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Die
vorliegende Erfindung betrifft 150 neue essentielle Gene und deren
Genprodukte von Bacillus licheniformis und hinreichend ähnliche
Gene und Proteine sowie darauf aufbauende, insofern verbesserte
biotechnologische Produktionsverfahren durch Mikroorganismen, als
jedes dieser Gene dafür
als Selektionsmarker geeignet ist.
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Die
vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biotechnologie, insbesondere
der Herstellung von Wertstoffen durch Fermentation von Mikroorganismen,
die zur Bildung der interessierenden Wertstoffe in der Lage sind.
Hierzu zählen
beispielsweise die Herstellung niedermolekularer Verbindungen, etwa
von Nahrungsmittelergänzungsstoffen
oder pharmazeutisch relevanten Verbindungen, oder von Proteinen,
für welche
aufgrund ihrer Diversität
wiederum ein großes
technisches Einsatzgebiet besteht. Im ersten Fall werden die Stoffwechseleigenschaften
der betreffenden Mikroorganismen zur Herstellung der Wertstoffe
ausgenutzt und/oder verändert;
im zweiten Fall werden Zeilen eingesetzt, die die Gene der interessierenden
Proteine (sogenannte Transgene) exprimieren. In beiden Fällen handelt
es sich zumeist also um gentechnisch veränderte Organismen (GVO).
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Zur
Fermentation von Mikroorganismen besteht ein reichhaltiger Stand
der Technik, insbesondere auch im großtechnischen Maßstab; er
reicht von der Optimierung der betreffenden Stämme hinsichtlich der Bildungsrate
und der Nährstoffausnutzung über die
technische Gestaltung der Fermenter bis hin zur Gewinnnung der Wertstoffe
aus den betreffenden Zellen selbst und/oder dem Fermentationsmedium.
Hierfür
kommen sowohl genetische und mikrobiologische als auch verfahrenstechnische
und biochemische Ansätze
zu tragen. Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diesen Prozeß hinsichtlich
der Stabilität
der Transgene in den eingesetzten Mikroorganismen zu verbessern,
und zwar auf der Ebene der genetischen Eigenschaften der betrachteten
Stämme.
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Expressionssysteme
werden im wesentlichen auf der Basis von zwei grundsätzlich verschiedenen
genetischen Konstruktionen entwickelt und weiterentwickelt. Einerseits
wird das Gen für
das herzustellende Protein in das Chromosom des Wirtsorganismus
integriert. Derartige Konstrukte sind ohne Selektion auf Anwesenheit
eines zusätzlichen
Markergens (siehe unten) sehr stabil. Ein wesentlicher Nachteil
besteht darin, daß nur
eine Kopie des Gens im Wirt vorhanden ist und sich die Integration
weiterer Kopien zur Erhöhung
der Produktbildungsrate über
den Gendosiseffekt methodisch sehr aufwendig gestaltet. Dieser Stand
der Technik sei im folgenden kurz illustriert.
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Das
europäische
Patent
EP 284126 B1 löst das Problem
einer stabilen Mehrfachintegration darüber, daß mehrere Genkopien in die
Zelle eingebracht werden, die dazwischenliegende, endogene und essentielle chromosomale
DNA-Abschnitte enthalten.
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Eine
andere Lösung
zur stabilen Mehrfachintegration wird in der Patentanmeldung WO
99/41358 A1 offenbart. Demnach werden zwei Kopien des interessierenden
Gens in entgegengesetzten Transkriptionsrichtungen integriert und
von einem nicht-essentiellen DNA-Abschnitt voneinander getrennt,
um somit homologe Rekombination der beiden Kopien zu verhindern.
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Aus
der Patentanmeldung
DD
277467 A1 geht ein Verfahren zur Herstellung von extrazellulären Enzymen
hervor, das auf der stabilen, vorteilhafterweise mehrfachen Integration
der für
das interessierende Enzym codierenden Gene in das Bakterienchromosom
beruht. Die Integration erfolgt über
homologe Bereiche. Zur Kontrolle erfolgreicher Integrationsereignisse
dient ein auf dem Plasmid enthaltenes Erythromycin-Gen, das bei
erfolgreicher Integration inaktiviert wird.
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Nach
der Schrift
DE 4231764
A1 kann die Integration ins Chromosom über ein einfaches oder doppeltes
Crossing-over über
das Gen für
die Thymidylat-Synthetase erfolgen. Letzteres erlaubt die Kontrolle
dieses Vorgehens, denn bei einem einfachen Crossing-over bleibt die thy-Aktivität erhalten,
während
sie bei einem doppelten Crossing-over verloren geht, das heißt hierdurch
eine Auxotrophie erzielt wird. Mit einem einfachen Crossing-over
geht in diesem speziellen System eine Resistenz gegen das Antibiotikum
Trimethoprim einher, mit einem doppelten eine entsprechende Sensitivität.
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In
der Anmeldung WO 96/23073 A1 wird ein Transposon-basiertes System
zur Integration von mehrfachen Kopien eines interessierenden Gens
in das Bakterienchromosom offenbart, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß das
Marker-Gen des Plasmids durch die Integration deletiert wird und
die erhaltenen Stämme
somit frei von einem Resistenzmarker sind. Auch nach dieser Schrift
wird ein Marker nur für
die Steuerung der Konstruktion des betreffenden Bakterienstamms
benötigt.
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Ein
System zur Erhöhung
der Kopienzahl von bestimmten, in ein bakterielles Chromosom integrieren Transgenen
wird auch in der Anmeldung WO 01/90393 A1 offenbart.
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Der
zweite Ansatz zur Konstruktion von Produzenten-Stämmen besteht
darin, das interessierende Gen auf ein autonom replizierendes Element,
zum Beispiel ein Plasmid zu übertragen
und auf diese Weise in den Wirtsorganismus zu transferieren. Vorteilhaft
wirkt sich dabei über
den Gendosis-Effekt die üblicherweise hohe
Zahl von Plasmidkopien pro Zelle aus. Nachteilig ist die Tatsache,
daß über die
gesamte Kulturzeit hinweg ein Selektionsdruck ausgeübt werden
muß, um
die Plasmide in den Zellen zu halten. Standardmäßig erfolgt dies über den
Zusatz von Antibiotika in das Kulturmedium, während Gene, die gegen die betreffenden Substanzen
Resistenz verleihen, auf den Plasmiden vorgelegt werden. Damit vermögen lediglich
die Zellen zu wachsen, welche die Plasmide in ausreichender Zahl
besitzen.
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Der
Einsatz von Antibiotikaresistenzen als Selektionsmarker stößt in den
letzten Jahren zunehmend auf Kritik. Zum einen ist der Einsatz von
Antibiotika recht teuer, insbesondere, wenn die Resistenz auf einem das
Antibiotikum abbauenden Enzym beruht und die betreffende Substanz
deshalb während
der gesamten Kultivierung zugeführt
werden muß.
Zum anderen trägt
ihr weitverbreiteter Einsatz, insbesondere auf anderen Technik-Gebieten zur Ausbreitung
der Resistenzgene auf andere Stämme,
sogar auf pathologische Stämme bei.
Dies führt
beispielsweise in der medizinischen Hygiene und insbesondere bei
der Behandlung von Infektionskrankheiten bereits zu erheblichen
Schwierigkeiten durch sogenannte multiresistente humanpathogene Stämme.
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Deshalb
wird in großem
Maße auf
die oben illustrierten Systeme zur stabilen Integration von Genen ins
Chromosom der Produzenten-Zellen zurückgegriffen, weil diese ohne
einen permanenten Selektionsdruck stabil sind. Allerdings sind die
betreffenden Stämme,
wie oben erwähnt
nur unter großem
Aufand herstellbar. Schneller und komfortabler ist es in der biotechnologischen
Praxis, ein beispielsweise neugefundenes oder modifiziertes Gen
auf einem Plasmid mit Selektionsmarker in. Wirtszellen einzubringen
und auf diese Weise zu exprimieren.
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Im
Stand der Technik sind inzwischen auch Antibiotika-freie Selektionssysteme
entwickelt worden. So werden beispielsweise in der Publikation "Transposon vectors
containing non-antibiotic
resistance selection markers for cloning and stable chromosomal
insertion of foreign genes in gram-negative bacteria" von Herrero et al.
(1990), in J. Bacteriol., Band 172, Seiten 6557–6567, Resistenzen gegen Herbizide
und Schwermetalle als Selektionsmarker beschrieben. Gegen den Einsatz
dieser Verbindungen sprechen jedoch dieselben Bedenken wie gegen
Antibiotika.
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Prinzipiell ähnlich wie
eine Antibiotikum-Selektion funktioniert beispielsweise die Selektion über Auxotrophie,
das heißt über einen
gezielten Stoffwechseldefekt, der die betreffenden Zellen von der
Zufuhr bestimmter Stoffwechselprodukte abhängig macht. Auxotrophe Stämme erhalten
dann gekoppelt mit dem interessierenden Transgen eines, das diese
Auxotrophie kuriert. Bei Verlust würden sie unter entsprechenden
Kulturbedingungen gleichzeitig ihre Lebensfähigkeit verlieren, so daß es zur
erwünschten
Selektion der auxotrophen Produzenten-Stämme kommt. So wird beispielsweise
in der Publikation "Gene
cloning in lactic streptococci" von
de Vos in Netherlands Milk and Dairy Journal, Band 40, (1986), Seite
141–154
auf S. 148 auf verschiedene, aus dem Stoffwechsel von Lacto-Streptococci
entwickelte Selektionsmarker verwiesen; hierunter sind solche aus
dem Lactose-Stoffwechsel, Kupfer-Resistenz und Resistenzgene gegenüber verschiedenen Bacteriocinen
von Lacto-Streptococci. Das Patent
EP 284126 B1 , das sich mit dem Problem der
stabilen Integration interessierender Gene ins Bakterienchromosom
befaßt
(siehe oben) faßt
die zur Selektion möglichen Systeme
Auxotrophie, Resistenz gegen Biozide und Resistenz gegen Virus-Infektionen
auf S. 7 unter dem Begriff „Überlebens-Selektion" zusammen. Als Beispiele
für Auxotrophie-Selektionsmarker
werden hier die Stoffwechselgene leu, his, trp „oder ähnliche" angeführt; gemeint sind offensichtlich
solche aus Aminosäuresynthesewegen.
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In
der Praxis gestaltet sich der Einsatz solcher Auxotrophien aber
bisher sehr problematisch, da insbesondere in industriellen Fermentationsmedien
fast alle notwendigen Substrate in ausreichenden Mengen zur Verfügung stehen
und die betreffenden Zellen den Mangel zur Synthese einer bestimmten
Verbindung über die
Aufnahme ebendieser Verbindung aus dem Nährmedium ausgleichen können.
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Eine
Ausnahme ist bisher nur das essentielle Thymidin, das in industriellen
Fermentationsmedien lediglich in Spuren vorkommt und deshalb von
den – proliferierenden
und somit DNA-synthetisierenden – Organismen über eine
Thymidylat-synthase
gebildet werden muß.
So bietet die Anmeldung
EP
251579 A2 die Lösung
an, als Wirts-Stämme
solche einzusetzen, die hinsichtlich des für den Nukleotid-Stoffwechsel
essentielen Gens für
die Thymidylat-Synthase defizient sind. Über einen Vektor kann demnach
das Gen für
eben diese Funktion (thyA aus Escherichia coli K12) zur Verfügung gestellt
werden und den Gen-Defekt kurieren. Trägt dieser Vektor zusätzlich das
Gen für
das interessierende Protein, so kommt es zu einer Antibiotikum-ähnlichen Selektion
der Produzenten-Zellen.
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In
der nicht vorveröffentlichten
Patentanmeldung PCT/EP2004/001949 wird vorgeschlagen, ein endogen
vorhandenes, für
eine essentielle Translokations-Aktivität codierendes Gen zu inaktivieren
und diesen Defekt über
einen Vektor zu kurieren. Hierbei soll es sich um das für einen
der Faktoren SecA, SecY, SecE, SecD, SecF, Signalpeptidase, b-SRP
(Ffh oder Ffs/Scr), FtsY/Srb, PrsA oder YajC codierende Gen handeln,
vorzugsweise um für
eine der Untereinheiten der Präprotein-Translokase
SecA, SecY, SecE, SecD oder SecF. In dieser Anmeldung werden hierfür die Sequenzen
von secA und dem hiervon abgeleiteten Protein SecA aus Bacillus
subtilis, Escherichia coli und B. licheniformis offenbart.
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Zusammenfassend
muß man
feststellen, daß im
Stand der Technik zwar große
Erfahrung hinsichtlich der biotechnologischen Produktion von Proteinen
besteht und die Expression interessierender Gene über chromosomale
Integration und Antibiotika-Selektion gezielt steuerbar ist, zu
diesen beiden Systemen bislang jedoch nur wenige Alternativen bestehen.
Insbesondere bestehen kaum Alternativen, die weniger aufwendig als
die chromosomale Integration sind und gleichzeitig ohne Selektion über eine
teure oder ökologisch
bedenkliche Verbindung auskommen.
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Insbesondere
der Ansatz zur Selektion über
Auxotrophie-Marker hat bislang hinsichtlich der in der Industrie
allgemein üblichen
komplexen Nährmedien
nur zu sehr spärlichen
Ergebnissen geführt.
Denn diese enthalten in der Regel zahlreiche niedrigmolekulare Verbindungen
wie Nukleotide, Vitamine oder Aminosäuren, über die derartige Auxotrophien,
das heißt
vergleichsweise einfache Stoffwechseldefekte ausgeglichen werden.
Wünschenswert
wäre daher
eine Selektionsmöglichkeit,
die prinzipiell wie eine Auxotrophie funktioniert, aber nicht auf
solchen Stoffwechseldefekten beruht, die über die allgemein üblichen
komplexen Nährmedien
ausgeglichen werden.
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Es
stellte sich somit die Aufgabe, weitere Selektionssysteme zu entwickeln,
die vergleichbar einfach zu handhaben sind wie die Selektion über ein
Antibiotikum, jedoch ohne teure und unter Umständen umweltschädliche Substanzen
auskommen. Sie sollten in industriellem Maßstab anwendbar sein. Sie sollten
auf solchen Genen aufbauen, deren Fehlen nicht über Begleitstoffe in industriellen
Medien ausgeglichen werden kann.
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In
Teilaufgaben bedeutete dies, essentielle Gene zu identifizieren
und über
Identifizierung der zugehörigen
Nukleotidsequenzen Werkzeuge für
die gewünschte
gentechnische Modifizierung zur Verfügung zu stellen.
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Unter
einem Teilaspekt dieser Aufgabe sind insbesondere solche essentiellen
Gene von Interesse, für deren
abgeleitete Proteine aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften
selbst technische Anwendungsmöglichkeiten
bestehen, beispielsweise in molekularbiologischen Reaktionsansätzen. Die
Ermittlung der zugehörigen
Nukleotidsequenzen würde
sie einer gezielten Produktion und damit diesen technischen Anwendungsmöglichkeiten
zugänglich
machen.
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Diese
Aufgabe wird durch jedes der im Sequenzprotokoll angegebenen 150
für B.
licheniformis gefundenen Proteine, einschließlich der jeweils hinreichend
homologen Proteine gelöst;
weitere eigenständige
Lösungen
der Aufgabe stellen die zugehörigen
Nukleinsäuren
dar, ebenfalls einschließlich
der jeweils hinreichend homologen Nukleinsäuren. Die jeweiligen Nukleinsäure- und
Aminosäuresequenzen
sind vollständig
im Sequenzprotokoll (Sequence Listing) der vorliegenden Anmeldung
angegeben.
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Diese
Faktoren übernehmen
in vivo jeweils elementare Lebensprozesse der betreffenden Organismen,
beispielsweise die Replikation (zum Beispiel DNA-Polymerease, Helicase
oder Gyrase), die Transkription (zum Beispiel RNA-Polymerase), die
Proteinbiosynthese (ribosomale Proteine, Aminocyl-tRNA-Synthetasen,
Initiations- und Elongationsfaktoren), die Sekretion von Proteinen
(zum Beispiel Translocase) oder den Energie-Stoffwechsel.
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Ein
Fehlen dieser Gene ist für
die betreffenden Zellen unmittelbar letal und kann nicht durch eventuelle Verbindungen
aus dem Nährmedium
ausgeglichen werden.
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Weitere
Lösungen
dieser Aufgabe stellen Vekoren mit den zugehörigen Nukleinsäureabschnitten,
Zellen und Verfahren zur Produktion dieser Proteine dar. Hinzu kommen
die Verwendungsmöglichkeiten
der betreffenden Nukleinsäuren
als Selektionsmarker, insbesondere indem entsprechende Plasmide
mit diesen Genen bereitgestellt werden, die in bezüglich dieser
Gene erzeugten Knock-out-Mutanten den für das Überleben erforderlichen Genotyp
aufrechterhalten.
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Mithilfe
dieser molekularbiologischen Konstrukte können nun Verfahren zur Fermentation
von Mikroorganismen, insbesondere grampositiven Bakterien der Spezies
Bacillus etabliert werden, in denen einzelne oder mehrere dieser
essentiellen Gene chromosomal inaktiviert sind und deren intakte
Kopien als Selektionsmarker dienen. Hierdurch ergeben sich die eingangs
als wünschenswert
beschriebenen Vorteile bei der Produktion interessierender Wertstoffe
und bei deren Aufarbeitung. Dazu gehört insbesondere die Möglichkeit,
auf Antibiotika als Selektionsagentien verzichten zu können. Es
können
sogar mehrere dieser Gene nebeneinander zur gleichzeitigen Selektion,
etwa von mehreren Plasmiden verwendet werden.
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Dem
genannten Teilaspekt der Aufgabe zur Erschließung von solchen essentiellen
Proteinen, für
die aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften selbst technische
Anwendungsmöglichkeiten
bestehen, wird ebenfalls entsprochen. Die zugehörigen Proteine können nun über die
erfindungsgemäß zur Verfügung gestellten
Nukleotidsequenzen gezielt produziert werden und stehen damit den
betreffenden technischen Anwendungsmöglichkeiten zur Verfügung. Ferner
können
die betreffenden Nukleinsäuren
zur Identifizierung verwandter Gene oder der natürlicherweise mit ihnen verbundenen
Promotoren verwendet werden.
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Wie
in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung beschrieben, konnten über eine
Sequenzierung der genomischen DNA von B. licheniformis DSM 13, dem
von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de)
erhältlichen
Referenzstamm für
diese Spezies 150 neue Gene identifiziert werden, die die gestellte
Aufgabe erfüllen.
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Die
hierzu im Stand der Technik bekannten jeweils nächstähnlichen Gene und zugehörigen Proteine weisen
die in Beispiel 3 (Tabelle 1) zur vorliegenden Anmeldung angegebenen
Sequenzhomologien auf. Hierüber
definiert sich der mit der vorliegenden Anmeldung jeweils abgedeckte
Schutzbereich. Dementsprechend stellen alle folgenden Nukleinsäuren und
Proteine, einschließlich
ihrer jeweils angegebenen Homologiebereiche prinzipiell gleichwertige
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung dar, wobei ein zunehmender Grad an Homologie
(angegeben in Prozent Identität)
jeweils zunehmend bevorzugt ist:
- – Eine Nukleinsäure dnaA,
codierend für
ein Initiatorprotein der chromosomalen Replikation, mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
85% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Initiatorprotein der chromosomalen Replikation DnaA mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 95% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
dnaB, codierend für
ein Membrananheftungsprotein der chromosomalen Replikationsinitiation,
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 74% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Membrananheftungsprotein der chromosomalen Replikationsinitiation
DnaB mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 70% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
dnaC, codierend für
eine replikative DNA-Helicase, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der
in SEQ ID NO. 5 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 87% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Replikative DNA-Helicase DnaC mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 6 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 95% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist.
- – eine
Nukleinsäure
dnaD, codierend für
ein DNA-Replikationsprotein, mit einer Nukleotidsequenz, die zu der
in SEQ ID NO. 7 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
DNA-Replikationsprotein DnaD, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 8 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 75% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
dnaE, codierend für
eine Alpha-Untereinheit einer DNA-Polymerase III (DNA polymerase
III alpha subunit; E.C. 2.7.7.7), mit einer Nukleotidsequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 9 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 74%
Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Alpha-Untereinheit einer DNA-Polymerase III (DNA polymerase III
alpha subunit; E.C. 2.7.7.7) DnaE mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 10 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 74% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
dnaG, codierend für
eine DNA-Primase (DNA primase; E.C. 2.7.7.-), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 11 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
76% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
DNA-Primase (DNA primase; E.C. 2.7.7.-) DnaG mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 12 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 79% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
dnaI, codierend für
ein Primosom-Protein (Primosomal protein), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 13 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
74% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Primosom-Protein (Primosomal protein) DnaI mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 14 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 74% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
dnaN, codierend für
eine Beta-Kette einer DNA-Polymerase III (DNA polymerase III beta
chain; E.C. 2.7.7.7), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in
SEQ ID NO. 15 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 82% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Beta-Kette einer DNA-Polymerase III (DNA polymerase III beta chain;
E.C. 2.7.7.7) DnaN, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 16 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 89% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,2%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
dnaX, codierend für
eine Kette III einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase III
(DNA-directed DNA polymerase III chain; E.C. 2.7.7.7), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 17 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 80% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Kette III einer DNA-abhängigen
DNA-Polymerase III (DNA-directed DNA polymerase III chain; E.C. 2.7.7.7)
DnaX mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 18 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 85% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,2%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
holB, codierend für
eine Delta-Untereinheit einer DNA-Polymerase III (DNA polymerase
III, delta' subunit;
E.C.2.7.7.7), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO.
19 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 84% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Delta-Untereinheit einer DNA-Polymerase III (DNA polymerase III,
delta' subunit;
E.C.2.7.7.7) HolB mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 20 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 85% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
ligA, codierend für
eine DNA-Ligase (DNA ligase; E.C. 6.5.1.2), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 21 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
81% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
DNA-Ligase (DNA ligase; E.C. 6.5.1.2) LigA mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 22 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 85% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
pcrA, codierend für
eine ATP-abhängige
DNA-Helicase (ATP-dependent
DNA helicase; E.C. 3.6.1.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu
der in SEQ ID NO. 23 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 82%
Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
ATP-abhängige
DNA-Helicase (ATP-dependent DNA helicase; E.C. 3.6.1.-) PcrA, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 24 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 87% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
polC (polIII), codierend für
eine PolC-Typ-DNA-Polymerase III (DNA polymerase III, polC-type),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 25 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 82% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
PolC-Typ-DNA-Polymerase III (DNA polymerase III, polC-type) PolC
mit einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 26 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 89% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
priA, codierend für
einen primosomalen Replicationsfaktor Y (primosomal replication factor
Y; primosomal protein N'),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 27 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 76% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Primosomaler Replicationsfaktor Y (primosomal replication factor
Y; primosomal protein N')
PriA mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 28 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 79% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
ssb, codierend für
ein DNA-Einzelstrang-bindendes Protein (singlestranded DNA-binding
protein), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 29 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 85% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – ein
DNA-Einzelstrang-bindendes Protein (single-stranded DNA-binding
protein) Ssb mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 30 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 90% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
gyrA, codierend für
eine Untereinheit A einer DNA-Gyrase (DNA gyrase subunit A; E.C. 5.99.1.3),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 31 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 82% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Untereinheit A einer DNA-Gyrase (DNA gyrase subunit A; E.C. 5.99.1.3)
GyrA, mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 32 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 89% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
gyrB, codierend für
eine Untereinheit B einer DNA-Gyrase (DNA gyrase subunit B; E.C. 5.99.1.3),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 33 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 82% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Untereinheit B einer DNA-Gyrase (DNA gyrase subunit B; E.C. 5.99.1.3)
GyrB mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 34 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 89% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
hbs, codierend für
ein DNA-Bindungsprotein HU (DNA-binding protein HU), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 35 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
95% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
DNA-Bindungsprotein HU (DNA-binding protein HU) Hbs mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 36 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 97% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
parC, codierend für
eine Untereinheit A einer Topoisomerase IV (Topoisomerase IV, subunit
A; E.C. 5.99.1.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 37 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 79% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Untereinheit A einer Topoisomerase IV (Topoisomerase IV, subunit
A; E.C. 5.99.1.-) ParC mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 38 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 83% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
parE, codierend für
eine Untereinheit B einer Topoisomerase IV (Topoisomerase IV, subunit
B; E.C. 5.99.1.-), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 39 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 84% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Untereinheit B einer Topoisomerase IV (Topoisomerase IV, subunit
B; E.C. 5.99.1.-) ParE, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 40 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
smc, codierend für
einen Faktor zur Chromosomen-Kondensation und -Segregation (Chromosome
condensation and segregation), mit einer Nukleotidsequenz, die zu
der in SEQ ID NO. 41 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 76%
Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Faktor zur Chromosomen-Kondensation und -Segregation (Chromosome
condensation and segregation) Smc mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 42 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 81% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
topA, codierend für
eine DNA-Topoisomerase I (DNA topoisomerase I; E.C. 5.99.1.2), mit
einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 43 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 83% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
DNA-Topoisomerase I (DNA topoisomerase I; E.C. 5.99.1.2) TopA mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 44 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 91% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
ydiO (aqul), codierend für
eine Alpha-Untereinheit einer Modifikationsmethylase (modification
methylase, alpha subunit; E.C. 2.1.1.73), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 45 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
36% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,
92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Alpha-Untereinheit einer Modifikationsmethylase (modification methylase,
alpha subunit; E.C. 2.1.1.73) YdiO (Aqul) mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 46 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 15% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92,5%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpoA, codierend für
eine Alpha-Kette einer DNA-abhängigen
RNA-Polymerase (DNA-directed
RNA polymerase, alpha chain (E.C. 2.7.7.6), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 47 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Alpha-Kette einer DNA-abhängigen
RNA-Polymerase (DNA-directed RNA polymerase, alpha chain (E.C. 2.7.7.6)
RpoA, mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 48 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 93% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpoB, codierend für
eine Beta-Kette einer DNA-abhängigen
RNA-Polymerase (DNA-directed
RNA polymerase beta chain; E.C. 2.7.7.6), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 49 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
89% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Beta-Kette einer DNA-abhängigen
RNA-Polymerase (DNA-directed RNA polymerase beta chain; E.C. 2.7.7.6)
RpoB mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 50 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpoC, codierend für
eine Beta'-Kette
einer DNA-abhängigen
RNA-Polymerase (DNA-directed
RNA polymerase beta' chain;
E.C. 2.7.7.6), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID
NO. 51 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 88% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Beta'-Kette einer
DNA-abhängigen
RNA-Polymerase (DNA-directed RNA polymerase beta' chain; E.C. 2.7.7.6) RpoC mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 52 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 93% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
sigA, codierend für
einen größeren RNA-Polymerase-Sigma-Faktor
43 (RNA polymerase major sigma-43 factor; sigma-A), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 53 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
86% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Größerer RNA-Polymerase-Sigma-Faktor
43 (RNA polymerase major sigma-43 factor; sigma-A) SigA mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 54 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
cca, codierend für
eine PolyA-Polymerase (polyA polymerase), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 55 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
66% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%,
92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
PolyA-Polymerase (polyA polymerase) Cca, mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 56 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 60% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
cspR, codierend für
eine rRNA-Methylase (rRNA methylase), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 57 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
79% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
rRNA-Methylase (rRNA methylase) CspR mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 58 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 84% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rnc, codierend für
eine Ribonuklease III (Ribonuclease III), mit einer Nukleotidsequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 59 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
86% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Ribonuklease III (Ribonuclease III) Rnc mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 60 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 93% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rnpA, codierend für
eine Ribonuklease P (Ribonuclease P; E.C. 3.1.26.5), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 61 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
65% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Ribonuklease P (Ribonuclease P; E.C. 3.1.26.5) RnpA mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 62 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 69% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
trmD, codierend für
eine Methyltransferase (Methyltransferase; E.C. 2.1.1.31), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 63 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 77% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Methyltransferase (Methyltransferase; E.C. 2.1.1.31) TrmD, mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 64 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 86% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
trmU, codierend für
eine Methyltransferase (Methyltransferase; E.C. 2.1.1.61), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 65 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 83% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Methyltransferase (Methyltransferase; E.C. 2.1.1.61) TrmU mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 66 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 92% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
yycF, codierend für
einen putativen Zwei-Komponenten-Response-Regulator (putative two-component response
regulator), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO.
67 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 83% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Putativer Zwei-Komponenten-Response-Regulator (putative two-component
response regulator) YycF mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 68 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
yycG, codierend für
einen putativen Zwei-Komponenten-Response-Regulator (putative two-component response
regulator), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO.
69 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 78% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Putativer Zwei-Komponenten-Response-Regulator (putative two-component
response regulator) YycG mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 70 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 78% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
nusA, codierend für
einen putativen Transcriptionsterminationsfaktor (putative transcription
termination factor), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 71 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 84% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Putativer Transcriptionsterminationsfaktor (putative transcription
termination factor) NusA, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 72 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 92% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplA, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L1 (50S ribosomal protein L1; BL1), mit
einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 73 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 89% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L1 (50S ribosomal protein L1; BL1) RplA
mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 74 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 91% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplB, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L2 (50S ribosomal protein L2), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 75 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – 50S-ribosomales
Protein L2 (50S ribosomal protein L2) RplB mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 76 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 95% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplC, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L3 (50S ribosomal protein L3), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 77 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L3 (50S ribosomal protein L3) RplC mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 78 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplD, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L4 (50S ribosomal protein L4), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 79 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%,
98%, 98,5%, 99% 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L4 (50S ribosomal protein L4) RplD, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 80 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 93% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplE, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L5 (50S ribosomal protein L5), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 81 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%,
99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L5 (50S ribosomal protein L5) RplE mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 82 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplF, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L6 (50S ribosomal protein L6), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 83 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
92% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L6 (50S ribosomal protein L6) RplF mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 84 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 92% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplL, codierend für
ein ribosomales Protein der großen
Untereinheit L9P (LSU ribosomal protein L9P), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 85 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
75% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein der großen
Untereinheit L9P (LSU ribosomal protein L9P) RplL mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 86 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 84% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplJ, codierend für
ein ribosomales Protein der großen
Untereinheit L10P (LSU ribosomal protein L10P), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 87 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
95% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%,
99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein der großen
Untereinheit L10P (LSU ribosomal protein L10P) RplJ, mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 88 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplL, codierend für
ein ribosomales Protein der großen
Untereinheit L12P (LSU ribosomal protein L12P; L7/L12), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 89 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 96% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%,
99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
ribosomales Protein der großen
Untereinheit L12P (LSU ribosomal protein L12P; L7/L12) RplL mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 90 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 96% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplM, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L13 (50S ribosomal protein L13), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 91 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 97% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L13 (50S ribosomal protein L13) RplM mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 92 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplN, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L14 (50S ribosomal protein L14), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 93 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 92% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L14 (50S ribosomal protein L14) RAIN mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 94 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 93% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplO, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L15 (50S ribosomal protein L15), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 95 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L15 (50S ribosomal protein L15) RplO, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 96 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 93% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplP, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L16 (50S ribosomal protein L16), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 97 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%,
99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L16 (50S ribosomal protein L16) RplP mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 98 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 96% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplQ, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L17 (50S ribosomal protein L17), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 99 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 92% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L17 (50S ribosomal protein L17) RplQ mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 100 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplR, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L18 (50S ribosomal protein L18), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 101 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 85% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L18 (50S ribosomal protein L18) RplR mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 102 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 87% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplS, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L19 (50S ribosomal protein L19), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 103 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 91% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L19 (50S ribosomal protein L19) RplS, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 104 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 93% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplT, codierend für
ein ribosomales Protein der großen
Untereinheit L20P (LSU ribosomal protein L20P), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 105 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%,
99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein der großen
Untereinheit L20P (LSU ribosomal protein L20P) RplT mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 106 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 98% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplU, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L21 (50S ribosomal protein L21), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 107 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 88% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L21 (50S ribosomal protein L21) RplU mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 108 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 86% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 88%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplV, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L22 (50S ribosomal protein L22), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 109 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%,
99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L22 (50S ribosomal protein L22) RplV mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 110 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 93% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplW, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L23 (50S ribosomal protein L23), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 111 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%,
99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L23 (50S ribosomal protein L23) RplW, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 112 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 88% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rplX, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L24 (50S ribosomal protein L24), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 113 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 92% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L24 (50S ribosomal protein L24) RplX mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 114 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpmA, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L27 (50S ribosomal protein L27), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 115 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%,
99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L27 (50S ribosomal protein L27) RpmA mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 116 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 93% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpmB, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L28 (SOS ribosomal protein L28), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 117 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 88% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L28 (50S ribosomal protein L28) RpmB mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 118 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 92% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist.
- – eine
Nukleinsäure
rpmC, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L29 (50S ribosomal protein L29), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 119 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 96% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%,
99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L29 (50S ribosomal protein L29) RpmC mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 120 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 99% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpmD, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L30 (50S ribosomal protein L30), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 121 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%,
99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L30 (50S ribosomal protein L30) RpmD mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 122 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 99% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpmE, codierend für
ein Ribosomales Protein L31 (ribosomal protein L31), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 123 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
95% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%,
99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein L31 (ribosomal protein L31) RpmE mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 124 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 99% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpmF, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L32 (50S ribosomal protein L32), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 125 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 83% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L32 (50S ribosomal protein L32) RpmE, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 126 angegebenen Aminosäureseguenz mindestens 71% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpmGA, codierend für
ein Typ 1-50S-ribosomales Protein L33 (50S ribosomal protein L33
type 1), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 127
angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 90% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Typ 1-50S-ribosomales Protein L33 (50S ribosomal protein L33 type
1) RpmGA mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 128 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpmGB, codierend für
ein ribosomales Protein der großen
Untereinheit L33P (LSU ribosomal protein L33P), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 129 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
84% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
ribosomales Protein der großen
Untereinheit L33P (LSU ribosomal protein L33P) RpmGB mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 130 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpmI, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L35 (50S ribosomal protein L35), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 131 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 88% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L35 (50S ribosomal protein L35) RpmI mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 132 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpmJ, codierend für
ein 50S-ribosomales Protein L36 (50S ribosomal protein L36), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 133 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
50S-ribosomales Protein L36 (50S ribosomal protein L36) RpmJ, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 134 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsB, codierend für
ein Ribosomales Protein S2 (ribosomal protein S2), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 135 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
92% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein S2 (ribosomal protein S2) RpsB mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 136 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsC, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S3 (30S ribosomal protein S3), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 137 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%,
99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S3 (30S ribosomal protein S3) RpsC mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 138 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsD, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S4 (30S ribosomal protein S4), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 139 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 89% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S4 (30S ribosomal protein S4) RpsD mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 140 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsE, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S5 (30S ribosomal protein S5), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 141 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 95% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S5 (30S ribosomal protein S5) RpsE, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 142 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsE, codierend für
ein ribosomales Protein S6 (ribosomal protein S6), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 143 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
91% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein S6 (ribosomal protein S6) RpsF mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 144 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 92% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsG, codierend für
ein ribosomales Protein der kleinen Untereinheit S7P (SSU ribosomal
protein S7P), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO.
145 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 95% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein der kleinen Untereinheit S7P (SSU ribosomal
protein S7P) RpsG mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 146 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsH, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S8 (30S ribosomal protein S8), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 147 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 91% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S8 (30S ribosomal protein S8) RpsH mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 148 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsI, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S9 (30S ribosomal protein S9), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 149 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 95% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%,
99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S9 (30S ribosomal protein S9) RpsI, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 150 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsJ, codierend für
ein ribosomales Protein S10 (ribosomal protein S10), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 151 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
97% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein S10 (ribosomal protein S10) RpsJ mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 152 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsK, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S11 (30S ribosomal protein S11), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 153 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S11 (30S ribosomal protein S11) RpsK mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 154 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsL, codierend für
ein ribosomales Protein der kleinen Untereinheit S12P (SSU ribosomal
protein S12P), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID
NO. 155 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 93% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein der kleinen Untereinheit S12P (SSU ribosomal
protein S12P) RpsL mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 156 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsM, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S13 (30S ribosomal protein S13), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 157 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%,
99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S13 (30S ribosomal protein S13) RpsM, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 158 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsN, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S14-1 (30S ribosomal protein S14-1), mit
einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 159 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 93% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S14-1 (30S ribosomal protein S14-1) RpsN
mit einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 160 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsO, codierend für
ein ribosomales Protein S15 (ribosomal protein S15), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 161 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
93% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%,
99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein S15 (ribosomal protein S15) RpsO mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 162 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsP, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S16 (30S ribosomal protein S16), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 163 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%,
99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S16 (30S ribosomal protein S16) RpsP mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 164 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsQ, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S17 (30S ribosomal protein S17), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 165 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S17 (30S ribosomal protein S17) RpsQ, mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 166 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsR, codierend für
ein ribosomales Protein S18 (ribosomal protein S18), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 167 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
94% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein S18 (ribosomal protein S18) RpsR mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 168 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsS, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S19 (30S ribosomal protein S19), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 169 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%,
99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S19 (30S ribosomal protein S19) RpsS mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 170 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsT, codierend für
ein 30S-ribosomales Protein S20 (30S ribosomal protein S20), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 171 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 87% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
30S-ribosomales Protein S20 (30S ribosomal protein S20) RpsT mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 172 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
rpsU, codierend für
ein ribosomales Protein der kleinen Untereinheit S21P (SSU ribosomal
protein S21P), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID
NO. 173 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 96% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Ribosomales Protein der kleinen Untereinheit S21P (SSU ribosomal
protein S21P) RpsU, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 174 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
alaS, codierend für
eine Alanyl-tRNA-Synthetase (Alanyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.7),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 175 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 81% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Alanyl-tRNA-Synthetase (Alanyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.7) AlaS
mit einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 176 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 84% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
argS, codierend für
eine wahrscheinliche Arginyl-tRNA-Synthetase (probable arginyl-tRNA
synthetase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO.
177 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 83% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Wahrscheinliche Arginyl-tRNA-Synthetase (probable arginyl-tRNA synthetase)
ArgS mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 178 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 92% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
asnS, codierend für
eine Asparaginyl-tRNA-Synthetase (asparaginyl-tRNA synthetase), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 179 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 86%
Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Asparaginyl-tRNA-Synthetase (asparaginyl-tRNA synthetase) AsnS mit
einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 180 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 96% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
aspS, codierend für
eine Aspartyl-tRNA-Synthetase (Aspartyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.12),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 181 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 80% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Aspartyl-tRNA-Synthetase (Aspartyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.12)
AspS, mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 182 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 85% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
cysS, codierend für
eine Cysteinyl-tRNA-Synthetase (cysteinyl-tRNA synthetase), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 183 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 80% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Cysteinyl-tRNA-Synthetase (cysteinyl-tRNA synthetase) CysS mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 184 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 87% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
gltX, codierend für
eine Glutamyl-tRNA-Synthetase (glutamyl-tRNA synthetase), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 185 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 82% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Glutamyl-tRNA-Synthetase (glutamyl-tRNA synthetase) GltX mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 186 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 90% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
glyQ, codierend für
eine Alpha-Kette einer Glycyl-tRNA-Synthetase (glycyl-tRNA synthetase
alpha chain; E.C. 6.1.1.14), mit einer Nukleotidsequenz, die zu
der in SEQ ID NO. 187 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 83%
Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Alpha-Kette einer Glycyl-tRNA-Synthetase (glycyl-tRNA synthetase
alpha chain; E.C. 6.1.1.14) GlyQ mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 188 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 96% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
glyS, codierend für
eine Beta-Kette einer Glycyl-tRNA-Synthetase (glycyl-tRNA synthetase
beta chain; E.C. 6.1.1.14), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der
in SEQ ID NO. 189 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 74% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Beta-Kette einer Glycyl-tRNA-Synthetase (glycyl-tRNA synthetase
beta chain; E.C. 6.1.1.14) GlyS, mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 190 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 76% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
hisS, codierend für
eine Histidyl-tRNA-Synthetase (Histidyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.21),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 191 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 81% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Histidyl-tRNA-Synthetase (Histidyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.21)
HisS mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 192 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 85% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
ileS, codierend für
eine Isoleucyl-tRNA-Synthetase (Isoleucyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.5),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 193 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 80% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Isoleucyl-tRNA-Synthetase (Isoleucyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.5)
IleS mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 194 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 85% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
leuS, codierend für
eine Leucyl-tRNA-Synthetase (Leucyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.4),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 195 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 84% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Leucyl-tRNA-Synthetase (Leucyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.4) LeuS
mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 196 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 90% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
lysS, codierend für
eine Lysyl-tRNA-Synthetase (Lysyl-tRNA synthetase), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 197 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
83% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%,
98%, 98,5%, 99% 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Lysyl-tRNA-Synthetase (Lysyl-tRNA synthetase) LysS, mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 198 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 92% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
metS, codierend für
eine Methionyl-tRNA-Synthetase (Methionyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.10), mit
einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 199 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 80% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Methionyl-tRNA-Synthetase (Methionyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.10)
MetS mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 200 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 89% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
pheS, codierend für
eine Alpha-Kette einer Phenylalanyl-tRNA-Synthetase (Phenylalanyl-tRNA synthetase,
alpha chain; E.C. 6.1.1.20), mit einer Nukleotidsequenz, die zu
der in SEQ ID NO. 201 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 82%
Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Alpha-Kette einer Phenylalanyl-tRNA-Synthetase (Phenylalanyl-tRNA
synthetase, alpha chain; E.C. 6.1.1.20) PheS mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 202 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
pheT, codierend für
eine Beta-Kette der Phenylalanyl-tRNA-Synthetase (Phenylalanyl-tRNA synthetase,
beta chain; E.C. 6.1.1.20), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der
in SEQ ID NO. 203 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Beta-Kette der Phenylalanyl-tRNA-Synthetase (Phenylalanyl-tRNA synthetase,
beta chain; E.C. 6.1.1.20) mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 204 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens
82% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
proS, codierend für
eine Prolyl-tRNA-Synthetase (Prolyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.15),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 205 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Prolyl-tRNA-Synthetase (Prolyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.15) ProS,
mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 206 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 84% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
serS, codierend für
eine Seryl-tRNA-Synthetase (Seryl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.11),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 207 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 85% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
90%, 95%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Seryl-tRNA-Synthetase (Seryl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.11) SerS
mit einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 208 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 95% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
trpS, codierend für
eine Tryptophanyl-tRNA-Synthetase (Tryptophanyl-tRNA synthetase;
E.C. 6.1.1.2), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID
NO. 209 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 83% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Tryptophanyl-tRNA-Synthetase (Tryptophanyl-tRNA synthetase; E.C.
6.1.1.2) TrpS mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 210 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
tyrS, codierend für
eine Tyrosyl-tRNA-Synthetase (Tyrosyl-tRNA synthetase), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 211 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
83% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Tyrosyl-tRNA-Synthetase (Tyrosyl-tRNA synthetase) TyrS mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 212 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
valS, codierend für
eine Valyl-tRNA-Synthetase (Valyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.9), mit
einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 213 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 84% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 90%, 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Valyl-tRNA-Synthetase (Valyl-tRNA synthetase; E.C. 6.1.1.9) ValS,
mit einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 214 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
gatA, codierend für
eine Gln/Glutamyl-tRNA(Gln)-Amidotransferase (Glutamyl-tRNA(Gln)
amidotransferase; E.C. 6.3.5.-), mit einer Nukleotidsequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 215 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
86% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%,
99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Gln/Glutamyl-tRNA(Gln)-Amidotransferase (Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase;
E.C. 6.3.5.-) GatA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 216 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
gatB, codierend für
eine B-Untereinheit einer Glutamyl-tRNA(Gln)-Amidotransferase (Glutamyl-tRNA(Gln)
amidotransferase subunit B; E.C. 6.3.5.-), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 217 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
89% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
B-Untereinheit einer Glutamyl-tRNA(Gln)-Amidotransferase (Glutamyl-tRNA(Gln)
amidotransferase subunit B; E.C. 6.3.5.-) GatB mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 218 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
gatC, codierend für
eine Untereinheit C einer Glutamyl-tRNA(Gln)-Amidotransferase (Glutamyl-tRNA(Gln)
amidotransferase subunit C; E.C. 6.3.5.-), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 219 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
83% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Untereinheit C einer Glutamyl-tRNA(Gln)-Amidotransferase (Glutamyl-tRNA(Gln)
amidotransferase subunit C; E.C. 6.3.5.-) GatC mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 220 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
fmt, codierend für
eine Methionyl-tRNA-Formyltransferase (Methionyl-tRNA formyltransferase;
E.C. 2.1.2.9), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID
NO. 221 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Methionyl-tRNA-Formyltransferase (Methionyl-tRNA formyltransferase;
E.C. 2.1.2.9) Fmt, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 222 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
frr, codierend für
einen Ribosomen-Recyclisierungsfaktor (ribosome recycling factor), mit
einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 223 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 82% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Ribosomen-Recyclisierungsfaktor (ribosome recycling factor) Frr
mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 224 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
fusA, codierend für
einen Elongationsfaktor G der Protein-Translation (Protein Translation
Elongation Factor G; EF-G), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der
in SEQ ID NO. 225 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 90% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Elongationsfaktor G der Protein-Translation (Protein Translation
Elongation Factor G; EF-G) FusA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 226 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 93% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
infA, codierend für
einen Translationsinitiationsfaktor IF-1 (Translation initiation
factor IF-1), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO.
227 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 96% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Translationsinitiationsfaktor IF-1 (Translation initiation factor
IF-1) InfA mit einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 228 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
infB, codierend für
einen Translationsinitiationsfaktor IF-2 (Translation initiation
factor IF-2), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO.
229 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 84% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%,
99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Translationsinitiationsfaktor IF-2 (Translation initiation factor
IF-2) InfB, mit einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 230 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
infC, codierend für
einen Translationsinitiationsfaktor IF-3 (Translation initiation
factor IF-3), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO.
231 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 73% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Translationsinitiationsfaktor IF-3 (Translation initiation factor
IF-3) InfC mit einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 232 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
prfA, codierend für
einen Peptidketten-Freisetzungsfaktor 1 (peptide chain release factor
1), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 233 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 86% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – ein
Peptidketten-Freisetzungsfaktor 1 (peptide chain release factor
1) PrfA mit einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 234 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 90% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 92,5%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
tsf, codierend für
einen Elongationsfaktor Ts (Elongation factor Ts; EF-Ts), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 235 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 87% Identität und
zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Elongationsfaktor Ts (Elongation factor Ts; EF-Ts) Tsf mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 236 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
tufA, codierend für
einen Protein-Translations-Elongationsfaktor Tu (Protein Translation
Elongation Factor Tu; EF-TU), mit einer Nukleotidsequenz, die zu
der in SEQ ID NO. 237 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 94%
Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%,
99,5% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Protein-Translations-Elongationsfaktor Tu (Protein Translation Elongation
Factor Tu; EF-TU) TufA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 238 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
spoVC, codierend für
eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase (Peptidyl-tRNA hydrolase), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 239 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 81% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Peptidyl-tRNA-Hydrolase (Peptidyl-tRNA hydrolase) SpoVC mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 240 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
groEL, codierend für
ein Klasse-I-Hitzeschock-Protein (Class I heat-shock protein;chaperonin), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 241 angegebenen Nukleotidsequenz
mindestens 91% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Klasse-I-Hitzeschock-Protein (Class I heat-shock protein;chaperonin)
GroEL, mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 242 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
groES, codierend für
ein Klasse-I-Hitzeschock-Protein (Class I heat- shock protein; chaperonin), mit einer
Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 243 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
91% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Klasse-I-Hitzeschock-Protein (Class I heat-shock protein; chaperonin)
GroES mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 244 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 98% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 98,5%, 99%, 99,5% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
map, codierend für
eine Methionin-Aminopeptidase (Methionine aminopeptidase; E.C. 3.4.11.18),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 245 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 88% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Methionin-Aminopeptidase (Methionine aminopeptidase; E.C. 3.4.11.18)
Map mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 246 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
ffh, codierend für
eine Untereinheit FFH/SRP54 eines Signal-Recognition-Particle (Signal recognition
particle, subunit FFH/SRP54), mit einer Nukleotidsequenz, die zu
der in SEQ ID NO. 247 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 85%
Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Untereinheit FFH/SRP54 eines Signal-Recognition-Particle (Signal
recognition particle, subunit FFH/SRP54) Ffh mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 248 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
ftsY, codierend für
ein Signal-Recognition-Particle (signal recognition particle), mit
einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 249 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 78% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – ein
Signal-Recognition-Particle (signal recognition particle) FtsY,
mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 250 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 82% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 86%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und
besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
prsA, codierend für
einen Vorläufer
eines Proteinexportproteins (Protein export protein precursor; E.C.
5.2.1.8), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 251
angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 73% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Vorläufer
eines Proteinexportproteins (Protein export protein precursor; E.C.
5.2.1.8) PrsA mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 252 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
secE, codierend für
eine Untereinheit einer Preprotein-Translocase (Preprotein translocase
subunit), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 253
angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 83% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Untereinheit einer Preprotein-Translocase (Preprotein translocase
subunit) SecE mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 254 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 63% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
secY, codierend für
eine Untereinheit einer Preprotein-Translocase (Preprotein translocase
subunit), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 255
angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 81% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Untereinheit einer Preprotein-Translocase (Preprotein translocase
subunit) SecY, mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 256 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 89% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
accA, codierend für
eine Acetyl-CoA-Carboxylase (Acetyl-CoA carboxylase), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 257 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
80% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Acetyl-CoA-Carboxylase (Acetyl-CoA carboxylase) AccA mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 258 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
accB, codierend für
ein Biotin-Carboxyl-Träger-Protein
der Acetyl-CoA-Carboxylase (Biotin
carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 259 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
76% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Biotin-Carboxyl-Träger-Protein
der Acetyl-CoA-Carboxylase (Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA
carboxylase) AccB mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 260 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
accC, codierend für
eine Biotin-Carboxylase-Untereinheit einer Acetyl-CoA-Carboxylase
(Acetyl-CoA carboxylase subunit; biotin carboxylase subunit; E.C.
6.4.1.2), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 261
angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 80% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Biotin-Carboxylase-Untereinheit einer Acetyl-CoA-Carboxylase (Acetyl-CoA
carboxylase subunit; biotin carboxylase subunit; E.C. 6.4.1.2) AccC
mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 262 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
accD, codierend für
eine Beta-Untereinheit einer Acetyl-CoA-Carboxylase (Acetyl-CoA carboxylase,
beta subunit), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID
NO. 263 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 74% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Beta-Untereinheit einer Acetyl-CoA-Carboxylase (Acetyl-CoA carboxylase,
beta subunit) AccD, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 264 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
acpA, codierend für
ein Acyl-Trägerprotein
(Acyl carrier protein), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in
SEQ ID NO. 265 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 93% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Acyl-Trägerprotein
(Acyl carrier protein) AcpA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 266 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
acpS, codierend für
eine Holo-Acyl-Trägerprotein-Synthase
(Holo-acyl carrier
protein synthase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 267 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 32% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Holo-Acyl-Trägerprotein-Synthase
(Holo-acyl carrier protein synthase) AcpS mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 268 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
birA, codierend für
einen Transcriptions-Repressor des Biotin-Operons (Transcriptional repressor of
the biotin operon), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 269 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 72% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 75%, 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
Transcriptions-Repressor des Biotin-Operons (Transcriptional repressor
of the biotin operon) BirA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 270 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
fabD, codierend für
eine Malonyl CoA-Acyl-Trägerprotein-Transacylase (Malonyl CoA-acyl
carrier protein transacylase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu
der in SEQ ID NO. 271 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 78%
Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%,
95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Malonyl CoA-Acyl-Trägerprotein-Transacylase
(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase) FabD, mit einer
Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 272 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
fabF, codierend für
eine 3-Oxoacyl-(Acyl-Trägerprotein)-Synthase
(3-oxoacyl-(acyl-carrier
protein) synthase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 273 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 83% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
3-Oxoacyl-(Acyl-Trägerprotein)-Synthase
(3-oxoacyl-(acyl-carrier protein) synthase) FabF mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 274 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
fabG, codierend für
eine Beta-Ketoacyl-Acyl-Trägerprotein-Reductase (Beta-ketoacyl-acyl
carrier protein reductase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der
in SEQ ID NO. 275 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Beta-Ketoacyl-Acyl-Trägerprotein-Reductase
(Beta-ketoacyl-acyl carrier protein reductase) FabG mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 276 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
cdsA, codierend für
eine Phosphatidat-Cytidylyl-Transferase (Phosphatidate cytidylyltransferase;
E.C. 2.7.7.41), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID
NO. 277 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 69% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 70%, 80%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Phosphatidat-Cytidylyl-Transferase (Phosphatidate cytidylyltransferase;
E.C. 2.7.7.41) CdsA mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 278 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
gpsA, codierend für
eine NAD(P)H-abhängige
Glyceryl-3-Phosphat-Dehydrogenase (NAD(P)H-dependent
glycerol-3-phosphate dehydrogenase), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 279 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
76% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
NAD(P)H-abhängige
Glyceryl-3-Phosphat-Dehydrogenase (NAD(P)H-dependent glycerol-3-phosphate
dehydrogenase) GpsA, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 280 angegebenen Aminosäuresequenz
mindestens 81% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
pgsA, codierend für
eine Phosphatidyl-Glycerophosphat-Synthase (Phosphatidylglycerophosphate
synthase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO.
281 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 79% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Phosphatidyl-Glycerophosphat-Synthase (Phosphatidylglycerophosphate
synthase) PgsA mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 282 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 88% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
yhdO, codierend für
eine 1-Acylglyceryl-3-Phosphate (1-acylglycerol-3-phosphate), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 283 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
79% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
1-Acylglyceryl-3-Phosphate (1-acylglycerol-3-phosphate) YhdO mit
einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 284 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100%
Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
plsX, codierend für
ein an der Fettsäure-/Phospholipid-Synthese
beteiligtes Protein (protein involved in fatty acid/phospholipid
synthesis), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 285
angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – ein
an der Fettsäure-/Phospholipid-Synthese
beteiligtes Protein (protein involved in fatty acid/phospholipid
synthesis) PlsX mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 286 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
gcaD, codierend für
eine UDP-N-Acetyl-Glucosamin-Pyrophosphorylase
(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase), mit einer Nukleotidsequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 287 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens
77% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%,
92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
UDP-N-Acetyl-Glucosamin-Pyrophosphorylase (UDP-N-acetylglucosamine
pyrophosphorylase) GcaD, mit einer Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 288 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens
94% Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
glmS, codierend für
eine Glucosamin-Fructose-6-Phosphat-Amino-Transferase (Glucosamine-fructose-6-phosphate
aminotransferase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ
ID NO. 289 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 84% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Glucosamin-Fructose-6-Phosphat-Amino-Transferase (Glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase)
GlmS mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 290 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
ybbT, codierend für
eine Phospho-Glucosamin-Mutase (Phosphoglucosamine mutase; E.C.
5.4.2.10), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO.
291 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 82% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Phospho-Glucosamin-Mutase (Phosphoglucosamine mutase; E.C. 5.4.2.10)
YbbT mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 292 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 94% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
yvyH, codierend für
eine putative UDP-N-Acetylglucosamin-2-Epimerase (Putative UDP-N-acetylglucosamine
2-epimerase; E.C. 5.1.3.14), mit einer Nukleotidsequenz, die zu
der in SEQ ID NO. 293 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 79%
Identität
und zunehmend bevorzugt mindestens 80%, 85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%,
97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Putative UDP-N-Acetylglucosamin-2-Epimerase (Putative UDP-N-acetylglucosamine
2-epimerase; E.C. 5.1.3.14) YvyH mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 294 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 89% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
asd, codierend für
eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase (Aspartate-semialdehyde
dehydrogenase), mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID
NO. 295 angegebenen Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% und besonders bevorzugt 100% Identität aufweist;
- – eine
Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase (Aspartate-semialdehyde dehydrogenase)
Asd, mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 296 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 89% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
dapA, codierend für
eine Dihydrodipicolinat-Synthase (Dihydrodipicolinate synthase), mit
einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 297 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 77% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Dihydrodipicolinat-Synthase (Dihydrodipicolinate synthase) DapA
mit einer Aminosäuresequenz,
die zu der in SEQ ID NO. 298 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 84% Identität und zunehmend bevorzugt
mindestens 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders
bevorzugt 100% Identität
aufweist;
- – eine
Nukleinsäure
dapB, codierend für
einen Dihydrodipicolinat-Reductase (Dihydrodipicolinate reductase),
mit einer Nukleotidsequenz, die zu der in SEQ ID NO. 299 angegebenen
Nukleotidsequenz mindestens 80% Identität und zunehmend bevorzugt mindestens
85%, 90%, 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und besonders bevorzugt
100% Identität
aufweist;
- – eine
Dihydrodipicolinat-Reductase (Dihydrodipicolinate reductase) DapB
mit einer Aminosäuresequenz, die
zu der in SEQ ID NO. 300 angegebenen Aminosäuresequenz mindestens 88% Identität und zunehmend
bevorzugt mindestens 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% und
besonders bevorzugt 100% Identität
aufweist.
-
Diese
Gene und Genprodukte können
nun nach an sich bekannten Methoden, und ohne daß man die in Beispiel 2 geschilderte
Sequenzierung nacharbeiten muß,
gezielt anhand dieser Sequenzen künstlich synthetisiert werden.
-
Als
weitere Alternative hierzu ist es möglich, die betreffenden Gene
aus einem Bacillus-Stamm,
insbesondere dem von der DSMZ erhältlichen Stamm B. licheniformis
DSM 13, über
PCR zu gewinnen, wobei die im Sequenzprotokoll angebenen jeweiligen
Randsequenzen für
die Synthese von Primern verwendet werden können. Bei Verwendung anderer
Stämme
werden die jeweils homologen Gene hierzu erhalten, wobei die PCR
umso erfolgreicher sein sollte, je enger die ausgewählten Stämme mit
B. licheniformis DSM 13 verwandt sind, weil damit eine zunehmende
Sequenzübereinstimmung
auch innerhalb der Primer-Bindungsregionen einhergehen dürfte.
-
Alternativ
dazu können
die im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuren auch als DNA-Sonden eingesetzt
werden, um die jeweiligen homologen Gene in Präparationen genomischer DNA
anderer Spezies nachzuweisen. Das Vorgehen hierzu ist ebenfalls
an sich bekannt; ebenso wie die Isolierung der auf diese Weise erhaltenen
Gene, deren Klonierung, deren Expression und Gewinnung der zugehörigen Proteine.
Insbesondere ist dabei an solche Arbeitsschritte gedacht, wie sie
in Beispiel 2 für
B. licheniformis selbst dargestellt sind.
-
Unter
den bisher genannten erfindungsgemäßen, unter Verweis auf SEQ
ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32,
34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64,
66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96,
98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124,
126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150,
152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176,
178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202,
204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228,
230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256,
258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282,
284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298 und 300 definierten Genprodukten
(wobei es sich in der Regel um Proteine handelt, zu einem Großteil sogar um
Proteine, die eine enzymatische Funktion besitzen) ist jeweils solch
eines bevorzugt, welches natürlicherweise
von einem Mikroorganismus gebildet wird, vorzugsweise von einem
Bakterium, besonders bevorzugt von einem grampositiven Bakterium,
hierunter bevorzugt von einem der Gattung Bacillus, hierunter besonders bevorzugt
von einem der Spezies B. licheniformis und hierunter ganz besonders
bevorzugt von B. licheniformis DSM13.
-
Entsprechendes
gilt für
die zugehörigen
Nukleinsäuren:
Unter den bisher genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, definiert
unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,
21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51,
53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83,
85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113,
115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139,
141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165,
167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191,
193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217,
219, 221, 223, 225, 227, 29, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243,
245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269,
271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295,
297 und 299, jeweils codierend für
ein Genprodukt (wobei es sich in der Regel um Proteine handelt,
zu einem Großteil
sogar um Proteine, die eine enzymatische Funktion besitzen) ist
jeweils solch eine bevorzugt, welche natürlicherweise in einem Mikroorganismus
enthalten ist, vorzugsweise einem Bakterium, besonders bevorzugt
einem grampositiven Bakterium, hierunter bevorzugt einem der Gattung
Bacillus, hierunter besonders bevorzugt einem der Spezies B. licheniformis
und hierunter ganz besonders bevorzugt B. licheniformis DSM13.
-
Denn
es ist, wie soeben beschrieben, gegenüber der Neusynthese vergleichsweise
einfach möglich, die
betreffenden Genprodukte und/oder Nukleinsäuren aus natürlichen
Spezies, insbesondere Mikroorganismen zu erhalten. Hierunter sind
in Hinblick auf die gestellte Aufgabe zunehmend diejenigen bevorzugt,
die sich fermentieren lassen und die in großtechnischen Fermentationen
tatsächlich
eingesetzt werden. Dazu zählen besonders
Vertreter der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterium und Bacillus.
Hierunter sind beispielsweise S. carnosus und C. glutamicum zu nennen,
sowie B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens,
B. lentus, B. globigii und B. alkalophilus. Am meisten ist B. licheniformis
DSM13 bevorzugt, weil aus diesem exakt die im Sequenzprotokoll aufgelisteten
Sequenzen erhalten werden konnten.
-
Insbesondere
bei diesen fermentierbaren und deshalb eine erhebliche wirtschaftliche
Bedeutung besitzenden Organismen stellte sich die Aufgabe, die Fermentation
durch solche Selektionssysteme zu verbessern, die die eingangs dargestellten
Vorteile aufweisen. Zum anderen sollte dies, wenn hierfür die zugehörigen Nukleinsäuren verwendet
werden, umso erfolgreicher sein, je enger die betreffenden Gene
und/oder Genprodukte mit den im Sequenzprotokoll angegebenen verwandt
sind. Je höher
die Verwandtschaft ist, desto eher sollten die betreffenden Gebprodukte
auch dieselben biochemischen Eigenschaften wie die oben genannten Enzyme
und Proteinfaktoren besitzen, beispielswiese hinsichtlich der Temperatur-
oder pH-Optima. Dies ist wichtig, wenn an ebendiesen Aktivitäten ein
Interesse besteht, beispielsweise für In-vitro-Reaktionsansätze (siehe unten), für die diese
Enzyme und Faktoren bereitgestellt werden sollen.
-
Unter
den genannten Nukleinsäuren,
codierend für
ein Genprodukt (Protein oder Enzym), sind jeweils diejenigen bevorzugt,
die für
eines der zuvor beschriebenen, unter Verweis auf SEQ ID NO. 2, 4,
6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,
40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,
74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104,
106, 108, 110, 112, 114, 116, 19 8, 120, 122, 124, 126, 128, 130,
132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156,
158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182,
184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210,
212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236,
238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262,
264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288,
290, 292, 294, 296, 298 und 300 definierten und/oder weiteren oben
definierten erfindungsgemäßen sekretierten
Proteine codieren.
-
Denn
für diese
besteht der mit dieser Anmeldung belegte Bezug zum essentiellen
Genprodukt. Zudem stehen einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung
zufolge die erfindungsgemäßen Proteine
auch für ihre
positive Nutzung zur Verfügung.
Insofern ist es wichtig, diese tatsächlich über an sich bekannte Methoden biotechnologisch
herstellen zu können.
Hierzu dienen die jeweils zugehörigen
Nukleinsäuren.
-
Besonders
zwischen entfernt verwandten Spezies bestehen Unterschiede hinsichtlich
des Gebrauchs synonymer, für
die jeweiligen Aminosäuren
codierender Codons, worauf auch der Proteinbiosyntheseapparat ausgerichtet
ist, etwa über
die verfügbare
Anzahl der passenden beladenen tRNAs. Die Übertragung eines der genannten
Gene in eine weniger verwandte Spezies kann dann besonders erfolgreich
beispielsweise zur Deletionsmutation oder zur Synthese des betreffenden
Proteins genutzt werden, wenn sie hinsichtlich der Codons entsprechend
optimiert ist. Hierdurch können
prozentual auf der DNA-Ebene zunehmende Unterschiede eingeführt werden,
die auf der Aminosäureebene
jedoch ohne Folge bleiben. Aus diesem Grund stellen auch solche
Nukleinsäuren
Verwirklichungen der vorliegenden Erfindung dar.
-
Einen
weiteren Erfindungsgegenstand stellen Vektoren dar, die eine der
zuvor bezeichneten, unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9,
11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,
43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73,
75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105,
107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131,
133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157,
159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183,
185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209,
211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 29, 231, 233, 235, 237,
239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263,
265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289,
291, 293, 295, 297 und 299 definierten und/oder weiteren oben definierten
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten.
-
Denn
um mit den erfindungsrelevanten Nukleinsäuren umzugehen, und damit insbesondere
die Produktion erfindungsgemäßer Proteine
vorzubereiten, werden sie geeigneterweise in Vektoren ligiert. Solche Vektoren
sowie die zugehörigen
Arbeitsmethoden sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben. Vektoren
sind in großer
Zahl und Variationsbreite, sowohl für die Klonierung als auch für die Expression
kommerziell erhältlich.
Dazu gehören
beispielsweise Vektoren, die sich von bakteriellen Plasmiden, von
Bakteriophagen oder von Viren ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren.
Ferner werden sie nach der Art der Zelltypen, in denen sie sich
zu etablieren vermögen,
beispielsweise nach Vektoren für
gramnegative, für
grampositive Bakterien, für
Hefen oder für
höhere
Eukaryonten unterschieden. Sie bilden geeignete Ausgangspunkte beispielsweise
für molekularbiologische
und biochemische Untersuchungen sowie für die Expression des betreffenden
Gens oder zugehörigen
Proteins. Insbesondere zur Herstellung von Konstrukten zur Deletion
oder Verstärkung
der Expression sind sie – wie
aus dem hierfür
einschlägigen
Stand der Technik hervorgeht – praktisch
unerläßlich.
-
Hierunter
sind solche Vektoren bevorzugt, die zwei oder mehrere der zuvor
bezeichneten Nukleinsäuren
enthalten.
-
Denn
darüber
sind zum einen die betreffenden Gene gleichzeitig lagerbar oder
können
unter der Kontrolle desselben Promotors exprimiert werden. Einer
anderen Anwendung zufolge kann ein Vektor, der gleichzeitig zwei
oder mehr intakte Kopien der erfindungsgemäßen Gene enthält, dazu
dienen, eine Deletionsmutante, die gleichzeitig in mehreren dieser
Genen deletiert ist, am Leben zu erhalten (Rescue). Ein gezieltes
Entfernen dieses Vektors hat dann das gleichzeitige Abschalten dieser
mehreren Gene zur Folge, wodurch sich im Falle essentieller Gene
jeweils eine Letalität
ergibt.
-
In
einer Ausführungsform
handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Klonierungsvektoren.
-
Denn
Klonierungsvektoren eignen sich neben der Lagerung, der biologischen
Amplifizierung oder der Selektion des interessierenden Gens für dessen
molekularbiologische Charakterisierung. Gleichzeitig stellen sie
transportierbare und lagerfähige
Formen der beanspruchten Nukleinsäuren dar und sind auch Ausgangspunkte
für molekularbiologische
Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise
die PCR oder In-vitro-Mutagenese-Verfahren.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei erfindungsgemäßen Vektoren um Expressionsvektoren.
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Denn
derartige Expressionsvektoren sind die Basis dafür, die entsprechenden Nukleinsäuren in
biologischen Produktionssystemen zu realisieren und damit die zugehörigen Proteine
zu produzieren, da sie in vivo die Transkription und Translation,
das heißt
die Synthese des betreffenden Genprodukts ermöglichen. Bevorzugte Ausführungsformen
dieses Erfindungsgegenstands sind Expressionsvektoren, die die zur
Expression notwendigen genetischen Elemente tragen, beispielsweise
den natürlichen,
ursprünglich
vor diesem Gen lokalisierten Promotor oder einen Promotor aus einem
anderen Organismus. Diese Elemente können beispielsweise in Form
einer sogenannten Expressionskassette angeordnet sein. Alternativ
können
einzelne oder alle Regulationselemente auch von der jeweiligen Wirtszelle
bereitgestellt werden. Besonders bevorzugt sind die Expressionsvektoren
hinsichtlich weiterer Eigenschaften, wie beispielsweise die optimale
Kopienzahl, auf das gewählte
Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle (siehe unten) abgestimmt.
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Die
Möglichkeit
zur Bildung intakter Genprodukte anhand eines Vektors, der ein einziges
Replikon darstellt, ist insbesondere für den oben beschriebenen Rescue
und das Abschalten bestimmter Gene von Bedeutung. Umgekehrt ist
die Bereitstellung eines Expressionsvektors die beste Möglichkeit,
ein erfindungsgemäßes Protein
verstärkt
zu bilden und somit die betreffende Aktivität zu erhöhen beziehungsweise einer quantitativen Herstellung
zugänglich
zu machen.
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Einen
eigenen Erfindungsgegenstand bilden Zellen, die nach gentechnischer
Modifizierung eine der zuvor bezeichneten, unter Verweis auf SEQ
ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31,
33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63,
65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95,
97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123,
125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149,
151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175,
177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201,
203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227,
29, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253,
255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279,
281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297 und 299 definierten
und/oder weiteren oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten.
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Denn
diese Zellen enthalten die genetische Information zur Synthese eines
erfindungsgemäßen Proteins.
Hierunter sind insbesondere diejenigen Zellen gemeint, die nach
an sich bekannten Verfahren mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren versehen
worden sind, beziehungsweise die sich von solchen Zellen ableiten.
Dafür werden
geeigneterweise solche Wirtszellen ausgewählt, die sich vergleichsweise
einfach kultivieren lassen und/oder hohe Produktausbeuten liefern.
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Sie
ermöglichen
beispielsweise die Amplifizierung der entsprechenden Gene, aber
auch deren Mutagenese oder Transkription und Translation und letztlich
die biotechnologische Produktion der betreffenden Proteine. Diese
genetische Information kann entweder extrachromosomal als eigenes
genetisches Element, das heißt
bei Bakterien in plasmidaler Lokalisation vorliegen oder in ein
Chromosom integriert sein. Die Wahl eines geeigneten Systems hängt von
Fragestellungen, wie beispielsweise die Art und Dauer der Lagerung
des Gens, beziehungsweise des Organismus oder die Art der Mutagenese
oder Selektion ab. Derartige Realisierungmöglichkeiten sind an sich dem
Molekularbiologen bekannt.
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Daraus
erklärt
sich auch die bevorzugte Ausführungsform,
nach welcher in einer solchen Zelle die genannte Nukleinsäure Teil
eines Vektors ist, insbesondere eines zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Vektors.
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Denn
damit sind die oben beschriebenen Vorteile bei der Handhabung, Lagerung,
Expression etc. der betreffenden Nukleinsäure verbunden.
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Bevorzugt
ist unter diesen Zellen jeweils eine Wirtszelle, bei der es sich
um ein Bakterium handelt.
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Denn
Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe
Ansprüche
an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren
etabliert werden. Zudem verfügt
man bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz.
Für eine
spezielle Produktion können
aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden
Gründen
wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate,
Zeitbedarf etc. gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet
sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich um ein gramnegatives Bakterium, insbesondere eines
der Gattungen Escherichia coli, Klebsiella, Pseudomonas oder Xanthomonas,
insbesondere um Stämme
von E. coli K12, E. coli B oder Klebsiella planticola, und ganz
besonders um Derivate der Stämme Escherichia
coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1
oder Klebsiella planticola (Rf).
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Denn
bei gramnegativen Bakterien, wie beispielsweise E. coli, werden
eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert.
Dies kann für
spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. In der Anmeldung WO 01/81597
A1 wird ein Verfahren offenbart, nach welchem erreicht wird, daß auch gramnegative
Bakterien die exprimierten Proteine ausschleusen. Die als bevorzugt
genannten gramnegativen Bakterien sind in der Regel leicht, das
heißt
kommerziell oder über öffentliche
Stammsammlungen zugänglich
und im Zusammenspiel mit ebenfalls in großer Zahl zur Verfügung stehenden übrigen Komponenten
wie etwa Vektoren auf spezifische Herstellbedingungen hin optimierbar.
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In
einer alternativen, nicht minder bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich um ein grampositives Bakterium, insbesondere eines
der Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebakterium, ganz
besonders der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens,
B. subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus
oder Corynebacterium glutamicum, und hierunter wiederum ganz besonders bevorzugt
um ein Derivat von B. licheniformis DSM 13.
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Denn
grampositive Bakterien besitzen den gramnegativen gegenüber den
grundsätzlichen
Unterschied, sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende
Nährmedium
abzugeben, aus welchem sich, wenn das gewünscht ist, die exprimierten
erfindungsgemäßen Proteine
direkt aufreinigen lassen. Zudem sind sie mit den meisten Herkunftsorganismen
für technisch
wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst
vergleichbare Enzyme, so daß sie über eine ähnliche
Codon-Usage verfügen
und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet
ist. Ganz besonders bevorzugt sind Derivate von B. licheniformis
DSM 13 deshalb, weil sie zum einen ebenfalls im Stand der Technik
als biotechnologische Produktionsstämme weit verbreitet sind und
weil zum anderen mit der vorligenden Anmeldungen exakt die erfindungsgemäßen Gene
und Proteine aus B. licheniformis DSM 13 zur Verfügung gestellt
werden, so daß die Realisierung
der vorliegenden Erfindung am ehesten in solchen Stämmen erfolgreich
sein sollte.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung bilden Verfahren zur Herstellung eines
oder mehrerer der oben beschriebenen, unter Verweis auf SEQ ID NO.
2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34,
36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66,
68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98,
100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124,
126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150,
152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178,
180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204,
206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230,
232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256,
258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282,
284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298 und 300 definierten und/oder
weiteren oben definierten erfindungsgemäßen Genprodukte (Proteine oder
Enzyme).
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Dazu
gehört
jedes Verfahren zur Herstellung eines solchen Proteins, beispielsweise
chemische Syntheseverfahren. Demgegenüber sind jedoch alle im Stand
der Technik etablierten, oben in einzelnen Aspekten bereits angesprochenen
molekularbiologischen, mikrobiologischen, beziehungsweise biotechnologischen Herstellverfahren
bevorzugt. Deren Ziel besteht in erster Linie darin, die erfindungsgemäßen Proteine
zu erhalten, um sie entsprechenden Anwendungen zur Verfügung zu
stellen.
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Als
Nachweis für
die Bildung eines betreffenden Proteins in einem für die Herstellung
eingesetzten Stamm dient, sofern es sich um Enzyme handelt, ein
enzymatischer Nachweis der betreffenden Enzymaktivitäten über geeignete
Nachweisreaktionen. Dies geschieht beispielsweise so, daß die für die fragliche
Reaktion relevante Ausgangsverbindung vorgelegt, mit einer Probe
des Überstands
(der die sekretierten Enzyme enthält) oder eines Zellextrakts
(falls sie nicht sekretiert werden) inkubiert und das gebildete
Produkt nach jeweils geeigneten Meßmethoden erfaßt wird.
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Als
Nachweis auf molekularbiologischer Ebene können die im vorliegenden Sequenzprotokoll
dargestellten Proteine nach üblichen
Methoden synthetisiert und hiergegen Antikörper gebildet werden; dies
gilt auch für
Proteine, die nicht über
eine spezifische enzymatische Reaktion erkennbar sind. Diese Proteine
sind dann beispielsweise über
entsprechende Western-Blots nachweisbar.
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Vorzugsweise
handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz einer oben
bezeichneten, jeweils entsprechenden Nukleinsäure und unter Verweis auf SEQ
ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31,
33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63,
65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95,
97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 1119,
121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145,
147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171,
173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197,
199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223,
225, 227, 29, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249,
251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275,
277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297 und 299 definierten und/oder
weiteren oben definierten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren erfolgen,
vorzugsweise unter Einsatz eines zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Vektors
und besonders bevorzugt unter Einsatz einer zuvor bezeichneten erfindungsgemäßen Zelle.
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Denn
durch die genannten Nukleinsäuren,
insbesondere den konkreten im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleinsäuren wird
die entsprechend bevorzugte genetische Information in mikrobiologisch
verwertbarer Form, das heißt
für gentechnische
Produktionsverfahren zur Verfügung
gestellt. Zunehmend bevorzugt ist die Bereitstellung auf einem von
der Wirtszelle besonders erfolgreich verwertbaren Vektor beziehungsweise von
solchen Zellen selbst. Die betreffenden Produktionsverfahren sind
dem Fachmann an sich bekannt.
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Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
auf der Grundlage der zugehörigen
Nukleinsäuresequenzen
auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese
in vitro nachvollzogen wird. Alle bereits oben ausgeführten Elemente
können
auch zu neuen Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine
herzustellen. Es ist dabei für
jedes erfindungsgemäße Protein
eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten
an Verfahrensschritten denkbar, so daß optimale Verfahren für jeden
konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden müssen.
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Weiterhin
bevorzugt sind solche derartigen Verfahren, bei denen die Nukleotidsequenz
in einem, vorzugsweise mehreren und besonders bevorzugt allen Codons
an die Codon-Usage
des Wirtsstamms angepaßt worden
ist.
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Denn
entsprechend dem oben Gesagten kann die Übertragung eines der genannten
Gene in eine weniger verwandte Spezies dann besonders erfolgreich
zur Synthese des betreffenden Proteins genutzt werden, wenn sie
hinsichtlich des Gebrauchs der Codons entsprechend optimiert ist.
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Ein
weiterer Erfindungsgegenstand besteht in der Verwendung eines oben
unter Verweis auf SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,
22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52,
54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,
86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114,
116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140,
142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166,
168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192,
194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218,
220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246,
248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272,
274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298
und 300 definierten und/oder weiteren oben definierten erfindungsgemäßen Genprodukts
(Proteins oder Enzyms) entsprechend seiner dort jeweils angegebenen
biochemischen Eigenschaften.
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Denn
mit der vorliegenden Erfindung werden nicht allein die betreffenden
Nukleinsäuren
zur Inaktivierung der betreffenden Gene zur Verfügung gestellt, sondern auch
deren positive Nutzung ermöglicht.
Die jeweiligen von diesen Proteinen, insbesondere Enzymproteinen
wahrgenommenen biochemischen Funktionen sind in den entsprechenden
Zeilen des Sequenzprotokolls angegeben und auch oben schon genannt
worden. Einen weiteren Hinweis auf die jeweiligen Einsatzmöglichkeiten
liefern die definierten Funktionen der in Tabelle 1 jeweils zugeordneten
aus dem Stand der Technik bekannten Proteine.
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Ein
Beispiel für
derartige Verwendungsmöglichkeiten
ist die Überexpression
von Faktoren der Proteinbiosynthese in Zellen, die als Expressionssysteme
genutzt werden. So ist zu erwarten, daß sich die Proteinbiosyntheseleistung
dieser Zellen dadurch steigern läßt, daß eines
oder vorzugsweise mehrere ribosomale Proteine überexprimiert werden; solche
sind oben, unter Bezug auf SEQ ID NO. 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86,
88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114,
116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132 und 134 (große Untereinheit)
beziehungsweise unter Bezug auf SEQ ID NO. 136, 138, 140, 142, 144,
146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170,
172 und 174 (kleine Untereinheit) definiert. Des weiteren sollte
sich eine prinzipiell gleichwertige, vorzugsweise hiermit kombinierbare
Wirkung durch die Überexpression
von Aminoacyl-tRNA-Synthetasen
ergeben, wie sie oben unter Bezug auf SEQ ID NO. 176, 178, 180,
182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206,
208, 210, 212, 214, 216, 218 oder 220 definiert sind, und/oder von
Translationsfaktoren, wie sie oben unter Bezug auf SEQ ID NO. 226,
228, 230, 232, 234, 236 oder 238 definiert sind. Hierbei sind jeweils
solche mit derartigen DNA- und Aminosäuresequenzen bevorzugt, die
entsprechend dem oben gesagten den im gewählten Expressionsystem endogen
vorhandenen Genen beziehungsweise Genprodukten am nächsten kommen.
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Dementsprend
können
derartige Expressionsysteme auch hinsichtlich der RNA-Synthese verbessert werden,
was sich positiv auf die Gesamtkonzentration der für das interessierende
Genprodukt codierenden mRNA auswirken und die Proteinsyntheserate
auf diese Weise verbessern sollte. Hierbei ist beispielsweise an eine Überexpression
eines oder mehrer folgender Faktoren gedacht: Alpha-Kette der DNA-abhängigen RNA-Polymerase (SEQ ID
NO. 48), Beta-Kette der DNA-abhängigen
RNA-Polymerase (SEQ ID NO. 50), Beta'-Kette der DNA-abhängigen RNA-Polymerase (SEQ
ID NO. 52), Größerer RNA-Polymerase-Sigma-Faktor 43
(SEQ ID NO. 54) und/oder die PolyA-Polymerase (SEQ ID NO. 56).
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Können chemische
Syntheseverfahren durch Einsatz geeigneter Enzyme zumindest in einem
Reaktionsschritt von biologischen Katalysatoren übernommen werden, ergibt sich
dadurch zumeist eine nennenswerte Vereinfachung. Dies gilt beispielsweise
für stereochemische
Reaktionen. Man spricht dann von Biotransformation. Dementsprechend
stellen alle derartigen Syntheseverfahren, in denen erfindungsgemäße Proteine, vorzugsweise
erfindungsgemäße Enzyme
einsetzbar sind, Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung dar.
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Eine
bevorzugte derartige Verwendung ist eine, wobei es sich um einen
In-vitro-Ansatz handelt.
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Hierzu
seien folgende Beispiele genannt, wobei diese Zusammenstellung nicht
erschöpfend
sein kann:
- – Molekularbiologische Behandlungen
von DNA-Präparationen
mithilfe einer DNA-Helicase,
oben definiert unter Bezug auf SEQ ID NO. 6, einer DNA-Ligase, oben
definiert unter Bezug auf SEQ ID NO. 22, eines DNA-Einzelstrang-bindenden
Proteins, oben definiert unter Bezug auf SEQ ID NO. 30, oder einer
DNA-Topoisomerase, oben definiert unter Bezug auf SEQ ID NO. 44;
- – In-vitro-Translationssysteme,
die zusätzlich
um Aminoacyl-tRNA-Synthetasen bereichert sind, wie sie oben unter
Bezug auf SEQ ID NO. 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192,
194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218
oder 220 definiert sind;
- – In-vitro-Translationssysteme,
die zusätzlich
um Translationsfaktoren bereichert sind, wie sie oben unter Bezug
auf SEQ ID NO. 226, 228, 230, 232, 234, 236 oder 238 definiert sind;
- – kombinierte
In-vitro-Transkriptions-Translationssysteme, die zusätzlich um
die oben bereits genannten ribosomalen Proteine und/oder an der
RNA-Synthese beteiligten Faktoren bereichert sind,
- – Regulations-
oder Indikatorsysteme, bei denen interessierende Gene von einem
Biotin-Promotor
gesteuert werden, der auf einen Repressor anspricht, wie er oben
unter Bezug auf SEQ ID NO. 270 definiert ist.
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Eine
weitere Ausprägung
der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer unter Verweis
auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,
29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59,
61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91,
93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119,
121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145,
147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171,
173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197,
199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223,
225, 227, 29, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249,
251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275,
277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297 und 299 definierten
und/oder einer weiteren oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder
Teilen davon zur funktionellen Inaktivierung des jeweils zugehörigen Gens
in einem Mikroorganismus.
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Unter
der funktionellen Inaktivierung ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung
jede Art von Modifikation oder Mutation zu verstehen, wonach die
Funktion des betreffenden Proteins unterbunden wird. Dazu gehört die Ausführungsform,
daß ein
praktisch vollständiges,
aber inaktives Protein gebildet wird, daß inaktive Teile eines solchen
Proteins in der Zelle vorliegen, bis hin zu den Möglichkeiten,
daß das
zugehörige
Gen nicht mehr translatiert wird oder sogar vollständig deletiert
ist. Somit besteht eine spezielle „Verwendung" dieser Faktoren
beziehungsweise Gene dieser Ausführungsform
nach darin, daß sie
in der betreffenden Zelle eben nicht mehr auf ihre natürliche Weise
zur Wirkung kommen. Dies wird diesem Erfindungsgegenstand zufolge auf
genetischer Ebene dadurch erreicht, daß das betreffende Gen ausgeschaltet
wird.
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Dieses
Vorgehen bedarf einer besonderen Sicherheitsvorkehrung, weil es
sich in allen Fällen
und erfindungsgemäß um essentielle
Gene handelt, deren Fehlen für
die betreffende Zelle unmittelbar letal ist. Deshalb muß bei diesem
Vorgehen, um die Lebensfähigkeit
der Zelle zu gewährleisten,
im Zusammenhang mit der funktionellen Inaktivierung, d. h. vorher
oder spätestens
im selben Arbeitsschritt, der zur Inaktivierung führt, eine
intakte Kopie desselben Gens in die betreffende Zelle eingeführt werden,
vorzugsweise auf einem eigenen genetischen Element, das heißt einem
Plasmid.
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Dadurch
ergibt sich die Situation, daß die
natürlicherweise
vorhandene, zumeist chromosomale Kopie des betreffenden Gens zwar
inaktiviert ist, so daß von
der Zelle in vivo kein funktionsfähiges Genprodukt mehr davon
abgeleitet werden kann; gleichzeitig wird dieser Defekt über die
vorher oder gleichzeitig zur Verfügung gestellte intakte Kopie
kuriert. Die Zelle kann nun nur noch deshalb überleben, weil sie das betreffende
genetische Element mit der intakten Kopie enthält. Dasselbe gilt für alle davon
abgeleiteten Zellen, insbesondere den hieraus resultierenden Klon,
solange sie bei den Zellteilungen mindestens eine intakte Kopie
des betreffenden kurierenden genetischen Elements erhalten.
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Das
ist das Prinzip, wonach die erfindungsgemäßen essentiellen Gene als Selektionsmarker
einsetzbar sind: jeweils intakte Kopien davon, vorzugsweise auf
einem Plasmid zur Verfügung
gestellt, sichern den Zellen, in denen die chromosomale Kopie inaktiviert
worden ist, das Überleben.
Abgeleitete Klone werden den betreffenden Vektor also solange aufweisen,
wie der Defekt nicht kuriert ist. Auf denselben genetischen Elementen
(Vektoren, Plasmide) wie das kurierende Gen können in die betreffenden Zellen
interessierende Gene eingebracht und dort dauerhaft aufrechterhalten
werden. Dies wird unten weiter illustriert.
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Der
wesentliche systemische Vorteil dieses Selektionsverfahrens gegenüber einer
Selektion über
Resistenzgene gegenüber
Giftstoffen, das heißt
Antibiotika, besteht darin, daß während der
Kultivierung nicht permanent ein entsprechender Stoff zugesetzt
werden muß und
daß Reversionen
zum Wildtyp seltener sind. Das ist mit den weiteren, eingangs beschriebenen
Vorteilen verbunden. Der wesentliche systemische Vorteil dieses
Selektionsverfahrens gegenüber
einer Selektion über
Auxotrophie besteht darin, daß während der
Kultivierung nicht auf komplexe, d. h. preisgünstig in hoher Menge zur Verfügung stehende
Nährmedien
verzichtet werden muß,
weil der jeweilige Mangel nicht durch Aufnahme eines einfachen Nährstoffs
ausgeglichen werden kann.
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Dies
wird dann besonders anschaulich, wenn man sich vergegenwärtigt, daß beispielsweise
mit den (jeweils geradzahligen) SEQ ID NO. 74 bis 174 (und den jeweils
hierzu homologen Genprodukten) ribosomale Proteine bezeichnet werden,
ohne die sich in keinem Fall funktionsfähige Ribosomen zusammensetzen
können,
welche die Proteinbiosynthese durchführen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
davon führt
die funktionelle Inaktivierung dazu, daß das betreffende Protein nicht
in vollständiger
Länge,
vorzugsweise überhaupt
nicht synthetisiert wird.
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So
reicht es in vielen Fällen
aus, nicht das komplette Gen zu deletieren, sondern lediglich Teile
herauszuschneiden oder durch Umwandlung einzelner codierender Codons
in Stopcodons das Gen soweit zu mutieren, daß nur noch Bruchstücke des
abgeleiteten Genprodukts gebildet werden, die nur noch wenig oder gar
nicht aktiv sind.
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Demgegenüber ist
die vollständige
Nichtsynthese des Genprodukts jedoch bevorzugt. Denn dies führt zum
einen zu einer Entlastung des Proteinsyntheseapparats und verhindert,
daß sich
im Zellinneren Fragmente der betreffenden Faktoren anhäufen. Damit
stehen entsprechend größere Anteile
des Proteinbiosyntheseapparats für
die eigentlich interessierenden Proteine zur Verfügung. Vor
allem aber ist eine Rückkehr
zum Wildtyp, eine sogenannte Reversion nicht mehr möglich, wenn
das Gen weitgehend entfernt ist. Beruht die Inaktivierung dagegen
lediglich auf einer Punktmutation, so kann eine einfache Rückmutation
den erfindungsgemäßen Effekt
wieder aufheben.
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Verschiedene
Ausführungsformen
dieses Gegenstand werden weiter unten ausgeführt. Hierbei ist unter anderem
zu berücksichtigen,
daß die
im Stand der Technik zur Inaktivierung auf genetischer Ebene zur
Verfügung
stehenden Methoden unterschiedliche Ergebnisse liefern können. So
kann mit Antisense-Konstrukten (siehe unten) in der Regel zwar eine
sehr weitgehende, nicht jedoch 100%ige Inaktivierung erreicht werden. Hierfür ist eine
Deletion des betreffenden Gens bevorzugt.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
handelt es sich bei diesen Verwendungen um solche, bei denen die
funktionelle Inaktivierung während
der Fermentation des Mikroorganismus erfolgt.
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Denn
der Aufgabe entsprechend sollte die Fermentation der für eine biotechnologische
Produktion eingesetzten Mikroorganismen verbessert werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
hiervon werden die eindeutig auf die betreffenden, inaktivierten Enzyme
oder Proteine zurückzuführenden
Aktivitäten
beziehungsweise Proteingehalte auf weniger als 50%, bevorzugt auf
weniger als 20%, ganz besonders bevorzugt auf weniger als 5% der
ohne die Inaktivierung auftretenden Aktivitätsbeziehungsweise Konzentrationswerte
reduziert.
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Diese
Abstufung hinsichtlich des Maßes
der Inaktivierung berücksichtigt
die unterschiedliche Wirksamkeit der verschiedenen zur Inaktivierung
zur Verfügung
stehenden Methoden. Zur Bestimmung dieser Werte werden Zellen eines
nichtbehandelten Stamms und eines behandelten Stamms unter ansonsten
identischen Bedingungen fermentiert und geeigneterweise während der
Fermentation die betreffenden Enzymaktivitäten geeigneterweise aus Zellextrakten
bestimmt. Da die Stämme
ansonsten identisch sind, sind die Aktivitätsunterschiede auf die erfindungsgemäßen Inaktivierungen
zurückzuführen. Dabei
ist erfindungsgemäß jede entsprechende
Aktivitätserniedrigung
erwünscht.
Prozentual vergleichbare Werte erhält man, indem man aus beiden
Fermentationen Proben nimmt und nach an sich bekannten Methoden
die betreffenden Aktivitäten bestimmt.
Zunehmend bevorzugt ist es, wenn der jeweilige in der erfindungsgemäßen Probe
bestimmbare Wert beim Übergang
in die stationäre
Wachstumsphase weniger als 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 7,5, 5% und ganz
besonders weniger als 1% des entsprechenden Werts der Vergleichsfermantation
beträgt.
Für Proteine, die
keinem enzymatischen Nachweis zugänglich sind, kann analog eine
antikörperbasierte
Nachweisreaktion durchgeführt
werden, wie sie prinzipiell weiter oben bereits beschrieben worden
ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
solcher erfindungsgemäßen Verwendungen
zur Inaktivierung werden 2, 3 oder mehr der genannten Gene funktionell
inaktiviert.
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Dies
dient zum einen dazu, um tatsächlich
einen letalen Genotyp zu erzeugen. Denn bei manchen Ansätzen, etwa
der RNA-Interferenz kann man nicht immer von einem 100%igen Erfolg
ausgehen. Insbesondere dient das aber dazu, um nach dem oben beschriebenen
Prinzip gleichzeitig mehrere Plasmide in derselben Zelle zu etablieren.
Das ist insbesondere dann abgebracht, wenn nebeneinander mehrere
Transgene eingebracht werden sollen, deren interessierende DNA-Abschnitte
nicht nebeneinander auf demselben Plasmid Platz haben oder getrennt
voneinander zur Wirkung kommen sollen. Der Selektionsdruck besteht
wiederum darin, daß jedes
Plasmid einen der genannten Gendefekte kuriert.
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In
einer Ausführungsform
dieser Verwendungen zur funktionellen Inaktivierung handelt es sich
um solche Verwendungen, wobei für
die Inaktivierung jeweils eine für
ein nichtaktives Protein codierende Nukleinsäure mit einer Punktmutation
eingesetzt wird.
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Derartige
Nukleinsäuren
können über an sich
bekannte Verfahren zur Punktmutagenese erzeugt werden. Solche sind
beispielsweise in einschlägigen
Handbüchern
wie dem von Fritsch, Sambrook und Maniatis, „Molecular cloning: a laboratory
manual", Cold Spring
Harbour Laboratory Press, New York, 1989, dargestellt. Zudem stehen
hierfür
inzwischen zahlreiche kommerzielle Baukästen zur Verfügung, etwa
das QuickChange®-Kit
der Firma Stratagene, La Jolla, USA. Dessen Prinzip besteht darin,
daß Oligonukleotide
mit einzelnen Austauschen (Mismatch-Primer) synthetisiert und mit
dem einzelsträngig
vorgelegten Gen hybridisiert werden; anschließende DNA-Polymerisation ergibt
dann entsprechende Punktmutanten. Hierfür können die jeweiligen Spezies-eigenen
Sequenzen dieser Gene verwendet werden. Aufgrund der hohen Homologien
ist es möglich
und erfindungsgemäß besonders
vorteilhaft, diese Reaktion anhand der mit dem Sequenzprotokoll
zur vorliegenden Anmeldung zur Verfügung gestellten Nukleinsäuresequenzen
durchzuführen.
Diese Sequenzen können
auch dazu dienen, entsprechende Mismatch-Primer für verwandte
Spezies zu entwerfen, wie sie nach an sich bekannten Methoden anhand
von Alignments der betreffenden Sequenzen ableitbar sind.
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Nach
einer alternativen Ausführungsform
dieser Verwendung wird für
die funktionelle Inaktivierung jeweils eine Nukleinsäure mit
einer Deletions- oder Insertionsmutation eingesetzt, vorzugsweise
umfassend die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen
umfassenden Randsequenzen des für
das Protein codierenden Bereichs.
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Auch
diese Verfahren sind dem Fachmann an sich vertraut. Somit ist es
möglich,
die Bildung eines oder mehrerer der im Sequenzprotokoll angegebenen
Genprodukte durch die Wirtszelle dadurch zu verhindern, daß ein Teil
des betreffenden Gens auf einem entsprechenden Transformationsvektor über Restriktionsendonukleasen
herausgeschnitten und der Vektor anschließend in den interessierenden
Wirt transformiert wird, wo über
die – bis
dahin noch mögliche – homologe
Rekombination das aktive Gen gegen die inaktive Kopie ausgetauscht
wird. In der Ausführungsform
der Insertionsmutation kann lediglich das intakte Gen unterbrechend
oder anstelle eines Genteils ein anderes Gen, beispielsweise ein
Selektionsmarker eingefügt
werden. Hierüber
ist das Mutationsereignis in an sich bekannter Weise phänotypisch überprüfbar.
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Um
diese jeweils notwendigen Rekombinationsereignisse zwischen dem
in die Zelle eingeführten
defekten Gen und der beispielsweise auf dem Chromosom endogen vorhandenen
intakten Genkopie zu ermöglichen,
ist nach dem derzeitigen Wissensstand eine Übereinstimmung in jeweils mindestens
70 bis 150 zusammenhängenden
Nukleinsäurepositionen,
jeweils in den beiden Randsequenzen zu dem nichtübereinstimmenden Teil nötig, wobei
es auf den dazwischenliegenden Teil nicht ankommt. Dementsprechend
sind solche Ausführungsformen
bevorzugt, die lediglich zwei flankierende Regionen mit mindestens
diesen Größen umfassen.
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Nach
einer alternativen Ausführungsform
dieser Verwendung werden Nukleinsäuren mit insgesamt zwei Nukleinsäureabschnitten
eingesetzt, die jeweils mindestens 70 bis 150 Nukleinsäurepositionen
umfassen und damit den für
das Protein codierenden Bereich zumindest teilweise, vorzugsweise
vollständig
flankieren. Die flankierenden Bereiche können dabei ausgehend von den
bekannten Sequenzen über
an sich bekannte Methoden, beispielsweise mithilfe nach außen gerichteter
PCR-Primer und einer Präparation
genomischer DNA als Matrize ermittelt werden (anchored PCR). Denn
allein um den Austausch der beiden Genkopien über homologe Rekombination
zu ermöglichen,
braucht es sich dabei nicht zwangsläufig um proteincodierende Abschnitte
zu handeln. Der vorliegenden Erfindung zufolge können die hierfür benötigten Primer
anhand der im Sequenzprotokoll angegebenen Nukleotidsequenzen auch
für andere
Spezies grampositiver Bakterien und hierunter insbesondere für solche
der Gattung Bacillus entworfen werden. Alternativ zu diesem experimentellen
Ansatz können
derartige, wenigstens zum Teil nichtcodierende Bereiche für viele
dieser Gene aus verwandten Spezies, beispielsweise aus B. subtilis
Datenbankeinträgen
entnommen werden, beispielsweise der Datenbank Subtilist des Institute
Pasteur, Paris, Frankreich (httpa/genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi).
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Nach
einer weiteren alternativen Ausführungsform
dieser Verwendung wird für
die funktionelle Inaktivierung jeweils eine Nukleinsäure eingesetzt,
die mit der 5'-terminalen
Sequenz, insbesondere der Signalsequenz des zugehörigen Gens
oder Teilen davon identisch ist oder interferiert.
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Hierunter
ist der Einsatz solcher molekularbiologischer Konstrukte zu verstehen,
mithilfe derer in den betreffenden, hiermit transformierten Zellen
Antisense-RNA zu den 5'-terminalen, insbesondere
für das
Signalpeptid codierenden Abschnitten der jeweiligen mRNA gebildet
werden. Dadurch ergibt sich eine Hybridisierung zwischen der in
vivo gebildeten, für
das zu inaktivierende Protein codierenden mRNA und der artifiziell
erzeugten homologen einzelsträngigen
RNA. Hierdurch wird eine effiziente Translation, das heißt Bildung
des betreffenden Proteins verhindert und die betreffende RNA über intrazelluläre Mechanismen
abgebaut. Diese Form der Inaktivierung liefert in der Regel keine
volständige
Inaktivierung, so daß gewisse
Restaktivitäten
verbleiben.
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In
einer Ausführungsform
der bislang beschriebenen Verwendungen zur funktionellen Inaktivierung handelt
es sich um solche Verwendungen, wobei zum Kurieren des Defekts jeweils
eine für
ein aktives Protein codierende Nukleinsäure auf einem Vektor in die
Wirtszelle eingebracht wird, vorzugsweise auf einem Vektor, der
sich als stabiles genetisches Element, besonders bevorzugt als Plasmid
in der Zelle etabliert.
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Hierdurch
ergibt sich das oben bereits beschriebene Selektionssystem, wonach
der kurierende Effekt eines Vektors dadurch ausgenutzt wird, daß dieser
Vektor gleichzeitig ein interessierendes Gen enthält. Auf diese
Weise wird ein Klon erzeugt, bei dem jede Zelle dieses interessierende
Gen als sogenanntes Transgen enthält. Dies ist dann besonders
leicht möglich,
wenn der betreffende Vektor alle genetischen Merkmale enthält, die
zur Replikation in der betreffenden Wirtszelle notwendig sind. Das
bedeutet, daß er
in allen Nachkommenzellen als Plasmid etabliert wird.
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In
einer Ausführungsform
hiervon handelt es sich um solch eine Verwendung, wobei die für das genannte
Kurieren verantwortliche Nukleinsäure zusätzlich zum lediglich proteincodierenden
Abschnitt den natürlicherweise
mit ihm verbundenen Promotor enthält oder einen als Promotor
ausreichenden Teil davon.
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Denn
zur Aktivierung eines Gen gehört,
daß es
unter den entsprechenden Bedingungen zur Bildung einer ausreichenden
Proteinmenge führt.
So verfügen
die meisten der oben beschriebenen Gene über sogenannte konstitutive
Promotoren, das heißt
solche, die praktisch permanent aktiv sind. Ein optimales Kurieren des
erfindungsgemäß herbeigeführten Gendefekts
sollte insbesondere dann der natürlicherweise
herrschenden Situation gleichkommen, wenn das betreffende Gen weitgehend
genauso wie bei natürlicher,
chromosomaler Lokalisation reguliert wird.
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In
einer weiteren, erfindungsgemäß angestrebten
Ausführungsform
hiervon handelt es sich um solch eine Verwendung, wobei auf demselben
genetischen Element wie das für
das genannte Kurieren des Defekts eine zu selektierende genetische
Information liegt, vorzugsweise unter der Kontrolle desselben Promotors.
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Dieser
Aspekt ist bereits oben ausführlich
beschrieben worden: eine zu selektierende genetische Information,
an der ein spezielles Interesse besteht, wird dadurch stabil in
einer Zellinie etabliert, daß sie
auf einem solchen kurierenden Vektor in eine Zelle eingebracht wird,
die den ansonsten letalen Gendefekt aufweist, welcher lediglich über die
Anwesenheit dieses Vektors kuriert wird.
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In
der besonderen Ausführungsform,
daß beide
genetischen Elemente unter der Kontrolle desselben Promotors stehen,
wird der Effekt ausgenutzt, daß es
sich insbesondere bei solchen konstitutiven Promotoren um praktisch
permanent aktive und oft auch starke Promotoren handelt. Ein weiterer
Vorteil kann darin bestehen, daß für das Transgen
kein zusätzlicher
Promotor bereitgestellt zu werden braucht; dadurch gestaltet sich die
Konstruktion des betreffenden Vektors vergleichweise einfach.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der hier beschriebenen Verwendungen sind solche Verwendungen, wobei
es sich bei der zu selektierenden genetischen Information um die
für ein
Protein, für
ein Enzym und/oder um eine Information zur Synthese einer niedermolekularen
Verbindung handelt.
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Denn
wie bereits gesagt sollte erfindungsgemäß die technische Fermentation
verbessert werden. Diese dienen in höchstem Maße der Herstellung derartiger
Verbindungen, welche beispielsweise der Medizin, der Lebensmitteltechnologie
oder weiteren Technikbreichen zugute kommen, in denen ein Interesse
an leistungsfähigen
Enzymen besteht, wie etwa der Waschmittelherstellung (siehe unten).
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Die
vorliegende Erfindung wird auch in der Form gentechnisch modifizierter
Mikroorganismen verwirklicht, auf die das oben Gesagte entsprechend
zutrifft.
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Ganz
allgemein sind das Mikroorganismen, bei denen die chromosomale Kopie
mindestens eines der oben unter Verweis auf SEQ ID NO. 1, 3, 5,
7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,
41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71,
73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103,
105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129,
131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155,
157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181,
183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207,
209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 29, 231, 233,
235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259,
261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285,
287, 289, 291, 293, 295, 297 und 299 definierten und/oder einer
weiteren oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren funktionell
inaktiviert ist.
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Hierunter
sind solche bevorzugt, bei denen 2, 3 oder mehr der genannten Gene
funktionell inaktiviert sind, vorzugsweise jeweils über eine
oben beschriebene erfindungsgemäße Verwendung
zur Inaktivierung durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure.
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Entsprechend
dem oben Gesagten können
auf diese Weise Stämme
erhalten werden, in denen mehrere ansonsten letale Gendefekte über mehrere
gleichzeitig vorhandene Plasmide kuriert werden. Jedes dieser Plasmide
kann Transgene tragen, an denen ein experimentelles oder technisches
Interesse besteht.
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Vorzugsweise
handelt es sich bei erfindungsgemäßen Mikroorganismen um solche,
wobei zum Kurieren des Defekts jeweils eine für ein aktives Protein codierende
Nukleinsäure
auf einem Vektor in die Wirtszelle eingebracht worden ist, vorzugsweise
auf einem Vektor, der sich als stabiles genetisches Element, besonders bevorzugt
als Plasmid in der Zelle etabliert hat.
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Denn
dadurch ergibt sich der beschriebene Effekt, wonach die zum Kurieren
notwendige genetische Information über Generationen hinweg stabil
in den betreffenden Zellinien enthalten bleibt.
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Weiterhin
bevorzugt handelt es sich bei erfindungsgemäßen Mikroorganismen um solche,
wobei die für
das genannte Kurieren verantwortliche Nukleinsäure zusätzlich zum lediglich proteincodierenden
Abschnitt den natürlicherweise
mit ihm verbundenen Promotor enthält oder einen als Promotor
ausreichenden Teil davon.
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Denn
dadurch ergibt sich der beschriebene Effekt, wonach die zum Kurieren
verantwortliche Nukleinsäure
möglichst
optimal zur Bildung eines entsprechenden Genprodukts führt.
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Weiterhin
bevorzugt handelt es sich bei erfindungsgemäßen Mikroorganismen um solche,
wobei auf demselben genetischen Element wie das für das genannte
Kurieren des Defekts eine zu selektierende genetische Information
liegt, bevorzugt unter der Kontrolle desselben Promotors.
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Denn
dadurch ergeben sich die oben beschriebenen Vorteile.
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Weiterhin
bevorzugt sind erfindungsgemäße Mikroorganismen
solche, wobei es sich bei der zu selektierenden genetischen Information
um die für
ein Protein, für
ein Enzym und/oder zur Synthese einer niedermolekularen Verbindung
handelt.
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Dies
ergibt sich, wie oben erläutert,
aus der technischen Bedeutung der betreffenden Genprodukte.
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Vorzugsweise
sind erfindungsgemäße Mikroorganismen
solche, bei denen es sich um Bakterien handelt.
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Hierunter
sind entsprechend den bisherigen Ausführungen solche Mikroorganismen
bevorzugt, bei denen es sich um gramnegative Bakterien handelt,
insbesondere solche der Gattungen Escherichia coli, Klebsiella,
Pseudomonas oder Xanthomonas, insbesondere um Stämme von E. coli K12, E. coli
B oder Klebsiella planticola, und ganz besonders um Derivate der
Stämme
Escherichia coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli
JM109, E. coli XL-1 oder Klebsiella planticola (Rf).
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Entsprechend
den bisherigen Ausführungen
sind solche Mikroorganismen nicht minder bevorzugt, bei denen es
sich um grampositive Bakterien handelt, insbesondere solche der
Gattungen Bacillus, Staphylococcus oder Corynebacterium, ganz besonders
der Species Bacillus lentus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B.
subtilis, B. globigii oder B. alcalophilus, Staphylococcus carnosus
oder Corynebacterium glutamicum und hierunter ganz besonders um
B. licheniformis DSM 13.
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Der
Aufgabe zufolge, die der vorliegenden Anmeldung zugrunde gelegen
hatte, sollten in erster Linie technische Fermentationsverfahren
verbessert werden. Dementsprechend wird die Erfindung insbesondere
in entsprechenden, erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren
verwirklicht.
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Dabei
handelt es sich ganz allgemein um Verfahren zur Fermentation eines
zuvor beschriebenen, erfindungsgemäßen Mikroorganismus.
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Die
durch derartige Mikroorganismen gekennzeichneten Verfahren sind
den bisherigen Ausführungen entsprechend
bevorzugt.
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Unter
den erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren
sind diejenigen zur Herstellung eines Wertstoffs bevorzugt, insbesondere
zur Herstellung einer niedermolekularen Verbindung oder eines Proteins.
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Denn
dies ist, wie bereits gesagt, das wichtigste Anwendungsgebiet für großtechnische
Fermentationen.
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In
einer Ausführungsform
sind das Verfahren, wobei es sich bei der niedermolekularen Verbindung
um einen Naturstoff, einen Nahrungsmittelergänzungsstoff oder um eine pharmazeutisch
relevante Verbindung handelt.
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Auf
diese Weise werden beispielsweise Aminosäuren, Vitamine oder Oligopeptide
produziert, die besonders als Nahrungsmittelergänzungsstoffe Verwendung finden.
Bei pharmazeutisch relevanten Verbindungen kann es sich um Vor-
oder Zwischenstufen zu Medikamenten oder sogar um diese selbst handeln.
In all diesen Fällen
spricht man auch von Biotransformation, wonach die Stoffwechseleigenschaften
der Mikroorganismen ausgenutzt werden, um die ansonsten aufwendige
chemische Synthese ganz oder zumindest in einzelnen Schritten zu
ersetzen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
sind das entsprechende Verfahren, bei denen es sich bei dem auf diese
Weise gebildeten Protein um ein Peptidhormon handelt.
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So
werden beispielsweise pharmazeutisch wichtige Peptidhormone wie
Interleukine oder Insulin großtechnisch
durch Fermentationen gewonnen, oft durch eukaryontische Wirtszellen.
Die erfindungsgemäße Umstellung
dieser Herstellungsprozesse auf eine antibiotikafreie Selektion,
stellt, wie oben beschrieben, eine unter Umweltschutzgesichtspunkten
vorteilhafte und kostengünstige
Ausführungsform
dar.
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Nicht
minder bevorzugt sind entsprechende Verfahren, bei denen es sich
bei dem auf diese Weise gebildeten Protein um ein Enzym handelt,
insbesondere eines aus der Gruppe der α-Amylasen, Proteasen, Cellulasen,
Lipasen, Oxidoreduktasen, Peroxidasen, Laccasen, Oxidasen und Hemicellulasen.
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Industrielle
Enzyme, die mit derartigen Verfahren hergestellt werden, finden
beispielsweise in der Nahrungsmittelindustrie Verwendung. So dienen α-Amylasen
beispielsweise dazu, um das Altbackenwerden von Brot zu verhindern
oder um Fruchtsäfte
zu klären.
Proteasen werden zum Aufschluß von
Proteinen verwendet. All diese Enzyme sind für den Einsatz in Wasch- und
Reinigungsmitteln beschrieben, wobei insbesondere die von grampositiven
Bakterien bereits natürlicherweise
hergestellten Subtilisin-Proteasen einen prominenten Platz einnehmen.
Insbesondere in der Textil- und Lederindustrie dienen sie der Aufarbeitung
der natürlichen Rohstoffe.
Ferner können
all diese Enzyme wiederum im Sinne der Biotransformation als Katalysatoren
für chemische
Reaktionen eingesetzt werden.
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Viele
dieser technisch relevanten Enzyme stammen ursprünglich aus Bacillusspezies
und werden deshalb besonders erfolgreich in grampositiven Organismen,
insbesondere solchen der Gattung Bacillus produziert, worunter in
vielen Fällen
auch Derivate von B. licheniformis DSM13 fallen. Insbesondere Produktionsverfahren,
die auf diesen mikrobiellen Systemen beruhen, können mithilfe der vorliegenden
Erfindung verbessert werden, weil insbesondere die im Sequenzprotokoll
angegebenen Sequenzen aus eben diesem Organismus stammen.
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Eine
weitere Ausprägung
der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer unter Verweis
auf SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,
29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59,
61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91,
93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119,
121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145,
147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171,
173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197,
199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223,
225, 227, 29, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249,
251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275,
277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297 und 299 definierten
und/oder einer weiteren oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder
Teilen davon zur Identifizierung des zugehörigen, in vivo unmittelbar
vorangehenden Promotors.
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An
diesen Promotoren besteht unter anderem zur Verwirklichung der hier
beschriebenen Erfindung ein Interesse. Denn wie oben beschrieben
kann es besonders vorteilhaft sein, zum erfindungsgemäßen Kurieren eines
erfindungsgemäß herbeigeführten Gendefekts
die hierfür
verwendete Nukleinsäure
unter die Kontrolle des Promotors zu stellen, der natürlicherweise
dieses Gen kontrolliert. Die zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, insbesondere
denen aus dem Sequenzprotokoll, zugehörigen Promotoren sind nicht
im Sequenzprotokoll angegeben, können
aber leicht nach an sich bekannten Methoden erhalten werden, insbesondere
indem auf die dort offenbarten, proteincodierenden Sequenzen zurückgegriffen
wird. Über
diese Sequenzen können
insbesondere aus B. licheniformis DSM12 sowie prinzipiell allen
hierzu verwandten Spezies die zugehörigen Promotoren erhalten werden,
wobei die Erfolgsaussichten, wie oben für die proteincodierenden Bereiche
beschrieben, umso höher
sind, je enger die betreffenden Organismen mit B. licheniformis
verwandt sind.
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Zusätzlich stehen
die hierdurch erhaltenen Promotoren auch für die Herstellung weiterer
Konstrukte zu Verfügung,
insbesondere von Expressionsvektoren. Dazu gehören vor allem solche, mit denen
erfindungsgemäße Genprodukte
wie oben beschrieben in größeren Mengen
hergestellt werden können,
beispielsweise um sie In-vitro-Verwendungsgsmöglichkeiten
zukommen zu lassen.
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In
einer Ausführungsform
dieses Erfindungsgegenstands wird die genannte Nukleinsäure mit
einer Präparation
einer genomischen DNA hybridisiert.
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Diese
genomische DNA stammt beispielsweise aus dem Wirt, an welchem die
oben beschriebene erfindungsgemäße Inaktivierung
vorgenommen werden soll. Sie wird in an sich bekannter Weise präpariert
und in einem Southern-Hybridisierungsexperiment mit der als Sonde
eingesetzten erfindungsgemäßen Nukleinsäure untersucht.
Aus dem Fragment, das auf diese Weise identifiziert worden ist,
kann der 5'-gelegene
Abschnitt nach ebenfalls bekannten Methoden isoliert werden, vorteilhafterweise
im Zusammenhang mit dem zugehörigen
Gen, so daß das
dadurch erhaltene Promotor-Genfragment
in einen entsprechenden Kurierungsvektor eingebracht werden kann.
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Eine
hierzu alternative Verwendungsmöglichkeit
besteht darin, anhand der genannten Nukleinsäure Primer zu bilden, über welche
flankierende DNA-Abschnitte aus einer Präparation einer genomischen
DNA identifiziert werden.
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Dies
geschieht analog der oben für
die proteincodierenden Bereiche beschriebenen Methode, wonach, ausgehend
von den bekannten Bereichen in den unbekannten Bereich hinein eine
PCR durchgeführt wird.
Hierduch werden, wie soeben beschrieben, Promotorenthaltende Bereiche
gewonnen, die vorteilhafterweise zusammen mit dem betreffenden Gen
in den Kurierungsvektor eingebracht werden können und dieses kontrollieren.
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Die
nachfolgenden Beispiele erläutern
die vorliegende Erfindung weiter.
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Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden,
wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und
Maniatis „Molecular
cloning: a laboratory manual",
Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren
einschlägigen
Werken angegeben sind. Enzyme, Baukästen (Kits) und Geräte werden
nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
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Beispiel 1
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Kultivierung
von Bacillus licheniformis
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Zellen
von B. licheniformis sind unter der Nummer DSM 13 bei der Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder
Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) erhältlich.
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B.
licheniformis wird in einem 500 ml-Schüttelkolben in 100 ml Horikoshi-Medium
pH 9 (0,1% K2HPO4, 0,5%
Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,02% MgSO4, 0,3%
Na2CO3) für 72 h bei
37°C und
200 rpm kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugation vom Überstand
getrennt. Der Überstand
enthält
die sekretierten Proteine.
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Beispiel 2
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Identifizierung der erfindungsgemäßen Gene
aus B. licheniformis DSM 13
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Aus
dem von der DSMZ erhältlichen
Stamm B. licheniformis DSM 13 wurde nach Standardmethoden die genomische
DNA präpariert,
mechanisch fraktioniert und über
Elektrophorese in einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Für eine Schrotschußklonierung
der kleineren Fragmente wurden die 2 bis 2,5 kb großen Fragmente
aus dem Agarosegel eluiert, dephosphoryliert und als stumpf endende
(blunt ended) Fragmente in die Smal-Restriktionsschnittstelle des
Vektors pTZ19R-Cm ligiert. Dabei handelt es sich um ein Chloramphenicol-Resistenz
verleihendes Derivat des von der Firma Fermentas (St. Leon-Rot)
kommerziell erhältliche Plasmid
pTZ19R. Dadurch wurde eine Genbank der kleineren Fragmente erhalten.
Als zweite Schrotschußklonierung
wurden die durch eine partielle Restriktion mit dem Enzym Saulllal
erhaltenen genomischen Fragmente in das SuperCos-1-Vektorsystem
(„Cosmid
Vector Kit") der
Firma Stratagene, La Jolla, USA, ligiert, wodurch eine Genbank über die überwiegend
größeren Fragmente
erhalten wurde.
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Aus
den durch Transformation mit den betreffenden Genbanken erhältlichen
Bakterien E. coli DH5α (D.Hannahan
(1983): „Studies
on transformation on Escherichia coli"; J. Mol. Microbiol., Band 166, Seiten 557–580) wurden
die betreffenden rekombinanten Plasmide isoliert und sequenziert.
Hierbei kam die Farbstoffabbruchmethode (dye terminator chemistry)
zum Einsatz, durchgeführt
durch die automatischen Sequenziergeräte Mega-BACE 1000/4000 (Fa. Amersham Bioscence,
Piscataway, USA) und ABI Prism 377 (Fa. Applied Biosystems, Foster
City, USA).
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Auf
diese Weise wurden unter anderem die im Sequenzprotokoll der vorliegenden
Anmeldung angegebenen Sequenzen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13,
15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45,
47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77,
79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107,
109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133,
135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159,
161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185,
187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211,
213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 29, 231, 233, 235, 237,
239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263,
265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289,
291, 293, 295, 297 und 299 erhalten. Die hiervon abgeleiteten Aminosäuresequenzen
sind in derselben Reihenfolge in den jeweils um eins höheren SEQ
IDs angegeben.
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Hierbei
zeigte sich, daß bei
folgenden Sequenzen: SEQ ID NO. 23 (pcrA), SEQ ID NO. 25 (polC),
SEQ ID NO. 39 (parE), SEQ ID NO. 49 (rpoB), SEQ ID NO. 51(rpoC),
SEQ ID NO. 57 (cspR), SEQ ID NO. 137 (rpsC), SEQ ID NO. 149 (rpsl),
SEQ ID NO. 159 (rpsN), SEQ ID NO. 171 (rpsT), SEQ ID NO. 179 (asnS),
SEQ ID NO. 181 (aspS), SEQ ID NO. 183 (cysS), SEQ ID NO. 187 (glyQ),
SEQ ID NO. 195 (leuS), SEQ ID NO. 223 (frr), SEQ ID NO. 243 (groES),
SEQ ID NO. 255 (secY), SEQ ID NO. 257 (accA), SEQ ID NO. 263 (accD)
und SEQ ID NO. 295 (asd) das Startcodon nicht ATG lautet, sondern
davon abweicht. Im Sequenzprotokoll befindet sich dazu jeweils folgende
Anmerkung: „First
codon translated as Met."
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Beispiel 3
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Sequenzhomologien
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Nach
Ermittlung der DNA- und Aminosäuresequenzen
gemäß Beispiel
2 wurden durch Recherche in den Datenbanken GenBank (National Center
for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda,
MD, USA; http://www.ncbi.nlm.nih.gov) und Subtilist des Institute
Pasteur, Paris, Frankreich (http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)
die jeweils nächstähnlichen,
bisher bekannten Homologe ermittelt.
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Die
ermittelten DNA- beziehungsweise Aminosäuresequenzen wurden zur Bestimmung
der Homologie über
Alignments einander gegenübergestellt;
hierfür
wurde das Computerprogramm Vector NTI® Suite
Version 7, verwendet, welches von der Firma Informax Inc., Bethesda,
USA, erhältlich
ist. Hierbei wurden die Standard-Parameter dieses Programms angewendet,
das heißt
für den
Vergleich der DNA-Sequenzen: K-tuple size: 2; Number of best Diagonals:
4; Window size: 4; Gap penalty: 5; Gap opening penalty: 15 und Gap
extension penalty: 6,66. Für
den Vergleich der Aminosäure- Sequenzen galten
folgende Standard-Parameter: K-tuple size: 1; Number of best Diagonals:
5; Window size: 5; Gap penalty: 3; Gap opening penalty: 10 und Gap extension
penalty: 0,1.
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Als
nächstähnliche
Gene und Proteine wurden jeweils die aus B. subtilis gefunden. Die
Ergebnisse dieser Sequenzvergleiche sind in folgender Tabelle 1
zusammengestellt. Von den jeweils nächstähnlichen Genen beziehungsweise
Proteinen von B. subtilis wurden, weil aufgrund der hohen Ähnlichkeiten
von denselben Funktionen ausgegangen werden kann, auch die jeweiligen
Gennamen und Proteinbezeichnungen übernommen.
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Tabelle
1: Nächstähnliche
Gene beziehungsweise Proteine zu den in Beispiel 2 ermittelten Genen
und Proteinen.
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Es
handelt sich also jeweils um Gene beziehungsweise Faktoren, denen über ihre
hohen Ähnlichkeiten
zu bekannten Genen und Faktoren aus B. subtilis eindeutige Funktionen
zugeordnet werden können.
Dies sind, wie die jeweiligen Bezeichnungen erkennen lassen, zentrale,
lebenswichtige Funktionen jeder Zelle.
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