される通り）。
スミドｐＴＧ４０及びｐＴＧ７６７１により形質転換さ
れた細胞株が等量の材料を含んでいること、及びこの細
胞当りのプラスミド含有量が誘導期間中に時間とともに
増大することを示している。ｐＴＧ４０は、二量体型で
存在する（アガロースゲルに示される通り）。
【０１２３】（３）ｄａｐＤ遺伝子を含むｐ +細胞の選
択 細胞の主要部分がその生存能力を大巾に低下させたら直
ちに発生しなくなるｐ-細胞の生育状況を考慮しつつ、
ｄａｐＤシステムの選択能を明らかにするために、誘導
を行なった。この誘導期間中に培養物は２時間毎に３回
に亘り５倍に希釈され、その後、定常期に達するまで放
置された。４２℃におけるＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６
７１誘導の結果は、選択培地中での生育について表８
に、又非選択性ＬＢ＋ＤＡＰ培地中での生育について表
９に示す。
択 細胞の主要部分がその生存能力を大巾に低下させたら直
ちに発生しなくなるｐ-細胞の生育状況を考慮しつつ、
ｄａｐＤシステムの選択能を明らかにするために、誘導
を行なった。この誘導期間中に培養物は２時間毎に３回
に亘り５倍に希釈され、その後、定常期に達するまで放
置された。４２℃におけるＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６
７１誘導の結果は、選択培地中での生育について表８
に、又非選択性ＬＢ＋ＤＡＰ培地中での生育について表
９に示す。
【０１２４】
【表８】
【０１２５】
【表９】
【０１２６】表９から、誘導開始９時間後に、選択的Ｌ
Ｂ培地中では、全ての生存細胞は、プラスミドを含んで
いることが明らかである（プラスミドの存在は、ＬＢ培
地中の全数６０のポジティブコロニー（positive colon
y）中の３０コロニーからのミニプレパレーション（min
i preparation）により確認され、アガロースゲル電気
泳動によりプラスミドが同定される）。これとは対照的
に、非選択性培地中では、生存率は５倍よりも大きい
が、培地では、プラスミド含有細胞を５％含むのみであ
る。ＬＢ培地中よりもＬＢ＋ＤＡＰ培地中での生存率が
高いということは、ＤＡＰが加えられた培地中でのｐ-
細胞の生育、並びにそれ以上に明確に選択的培地中での
ｐ-細胞の死滅率を示している。従って、ＬＢ培地は、
ｐ-細胞の対抗選択を効率よく行なうものである。
Ｂ培地中では、全ての生存細胞は、プラスミドを含んで
いることが明らかである（プラスミドの存在は、ＬＢ培
地中の全数６０のポジティブコロニー（positive colon
y）中の３０コロニーからのミニプレパレーション（min
i preparation）により確認され、アガロースゲル電気
泳動によりプラスミドが同定される）。これとは対照的
に、非選択性培地中では、生存率は５倍よりも大きい
が、培地では、プラスミド含有細胞を５％含むのみであ
る。ＬＢ培地中よりもＬＢ＋ＤＡＰ培地中での生存率が
高いということは、ＤＡＰが加えられた培地中でのｐ-
細胞の生育、並びにそれ以上に明確に選択的培地中での
ｐ-細胞の死滅率を示している。従って、ＬＢ培地は、
ｐ-細胞の対抗選択を効率よく行なうものである。
【０１２７】（４）インターフェロンの生産
ｐＴＧ７６７１は、原プラスミドｐＴＧ４０と同様のγ
−インターフェロン産生能を保持している。
−インターフェロン産生能を保持している。
【０１２８】実施例１０ 細菌の染色体からのｄａｐＤ遺伝子の欠失
（１）２つのＰstＩフラグメント上でのｄａｐＤ遺伝子
のサブ−クローニング プラスミドｐＤＢ６とＭ１３ｍｐ８をＰstＩで切断し、
リゲートする。遺伝子の５′末端及び３′末端を含むＭ
１３をこの領域に対して特異的なオリゴヌクレオチド、
ＴＧ５９６（ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＡＡＣＧＡＧＴＴＧ）
およびＴＧ５９８（ＴＧＴＧＣＡＴＡＣＴＴＴＡＧＴ
Ｃ）により夫々スクリーニングする。候補体としてＳＢ
９６及びＳＢ９８を選び、所望のフラグメントの挿入を
配列決定法により確認する（図６のダイアグラム参照の
こと）。
のサブ−クローニング プラスミドｐＤＢ６とＭ１３ｍｐ８をＰstＩで切断し、
リゲートする。遺伝子の５′末端及び３′末端を含むＭ
１３をこの領域に対して特異的なオリゴヌクレオチド、
ＴＧ５９６（ＧＣＧＣＴＴＡＡＴＡＡＣＧＡＧＴＴＧ）
およびＴＧ５９８（ＴＧＴＧＣＡＴＡＣＴＴＴＡＧＴ
Ｃ）により夫々スクリーニングする。候補体としてＳＢ
９６及びＳＢ９８を選び、所望のフラグメントの挿入を
配列決定法により確認する（図６のダイアグラム参照の
こと）。
【０１２９】（２）ｄａｐＤ遺伝子の５′及び３′末端
へのＥcoＲＩ部位の導入 点変異によりＳＢ９６及びＳＢ９８中にＥcoＲＩ部位を
導入する。
へのＥcoＲＩ部位の導入 点変異によりＳＢ９６及びＳＢ９８中にＥcoＲＩ部位を
導入する。
【０１３０】ＳＢ９８には、オリゴヌクレオチドＴＧ５
９７：ＧＴＡＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＴＧＣ
ＣＧを使用する。これは、遺伝子末端の３′領域と対合
するが、推定される転写ターミネーター（assumed tran
scription terminator）の前である。
９７：ＧＴＡＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＴＧＣ
ＣＧを使用する。これは、遺伝子末端の３′領域と対合
するが、推定される転写ターミネーター（assumed tran
scription terminator）の前である。
【０１３１】ＳＢ９６には、オリゴヌクレオチドＴＧ６
２０：ＡＧＡＧＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＧを使
用する。これは、ｄａｐＤ遺伝子の推定されるプロモー
ターの上流側の５′領域と対合する。
２０：ＡＧＡＧＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＣＧを使
用する。これは、ｄａｐＤ遺伝子の推定されるプロモー
ターの上流側の５′領域と対合する。
【０１３２】形質転換体は、ＥcoＲＩ部位を導入するに
使用したものと同じプローブにより分析する。このＥco
ＲＩ部位の存在は、ＤＮＡミニプレパレーションによ
り、次いで、選ばれたＭ１３候補体を配列決定すること
により確認される（図７参照）。
使用したものと同じプローブにより分析する。このＥco
ＲＩ部位の存在は、ＤＮＡミニプレパレーションによ
り、次いで、選ばれたＭ１３候補体を配列決定すること
により確認される（図７参照）。
【０１３３】（３）欠失ベクター（deletion vector）
の構築 プラスミドｐＵＣ−４Ｋ（ファルマシア社により市販）
のカナマイシン耐性遺伝子をＥcoＲＩフラグメントの形
態で回収する。Ｍ１３ＴＧ５９７及び６２０をＥcoＲＩ
及びＰstＩにより切断する。これにより、ｄａｐＤ遺伝
子の３′末端（推定されるターミネーターを有しない）
及び遺伝子の５′末端（推定されるプロモーターを有す
る）を遊離する。
の構築 プラスミドｐＵＣ−４Ｋ（ファルマシア社により市販）
のカナマイシン耐性遺伝子をＥcoＲＩフラグメントの形
態で回収する。Ｍ１３ＴＧ５９７及び６２０をＥcoＲＩ
及びＰstＩにより切断する。これにより、ｄａｐＤ遺伝
子の３′末端（推定されるターミネーターを有しない）
及び遺伝子の５′末端（推定されるプロモーターを有す
る）を遊離する。
【０１３４】クローニングベクターｐＴＧ１９２（実施
例２ａ参照）をＰstＩにより切断する。
例２ａ参照）をＰstＩにより切断する。
【０１３５】これら全てのフラグメントをリゲートす
る。５Ｋ細胞の形質転換、及びＬＢ培地＋アンピシリン
０.１μｇ／ｍｌ＋カナマイシン０.０２μｇ／ｍｌ上へ
の塗布（spreading）後に、コロニーをオリゴヌクレオ
チドＴＧ５９６によりスクリーニングする。
る。５Ｋ細胞の形質転換、及びＬＢ培地＋アンピシリン
０.１μｇ／ｍｌ＋カナマイシン０.０２μｇ／ｍｌ上へ
の塗布（spreading）後に、コロニーをオリゴヌクレオ
チドＴＧ５９６によりスクリーニングする。
【０１３６】一つの構築物ｐＴＧ４７を選択する。その
構造をＤＮＡミニプレパレーションにより分析し、Ｈin
d IIIによりプラスミドを消化してカナマイシン耐性遺
伝子のオリエンテーションを決定する。かくして、５.
３kb及び４.０kbの大きさの２本のバンドが遊離され
る。ｐＴＧ４７中のカナマイシン耐性遺伝子のオリエン
テーションは、ｐＤＢ６中のｄａｐＤ遺伝子のそれと同
じである（他方のオリエンテーションでは、４.９kb及
び４.４kbの大きさのバンドが得られたはずである）。
構造をＤＮＡミニプレパレーションにより分析し、Ｈin
d IIIによりプラスミドを消化してカナマイシン耐性遺
伝子のオリエンテーションを決定する。かくして、５.
３kb及び４.０kbの大きさの２本のバンドが遊離され
る。ｐＴＧ４７中のカナマイシン耐性遺伝子のオリエン
テーションは、ｐＤＢ６中のｄａｐＤ遺伝子のそれと同
じである（他方のオリエンテーションでは、４.９kb及
び４.４kbの大きさのバンドが得られたはずである）。
【０１３７】ｐＴＧ４７についてのダイアグラムを図８
に示す。
に示す。
【０１３８】（４）染色体からのｄａｐＤ遺伝子の欠失
中間細胞株からの染色体のｄａｐＤ遺伝子の除去を行な
う。
う。
【０１３９】ＲＨ５３４５細胞（その受容能力は、ｐＴ
Ｇ４７のＤＮＡのμｇ当り２.５×１０-7形質転換体に
達する）を、予めＫpnＩ及びＢglIIにより切断したプラ
スミドｐＴＧ４７により形質転換させる（図８参照）。
Ｇ４７のＤＮＡのμｇ当り２.５×１０-7形質転換体に
達する）を、予めＫpnＩ及びＢglIIにより切断したプラ
スミドｐＴＧ４７により形質転換させる（図８参照）。
【０１４０】この消化により、ｄａｐＤ遺伝子の側方領
域（flanking regions）を含むフラグメントが遊離され
る。該遺伝子自身は、カナマイシン耐性遺伝子によって
置き換えられる。
域（flanking regions）を含むフラグメントが遊離され
る。該遺伝子自身は、カナマイシン耐性遺伝子によって
置き換えられる。
【０１４１】ＬＢ培地＋ＤＡＰ＋カナマイシン０.０１
μｇ／ｍｌへの塗布後に、９つの候補が選択される。即
ち、ＴＧＥ７２１からＴＧＥ７２９までであり、そのｄ
ａｐ-、ｋａｎR表現型が確認される。
μｇ／ｍｌへの塗布後に、９つの候補が選択される。即
ち、ＴＧＥ７２１からＴＧＥ７２９までであり、そのｄ
ａｐ-、ｋａｎR表現型が確認される。
【０１４２】ｄａｐＤ遺伝子の欠如は、ｐＴＧ７６４に
よるこれら細胞株の形質転換後に、そのＬＢ培地中での
増殖能力により確認された。
よるこれら細胞株の形質転換後に、そのＬＢ培地中での
増殖能力により確認された。
【０１４３】（５）ＴＧＥ９０１及びＮ５９６９株から
のｄａｐＤ遺伝子の欠失 細胞株ＴＧＥ７２１のｄａｐＤ欠失は、ファージトラン
スデューサーＰｌvir／ＴＧＥ７２１により、細胞株Ｔ
ＧＥ９０１及びＮ５９６９内に形質導入され、ｄａｐ-
組換体は、カナマイシン０.０１μｇ／ｍｌに対する耐
性により選択される。
のｄａｐＤ遺伝子の欠失 細胞株ＴＧＥ７２１のｄａｐＤ欠失は、ファージトラン
スデューサーＰｌvir／ＴＧＥ７２１により、細胞株Ｔ
ＧＥ９０１及びＮ５９６９内に形質導入され、ｄａｐ-
組換体は、カナマイシン０.０１μｇ／ｍｌに対する耐
性により選択される。
【０１４４】選ばれた候補は、それぞれＴＧＥ７２１
３、７２１４及びＴＧＥ７３０３である。一つの候補、
ＴＧＥ７２１４については、 ｄａｐ- ｋａｎR特性に
加えて、親株ＴＧＥ９０１のile 、val 及びhis 要求
（requirements）が適当な培地上で確認された。
３、７２１４及びＴＧＥ７３０３である。一つの候補、
ＴＧＥ７２１４については、 ｄａｐ- ｋａｎR特性に
加えて、親株ＴＧＥ９０１のile 、val 及びhis 要求
（requirements）が適当な培地上で確認された。
【０１４５】実施例１１
（１）種々の細胞株における染色体ブロッテイングによ
るｄａｐ遺伝子の欠失の確認 下記の遺伝子を分析した： (i) 親株ＴＧＥ９０１及びＲＨ５３４５、ｄａｐＤ+； (ii) 欠失株ＴＧＥ７２１３及びＴＧＥ７２１４； (iii)ＴＧＥ９０１にｄａｐＤ-突然変異を導入するのに
用いられた親株ＲＬ５８、 及びそれにより得られ
たｄａｐＤ-変異株ＴＧＥ７６１５； (iv) Ｔｎ５の組み込みによりカナマイシンに対し耐性
を持つＧＣ４５４０。
るｄａｐ遺伝子の欠失の確認 下記の遺伝子を分析した： (i) 親株ＴＧＥ９０１及びＲＨ５３４５、ｄａｐＤ+； (ii) 欠失株ＴＧＥ７２１３及びＴＧＥ７２１４； (iii)ＴＧＥ９０１にｄａｐＤ-突然変異を導入するのに
用いられた親株ＲＬ５８、 及びそれにより得られ
たｄａｐＤ-変異株ＴＧＥ７６１５； (iv) Ｔｎ５の組み込みによりカナマイシンに対し耐性
を持つＧＣ４５４０。
【０１４６】これに対し、トランスジーン ソシエテ
アノニムの株においては、カナマイシン耐性遺伝子はＴ
n ９０３由来である（２つの遺伝子は相同性（homolog
y）がないため、交差雑種形成（cross hybridization）
を起こさないはずである：ベック(Beck)等、１９８
２）。
アノニムの株においては、カナマイシン耐性遺伝子はＴ
n ９０３由来である（２つの遺伝子は相同性（homolog
y）がないため、交差雑種形成（cross hybridization）
を起こさないはずである：ベック(Beck)等、１９８
２）。
【０１４７】制限酵素の選択は、ｐＤＢ６の配列に基づ
く：ＢamＨＩとＨind IIIによる切断は、野生株の場
合、ｄａｐＤ遺伝子及びその側方領域を含有する９−kb
の染色体フラグメントを遊離する。欠失株の場合、耐性
遺伝子はＢamＨＩによる消化で遊離し、Ｈind IIIによ
る消化で２つのフラグメントに切断される；ＰstＩは、
野生型株の場合、各々ｄａｐＤ遺伝子の一部を含有する
２つのフラグメント（５′領域から２.８kb及び３′領
域から３.４kb）を遊離する。欠失株の場合、ＰstＩに
よる消化は、カナマイシン耐性遺伝子及び２つの側方領
域（５′側上の２.４kbフラグメント及び３′側上の２.
８kbフラグメント）を遊離する（図６及び図８）。
く：ＢamＨＩとＨind IIIによる切断は、野生株の場
合、ｄａｐＤ遺伝子及びその側方領域を含有する９−kb
の染色体フラグメントを遊離する。欠失株の場合、耐性
遺伝子はＢamＨＩによる消化で遊離し、Ｈind IIIによ
る消化で２つのフラグメントに切断される；ＰstＩは、
野生型株の場合、各々ｄａｐＤ遺伝子の一部を含有する
２つのフラグメント（５′領域から２.８kb及び３′領
域から３.４kb）を遊離する。欠失株の場合、ＰstＩに
よる消化は、カナマイシン耐性遺伝子及び２つの側方領
域（５′側上の２.４kbフラグメント及び３′側上の２.
８kbフラグメント）を遊離する（図６及び図８）。
【０１４８】ｄａｐＤ遺伝子又はその側方領域或いはｋ
ａｎR遺伝子を明らかにするべく、プローブが選択され
た：カナマイシン耐性遺伝子を調べるために、該耐性遺
伝子のみを有するｐＴＧ４７のＥcoＲＩ断片（図８）を
単離する；ｄａｐＤ遺伝子を調べるため、ｄａｐＤ遺伝
子の５′領域のみを有し、ＴＧＥ７２１、７２１３及び
７２１４中では完全に欠失されるべきＭ１３ＴＧ６２０
の２.４kb ＥcoＲＩ断片が用いられる（図７）；染色体
ｄａｐＤ遺伝子及びその側方領域を調べるため、カナマ
イシン耐性遺伝子及びｄａｐＤ遺伝子の側方にある染色
体の２つの領域（５′及び３′側）を有するｐＴＧ４７
のＫpnＩ−ＢglII断片が用いられる。
ａｎR遺伝子を明らかにするべく、プローブが選択され
た：カナマイシン耐性遺伝子を調べるために、該耐性遺
伝子のみを有するｐＴＧ４７のＥcoＲＩ断片（図８）を
単離する；ｄａｐＤ遺伝子を調べるため、ｄａｐＤ遺伝
子の５′領域のみを有し、ＴＧＥ７２１、７２１３及び
７２１４中では完全に欠失されるべきＭ１３ＴＧ６２０
の２.４kb ＥcoＲＩ断片が用いられる（図７）；染色体
ｄａｐＤ遺伝子及びその側方領域を調べるため、カナマ
イシン耐性遺伝子及びｄａｐＤ遺伝子の側方にある染色
体の２つの領域（５′及び３′側）を有するｐＴＧ４７
のＫpnＩ−ＢglII断片が用いられる。
【０１４９】従って、下記のことが明らかにされるもの
と期待される：野生株においては、ｄａｐＤ遺伝子の
５′領域に対応する２.８−kbバンド及び該遺伝子の
３′領域に対応する３.４−kbバンド（図６）；欠失株
においては、カナマイシン耐性遺伝子、ｄａｐＤ遺伝子
の側方に尚存在する５′領域（２.４kb）及びｄａｐＤ
遺伝子の側方に尚存在する３′領域（２.８kb）（図
８） （２）カナマイシン耐性遺伝子の取り込みの証明 ＰstＩ又はＢamＨＩ及びＨind IIIで切断されたＧＣ４
５４０、ＴＧＥ７２１３、ＴＧＥ７２１４及びＴＧＥ９
０１の染色体ＤＮＡを比較し、ｐＴＧ４７のＥcoＲＩフ
ラグメントをプローブとして調べた。
と期待される：野生株においては、ｄａｐＤ遺伝子の
５′領域に対応する２.８−kbバンド及び該遺伝子の
３′領域に対応する３.４−kbバンド（図６）；欠失株
においては、カナマイシン耐性遺伝子、ｄａｐＤ遺伝子
の側方に尚存在する５′領域（２.４kb）及びｄａｐＤ
遺伝子の側方に尚存在する３′領域（２.８kb）（図
８） （２）カナマイシン耐性遺伝子の取り込みの証明 ＰstＩ又はＢamＨＩ及びＨind IIIで切断されたＧＣ４
５４０、ＴＧＥ７２１３、ＴＧＥ７２１４及びＴＧＥ９
０１の染色体ＤＮＡを比較し、ｐＴＧ４７のＥcoＲＩフ
ラグメントをプローブとして調べた。
【０１５０】ＰstＩは、１.３−kbバンドを遊離する。
【０１５１】ＢamＨＩ及びＨind III制限は、欠失株に
ついてのみ０.７kb及び０.６kbの２つのフラグメントを
与え得る。ＴＧＥ９０１又はＧＣ４５４０においては、
バンドは認められない（図９Ａ）。
ついてのみ０.７kb及び０.６kbの２つのフラグメントを
与え得る。ＴＧＥ９０１又はＧＣ４５４０においては、
バンドは認められない（図９Ａ）。
【０１５２】これらの結果より、カナマイシン耐性遺伝
子が欠失株の染色体に組み込まれ、該遺伝子がｐＵＣ−
４Ｋに由来することがわかる。
子が欠失株の染色体に組み込まれ、該遺伝子がｐＵＣ−
４Ｋに由来することがわかる。
【０１５３】（３）ｄａｐＤ遺伝子の染色体からの欠失
の証明 ＧＣ４５４０、ＴＧＥ７２１３、７２１４及びＴＧＥ９
０１の染色体ＤＮＡを、対照としてＭ１３ＴＧ６２０、
Ｍ１３ＴＧ５９７、ｐＤＢ６のＢamＨＩ−Ｈind IIIフ
ラグメント及びＰstＩで切断された同フラグメント（図
６）を用いて、比較する。
の証明 ＧＣ４５４０、ＴＧＥ７２１３、７２１４及びＴＧＥ９
０１の染色体ＤＮＡを、対照としてＭ１３ＴＧ６２０、
Ｍ１３ＴＧ５９７、ｐＤＢ６のＢamＨＩ−Ｈind IIIフ
ラグメント及びＰstＩで切断された同フラグメント（図
６）を用いて、比較する。
【０１５４】染色体ＤＮＡは、ＰstＩ又はＢamＨＩ及び
Ｈind IIIで切断される。
Ｈind IIIで切断される。
【０１５５】ＥcoＲＩで切断されたＭ１３ＴＧ６２０
は、ｄａｐＤ遺伝子の５′側を特異的に含有するバンド
から単離され、これをプローブとして使用する（図９
Ｂ）。
は、ｄａｐＤ遺伝子の５′側を特異的に含有するバンド
から単離され、これをプローブとして使用する（図９
Ｂ）。
【０１５６】ＰstＩで消化後、野生株においては、ｄａ
ｐＤ遺伝子の５′領域に対応する２.８−kbバンド及び
予期しなかった１.７−kbバンドが認められることが判
る。
ｐＤ遺伝子の５′領域に対応する２.８−kbバンド及び
予期しなかった１.７−kbバンドが認められることが判
る。
【０１５７】ＢamＨＩ及びＨind IIIで消化後、ｐＤＢ
６由来のバンド（９kb）よりも大きい約１２−kbのバン
ドが認められる。更に、付加的な２.５−kbバンドも野
生株に存在する（図９Ｂ）。
６由来のバンド（９kb）よりも大きい約１２−kbのバン
ドが認められる。更に、付加的な２.５−kbバンドも野
生株に存在する（図９Ｂ）。
【０１５８】欠失株については、どの消化フラグメント
にも有意な相同性（homology）は認められない。
にも有意な相同性（homology）は認められない。
【０１５９】これらの観察により下記のことが判る：ｄ
ａｐＤ遺伝子の５′部分をカバーするプローブは、株Ｔ
ＧＥ７２１３及び７２１４の染色体中のいかなるバンド
も明らかにしない。このことは該遺伝子の５′側の欠失
を示す；野生株においては、ｄａｐＤ遺伝子に特異的な
第２のバンドが予測されたバンドの他にも認められるた
め、該遺伝子はこれらの菌株中では重複していると思わ
れる。
ａｐＤ遺伝子の５′部分をカバーするプローブは、株Ｔ
ＧＥ７２１３及び７２１４の染色体中のいかなるバンド
も明らかにしない。このことは該遺伝子の５′側の欠失
を示す；野生株においては、ｄａｐＤ遺伝子に特異的な
第２のバンドが予測されたバンドの他にも認められるた
め、該遺伝子はこれらの菌株中では重複していると思わ
れる。
【０１６０】ｄａｐＤ遺伝子の重複は予期されなかった
ことであったので、我々は数種の野生株においてこの重
複を確認し、５′側に加えて３′側からのｄａｐＤ遺伝
子の欠失を確認した。
ことであったので、我々は数種の野生株においてこの重
複を確認し、５′側に加えて３′側からのｄａｐＤ遺伝
子の欠失を確認した。
【０１６１】ＰstＩで消化後、同じ染色体ＤＮＡ及び対
照ＤＮＡが用いられる（図８）。
照ＤＮＡが用いられる（図８）。
【０１６２】プローブはＫpnＩ及びＢglIIで切断された
ｐＴＧ４７である。上記予期されたバンドの他に、この
プローブは少くとも１.７−kbのバンドを認識するはず
である。事実、ｐＴＧ４７は５′及び ３′側からのｄ
ａｐＤ遺伝子に対し相同性を有する３００bp及び１００
bpを各々有し、これらは欠失株でも認められねばならな
い。
ｐＴＧ４７である。上記予期されたバンドの他に、この
プローブは少くとも１.７−kbのバンドを認識するはず
である。事実、ｐＴＧ４７は５′及び ３′側からのｄ
ａｐＤ遺伝子に対し相同性を有する３００bp及び１００
bpを各々有し、これらは欠失株でも認められねばならな
い。
【０１６３】図９Ｃは下記のことを示す：２.８−kb及
び２.４−kbのバンドは欠失株で認められ、３.４−kb及
び２.８−kbバンドが野生株で認めらる。加えて、カナ
マイシン耐性遺伝子に対応する１.３−kbバンドが認め
られる。このことは、株ＴＧＥ７２１３及び７２１４の
欠失を証明するものである；重複したｄａｐＤ遺伝子に
よる２つの強度の弱いバンドも又、野生株においてのみ
現れる。１.７−kbバンドは５′部について認められる
ことが知られているので、２.１−kbバンドは３′側よ
り由来したものであるに違いない。このことは、これら
の株が欠失株では消失している重複を有することを証明
するものである。
び２.４−kbのバンドは欠失株で認められ、３.４−kb及
び２.８−kbバンドが野生株で認めらる。加えて、カナ
マイシン耐性遺伝子に対応する１.３−kbバンドが認め
られる。このことは、株ＴＧＥ７２１３及び７２１４の
欠失を証明するものである；重複したｄａｐＤ遺伝子に
よる２つの強度の弱いバンドも又、野生株においてのみ
現れる。１.７−kbバンドは５′部について認められる
ことが知られているので、２.１−kbバンドは３′側よ
り由来したものであるに違いない。このことは、これら
の株が欠失株では消失している重複を有することを証明
するものである。
【０１６４】株ＲＨ５３４５及びＲＬ５８のＰstＩで切
断された染色体のＤＮＡを、ＴＧＥ９０１とＲＬ５８の
接合により得られた ｄａｐＤ-変異株と比較した。これ
らＤＮＡは、ＫpnＩ、カナマイシン耐性遺伝子（何も明
らかにしない）を有するｐＴＧ４７より単離されたＢgl
II断片及び遺伝子ｄａｐＤの側方にある領域を用いて調
べられた。図９Ｄは、ＲＨ５３４５において３.４及び
２.８−kbのバンドのみが認められ、ＧＣ４５４０及び
ＴＧＥ９０１に存在する遺伝子の重複によるバンドは認
められないことを示す。更に、７−kbバンドのみが、Ｒ
Ｌ５８及びＴＧＥ７６１５について認められ、このこと
はＰstＩ部位の欠失を示す。これにより、これら２つの
変異株が同一であり、少くともｄａｐＤ遺伝子のＰstＩ
部位において影響を受けることが証明されている。
断された染色体のＤＮＡを、ＴＧＥ９０１とＲＬ５８の
接合により得られた ｄａｐＤ-変異株と比較した。これ
らＤＮＡは、ＫpnＩ、カナマイシン耐性遺伝子（何も明
らかにしない）を有するｐＴＧ４７より単離されたＢgl
II断片及び遺伝子ｄａｐＤの側方にある領域を用いて調
べられた。図９Ｄは、ＲＨ５３４５において３.４及び
２.８−kbのバンドのみが認められ、ＧＣ４５４０及び
ＴＧＥ９０１に存在する遺伝子の重複によるバンドは認
められないことを示す。更に、７−kbバンドのみが、Ｒ
Ｌ５８及びＴＧＥ７６１５について認められ、このこと
はＰstＩ部位の欠失を示す。これにより、これら２つの
変異株が同一であり、少くともｄａｐＤ遺伝子のＰstＩ
部位において影響を受けることが証明されている。
【０１６５】結論として、これらの実験は下記のことを
示す：株ＴＧＥ７２１３及び７２１４は、ｄａｐＤ遺伝
子を欠失し、カナマイシン耐性遺伝子を有する；ＲＬ５
８及びＴＧＥ７６１５のｄａｐＤ-突然変異は少くとも
ｄａｐＤ遺伝子のＰstＩ部位に存在する；いくつかの大
腸菌株はｄａｐＤ遺伝子の重複があり、この重複は欠失
株では認められない。
示す：株ＴＧＥ７２１３及び７２１４は、ｄａｐＤ遺伝
子を欠失し、カナマイシン耐性遺伝子を有する；ＲＬ５
８及びＴＧＥ７６１５のｄａｐＤ-突然変異は少くとも
ｄａｐＤ遺伝子のＰstＩ部位に存在する；いくつかの大
腸菌株はｄａｐＤ遺伝子の重複があり、この重複は欠失
株では認められない。
【０１６６】受容株の２つのｄａｐＤ遺伝子は、形質導
入により欠失するので、重複遺伝子は、第一のｄａｐＤ
遺伝子と近接（大腸菌の染色体地図上の２′未満）して
いる。
入により欠失するので、重複遺伝子は、第一のｄａｐＤ
遺伝子と近接（大腸菌の染色体地図上の２′未満）して
いる。
【０１６７】実施例１２ cer 遺伝のクローニング
cer 遺伝子をＣol Ｅ１プラスミド（その配列はチャン
(Chan）等（１９８５）により公表されている）より１.
８５−kb ＨaeIIフラグメントの形で回収する。
(Chan）等（１９８５）により公表されている）より１.
８５−kb ＨaeIIフラグメントの形で回収する。
【０１６８】その後、該ＨaeIIフラグメントをＨpaIIで
切断し、クレノーで処理し、０.４−kbバンドを回収す
る。Ｍ１３mp１３０をＥcoＲＶで切断し、ホスファター
ゼで処理する。Ｃol Ｅ１の０.４−kbフラグメントを
Ｍ１３ｍｐ１３０にリゲートし、株ＪＭ１０３に導入す
る。Ｃol Ｅ１cer フラグメントの存在は、ＳmaＩ及び
Ｈind IIIで切断されて遊離した０.４−kbバンドの配列
決定により確認された。
切断し、クレノーで処理し、０.４−kbバンドを回収す
る。Ｍ１３mp１３０をＥcoＲＶで切断し、ホスファター
ゼで処理する。Ｃol Ｅ１の０.４−kbフラグメントを
Ｍ１３ｍｐ１３０にリゲートし、株ＪＭ１０３に導入す
る。Ｃol Ｅ１cer フラグメントの存在は、ＳmaＩ及び
Ｈind IIIで切断されて遊離した０.４−kbバンドの配列
決定により確認された。
【０１６９】Ｍ１３ｍｐ１３１のポリリンカー中に挿入
されたcer 遺伝子を、ＳmaＩ及びＨind IIIによる消化
後単離し、ＢglIIで切断したｐＴＧ７２０ベクター（ヒ
ルジン遺伝子を有する、図２）にリゲートし、クレノー
で処理する。得られたプラスミドがｐＴＧ７２０cer で
ある。
されたcer 遺伝子を、ＳmaＩ及びＨind IIIによる消化
後単離し、ＢglIIで切断したｐＴＧ７２０ベクター（ヒ
ルジン遺伝子を有する、図２）にリゲートし、クレノー
で処理する。得られたプラスミドがｐＴＧ７２０cer で
ある。
【０１７０】実施例１３ cer 遺伝子及びｄａｐＤ遺伝子を含有するクローニング
ベクターの構築 （１）アンピシリン耐性をコードするベクターにおける
Ｍ１３ｍｐ１３１ポリリンカーのオリエンテーションの
逆位（inversion ） ｐＴＧ１９２（図１）をＥcoＲＩ及びＢglIIで切断しＭ
１３ｍｐ１３１ポリリンカーを遊離させ、ＨaeIII消化
により短くする。例えば、ｐＴＧ７３０（フランス特許
８６／１６，７２３に記載のヒルジンの発現ベクター）
等のアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドを用い
る；このプラスミドは、ＢglII及びＥcoＲＩで切断さ
れ、ｐＴＧ１９２のＥcoＲＩ−ＢglIIフラグメントに結
合（ligate）される。こうして、ｐＴＧ７３０のヒルジ
ン構造遺伝子とＰLを含有する発現ブロックが失われ、
Ｍ１３ｍｐ１３１ポリリンカーで置換される。この新し
いプラスミドをｐＴＧ７９０と呼ぶ（図１０）。
ベクターの構築 （１）アンピシリン耐性をコードするベクターにおける
Ｍ１３ｍｐ１３１ポリリンカーのオリエンテーションの
逆位（inversion ） ｐＴＧ１９２（図１）をＥcoＲＩ及びＢglIIで切断しＭ
１３ｍｐ１３１ポリリンカーを遊離させ、ＨaeIII消化
により短くする。例えば、ｐＴＧ７３０（フランス特許
８６／１６，７２３に記載のヒルジンの発現ベクター）
等のアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドを用い
る；このプラスミドは、ＢglII及びＥcoＲＩで切断さ
れ、ｐＴＧ１９２のＥcoＲＩ−ＢglIIフラグメントに結
合（ligate）される。こうして、ｐＴＧ７３０のヒルジ
ン構造遺伝子とＰLを含有する発現ブロックが失われ、
Ｍ１３ｍｐ１３１ポリリンカーで置換される。この新し
いプラスミドをｐＴＧ７９０と呼ぶ（図１０）。
【０１７１】（２）cer フラグメントのクローニングベ
クターへの導入 ｐＴＧ７９０をＳstＩ及びＫpnＩで切断し、ホスファタ
ーゼで処理する。この消化により得られるフラグメント
は、ｐＴＧ７２０cer にリゲートされ、ＳstＩ及びＫpn
Ｉで切断され（これにより、cer フラグメントが遊離さ
れる）、ＢglII消化により短くされる。得られるベクタ
ーｐＴＧ７９２は、cer フラグメントを含有する（図１
１）。
クターへの導入 ｐＴＧ７９０をＳstＩ及びＫpnＩで切断し、ホスファタ
ーゼで処理する。この消化により得られるフラグメント
は、ｐＴＧ７２０cer にリゲートされ、ＳstＩ及びＫpn
Ｉで切断され（これにより、cer フラグメントが遊離さ
れる）、ＢglII消化により短くされる。得られるベクタ
ーｐＴＧ７９２は、cer フラグメントを含有する（図１
１）。
【０１７２】（３）ｄａｐＤ遺伝子のcer フラグメント
含有ベクターへの導入 ｐＴＧ７９２をＥcoＲＩで切断し、クレノウ（Klenow）
及びホスファターゼで処理する。得られるフラグメント
と、ｄａｐＤ遺伝子を含有するｐＤＢ６由来の１.３−k
b ＡluＩフラグメント（図６）とをリゲートする。２
つのプラスミドｐＴＧ７９２２及びｐＴＧ７９２３が得
られる。両者は、２つのＥcoＲＩ部位間に位置するｄａ
ｐＤ遺伝子のオリエンテーションにおいてのみ異なる。
ｐＴＧ７９２２に関しては、上記３つの遺伝子即ち、複
製起源、アンピシリン耐性及びｄａｐＤの各遺伝子用の
プロモーターが同一方向に配向している（図１２）。
含有ベクターへの導入 ｐＴＧ７９２をＥcoＲＩで切断し、クレノウ（Klenow）
及びホスファターゼで処理する。得られるフラグメント
と、ｄａｐＤ遺伝子を含有するｐＤＢ６由来の１.３−k
b ＡluＩフラグメント（図６）とをリゲートする。２
つのプラスミドｐＴＧ７９２２及びｐＴＧ７９２３が得
られる。両者は、２つのＥcoＲＩ部位間に位置するｄａ
ｐＤ遺伝子のオリエンテーションにおいてのみ異なる。
ｐＴＧ７９２２に関しては、上記３つの遺伝子即ち、複
製起源、アンピシリン耐性及びｄａｐＤの各遺伝子用の
プロモーターが同一方向に配向している（図１２）。
【０１７３】（４）アンピシリン耐性遺伝子の欠失
下記構築法は、複数の目的を有する。即ち、
−ｄａｐＤ遺伝子を含有するベクターからアンピシリン
耐性遺伝子を欠失させること、 −cer 遺伝子を含有するｄａｐＤクローニングベクター
を得ること、 −Ｍ１３ｍｐ１３１ポリリンカー（cer のクローニング
に用いられたＥcoＲＶ部位がない）を含有するｄａｐＤ
クローニングベクターを得ること、及び −単一ＥcoＲＩ部位を有するｄａｐＤベクターを得るこ
と。
耐性遺伝子を欠失させること、 −cer 遺伝子を含有するｄａｐＤクローニングベクター
を得ること、 −Ｍ１３ｍｐ１３１ポリリンカー（cer のクローニング
に用いられたＥcoＲＶ部位がない）を含有するｄａｐＤ
クローニングベクターを得ること、及び −単一ＥcoＲＩ部位を有するｄａｐＤベクターを得るこ
と。
【０１７４】ＰstＩフラグメントを、夫々ｄａｐＤ遺伝
子の３′及び５′部分及びcer 遺伝子を含有するｐＴＧ
７９２２及びｐＴＧ７９２３から回収し、これを類似し
ているが、ＥcoＲＩ又はＡvaＩ部位又はcer を有しない
フラグメントを含有するｄａｐベクター中に導入する。
この類似するベクターは、夫々前記ｐＴＧ７６７及びｐ
ＴＧ７６６である。
子の３′及び５′部分及びcer 遺伝子を含有するｐＴＧ
７９２２及びｐＴＧ７９２３から回収し、これを類似し
ているが、ＥcoＲＩ又はＡvaＩ部位又はcer を有しない
フラグメントを含有するｄａｐベクター中に導入する。
この類似するベクターは、夫々前記ｐＴＧ７６７及びｐ
ＴＧ７６６である。
【０１７５】即ち、ｐＴＧ７９２２及びｐＴＧ７９２３
をＰstＩで切断し、ＢglII消化により短くし、ＰstＩで
切断されホスファターゼで処理されたｐＴＧ７６７及び
ｐＴＧ７６６に夫々リゲートする。得られるクローニン
グベクターは、夫々ｐＴＧ７６９及びｐＴＧ７６８であ
る（ｐＴＧ７６９を図１３に示す）。
をＰstＩで切断し、ＢglII消化により短くし、ＰstＩで
切断されホスファターゼで処理されたｐＴＧ７６７及び
ｐＴＧ７６６に夫々リゲートする。得られるクローニン
グベクターは、夫々ｐＴＧ７６９及びｐＴＧ７６８であ
る（ｐＴＧ７６９を図１３に示す）。
【０１７６】実施例１４ カテコール２，３−オキシゲナーゼ（Ｃ 2, 3Ｏ）用の発
現ベクターの構築へのｄａｐモデルの応用 （１）Ｃ 2, 3Ｏの上流のＢamＨＩ部位を有しないベクタ
ー Ｃ2,3Ｏの構造遺伝子を上記ｄａｐベクターｐＴＧ７６
７１中へ導入すべく、ｐＴＧ４４４から回収する。
現ベクターの構築へのｄａｐモデルの応用 （１）Ｃ 2, 3Ｏの上流のＢamＨＩ部位を有しないベクタ
ー Ｃ2,3Ｏの構造遺伝子を上記ｄａｐベクターｐＴＧ７６
７１中へ導入すべく、ｐＴＧ４４４から回収する。
【０１７７】ｐＴＧ４４４は、非再生ＸmaIII部位を除
けばツコウスキー（Zukowski）ら（１９８４）により記
載されたｐＴＧ４４５と同一である。ｐＴＧ４４４をＢ
amＨＩ及びＨind IIIで切断し、ＢamＨＩ及びＨind III
で切断されホスファターゼで処理されたｐＴＧ７６９に
リゲートする。得られるプラスミド、即ちｐＴＧ７４０
１はＣ2,3Ｏの構造遺伝子を含有しない。
けばツコウスキー（Zukowski）ら（１９８４）により記
載されたｐＴＧ４４５と同一である。ｐＴＧ４４４をＢ
amＨＩ及びＨind IIIで切断し、ＢamＨＩ及びＨind III
で切断されホスファターゼで処理されたｐＴＧ７６９に
リゲートする。得られるプラスミド、即ちｐＴＧ７４０
１はＣ2,3Ｏの構造遺伝子を含有しない。
【０１７８】ｐＴＧ７６７１は、２つのＢglII部位、即
ち、ポリリンカーのＰL形成部の上流の部位及びリボソ
ーム結合部位中に位置するＰLの下流でγ−インターフ
ェロンの構造遺伝子の上流の部位を有する。ｐＴＧ７６
７１をＢglIIで切断し、ＫpnＩ消化により短くする。得
られる混合物をｐＴＧ７４０１にリゲートし、ＢglII及
びＢamＨＩにてそのポリリンカーにおいて切断し、ホス
ファターゼで処理する。ＢglII部位は、このリゲーショ
ンにより再構成されるが、ＢglII部位にリゲートされた
ＢamＨＩ部位は失われる。Ｃ2,3Ｏの構造遺伝子につい
て、ＰLの２つのオリエンテーションが可能である。
Ｃ2,3ＯがＰLの制御下にある構造を区別するために、Ｂ
amＨＩ及びＢglIIを用いて切断を行なう（事実、所望の
オリエンテーションに関しては、ＢamＨＩ部位がＢglII
部位の近傍に存在し、実際上、消化により４.３−kbの
バンドのみが得られるであろう。また、他のオリエンテ
ーションにおいては、消化により３.９−kbのバンドと
０.４−kbのバンドが遊離される。
ち、ポリリンカーのＰL形成部の上流の部位及びリボソ
ーム結合部位中に位置するＰLの下流でγ−インターフ
ェロンの構造遺伝子の上流の部位を有する。ｐＴＧ７６
７１をＢglIIで切断し、ＫpnＩ消化により短くする。得
られる混合物をｐＴＧ７４０１にリゲートし、ＢglII及
びＢamＨＩにてそのポリリンカーにおいて切断し、ホス
ファターゼで処理する。ＢglII部位は、このリゲーショ
ンにより再構成されるが、ＢglII部位にリゲートされた
ＢamＨＩ部位は失われる。Ｃ2,3Ｏの構造遺伝子につい
て、ＰLの２つのオリエンテーションが可能である。
Ｃ2,3ＯがＰLの制御下にある構造を区別するために、Ｂ
amＨＩ及びＢglIIを用いて切断を行なう（事実、所望の
オリエンテーションに関しては、ＢamＨＩ部位がＢglII
部位の近傍に存在し、実際上、消化により４.３−kbの
バンドのみが得られるであろう。また、他のオリエンテ
ーションにおいては、消化により３.９−kbのバンドと
０.４−kbのバンドが遊離される。
【０１７９】ＰLの制御下にあるＣ2,3Ｏを有する、選択
されたプラスミドｐＴＧ７４０７は、下記に示すｐＴＧ
７４０６（図１４参照）と近似した構造を有するが、Ｃ
2,3Ｏの上流のＢamＨＩ部位を失っている。
されたプラスミドｐＴＧ７４０７は、下記に示すｐＴＧ
７４０６（図１４参照）と近似した構造を有するが、Ｃ
2,3Ｏの上流のＢamＨＩ部位を失っている。
【０１８０】（２）Ｃ 2, 3Ｏの上流のＢamＨＩ部位を有
するベクター ｐＴＧ７６９をＢglII及びＢamＨＩで切断し、ホスファ
ターゼで処理し、λの完全なＮ遺伝子及びＰLを含有す
る任意の発現プラスミド（ｐＴＧ９０７）のＢamＨＩ−
ＢglIIフラグメントにリゲートする。構築物ｐＴＧ７４
００が得られるが、これはＢamＨＩ及びＢglII切断によ
り２.６−kb及び１.３−kbの２つのバンドを遊離するこ
とにより同定される。この構築物は、ＰL及び完全なＮ
遺伝子を含有する。
するベクター ｐＴＧ７６９をＢglII及びＢamＨＩで切断し、ホスファ
ターゼで処理し、λの完全なＮ遺伝子及びＰLを含有す
る任意の発現プラスミド（ｐＴＧ９０７）のＢamＨＩ−
ＢglIIフラグメントにリゲートする。構築物ｐＴＧ７４
００が得られるが、これはＢamＨＩ及びＢglII切断によ
り２.６−kb及び１.３−kbの２つのバンドを遊離するこ
とにより同定される。この構築物は、ＰL及び完全なＮ
遺伝子を含有する。
【０１８１】次いで、上記ｐＴＧ７４００をＨpaＩで切
断し、リン酸化されハイブリダイズされたＢamＨＩリン
カー、ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ（ベセスダ リサーチ ラ
ボラトリー（Bethesda Research Laboratory）により市
販されている）をその中へ挿入する。こうして、ＨpaＩ
部位を失ったが２つのＢamＨＩ部位を含有するｐＴＧ７
４０２を得る。
断し、リン酸化されハイブリダイズされたＢamＨＩリン
カー、ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ（ベセスダ リサーチ ラ
ボラトリー（Bethesda Research Laboratory）により市
販されている）をその中へ挿入する。こうして、ＨpaＩ
部位を失ったが２つのＢamＨＩ部位を含有するｐＴＧ７
４０２を得る。
【０１８２】該ｐＴＧ７４０２をＢamＨＩで切断し、再
リゲートしてｐＴＧ７４０４を得る。この方法により、
１つのＢamＨＩ部位を除去し、Ｎ遺伝子を切形（trunca
te）する。
リゲートしてｐＴＧ７４０４を得る。この方法により、
１つのＢamＨＩ部位を除去し、Ｎ遺伝子を切形（trunca
te）する。
【０１８３】（３）Ｃ 2, 3Ｏ遺伝子のｄａｐ−ｃｅｒベ
クターへの導入 上記ｐＴＧ７４０２をＢamＨＩ及びＨind IIIで切断
し、ホスファターゼで処理し、ｐＴＧ４４４のＢglII−
Ｈind IIIフラグメントをその中へ導入し、ｐＴＧ７４
０６を得る（図１４参照）。これは、ｐＴＧ７４０７と
比べると、Ｃ2,3Ｏ遺伝子がＢamＨＩ−Ｈind III切断に
より除去されてｐＴＧ４４４から導入されたフラグメン
トが回収される点において異なっている。
クターへの導入 上記ｐＴＧ７４０２をＢamＨＩ及びＨind IIIで切断
し、ホスファターゼで処理し、ｐＴＧ４４４のＢglII−
Ｈind IIIフラグメントをその中へ導入し、ｐＴＧ７４
０６を得る（図１４参照）。これは、ｐＴＧ７４０７と
比べると、Ｃ2,3Ｏ遺伝子がＢamＨＩ−Ｈind III切断に
より除去されてｐＴＧ４４４から導入されたフラグメン
トが回収される点において異なっている。
【０１８４】（４）プラスミドｐＴＧ７４０７により形
質転換されたｄａｐ -イー．コリ（Ｅ．coli）株中での
Ｃ 2, 3Ｏの発現 バクテリアＴＧＥ７２１３／ｐＴＧ７４０７中でのＣ2,
3Ｏ遺伝子の発現を、３０℃にて４時間及び７時間培養
後に及び４時間及び７時間後に４２℃にて誘導中に観察
した。夫々の観察のため、サンプルを培養物から回収
し、遠心分離し、ペレットをリン酸塩緩衝液で洗浄し、
同緩衝液中にとり（ツコウスキー(Zukowski）ら、１９
８３に記載の方法に従う）、次いで、超音波で３回２０
秒間処理する。
質転換されたｄａｐ -イー．コリ（Ｅ．coli）株中での
Ｃ 2, 3Ｏの発現 バクテリアＴＧＥ７２１３／ｐＴＧ７４０７中でのＣ2,
3Ｏ遺伝子の発現を、３０℃にて４時間及び７時間培養
後に及び４時間及び７時間後に４２℃にて誘導中に観察
した。夫々の観察のため、サンプルを培養物から回収
し、遠心分離し、ペレットをリン酸塩緩衝液で洗浄し、
同緩衝液中にとり（ツコウスキー(Zukowski）ら、１９
８３に記載の方法に従う）、次いで、超音波で３回２０
秒間処理する。
【０１８５】１０，０００ｇにて１０分間遠心分離後の
ペレットを不溶性フラクション（Ｐ）、上清を可溶性フ
ラクション（Ｓ）とする。
ペレットを不溶性フラクション（Ｐ）、上清を可溶性フ
ラクション（Ｓ）とする。
【０１８６】各フラクション中に存在する蛋白質をＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分析す
る。各バンドは、クーマシーブルー(Coomassie blue）
で染色することにより顕現化する。結果を図１５に示
す。ＭＷ３５,０００のバンドの強度が、特に４２℃に
て誘導７時間後に、観察される。ゲルの“スキャニン
グ”により、フラクションＳ及びＰにおいて夫々約６４
％及び７５％のＣ2,3Ｏが得られる。
Ｓポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分析す
る。各バンドは、クーマシーブルー(Coomassie blue）
で染色することにより顕現化する。結果を図１５に示
す。ＭＷ３５,０００のバンドの強度が、特に４２℃に
て誘導７時間後に、観察される。ゲルの“スキャニン
グ”により、フラクションＳ及びＰにおいて夫々約６４
％及び７５％のＣ2,3Ｏが得られる。
【０１８７】よりリッチなサンプル（Ｓ，４２℃にて７
時間）において、Ｃ2,3Ｏの特異的活性を、（ツコウス
キー（Ｚukowski ）ら、１９８３記載の方法に従い）基
質としてカテコールを添加することにより測定する。２
８〜３５Ｕ／ｍｇの特異的活性が測定される。
時間）において、Ｃ2,3Ｏの特異的活性を、（ツコウス
キー（Ｚukowski ）ら、１９８３記載の方法に従い）基
質としてカテコールを添加することにより測定する。２
８〜３５Ｕ／ｍｇの特異的活性が測定される。
【０１８８】純粋な酵素組成物の特異的活性は２８０Ｕ
／ｍｇであり、分析された抽出物は約１２％の活性Ｃ2,
3Ｏを含有する。
／ｍｇであり、分析された抽出物は約１２％の活性Ｃ2,
3Ｏを含有する。
【０１８９】実施例１５ cer フラグメントのγ−インターフェロン発現ベクター
への導入 上記ｐＴＧ７６７１をそのポリリンカーにおいてＳstＩ
（ＳacＩと同一）及びＫpnＩで切断し、次いでホスファ
ターゼで処理し、ＳstＩ及びＫpnＩで切断されたｐＴＧ
７２０cer フラグメントにリゲートする。ＴＧＥ７６１
５中に形質転換後、１つの候補ｐＴＧ７６７５を選択す
る（図１６）。これは、ＳstＩ及びＫpnＩで消化すると
４００bp及び３.４−kbの２つのフラグメントを遊離す
る。
への導入 上記ｐＴＧ７６７１をそのポリリンカーにおいてＳstＩ
（ＳacＩと同一）及びＫpnＩで切断し、次いでホスファ
ターゼで処理し、ＳstＩ及びＫpnＩで切断されたｐＴＧ
７２０cer フラグメントにリゲートする。ＴＧＥ７６１
５中に形質転換後、１つの候補ｐＴＧ７６７５を選択す
る（図１６）。これは、ＳstＩ及びＫpnＩで消化すると
４００bp及び３.４−kbの２つのフラグメントを遊離す
る。
【０１９０】実施例１６ γ−インターフェロン発現の誘導（induction）中のプ
ラスミドの安定性の観察 ａ）アンピシリン耐性遺伝子含有ベクターについての４
２℃でのＬＢ培地中でのγ−インターフェロン発現の誘
導：ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０結果を表１０に示す。
ラスミドの安定性の観察 ａ）アンピシリン耐性遺伝子含有ベクターについての４
２℃でのＬＢ培地中でのγ−インターフェロン発現の誘
導：ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０結果を表１０に示す。
【０１９１】
【表１０】
【０１９２】総細胞数／ｍｌ／ＯＤユニットを測定し、
生存率（viability）の消失(loss)が真実の現象であっ
て、例えば細胞体積の変化によるものではないことを確
認する。これらのデータを表１０に併記する。Ｆｐ
-は、実施例７で定義した通りであり、所定時刻に存在
する総細胞数に対するｐ-細胞の数である。
生存率（viability）の消失(loss)が真実の現象であっ
て、例えば細胞体積の変化によるものではないことを確
認する。これらのデータを表１０に併記する。Ｆｐ
-は、実施例７で定義した通りであり、所定時刻に存在
する総細胞数に対するｐ-細胞の数である。
【０１９３】誘導７時間３０分後のＦｐ-が約２％に達
することが判る。従って、それは、前記実験（実施例９
参照）におけるよりも低いものであり、これら２つの実
験におけるプラスミドｐＴＧ４０の構造上の差にのみ起
因し得る。即ち、実際のところ、誘導の各時点において
プラスミドの量は同一であるが、最初の実験においては
プラスミドはダイマーの形態であり、他方ここに記載の
実験においては、主としてモノマー形態にある（ゲル上
の分析により示される）。プラスミドの状態（conditio
n)は、γ−インターフェロン産生に影響を与えないが、
プラスミドのモノマー形態が維持されない場合は、結論
として安定性が失われるものと説明できる。
することが判る。従って、それは、前記実験（実施例９
参照）におけるよりも低いものであり、これら２つの実
験におけるプラスミドｐＴＧ４０の構造上の差にのみ起
因し得る。即ち、実際のところ、誘導の各時点において
プラスミドの量は同一であるが、最初の実験においては
プラスミドはダイマーの形態であり、他方ここに記載の
実験においては、主としてモノマー形態にある（ゲル上
の分析により示される）。プラスミドの状態（conditio
n)は、γ−インターフェロン産生に影響を与えないが、
プラスミドのモノマー形態が維持されない場合は、結論
として安定性が失われるものと説明できる。
【０１９４】ｂ）ｄａｐ遺伝子について変異され、ｄａ
ｐＤ遺伝子及びｃｅｒ遺伝子を含有するベクターで形質
転換された菌株ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７５中での
γ−インターフェロン発現の誘導 結果を表１１に示す。
ｐＤ遺伝子及びｃｅｒ遺伝子を含有するベクターで形質
転換された菌株ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７５中での
γ−インターフェロン発現の誘導 結果を表１１に示す。
【０１９５】
【表１１】
【０１９６】総細胞数／ｍｌ／ＯＤユニットを測定す
る。ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０に比し大差は認められな
い。従って、生存率の現実の消失（loss）が確認され
る：誘導７時間３０分後、培養物のわずか０.０２％が
生存し続けるに過ぎない。この結果を、２.４％の値が
得られたＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０についての結果と比
較すべきである。このことは、Ｆｐ-にも現れており、
ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０に比し、ＴＧＥ７６１５／ｐ
ＴＧ７６７５の場合は１０００分の１に減少している。
しかし、いくつかのｐ-細胞は生存し続け、誘導終期に
現れる。プラスミド含量は前記と同一の特徴を有し、換
言すれば、増殖終期にコピー数が増加するが、cer を有
しないプラスミドと共に変化し得る数で存在する多量体
形態（multimeric form ）のものが、この場合は殆んど
存在しない。γ−インターフェロン産生量は、ｐＴＧ４
０の場合に比し、わずかに大きい。
る。ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０に比し大差は認められな
い。従って、生存率の現実の消失（loss）が確認され
る：誘導７時間３０分後、培養物のわずか０.０２％が
生存し続けるに過ぎない。この結果を、２.４％の値が
得られたＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０についての結果と比
較すべきである。このことは、Ｆｐ-にも現れており、
ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０に比し、ＴＧＥ７６１５／ｐ
ＴＧ７６７５の場合は１０００分の１に減少している。
しかし、いくつかのｐ-細胞は生存し続け、誘導終期に
現れる。プラスミド含量は前記と同一の特徴を有し、換
言すれば、増殖終期にコピー数が増加するが、cer を有
しないプラスミドと共に変化し得る数で存在する多量体
形態（multimeric form ）のものが、この場合は殆んど
存在しない。γ−インターフェロン産生量は、ｐＴＧ４
０の場合に比し、わずかに大きい。
【０１９７】ｃ）ｄａｐＤ遺伝子を欠失され、ｄａｐＤ
遺伝子及びcer を含有するベクターで形質転換された宿
主細胞ＴＧＥ７２１３／ｐＴＧ７６７５中でのγ−イン
ターフェロン発現の誘導 結果を表１２に示す。
遺伝子及びcer を含有するベクターで形質転換された宿
主細胞ＴＧＥ７２１３／ｐＴＧ７６７５中でのγ−イン
ターフェロン発現の誘導 結果を表１２に示す。
【０１９８】
【表１２】
【０１９９】結論は、ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０とＴＧ
Ｅ７６１５／ｐＴＧ７６７５との比較から導き出された
ものと同一である。即ち、死滅率（mortality）は、３.
５×１０-4のファクターに達し、総細胞数／ｍｌ／ＯＤ
ユニットの値は誘導中有意に変化しない。これと対照的
に、誘導７時間３０分後であっても、ｐ-細胞は現れな
い（２４時間後、全培養物はＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０
の場合はｐ-となり、ＴＧＥ７２１３／ｐＴＧ７６７５
の場合は１００％ｐ+のままであった）。プラスミド含
量は、多量体（multimer）の不存在下、ＴＧＥ７６１５
／ｐＴＧ７６７５のそれと同等である。γ−インターフ
ェロン産生量は、ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７５によ
り得られたよりもわずかに大きい。
Ｅ７６１５／ｐＴＧ７６７５との比較から導き出された
ものと同一である。即ち、死滅率（mortality）は、３.
５×１０-4のファクターに達し、総細胞数／ｍｌ／ＯＤ
ユニットの値は誘導中有意に変化しない。これと対照的
に、誘導７時間３０分後であっても、ｐ-細胞は現れな
い（２４時間後、全培養物はＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４０
の場合はｐ-となり、ＴＧＥ７２１３／ｐＴＧ７６７５
の場合は１００％ｐ+のままであった）。プラスミド含
量は、多量体（multimer）の不存在下、ＴＧＥ７６１５
／ｐＴＧ７６７５のそれと同等である。γ−インターフ
ェロン産生量は、ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７５によ
り得られたよりもわずかに大きい。
【０２００】実施例１７ α−１アンチトリプシン用の発現ベクターの構築へのｄ
ａｐモデルの適用 ｐＴＧ２９０１（フランス国特許８５／０７，３９３号
記載のｐＴＧ９８３の切形された（truncated ）誘導
体）由来のα−１アンチトリプシン発現ブロックを含有
するＰstＩフラグメント、即ち、ファージラムダプロモ
ーターＰL、切形されたＮ遺伝子、リボソーム結合部位
及びα−１アンチトリプシンの構造遺伝子（Ａｒ
ｇ358）を前記ｐＴＧ７９２中へ導入し、ＰstＩで切断
しホスファターゼで処理する。
ａｐモデルの適用 ｐＴＧ２９０１（フランス国特許８５／０７，３９３号
記載のｐＴＧ９８３の切形された（truncated ）誘導
体）由来のα−１アンチトリプシン発現ブロックを含有
するＰstＩフラグメント、即ち、ファージラムダプロモ
ーターＰL、切形されたＮ遺伝子、リボソーム結合部位
及びα−１アンチトリプシンの構造遺伝子（Ａｒ
ｇ358）を前記ｐＴＧ７９２中へ導入し、ＰstＩで切断
しホスファターゼで処理する。
【０２０１】得られる発現ベクターｐＴＧ７９１３を、
次いで、ＢglII及びＳstＩで切断し、α−１アンチトリ
プシン及びcer 遺伝子を含有する発現ブロックを、ｐＴ
Ｇ７６７中へ導入し、ＢglII及びＳstＩで切断し、ホス
ファターゼで処理する。
次いで、ＢglII及びＳstＩで切断し、α−１アンチトリ
プシン及びcer 遺伝子を含有する発現ブロックを、ｐＴ
Ｇ７６７中へ導入し、ＢglII及びＳstＩで切断し、ホス
ファターゼで処理する。
【０２０２】得られるプラスミドｐＴＧ７９１４は、ｄ
ａｐＤ遺伝子、cer 遺伝子及びα−１アンチトリプシン
発現ブロック（Ａｒｇ358）を含有する（図１７）。
ａｐＤ遺伝子、cer 遺伝子及びα−１アンチトリプシン
発現ブロック（Ａｒｇ358）を含有する（図１７）。
【０２０３】本発明の代表的菌株の寄託
下記菌株は、パリ リュ デュ ドクトル ルー ２５
のコレクシオン・ナシオナル・ド・クルチュール・デ・
ミクロオルガニスム（Ｃollection Ｎationalede Ｃult
ures des Ｍicroorganismes、Ｎational Ｃollection o
f ＭicrobialＣultures ）に寄託された。
のコレクシオン・ナシオナル・ド・クルチュール・デ・
ミクロオルガニスム（Ｃollection Ｎationalede Ｃult
ures des Ｍicroorganismes、Ｎational Ｃollection o
f ＭicrobialＣultures ）に寄託された。
【０２０４】
(1) ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７６７１ 寄託番号Ｉ−５８６
(2) ＴＧＥ７６１５／ｐＴＧ７７１ 寄託番号Ｉ−５８５
(1)(2)いずれも寄託日は１９８６年７月２５日である。
【０２０５】
(3) ＴＧＥ７２１４、ｄａｐＤ遺伝子を欠失されたコリ（coli）株
寄託番号Ｉ−６５２
(4) ＴＧＥ７３０３、ｄａｐＤ遺伝子を欠失されたコリ株
寄託番号Ｉ−６５３
上記２つの菌株は、ｄａｐＤ及びcer 遺伝子を含有する
プラスミドｐＴＧ７６８で形質転換されている。
プラスミドｐＴＧ７６８で形質転換されている。
【０２０６】
(5) ＴＧＥ７２１４／ｐＴＧ７４０７、Ｃ2,3Ｏの発現プラスミドで形質転換さ
れたｄａｐＤ-株 寄託番号Ｉ−６５５
（3),(4)のいずれも寄託日は１９８７年３月１０日であ
り、(5)の寄託日は１９８７年４月３日である。
り、(5)の寄託日は１９８７年４月３日である。
【０２０７】参考文献
１．ジョーンズ アイ．エム(Jones I.M.)、プリムロー
ズ エス．ビー．(Primrose S. B.)、ロビンソン エ
ー．(Robinson A.)、エルウッド ディー．シー．(Ellw
ood D. C.)（１９８０）、モレキュラー アンド ジェ
ネラル ジェネテッイクス(Mol. Gen. Genet.)１８０，
５７９−５８４。
ズ エス．ビー．(Primrose S. B.)、ロビンソン エ
ー．(Robinson A.)、エルウッド ディー．シー．(Ellw
ood D. C.)（１９８０）、モレキュラー アンド ジェ
ネラル ジェネテッイクス(Mol. Gen. Genet.)１８０，
５７９−５８４。
【０２０８】２．ニルソン ジェイ．(Nilsson J.）、
スコグマン ジー．(Skogman G.）、（１９８５）欧州
特許出願第８４８５０３１３．２号。
スコグマン ジー．(Skogman G.）、（１９８５）欧州
特許出願第８４８５０３１３．２号。
【０２０９】３．スコグマン ジー．(Skogman G.)、ニ
ルソン ジェイ．(Nilsson J.)、（１９８４）、ジーン
(Gene)、３１，１１７−１２２。
ルソン ジェイ．(Nilsson J.)、（１９８４）、ジーン
(Gene)、３１，１１７−１２２。
【０２１０】４．ミワ ケー．(Miwa K.)、ナカモリ
エス．(Nakamori S.)、サノ ケー．(Sano K.)、モモセ
エイチ．(Momose H.)、（１９８４）、Ａgric. Ｂio
l. Ｃhem、４８，２２３３−２２３７。
エス．(Nakamori S.)、サノ ケー．(Sano K.)、モモセ
エイチ．(Momose H.)、（１９８４）、Ａgric. Ｂio
l. Ｃhem、４８，２２３３−２２３７。
【０２１１】５．ミワ ケー．(Miwa K.）、ナカモリ
エス．(Nakamori S.)、サノ ケー．(Sano K.)、モモセ
エイチ．(Momose H.)、（１９８４）、ジーン(Gen
e)、３１，２７５−２７７。
エス．(Nakamori S.)、サノ ケー．(Sano K.)、モモセ
エイチ．(Momose H.)、（１９８４）、ジーン(Gen
e)、３１，２７５−２７７。
【０２１２】６．ハーシュバーガー シー．エル．(Her
shberger C. L.) 、ロステック ピー．アール．(Roste
ck P. R.)、（１９８４）米国特許第４，４３６，８１
５号。
shberger C. L.) 、ロステック ピー．アール．(Roste
ck P. R.)、（１９８４）米国特許第４，４３６，８１
５号。
【０２１３】７．ワーク イー．(Work E.)、（１９５
０）、ネイチャー(Nature)、１６５，７４−７５。
０）、ネイチャー(Nature)、１６５，７４−７５。
【０２１４】８．デイビス ビー．ディー．(Davis B.
D.)、ドウルベッコ アール.(Dulbecco R.)、アイゼン
エイチ．エヌ．(Eisen H．N.)、ギンスバーグ エイ
チ．エス．(Ginsberg H．S.)、ウッド ダブリュー．ビ
ー(Wood W. B.)（第２版、１９７３）、Ｍicrobiology
Ｅd. Ｈarper Ｉnternational、第７２頁。
D.)、ドウルベッコ アール.(Dulbecco R.)、アイゼン
エイチ．エヌ．(Eisen H．N.)、ギンスバーグ エイ
チ．エス．(Ginsberg H．S.)、ウッド ダブリュー．ビ
ー(Wood W. B.)（第２版、１９７３）、Ｍicrobiology
Ｅd. Ｈarper Ｉnternational、第７２頁。
【０２１５】９．ダウス−ル リベレンド ビー．(Dau
ce- Le Reverend B.)、ボワテル エム．（Boitel
M.)、デシャンプ エー．エム．(Deschamps A. M.)、ル
ボールジェイ−エム．(Lebeault J-M.）、サノ ケー、
(Sano K.)、タキナミ ケー．(Takinami K.)、パッテ
ジェイ−シー(Patte J-C）、（１９８２）、Ｅuropean
Ｊ．Ａppl.Ｍicrobiol. Ｂiotechnol.１５，２２７−２
３１。
ce- Le Reverend B.)、ボワテル エム．（Boitel
M.)、デシャンプ エー．エム．(Deschamps A. M.)、ル
ボールジェイ−エム．(Lebeault J-M.）、サノ ケー、
(Sano K.)、タキナミ ケー．(Takinami K.)、パッテ
ジェイ−シー(Patte J-C）、（１９８２）、Ｅuropean
Ｊ．Ａppl.Ｍicrobiol. Ｂiotechnol.１５，２２７−２
３１。
【０２１６】10. リチャウド シー．(Richaud C.)、リ
チャウド エフ．(Richaud F.)、マルチン シー．(Mar
tin C.)、ハジザ シー．(Haziza C.)、パッテ ジェイ
−シー．(Patte J-C)、（１９８４）、ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem
）、２５９，１４８２４−１４８２８。
チャウド エフ．(Richaud F.)、マルチン シー．(Mar
tin C.)、ハジザ シー．(Haziza C.)、パッテ ジェイ
−シー．(Patte J-C)、（１９８４）、ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（J. Biol. Chem
）、２５９，１４８２４−１４８２８。
【０２１７】11. ハナハン ディー．(Hanahan D.)、
（１９８３）、ジャーナル オブ モレキュラー バイ
オロジー(J. Mol. Biol.)，１６６，５５７−５８０。
（１９８３）、ジャーナル オブ モレキュラー バイ
オロジー(J. Mol. Biol.)，１６６，５５７−５８０。
【０２１８】12. ボレン エー．(Bollen A.)、ラセ
アール．(Lathe R.)、ハーツオグ エー．(Herzog
A.)、デニコート デイー．(Denicourt D.)、ルコック
ジェイ−ピー．(Lecocq J-P.)、デマレツ エル．(Dem
arez L.)、ラバレ アール．(Lavalle R.)、（１９７
９）、ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー
(J. Mol. Biol.）、１３２，２１９−２３３。
アール．(Lathe R.)、ハーツオグ エー．(Herzog
A.)、デニコート デイー．(Denicourt D.)、ルコック
ジェイ−ピー．(Lecocq J-P.)、デマレツ エル．(Dem
arez L.)、ラバレ アール．(Lavalle R.)、（１９７
９）、ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー
(J. Mol. Biol.）、１３２，２１９−２３３。
【０２１９】13. ゴッテスマン エム．イー．(Gottesm
an M. E.)、アドヒア エス(Adhya S.）、ダス エー．
(Das A.)、（１９８０）、ジャーナル オブ モレキュ
ラーバイオロジー(J. Mol. Biol.)、１４０，５７−７
５。
an M. E.)、アドヒア エス(Adhya S.）、ダス エー．
(Das A.)、（１９８０）、ジャーナル オブ モレキュ
ラーバイオロジー(J. Mol. Biol.)、１４０，５７−７
５。
【０２２０】14. ラスキー エム．(Lusky M.)、ボチャ
ン エム．(Botchan M.)、（１９８１）、ネイチャー(N
ature）、２９３，７９−８１。
ン エム．(Botchan M.)、（１９８１）、ネイチャー(N
ature）、２９３，７９−８１。
【０２２１】15. ヴイエイラ ジェイ．(Vieira J.)、
メシング ジェイ．(Messing J.)、（１９８２）、ジー
ン(Gene)、２２，２５９−２６８。
メシング ジェイ．(Messing J.)、（１９８２）、ジー
ン(Gene)、２２，２５９−２６８。
【０２２２】16. ラセ アール(Lathe R.)、キーニー
エム．ピー(Kieny M. P.)、スコーリー エス(Skory
S.)、ルコック ジェイ−ピー．(Lecocq J-P.)、（１９
８４）、ディーエヌエイ（ＤＮＡ）、３，１７３−１８
２。
エム．ピー(Kieny M. P.)、スコーリー エス(Skory
S.)、ルコック ジェイ−ピー．(Lecocq J-P.)、（１９
８４）、ディーエヌエイ（ＤＮＡ）、３，１７３−１８
２。
【０２２３】17. キーニー エム−ピー(Kieny M-P.)、
ラセ アール(Lathe R.)、ルコックジェイ−ピー．(Lec
ocq J-P.)、（１９８３）、ジーン(Gene）、２６，９１
−９９。
ラセ アール(Lathe R.)、ルコックジェイ−ピー．(Lec
ocq J-P.)、（１９８３）、ジーン(Gene）、２６，９１
−９９。
【０２２４】18. ベンデイアク ディー．エス．(Bendi
ak D. S.)、フリーセン ジェイ．ディー．(Friesen J.
D.) 、（１９８１）、モレキュラー アンド ジェネ
ラルジェネテイクス(Mol. Gen. Genet)、１８１，３５
６−３６２。
ak D. S.)、フリーセン ジェイ．ディー．(Friesen J.
D.) 、（１９８１）、モレキュラー アンド ジェネ
ラルジェネテイクス(Mol. Gen. Genet)、１８１，３５
６−３６２。
【０２２５】19. サマーズ ディー．ジェイ．(Summers
D. J.)、シャーラット ディー．ジェイ(Sherat D.
J.)、（１９８４）、セル（Ｃell）、３６，１０９７−
１１０３。
D. J.)、シャーラット ディー．ジェイ(Sherat D.
J.)、（１９８４）、セル（Ｃell）、３６，１０９７−
１１０３。
【０２２６】20. ベック イー．(Beck Ｅ.)、ルードウ
イッヒ ジー．(Ludwig G.)、アウエルスヴァルト イ
ー．エー．(Auersward E. A.)、ライス ビー．(Reiss
B.)及びシャラー エム．(Schaller M.)、ジーン（Ｇen
e)、１９，３２７−３３６（１９８２）。
イッヒ ジー．(Ludwig G.)、アウエルスヴァルト イ
ー．エー．(Auersward E. A.)、ライス ビー．(Reiss
B.)及びシャラー エム．(Schaller M.)、ジーン（Ｇen
e)、１９，３２７−３３６（１９８２）。
【０２２７】21. ベンデイアク デイー．エス．(Bendi
ak D. S.)及びフリーセン ジェイ．ディー．(Friesen
J. D.)、モレキュラー アンド ジェネラル ジェネテ
ィクス(Mol. Gen. Genet.)、１８１，３５６−３６２
（１９８１）。
ak D. S.)及びフリーセン ジェイ．ディー．(Friesen
J. D.)、モレキュラー アンド ジェネラル ジェネテ
ィクス(Mol. Gen. Genet.)、１８１，３５６−３６２
（１９８１）。
【０２２８】22. ボレン エー．(Bollen A.)、ラセ
アール．(Lathe R.)、ハーツォグ エー(Herzog A.)、
デニコート ディー．(Denicourt D.)、ルコック ジェ
イ．ピー．(Lecocq J. P.)、デスマレツ エル．(Desma
rez L.)及びラバレ アール．(Lavalle R.)、ジャーナ
ル オブ モレキュラー バイオロジー（Ｊ．Ｍol.Ｂi
ol.）、１３２，２１９−２３３（１９７９）。
アール．(Lathe R.)、ハーツォグ エー(Herzog A.)、
デニコート ディー．(Denicourt D.)、ルコック ジェ
イ．ピー．(Lecocq J. P.)、デスマレツ エル．(Desma
rez L.)及びラバレ アール．(Lavalle R.)、ジャーナ
ル オブ モレキュラー バイオロジー（Ｊ．Ｍol.Ｂi
ol.）、１３２，２１９−２３３（１９７９）。
【０２２９】23. ブクハリ エー．アイ.(Bukhari A.
I.)、テイラー エー．エル．(TaylorA. L.)、ジャーナ
ル オブ バクテリオロジー(J. Bacteriol.）、１０
５，８４４−８５４（１９７１）。
I.)、テイラー エー．エル．(TaylorA. L.)、ジャーナ
ル オブ バクテリオロジー(J. Bacteriol.）、１０
５，８４４−８５４（１９７１）。
【０２３０】24. チャン ピー．ティー．(Chan P.
T.)、オーモリ エイチ．(Ohmori H.)、トミザワ ジェ
イ．アイ．(Tomizawa J. I.)及びレボウィッツ ジェ
イ．ジェイ．(Lebowitz J. J.)、Biol. Chem．、２６
０，８９２５−８９３５（１９８５）。
T.)、オーモリ エイチ．(Ohmori H.)、トミザワ ジェ
イ．アイ．(Tomizawa J. I.)及びレボウィッツ ジェ
イ．ジェイ．(Lebowitz J. J.)、Biol. Chem．、２６
０，８９２５−８９３５（１９８５）。
【０２３１】25. ダリ アール(D’Ari R.)及びフイス
マン オー．(Huisman O.）、ジャーナル オブ バク
テリオロジー(J. Bacteriol.)、１５６，２４３−２５
０（１９８３）。
マン オー．(Huisman O.）、ジャーナル オブ バク
テリオロジー(J. Bacteriol.)、１５６，２４３−２５
０（１９８３）。
【０２３２】26. リチャウッド シー．(Richaud C.)、
リチャウッド エフ．(Richaud F.)、マルチン シー．
(Martin C.)、ハジザ シー．(Haziza C.)及びパッテ
ジェイ．シー．(Patte J. C.)、ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂiol. Ｃhem.）、
２５９，１４８２４−１４８２８、１９８４。
リチャウッド エフ．(Richaud F.)、マルチン シー．
(Martin C.)、ハジザ シー．(Haziza C.)及びパッテ
ジェイ．シー．(Patte J. C.)、ジャーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂiol. Ｃhem.）、
２５９，１４８２４−１４８２８、１９８４。
【０２３３】27. サマーズ ディー.ケー．(Summers D.
K.)及びスファーラット(Spherratt）、セル（Ｃell
）、３６，１０９７−１１０３（１９８４）。
K.)及びスファーラット(Spherratt）、セル（Ｃell
）、３６，１０９７−１１０３（１９８４）。
【０２３４】28. ツコウスキー エム．エム．(Zukowsk
i M. M.)、ガフニー ディー．エフ．(Gaffney D.
F.)、スペック ディー(Speck D.)、カウフマン エ
ム．(KauffmanM.)、フィンデリ エー．(Findeli A.)、
ワイズカップ エー．(Wisecup A.)及びルコック ジェ
イ．ピー．(Lecocq J. P.)、プロシーディングスオブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ
ザ ユーエスエー（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳ
Ａ）、８０，１１０１−１１０５（１９８３）。
i M. M.)、ガフニー ディー．エフ．(Gaffney D.
F.)、スペック ディー(Speck D.)、カウフマン エ
ム．(KauffmanM.)、フィンデリ エー．(Findeli A.)、
ワイズカップ エー．(Wisecup A.)及びルコック ジェ
イ．ピー．(Lecocq J. P.)、プロシーディングスオブ
ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ
ザ ユーエスエー（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳ
Ａ）、８０，１１０１−１１０５（１９８３）。
【０２３５】29. ツコウスキー エム．エム．(Zukowsk
i M. M.)、スペック ディー．(SpeckD.)、カウフマン
エム．(Kauffmann M.)及びルコック ジェイ．ピー．
(Lecocq J. P.)、ジェネティクス アンド バイオテク
ノロジー オブ バシリ(Genetics and Biotechnoligy
of Bacilli）、３０９−３１９（１９８４）。
i M. M.)、スペック ディー．(SpeckD.)、カウフマン
エム．(Kauffmann M.)及びルコック ジェイ．ピー．
(Lecocq J. P.)、ジェネティクス アンド バイオテク
ノロジー オブ バシリ(Genetics and Biotechnoligy
of Bacilli）、３０９−３１９（１９８４）。
【図１】プラスミドｐＴＧ１９２からプラスミドｐＴＧ
７６４を構築する方法を示す図である。
７６４を構築する方法を示す図である。
【図２】プラスミドｐＴＧ７６４及びｐＴＧ７２０か
ら、プラスミドｐＴＧ７７１を構築する方法を示す図で
ある。
ら、プラスミドｐＴＧ７７１を構築する方法を示す図で
ある。
【図３】プラスミドｐＴＧ７７１から、プラスミドｐＴ
Ｇ７７５及びｐＴＧ７７６を構築する方法を示す図であ
る。
Ｇ７７５及びｐＴＧ７７６を構築する方法を示す図であ
る。
【図４】プラスミドｐＴＧ１９２から、プラスミドｐＴ
Ｇ７６６及びｐＴＧ７６７を構築する方法を示す図であ
る。
Ｇ７６６及びｐＴＧ７６７を構築する方法を示す図であ
る。
【図５】プラスミドｐＴＧ７６７及びｐＴＧ４０ＰＥＤ
から、プラスミドｐＴＧ７６７１を構築する方法を示す
図である。
から、プラスミドｐＴＧ７６７１を構築する方法を示す
図である。
【図６】ｐＤＢ６のＨind III−ＢamＨＩフラグメント
の制限地図を示す図である。
の制限地図を示す図である。
【図７】Ｍ１３ｍｐ８におけるｐＤＢ６のＰｓｔＩ挿入
物及び導入されたＥｃｏＲＩ部位の概略図である。
物及び導入されたＥｃｏＲＩ部位の概略図である。
【図８】ｐＴＧ４７のＫpnＩ−ＢglIIフラグメントの制
限地図を示す図である。
限地図を示す図である。
【図９】種々の菌株の染色体ＤＮＡにおけるｄａｐ遺伝
子の欠失をサザンブロットオートラジオグラフィーによ
り示す図を図９Ａ〜図９Ｄとして示す。図９Ａは、プロ
ーブとしてｐＴＧ４７のＥcoＲＩフラグメントにより保
有されるＫａｎR遺伝子を用いたものであり、各バンド
は次のものを示す。バンド６〜９：ＰstＩで切断された
ＤＮＡ、バンド１０〜１４：ＢamＨＩ及びＨind IIIで
切断されたＤＮＡ、バンド６及び１０：株ＧＣ４５４
０、バンド７及び１１：ＴＧＥ７２１３、バンド８及び
１２：ＴＧＥ７２１４、バンド９及び１３：ＴＧＥ９０
１、バンド１４：ｐＤＢ６、バンド１５：分子量マーカ
ー。図９Ｂは、プローブとしてＭ１３ＴＧ６２０のＥco
ＲＩフラグメントにより保有されたｄａｐＤ遺伝子の
５′側をを用いたものであり、各バンドは次のものを示
す。バンド４−７：ＰstＩで切断されたＤＮＡ、バンド
８−１１：ＢamＨＩ及びＨind IIIで切断されたＤＮ
Ａ、バンド４及び８：ＧＣ４５４０株、バンド５及び
９：ＴＧＥ７２１３株、バンド６及び１０：ＴＧＥ７２
１４株、バンド７及び１１：ＴＧＥ９０１株、バンド１
３：分子量マーカー、バンド１及び１２：ＰstＩ又はＢ
amＨＩ及びＨind IIIで切断されたｐＤＢ６２、バンド
２：ＰstＩで切断されたＭ１３ＴＧ６２０、バンド３：
ＰstＩで切断されたＭ１３ＴＧ５９７。図９Ｃは、プロ
ーブとしてｐＴＧ４７のＫpnＩ−ＢglIIフラグメントに
より保有されるｄａｐＤ遺伝子の側方（flanking）領域
を用いたものである。ＰstＩで切断された染色体ＤＮＡ
である。各バンドは次のものを示す。バンド４：ＧＣ４
５４０、バンド５：ＴＧＥ７２１３、バンド６：ＴＧＥ
７２１４、バンド７：ＴＧＥ９０１、バンド８：分子量
マーカー、バンド１：ＰstＩで切断されたｐＤＢ６のＢ
amＨＩ−Ｈind III断片：バンド２：ＰstＩで切断され
たＭ１３ＴＧ６２０３＝ＰstＩで切断されたＭ１３ＴＧ
５９７。図９Ｄは、プローブとしてｐＴＧ４７のＫpnＩ
−ＢglIII断片により保有されるｄａｐＤ遺伝子の側方
領域を用いたものである。ＰstＩで切断された染色体Ｄ
ＮＡである。各バンドは次のものを示す。バンド４：Ｒ
Ｈ５３４５株、バンド５：ＲＬ５８、バンド６：ＴＧＥ
７６１５、バンド１，２及び３は図９Ｃにおける、もの
と同じ、バンド７：分子量マーカー。
子の欠失をサザンブロットオートラジオグラフィーによ
り示す図を図９Ａ〜図９Ｄとして示す。図９Ａは、プロ
ーブとしてｐＴＧ４７のＥcoＲＩフラグメントにより保
有されるＫａｎR遺伝子を用いたものであり、各バンド
は次のものを示す。バンド６〜９：ＰstＩで切断された
ＤＮＡ、バンド１０〜１４：ＢamＨＩ及びＨind IIIで
切断されたＤＮＡ、バンド６及び１０：株ＧＣ４５４
０、バンド７及び１１：ＴＧＥ７２１３、バンド８及び
１２：ＴＧＥ７２１４、バンド９及び１３：ＴＧＥ９０
１、バンド１４：ｐＤＢ６、バンド１５：分子量マーカ
ー。図９Ｂは、プローブとしてＭ１３ＴＧ６２０のＥco
ＲＩフラグメントにより保有されたｄａｐＤ遺伝子の
５′側をを用いたものであり、各バンドは次のものを示
す。バンド４−７：ＰstＩで切断されたＤＮＡ、バンド
８−１１：ＢamＨＩ及びＨind IIIで切断されたＤＮ
Ａ、バンド４及び８：ＧＣ４５４０株、バンド５及び
９：ＴＧＥ７２１３株、バンド６及び１０：ＴＧＥ７２
１４株、バンド７及び１１：ＴＧＥ９０１株、バンド１
３：分子量マーカー、バンド１及び１２：ＰstＩ又はＢ
amＨＩ及びＨind IIIで切断されたｐＤＢ６２、バンド
２：ＰstＩで切断されたＭ１３ＴＧ６２０、バンド３：
ＰstＩで切断されたＭ１３ＴＧ５９７。図９Ｃは、プロ
ーブとしてｐＴＧ４７のＫpnＩ−ＢglIIフラグメントに
より保有されるｄａｐＤ遺伝子の側方（flanking）領域
を用いたものである。ＰstＩで切断された染色体ＤＮＡ
である。各バンドは次のものを示す。バンド４：ＧＣ４
５４０、バンド５：ＴＧＥ７２１３、バンド６：ＴＧＥ
７２１４、バンド７：ＴＧＥ９０１、バンド８：分子量
マーカー、バンド１：ＰstＩで切断されたｐＤＢ６のＢ
amＨＩ−Ｈind III断片：バンド２：ＰstＩで切断され
たＭ１３ＴＧ６２０３＝ＰstＩで切断されたＭ１３ＴＧ
５９７。図９Ｄは、プローブとしてｐＴＧ４７のＫpnＩ
−ＢglIII断片により保有されるｄａｐＤ遺伝子の側方
領域を用いたものである。ＰstＩで切断された染色体Ｄ
ＮＡである。各バンドは次のものを示す。バンド４：Ｒ
Ｈ５３４５株、バンド５：ＲＬ５８、バンド６：ＴＧＥ
７６１５、バンド１，２及び３は図９Ｃにおける、もの
と同じ、バンド７：分子量マーカー。
【図１０】ｐＴＧ７９０についてのダイアグラムと制限
地図を示す図である。
地図を示す図である。
【図１１】ｐＴＧ７９２についてのダイアグラムと制限
地図を示す図である。
地図を示す図である。
【図１２】ｐＴＧ７９２２についてのダイアグラムと制
限地図を示す図である。
限地図を示す図である。
【図１３】ｐＴＧ７６９についてのダイアグラムと制限
地図を示す図である。
地図を示す図である。
【図１４】ｐＴＧ７４０６についてのダイアグラムと制
限地図を示す図である。
限地図を示す図である。
【図１５】クーマシーブルーで顕現化して行なった、Ｔ
ＧＥ７２１３／ｐＴＧ７４０７により合成された蛋白質
のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。尚、
各バンドは次のものを示す。バンド１、８：分子量マー
カー、バンド２〜５：３０℃で４時間（２及び３）又は
７時間（４及び５）の培養物、バンド６〜１２：４２℃
で４時間（６，１１及び１２）又は７時間（７，９及び
１０）の培養物、また図中Ｃは電気泳動試料として不溶
性フラクション（２０μｌ）を、Ｓは可溶性フラクショ
ン（４０μｌ）を用いたものである。
ＧＥ７２１３／ｐＴＧ７４０７により合成された蛋白質
のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。尚、
各バンドは次のものを示す。バンド１、８：分子量マー
カー、バンド２〜５：３０℃で４時間（２及び３）又は
７時間（４及び５）の培養物、バンド６〜１２：４２℃
で４時間（６，１１及び１２）又は７時間（７，９及び
１０）の培養物、また図中Ｃは電気泳動試料として不溶
性フラクション（２０μｌ）を、Ｓは可溶性フラクショ
ン（４０μｌ）を用いたものである。
【図１６】ｐＴＧ７６７５についてのダイアグラム及び
制限地図を示す図である。
制限地図を示す図である。
【図１７】ｐＴＧ７９１４についてのダイアグラム及び
制限地図を示す図である。
制限地図を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ｄａｐＤ染色体遺伝子の変異を含む細菌であって、
インタクトなｄａｐＤ遺伝子、産業上有用な蛋白質をコ
ードする遺伝子及び宿主細菌中での発現を確保するため
の要素を含有するプラスミドベクターによって形質転換
されてなる細菌を、完全培地中で培養することを特徴と
する当該産業上有用な蛋白質を製造する方法。 ２．ｄａｐＤ染色体の変異がｄａｐＤ遺伝子の少なくと
も一部の欠失であり、プラスミドベクターがインタクト
なｄａｐＤ遺伝子を含有するものであることを特徴とす
る、請求項１記載の産業上有用な蛋白質を製造する方
法。 ３．欠失がｄａｐＤ遺伝子の全欠失であることを特徴と
する、請求項２記載の産業上有用な蛋白質を製造する方
法。 ４．プラスミドベクターがモノマー状態を保持する配列
を有するものであることを特徴とする、請求項１乃至３
のいずれかに記載の産業上有用な蛋白質を製造する方
法。 ５．モノマー状態を保持する配列が“ｃｅｒ”配列であ
ることを特徴とする請求項４記載の産業上有用な蛋白質
を製造する方法。 ６．宿主細菌がＥ．ｃｏｌｉ株であることを特徴とする
請求項１乃至５のいずれかに記載の産業上有用な蛋白質
を製造する方法。 ７．産業上有用な蛋白質をコードする遺伝子が、ヒルジ
ン類、γ−インターフェロン、カテコール２，３−オキ
シゲナーゼ及びα−アンチトリプシンからなる群から選
択されるいずれかの蛋白質をコードする遺伝子であるこ
とを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の産業
上有用な蛋白質を製造する方法。 ８．前記ヒルジン類をコードする遺伝子が、ヒルジン又
はその天然若しくは人工的な変異型をコードする遺伝子
であることを特徴とする請求項７記載の産業上有用な蛋
白質を製造する方法。
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-
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|---|---|---|---|
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