DE69819168T2

DE69819168T2 - Erhöhung der proteinproduktion in gram-positiven mikroorganismen

Info

Publication number: DE69819168T2
Application number: DE69819168T
Authority: DE
Inventors: J. Wilhelmus QUAX; M. Robert CALDWELL
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1997-07-15
Filing date: 1998-07-14
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2018-07-15
Also published as: DK1003872T3; WO1999004006A1; CA2295878A1; DE69819168D1; JP2001510046A; CA2295878C; ATE252641T1; AU8405698A; EP1003872A1; EP1003872B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft im allgemeinen die Expression von Proteinen in gram-positiven Mikroorganismen und insbesondere des Sekretionsfaktors SecG im gram-positiven Mikroorganismus. Die Erfindung betrifft außerdem Expressionsvektoren, Verfahren und Systeme zur Herstellung von Proteinen in gram-positiven Mikroorganismen.
Hintergrund der Erfindung
Gram-positive Mikroorganismen, wie Mitglieder der Bacillus-Gruppe, sind bei der Fermentation im industriellen Maßstab verwendet worden, zum Teil wegen ihrer Fähigkeit ihre Fermentationsprodukte in die Kulturmedia zu sekretieren. Bei gram-positiven Bakterien werden die sekretierten Proteine über eine Zellmembran und eine Zellwand exportiert und anschließend in die äußeren Media nacheinander abgegeben, wobei im allgemeinen ihre native Konformation beibehalten wird.
Sekretionsfaktoren von gram-positiven Mikroorganismen, die identifiziert und in der Literatur beschrieben worden sind, umfassen SecA (Sadaie Y., Takamatsu H., Nakamura K., Yamane K.; Gene 98: 101–105, 1991), SecY (Suh J. -W., Boylan S. A., Thomas S. M., Dolan K. M., Oliver D. B., Price C. W.; Mol. Microbiol. 4: 305–314, 1990), SecE (Jeong S., Yoshikawa H., Takahashi H.; Mol. Microbiol. 10: 133–142, 1993), FtsY und FfH (WO 98/03197, PCT/NL 96/00278) und PrsA (WO 94/19471).
Im Gegensatz dazu wird beim gram-negativen Mikroorganismus, E. coli, das Protein in das Periplasma transportiert und nicht über die Zellmembran und die Zellwand in die Kulturmedia. E. coli weist mindestens zwei Typen von Komponenten beim Sekretionsmechanismus auf, lösliche cytoplasmatische Proteine und Membran-assoziierte Proteine. Die berichteten E. coli-Sekretionsfaktoren umfassen die löslichen cytoplasmatischen Proteine, SecB und Hitzeschockproteine, das periphere Membran-assoziierte Protein SecA und die integralen Membranproteine SecY, SecE, SecD und SecF.
Trotz der Fortschritte, Teile der Protein-Sekretionsmaschinerie in prokaryotischen Zellen zu verstehen, wurde der vollständige Mechanismus der Proteinsekretion, insbesondere von gram-positiven Mikroorganismen, wie Bacillus, bisher noch nicht vollständig aufgeklärt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Kapazität der Sekretionsmaschine eines gram-positiven Mikroorganismus kann ein beschränkender Faktor oder ein Engpaß bei der Proteinsekretion und der Herstellung von Proteinen in sekretierter Form, insbesondere wenn die Proteine rekombinant eingeführt und durch die Wirtszelle überexprimiert werden sein. Die Erfindung stellt ein Mittel zur Vermeidung dieses Engpasses zur Verfügung.
Die Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung eines Bacillus subtilis SecG-Sekretionsfaktors (hier auch YVAL genannt), der in bisher nicht-charakterisierter translatierter Genom-DNA durch seine Homologie mit einer Consensus-Sequenz von SecG (auf Basis der SecG-Sequenzen von Escherichia, Haemophilus und Macoplasmaorganismen) und der Tatsache, daß B. subtilis SecG ein funktionelles Homolog vom E. coli SecG ist, identifiziert worden ist. Die Erfindung basiert zum Teil außerdem auf der Entdeckung, daß B. subtilis SecG in Kombination mit anderen B. subtilis-Sekretionsfaktoren eine funktionelle Preproteintranslocase bildet.
Die Erfindung stellt isolierte Nukleinsäure- und abgeleitete Aminosäuresequenzen von B. subtilis SecG bereit. Die Aminosäuresequenz von B. subtilis SecG ist in der 1 gezeigt. Die Nukleinsäuresequenz, die B. subtilis SecG codiert, ist in 1 gezeigt.
Die Erfindung stellt außerdem verbesserte Verfahren, um Proteine aus gram-positiven Mikroorganismen zu sekretieren, bereit. Demzufolge liefert die Erfindung ein verbessertes Verfahren ein gewünschtes Protein in einem gram-positiven Mikroorganismus zu sekretieren, umfassend die Schritte des Erhaltens einer gram-positiven Mikroorganismus-Wirtszelle, umfassend eine SecG-codierende Nukleinsäure, die mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität mit der B. subtilis SecG aufweist, die in 1 gezeigt ist, und die Sekretion in einem gram-positiven Mikroorganismus modulieren kann, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle der Expressionssignale steht, die SecG in einem gram-positiven Mikroorganismus exprimieren kann, wobei der Mikroorganismus außerdem eine das Protein codierende Nukleinsäure umfaßt und des Kultivierens des Mikroorganismus unter Bedingungen, die sich zur Expression von SecG und Expression und Sekretion dieses Proteins eignen. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das gewünschte Protein homolog oder kommt in dem gram-positiven Mikroorganismus in der Natur vor. Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das gewünschte Protein heterolog zu dem gram-positiven Mikroorganismus.
Unter einem erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Mikroorganismus genetisch verändert um ein gewünschtes Protein, z. B. ein Enzym, einen Wachstumsfaktor oder ein Hormon zu erzeugen. Das Enzym ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteasen, Carbohydrase, einschließlich Amylasen, Cellulasen, Xylanasen und Lipasen, Isomerasen wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen, Transferasen, Kinasen, Phosphatasenacylasen, Amidasen, Esterasen, Reduktasen, Oxidasen. Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Expression des Sekretionsfaktors SecG mit der Expression anderer Komponenten der Sekretionsmaschine koordiniert. Bevorzugt werden anderen Komponenten der Sekretionsmaschine, d. h. eine Translokase, SecA, SecY, SecE verändert und/oder eine andere dem Fachmann bekannte Sekretion wird verändert, um im optimalen Verhältnis zu SecG exprimiert zu werden. Z. B. kann es zur optimalen Verbesserung der Sekretionsmaschine wünschenswert sein, mehrere Sekretionsfaktoren zusätzlich zu SecG zu überexprimieren. Bei einer weiteren hier offenbarten Ausführungsform wird B. subtilis SecG zusammen mit B. subtilis SecYE und SecA exprimiert, um eine funktionale Preproteintranslokase zu bilden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt die Nukleotidsequenz von secG und die Aminosäuresequenz von SecG.
2 zeigt eine Aminosäureanordnung der SecG-Sequenz von E. coli (ecosecg.p1), Hämophilius (haeinsecg.p1), Mycoplasma (myclepsecg.p1) und B. subtilis (bsuyval.p1) und die SecG-Consensus-Sequenz der vier Organismen.
3 zeigt die Aminosäureidentität zwischen B. subtilis SecG und E. col SecG.
4 zeigt die Aminosäureidentität zwischen B. subtilis SecG und Mycoplasma SecG.
5 zeigt ein Hydrophilizitätsprofil von B. subtilis SecG.
6A–6B. 6A zeigt ein mit Comassie gefärbtes SDS-PAGE von Zellfraktionen von B. subtilis DB104 und DB104:Δyval. Der kleine Buchstabe "c" bedeutet celluläre Fraktion, der kleine Buchstabe "m" bedeutet Medium. Die Position einer Polypeptidbande, die in Wildtypzellen vorhanden aber in der Deletionsmutante abwesend ist, ist angezeigt.
6B zeigt den Proteinase K-Verdau von zellassoziierten Proteinen. Der Verdau der Polypeptid-Bande bei 30 kDa ist bei den DB104:Δyval-Zellen nicht vorhanden. Die Endbande zeigt eine Kontrolle mit Triton X-100, um zu zeigen, daß die Proteinase K in überschüssigen Mengen vorhanden ist.
7A–7C
7A zeigt ein mit Commassie gefärbtes SDS-PAGE von inneren Membranvesikeln von E. coli, die B. subtilis SecYA und entweder E. coli SecG oder B. subtilis SecG (Yval) im Vergleich zu Wildtypvesikeln exprimieren. Die B. subtilis SecY- und SecE-Position ist angezeigt.
7B zeigt einen Immunoblot, der mit einem pAb, der gegen ein synthetisches E. coli SecG-Polypeptid gerichtet ist, entwickelt wurde.
7C zeigt einen Immunoblot, der mit einem pAb, der gegen ein synthetisches B. subtilis SecG-Polypeptid gerichtet ist, entwickelt wurde.
8 zeigt eine in vitro-Translokation von ¹²⁵I-markierten prePhoB in E. Coli eingestülpten Vesikeln. Aus den Vesikeln wurde SecA entfernt und gereinigtes B. subtilis SecA wurde, wenn angezeigt, zugegeben.
Detaillierte Beschreibung
Definitionen
Die Gattung Bacillus umfaßt hier alle Mitglieder die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich S. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und B. thuringiensis, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Die Erfindung umfaßt neue SecG-Sekretionsfaktoren aus gram-positiven Mikroorganismus. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der gram-positive Organismus Bacillus. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der gram-positive Organismus B. subtilis. Der Ausdruck "B. subtilis SecG-Sekretionsfaktor", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die in 1 gezeigt abgeleitete Aminosäuresequenz. Die Erfindung umfaßt Varianten der in 1 offenbarten Aminosäuresequenz, die die Sekretion allein oder in Kombination mit anderen Sekretionsfaktoren verändern kann.
"Nukleinsäure" bezieht sich hier auf eine Nukleotid- oder Polynukleotidsequenz und Fragmente oder Teile davon und auf DNA oder RNA genomischen oder synthetischem Ursprungs, die doppelsträngig oder einzelsträngig sein kann, und den Sinne- oder Antisinne-Strang darstellen. "Aminosäure" bezieht sich hier auf Peptid- oder Proteinsequenzen oder Teile davon. Das kleingeschriebene "secG" wird hier verwendet, um eine Nukleotidsequenz zu benennen, während das großgeschriebene "SecG" verwendet wird, um eine Aminosäuresequenz zu benennen. Ein "B. subtilis Polynukleotid-Homolog" oder "Polynukleotid- Homolog", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf ein neues Polynukleotid, das mindestens 80%, mindestens 90%, m mindestens 90% und mindestens 95% Identität mit dem secG Polynukleotid in 1 zeigt oder das mit dem Polynukleotid der 1 unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann und das eine Aminosäuresequenz codiert, die die Sekretion des gram-positiven Mikroorganismus, von dem es abstammt, verändern kann. Verändern bezieht sich hier auf die Fähigkeit eines Sekretionsfaktors, das Sekretionsmuster von Proteinen zu verändern.
Die Ausdrücke "isoliert" oder "gereinigt", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf eine Nukleinsäure oder Aminosäure, die von mindestens einer Komponente mit der sie in der Natur assoziiert ist, entfernt wird.
Der Ausdruck "heterologes Protein", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Protein oder Polypeptid, das in der Natur in einer gram-positiven Wirtszelle nicht vorkommt. Beispiele heterologer Proteine umfassen Enzyme, wie Hydrolasen, einschließlich Proteasen, Cellulasen. Amylasen, andere Carbohydrasen und Lipasen, Isomerasen wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen, Transferasen, Kinasen und Phosphatasen. Das heterologe Gen kann therapeutisch bedeutende Protein oder Peptide codieren, wie Wachstumsfaktoren, Cytokine, Liganden, Rezeptoren und Inhibitoren sowie Vakzine und Antikörper. Das Gen kann kommerziell wichtige industrielle Proteine oder Peptide codieren, wie Proteasen, Carbohydrasen, wie Amylasen und Glucoamlylasen, Cellulasen, Oxidasen und Lipasen. Das Gen von Interesse kann ein in der Natur vorkommendes Gen, ein mutiertes Gen oder ein synthetisches Gen sein.
Der Ausdruck "homologes Protein" bezieht sich auf ein Protein oder Polypeptid das nativ oder in der Natur in einer gram-positiven Wirtszelle vorkommt. Die Erfindung umfaßt Wirtszellen, die das homologe Protein über rekombinante DNA-Technik erzeugen. Die Erfindung umfaßt eine gram-positive Wirtszelle, die eine Nukleinsäure, die das in der Natur vorkommende homologe Protein codiert, wie eine Protease, mit einer Deletion oder Unterbrechung aufweist und eine, die eine Nukleinsäure, die das homolge Protein oder eine Variante davon codiert, und die in rekombinanter Form wieder eingeführt worden ist, aufweist. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Wirtszelle das homologe Protein her.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfindung betrifft neue Sekretionsfaktoren von gram-positiven Mikroorganismen und Verfahren die in den gram-positiven Mikroorganismen verwendet werden können, um den Engpaß der Proteinsekretion zu verbessern und die Herstellung von Proteinen in sekretierter Form zu gewährleisten, insbesondere wenn die Proteine rekombinant eingeführt und durch die Wirtszelle überexprimiert werden. Die Erfindung stellt den Sekretionsfaktor SecG, der von Bacillus subtilis abstammt, bereit.
I. SecG-Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen
SecG-Nukleinsäuresquenzen
Das SecG-Polynukleotid mit der in 1 gezeigten Sequenz codiert den Bacillus subtilis Sekretionsfaktor SecG. Eine FASTA-Suche nach Bacillus subtilis translatierten Genomsequenzen mit der E. coli SecG-Sequenz allein reicht nicht aus, um den B. subtilis SecG zu identifizieren. Bacillus subtilis SecG wurde über eine FASTA-Suche nach Bacillus subtilis translatierten Genomsequenzen unter Verwendung einer Consensussequenz von 30 Aminosäuren von SecG, die von E. coli Haemophilus und Mycoplasma-Arten, wie in 2 gezeigt, abstammen. Die verwendete Consensussequenz war "LVGLILLQQG KGAXXGASFG GGASXTLFGS", die in der Richtung vom Aminoende zum Carboxyende mit der FASTA-Suche (Ausgabe 1.0, am 11. Juni 1997 ausgegeben) angegeben ist, wobei die Parameter Scoring matrix, GenRunData, biosum50.cmp, variabler verwendeter Pamfaktor, Gap-Herstellungsstrafe: 12 und Gap-Verlängerungsstrafe: 2 sind.
Die vorliegende Erfindung stellt gram-positive secG-Polynukleotide bereit, die allein oder zusammen mit anderen Sekretionsfaktoren, wie SecY, SecE und SecA in einer gram-positiven Wirtszelle zum Zweck des Erhöhens der Sekretion von gewünschten heterologen oder homologen Proteinen oder Polypeptiden verwendet werden können.
Die Erfindung umfaßt secG-Polynukleotid-Homologe, die einen neuen SecG des gram-positiven Mikroorganismus codieren, der entweder durch eine oder mehrere Polynukleotide codiert wird, die mindestens 80% oder mindestens 90% oder mindestens 95% Identität mit B. subtilis SecG aufweisen solange das Homolog ein Protein codiert, das die Sekretion in einem gram-positiven Mikroorganismus verändern kann. Es ist für den Fachmann verständlich, daß wegen der Degeneration des genetischen Codes eine Vielzahl von Polynukleotiden, d. h. SecG Polynukleotid-Varianten, die den Bacillus subtilis-Sekretionsfaktor SecG codieren können. Die Erfindung umfaßt all solche Polynukleotide.
Gram-positive Polynukleotid-Homologe von B. subtilis SecG können durch Standardverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, erhalten werden, z. B. durch klonierte DNA (z. B. eine DNA-"Bibliothek"), Genom-DNA-Bibliotheken, durch chemische Synthese sobald sie identifiziert worden sind, durch cDNA-Klonierung oder durch die Klonierung der Genom-DNA oder von Fragmenten davon, die von einer gewünschten Zelle gereinigt wurden (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York; Glover, D. M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Bd. I, II). Eine bevorzugte Quelle ist aus Genom-DNA. Nukleinsäuresequenzen, die von Genom-DNA abstammen, können regulatorische Bereiche zusätzlich zu den codierenden Bereichen enthalten. Egal von welcher Quelle sollte das isolierte secG-Gen molekular in einen geeigneten Vektor zur Vermehrung des Gens kloniert sein.
Bei der molekularen Klonierung des Gens aus der Genom-DNA werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen codieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in der Gegenwart von Mangan verwenden, um die DNA zu fragmentieren oder die DNA kann physikalisch geschert werden wie z. B. durch Beschallung. Die linearen DNA-Fragmente können anschließend nach der Größe durch Standardtechniken getrennt werden, die Agarose und Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Säulenchromatographie umfassen, aber nicht auf diese beschränkt sind.
Sobald die DNA-Fragmente erzeugt worden sind, kann die Identifizierung des spezifischen DNA-Fragmentes, das das SecG enthält, auf verschiedene Wege erreicht werden. Z. B. kann ein erfindungsgemäßes B. subtilis SecG-Gen oder seine spezifische RNA oder ein Fragment davon, wie eine Sonde oder ein Primer, isoliert und markiert und anschließend in Hybridisierungs-Assays verwendet werden, um ein gram-positives SecG-Gen nachzuweisen (Benton, W. und Davis, R. 1977, Science 196: 180; Grunstein, M. und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961). Solche DNA-Fragmente, die im wesentlichen Sequenzähnlichkeit mit der Sonde zeigen, werden unter stringenten Bedingungen hybridisieren.
Folglich stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von grampositiven SecG Polynukleotid-Homologen bereit, das das Hybridisieren eines Teils oder der gesamten SecG-Nukleinsäuresequenz von B. subtilis mit der Nukleinsäure des gram-positiven Mikroorganismus, entweder der genomischen oder der cDNA umfaßt.
Auch sind erfindungsgemäß Polynukleotidsequenzen vom gram-positiven Mikroorganismus umfaßt, die mit der SecG-Nukleotidsequenz von B. subtilis unter Bedingungen von mittlerer bis maximaler Stringenz hybridisieren können. Die Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäure-Bindungskomplexes, wie von Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, San Diego CA) beschrieben, was hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist und eine definierte "Stringenz", wie unten beschrieben, übertragen.
Auch sind erfindungsgemäß neue secG-Nukleotidsequenzen vom gram-positiven Mikroorganismus umfaßt, die mit einem Teil oder der gesamten secG-Nukleotidsequenz der 1 unter Bedingungen von mittlerer bis maximaler Stringenz hybridisieren. Die Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäure-Bindungskomplexes, wie von Berger und Kimmel (1987 in Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, San Diego, CA) gelehrt, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist und eine definierte "Stringenz", wie unten erläutert, überträgt.
"Maximale Stringenz" tritt gewöhnlich bei ungefähr Tm –5°C (5°C unter dem Tm der Sonde) auf, "hohe Stringenz" bei ungefähr 5 bis 10°C unter der Tm, "mittlere Stringenz" bei ungefähr 10 bis 20°C unter der Tm und "niedrige Stringenz" bei ungefähr 20 bis 25°C unter der Tm. Wie für den Fachmann verständlich ist, kann eine Hybridisierung bei maximaler Stringenz verwendet werden, um Polynukleotidsequenzen zu identifizieren oder nachzuweisen, während Hybridisierung bei mittlerer oder niedriger Stringenz verwendet werden kann, um Polynukleotidsequenz-Homologe zu identifizieren oder nachzuweisen.
Der Ausdruck "Hybridisierung", wie er hier verwendet wird, soll "das Verfahren, bei dem ein Strang einer Nukleinsäure mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung verbunden wird" (Coombs J. (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY). Das Amplifizierungsverfahren, wie es durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Techniken durchgeführt wird, wird in Dieffenbach C. W. und G. S. Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY) beschrieben. Eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens ungefähr 10 Nukleotiden und so viel wie ungefähr 60 Nukleotiden der SecG-Nukleotidsequenz der 1, bevorzugt ungefähr 10 bis 30 Nukleotide und am meisten bevorzugt ungefähr 20–25 Nukleotide kann als Sonde oder PCR-Primer verwendet werden.
Aminosäuresequenzen
Das secG-Polynukleotid von B. subtilis, das in 1 gezeigt ist, codiert B. subtilis SecG. Die Erfindung umfaßt neue Aminosäure-Varianten der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz vom gram-positiven Mikroorganismus, die mindestens 80% identisch, mindestens 90% identisch und mindestens 95% identisch mit der in 1 gezeigten Sequenz sind, solange die Aminosäuresequenzvariante die Sekretion von Proteinen in gram-positiven Mikroorganismen allein oder in Kombination mit anderen Sekretionsfaktoren verändern kann.
Der Sekretionsfaktor SecG, wie in 1 gezeigt, wurde einer FASTA (Lipmann Pearson Routine) Aminosäurensuche gegen eine Consensus-Aminosäuresequenz von SecG unterworfen. die Aminosäureanordnung ist in 2 gezeigt. Das Hydrophilizitätsprofil von B. subtilis SecG, wie in 5 gezeigt, zeigt zwei potentielle Membran-überschreitende Bereiche.
II. Expressionssysteme
Die Erfindung stellt ein Expressionssystem zur verbesserten Herstellung und Sekretion von gewünschten heterologen oder homologen Proteinen in gram-positiven Mikroorganismen bereit.
a. Codierende Sequenzen
Erfindungsgemäß umfaßt der Vektor mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure, die einen SecG-Sekretionsfaktor vom gram-positiven Mikroorganismus codiert und umfaßt bevorzugt mehrere Kopien. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der gram-positive Mikroorganismus Bacillus. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der gram-positive Mikroorganismus Bacillus subtilis. Bei einer bevorzugten Ausführungsform können Polynukleotide, die B. subtilis SecG oder Fragmente davon codieren oder Fusionsproteine oder Polynukleotid-Homologsequenzen, die Aminosäurevarianten von SecG codieren, verwendet werden, um rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, die die Expression von SecG bzw. Aminosäurevarianten davon in gram-positiven Wirtszellen steuern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform gehört die Wirtszelle zur Bacillus-Gattung. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle B. subtilis.
Es ist für den Fachmann verständlich, daß es von Vorteil sein kann, Polynukleotidsequenzen zu erzeugen, die in der Natur nicht vorkommende Codone besitzen. Codone, die bei einer bestimmten gram-positiven Wirtszelle (Murray E. et al. (1989) bevorzugt sind, können ausgewählt werden, z. B. um die Expressionsrate zu erhöhen oder um rekombinante RNA-Transkripte mit gewünschten Eigenschaften zu erzeugen, z. B. eine längere Halbwertszeit, als Transkripte, die von der in der Natur vorkommenden Sequenz erzeugt werden.
Veränderte gram-positive secG-Polynukleotidsequenzen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen Deletionen, Insertionen oder Substitutionen verschiedener Nukleotidreste, die zu einem Polynukleotid führen, das das gleiche bzw. ein funktional äquivalentes secG-Homolog codiert. Eine "Deletion", wie sie hier verwendet wird, wird definiert als eine Änderung in entweder der Nukleotid- oder Aminosäuresequenz, wobei ein oder mehrere Nukleotide oder Aminosäurereste fehlen.
Eine "Insertion" oder "Addition", wie sie hier verwendet wird, ist eine Änderung in einer Nukleotid- oder Aminosäuresequenz, die zu einer Zugabe von ein oder mehreren Nukleotiden bzw. Aminosäureresten im Vergleich zu der in der Natur vorkommenden gram-positiven secG führt.
Eine "Substitution", wie sie hier verwendet wird, bedeutet der Austausch einer oder mehrerer Nukleotide oder Aminosäuren durch verschiedene Nukleotide bzw. Aminosäuren.
Das codierte Protein kann außerdem Deletionen, Insertionen oder Substitutionen der Aminosäurerest zeigen, die eine stille Änderung erzeugen und zu einer funktional äquivalenten gram-positiven secG-Variante führen. Absichtliche Aminosäuresubstitutionen können auf Basis der Ähnlichkeit der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilizität und/oder der amphipathischen Natur der Reste erzeugt werden, solange die Variante die Fähigkeit beibehält, die Sekretion zu verändern. Z. B. umfassen negativ geladenen Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure, positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; und Aminosäuren mit ungeladenen Polargruppen mit ähnlichen Hydrophilizitätswerten umfassen Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.
Die erfindungsgemäßen SecG-Polynukleotide können gentechnisch hergestellt werden, um die Klonierung, das Processing und/oder die Expression des Genproduktes zu verändern. Z. B. können Mutationen unter Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, eingeführt werden, z. B. durch seitengerichtete Mutagenese, um neue Restriktionsstellen einzuführen, um Glycosylierungsmuster zu verändern oder um die Codon-Preferenz zu verändern.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann ein secG-Polynukleotid an eine heterologe Sequenz ligiert werden, um ein Fusionsprotein zu codieren. Ein Fusionsprotein kann außerdem gentechnisch hergestellt werden, um eine Spaltstelle zu enthalten, die sich zwischen der SecG-Nukleotidsequenz und der hetereologen Proteinsequenz befindet, so daß das SecG-Protein von dem heterologen Teil gespalten und gereinigt werden kann.
b. Vektorsequenzen
Expressionsvektoren, die bei dem Exprimieren der erfindungsgemäßen Sekretionsfaktoren in gram-positiven Mikroorganismen verwendet werden, umfassen mindestens einen Promotor der mit einer gram-positiven SecG in Verbindung steht, wobei der Promotor in der Wirtszelle funktional ist. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Promotor der Wildtyp-Promotor des ausgewählten Sekretionsfaktors und in einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Promotor heterolog zu dem Sekretionsfaktor, ist aber immer noch in der Wirtszelle funktionstüchtig.
Zusätzliche Promotoren die mit heterologen Nukleinsäuren verbunden sind, die die gewünschten Proteine oder Polypeptid codieren, können über rekombinante DNA-Techniken eingeführt werden. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann die Wirtszelle ein heterologes Protein oder Polypeptid überexprimieren und eine Nukleinsäure, die einen Sekretionsfaktor oder mehrere Sekretionsfaktoren codiert/codieren, wird/werden rekombinant eingeführt. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die SecG-codierende Nukleinsäure in das Genom des Mikroorganismus stabil integriert. In einer weiteren Ausführungsform wird die Wirtszelle gentechnisch verändert, um einen erfindungsgemäßen Sekretionsfaktor überzuexprimieren und die Nukleinsäure, die das heterologe Protein oder Polypeptid codiert, wird über rekombinante DNA-Techniken eingeführt. Beispiel 3 veranschaulicht daß B. subtilis SecG in einer Wirtszelle exprimiert werden kann. Die Erfindung umfaßt gram-positive Wirtszellen, die Sekretionsfaktoren, die dem Fachmann bekannt sind, überexprimieren können, einschließlich SecA, SecY, SecE, sind auf diese aber nicht beschränkt, oder aber andere Sekretionsfaktoren, die dem Fachmann bekannt sind oder in Zukunft identifiziert werden. In einer Ausführungsform, die hier in Beispiel 2 offenbart ist, wird veranschaulicht, daß B. subtilis SecG zusammen mit den B. subtilis-Sekretionsfaktoren SecY, E und A an der Bildung einer funktionalen Preprotein-Translokase teilnehmen können.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor eine Mehrfach-Klonierungskassette, die bevorzugt mindestens eine Restriktionsendonukleasenstelle umfaßt, die für den Vektor einzigartig ist, um die Manipulierung der Nukleinsäure zu erleichtern. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Vektor außerdem einen oder mehrere selektierbare Marker. Der Ausdruck selektierbarer Marker, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Gen, das in dem gram-positiven Wirt exprimiert werden kann und durch das einfach nach solchen Wirten selektiert werden kann, die den Vektor enthalten. Beispiele solcher markierbarer Marker umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt, Antibiotika, wie Erythromycin, Actinomycin, Chloramphenicol und Tetracyclin.
C. Transformation
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Nukleinsäure, die einen erfindungsgemäßen oder mehrere erfindungsgemäße gram-positive Sekretionsfaktor (Faktoren) codiert in einen gram-positiven Wirt über einen Expressionsvektor, der sich in dem Wirt vermehren kann, eingeführt. Geeignete sich vermehrende Plasmide für Bacillus sind in Molecular Biological Methods for Bacillus, Hrsg. Harwood and Cutting, John Weley & Sons, 1990 beschrieben, die hier ausdrücklich durch Bezugnahme eingeschlosse sind; siehe Kapitel 3 über Plasmide. Geeignete sich vermehrende Plasmide für B. subtilis sind auf Seite 92 aufgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform ist eine Nukleinsäure, die SecG von einem gram-positiven Mikroorganismus codiert stabil in das Genom des Mikroorganismus eingeführt worden. Bevorzugte gram-positive Wirtszellen sind von der Gattung Bacillus. Ein weiterer bevorzugter gram-positiver Wirt ist B. subtilis. Verschiedene Strategien sind in der Literatur zur direkten Klonierung von DNA in Bacillus beschrieben worden. Die Rettungstransformation des Plasmidmarkers umfaßt die Aufnahme eines Donor-Plasmids durch kompetente Zellen, die ein teilweise homologes residentes Plasmid tragen (Contente et al., Plasmid 2: 555–571 (1979); Haima et al., Mol. Gen. Genet. 223: 185–191 (1990); Weinrauch et al., J. Bactenol. 154(3): 1077–1087 (1983); und Weinrauch et al., J. Bacteriol. 169(3): 1205–1211 (1987)). Das eintretende Donorplasmid verbindet sich mit dem homologen Bereich des residenten "Helfer"-Plasmids in einem Verfahren bei dem die chromosomale Transformation nachgeahmt wird.
Die Transformation durch Protoplasten-Transformation wird für B. subtilis beschrieben von Chang und Cohen (1979) in Mol. Gen. Genet. 168: 111–115; für B. megatorium in Vorobjeva et al. (1980) FEMS Microbiol. Letters 7: 261–263; für B. amyloliquefaciens von Smith et al. (1986) in App. and Env. Microbiol. 51: 634, für B. thurigiensis von Fisher et al. in (1981) Arch. Microbiol. 139: 213–217; für B. sphaericus von McDonald (1984) in J. Gen. Microbiol. 130: 203; und für B. larvae von Bakhiet et al. (1985), 49: 577. Mann et al. (1986, Current Microbiol. 13: 131–135) berichtet über die Transformation von Bacillus-Protoplasten und Holubova (1985, Folia Microbiol. 30: 97) beschreibt Verfahren zur Einführung von DNA in Protoplasten unter Verwendung von DNA-enthaltenden Liposomen.
III. Identifizierung der Transformanten
Obgleich die Gegenwart/Abwesenheit der Markergen-Expression darauf schließen läßt, daß das Gen von Interesse auch vorhanden ist, sollte seine Gegenwart und Expression bestätigt werden. Z. B. wenn die SecG-codierende Nukleinsäure mit einer Markergensequenz eingeführt wird, können die rekombinanten Zellen, die das Insert enthalten, durch die Abwesenheit der Wirkung des Markergens identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen zusammen mit einer den Sekretionsfaktor codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors plaziert werden. Die Expression des Markergens als Antwort auf die Induktion oder Selektion zeigt gewöhnlich auch die Expression des Sekretionsfaktors.
Alternativ können Wirtszellen, die eine einen Sekretionsfaktor codierende Sequenz enthalten und das Protein exprimieren, durch eine Vielzahl von Verfahren identifiziert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Verfahren umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und Protein-Bioassay oder Immunoassay-Techniken, die Membran-basierte, Lösungs-basierte oder Chip-basierte Technologien zum Nachweis und/oder Quantifizieren der Nukleinsäure oder des Proteins umfassen.
Die Gegenwart der secG-Polynukleotidsequenz kann durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder -Amplifizierung unter Verwendung von Sonden, Teilen oder Fragmenten, die von dem B. subtilis secG-Polypeptid abstammen, nachgewiesen werden.
IV. Sekretionsassays
Bei einer Ausführungsform, die hier in Beispiel IV. offenbart ist, wird gezeigt, daß ein B. subtilis-Mikroorganismus mit einer Störung in der Nukleinsäure die SecG codiert in der Sekretion einiger extrazellulärer Proteine defekt zu sein scheint.
Verfahren zur Bestimmung des Grades der Sekretion eines heterologen oder homologen Proteins in einer gram-positiven Wirtszelle und das Nachweisen der sekretierten Proteine umfassen entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper, die für das Protein spezifisch sind. Beispiele umfassen den Enzym-Immuntest (ELISA), den Radioimmuntest (RIA) und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Diese und andere Verfahren sind u. a. in Hampton R. et al. (1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN) und Maddox D. E. et al. (1983, J. Exp. Med. 158: 1211) beschrieben.
Eine Vielzahl von Markierungen und Konjugationstechniken, die dem Fachmann bekannt sind, können bei verschiedenen Nuklein- und Aminosäure-Tests verwendet werden. Verfahren zur Erzeugung von markierter Hybridisierung oder PCR-Sonden zum Nachweis von spezifischen Polynukleotidsequenzen umfassen Oligomarkierung, Nich-Translation, Endmarkierung oder PCR-Amplifizierung unter Verwendung eines markierten Nukleotids. Alternativ kann die Nukleotidsequenz oder ein Teil davon in einen Vektor zur Herstellung einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind im Stand der Technik bekannt, sind kommerziell verfügbar und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch Zugabe einer geeigneten RNA-Polymerase, wie T7, T3 oder Sp6 und markierter Nukleotide zu synthetisieren.
Eine Vielzahl von Verbindungen wie Pharmacia Biotech (Piscataway NJ), Promega (Madison WI) und US Biochemical Corp (Cleveland OH) liefern kommerzielle Kits und Handbücher für diese Verfahren. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen umfassen Radionukleotide, Enzyme, fluoreszierende, chemilumineszierende oder chromogene Agenzien sowie Substrate, Co-Faktoren, Inhibitoren, magnetische Teilchen und dgl. Patente, die die Verwendung solcher Markierungen lehren, umfassen die US-Patente 3 817 837; 3 850 752; 3 939 350; 3 996 345; 4 277 437; 4 275 149 und 4 366 241. Ebenfalls können rekombinante Immunglobuline hergestellt werden, wie es im US-Patent Nr. 4 816 567 gezeigt ist.
V. Reinigung der Proteine
Gram-positive Wirtszellen, die mit Polynukleotidsequenzen transformiert sind, die ein heterologes oder homologes Protein codieren, können unter Bedingungen kultiviert werden, die sich zur Expression und Gewinnung des codieren Proteins aus der Zellkultur eignen. Das von einer rekombinanten gram-positiven Wirtszelle erzeugte Protein, das einen erfindungsgemäßen Sekretionsfaktor umfaßt, wird in die Kulturmedia sekretiert. Andere rekombinante Konstrukte können sich mit den heterologen oder homologen Polynukleotidsequenzen verbinden, die eine Polypeptid-Domäne codieren, die die Reinigung löslicher Proteine erleichtern wird (Kroll D. J. et al. (1993) DNA-Cell Biol. 12: 441–53).
Solche Domänen zur Erleichterung der Reinigung umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt, Metallchelat-Peptide, wie Histidin-Typrophan-Module, die die Reinigung auf immobilisierten Metallen ermöglicht (Porath J. (1992) Protein Expr Purif 3: 263–281). Protein A-Domänen, die die Reinigung auf immobilisiertem Immunoglobulin ermöglicht und die Domäne, die bei dem FLAGS-Erweiterungs/Affinitäts-Reinigungssystem (Immunex corp., Seatle WA) eingesetzt wird. Die Einführung einer spaltbaren Linkersequenz, wie Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego CA) zwischen der Reinigungsdomäne und dem heterologen Protein kann durchgeführt werden, um die Reinigung zu erleichtern.
Die Art und Weise und das Verfahren, durch das die Erfindung ausgeführt wird, ist für den Fachmann durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele voll verständlich, aber es ist nicht beabsichtigt, daß die Beispiele den erfindungsgemäßen Umfang oder die Ansprüche in irgendeiner Weise einschränken.
Beispiel I
Beispiel I erläutert die Materialien und Verfahren die in den Beispielen II bis VI verwendet werden.
a. Bakterienstämme und Wachstumsmedia
Die Stämme wurde in Luria-Bertani-Brühe oder auf Luria-Bertani-Agar wachsen gelassen. Wenn notwendig, wurde das Medium mit relevanten Antikörpern, wie angezeigt, ergänzt.
Die Konstruktion der Vektoren wurde in E. coli DH5α (supE44, ΔlacU169 (ϕ80lacZΔM15), hsdr17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, re1Al) durchgeführt. Chromosomale Deletionen und Wachstumsexperimente wurden in B. subtilis DB104 (nprE18, aprEΔ3) durchgeführt (Yang et al., 1984, Journal of Bacteriology 160: 15–21).
b. Herstellung der Plasmide
Die E. coli SecG und B. subtilis yval-Gene, einschließlich geeigneter Ribosombindungsstellen, wurden als BamhI-Xbal-Kassetten durch PCR aus chromosomaler DNA der Stämme DH5α bzw. DB104 amplifiziert und in pBluescript SK+ kloniert, wobei der verwendete Primer in der Tabelle 1 aufgeführt ist. Die Sequenzen der beiden offenen Leserahmen wurden bestimmt und mit relevanten Datenbanken verglichen. Zur Expression in E. coli wurden die Gene in pET324 (Van der Does et al., 1996) kloniert, was zu pET304 (E. coli secG) und pET820 (B. subtilis yval) führt.
Die Vektoren pPR111 (ein pUB110-Derivat, Diderichsen et al., 1993, Plasmid 30: 312–315) und pBEY13 (ein Geschenk von Dr. R. Breitlin) sind Shuttle-Vektoren unter Verwendung eines ColE1-Ursprungs zur Replikation in E. coli und RepR zur Replikation in gram-positiven Organismen. Die Plasmide codieren Ampicillin-resistente Marker für E. coli und Phleomycin-resistente Marker für B. subtilis. Der Vektor pBEY13 exprimiert die B. subtilis secY- und secE-Gene durch den konstitutiven staphylococcalen sak-Promotor. Die Plasmide pET470 und pET471 wurden gebildet durch Austauschen der secYA-Kassette durch E coli secG bzw. B. subtilis yval. Der Vektor pAMP21 ist ein pGK13 (Kok et al., 1984, Applied Environmental Microbiology 4B: 726–731) Vektor, der auf einem Wirtsvektor der häufig verwendet wird basiert, und der den von Lactococcos abstammenden p32-Promotor (van der Vossen et al., 1987, Applied and Environmetnal Microbiology 10: 2452– 2457) enthält mit einer synthetischen Ribosom-Bindungsstelle und einer Ncol-Stelle, die mit den Startcodon überlappt. Das B. amyloliquefaciens α-Amylase-Gen wurde durch PCR aus dem Plasmid pKTH10 (Palva, 1982, Gene 1: 81–87) als eine NcoI-BamHI-Kassette isoliert und in NcoI-BamHI verdautem pAMP21 ligiert. Der resultierende Vektor, pET468 genannt, beherbergt das amyQ-Gen unter der Kontrolle des konstitutiven p32-Promotors. Die Vektoren pET472 und pET473 wurden erzeugt durch die Ligieren der E. coli bzw. B. subtilis secG.Gene, die BamHI-BssHI-Fragmente aus den pBluescript-Derivaten enthalten, in das BamHI-BssHII-MluI-verdaute pET468. Die resultierenden Vektoren exprimieren B. amylolquefaciens α-Amylase und secG oder yval als zusammenhängendes Operon mit dem einzelnen p32-Promotor.
Ein Vektor zur yval-Zerstörung wurde wie folgt erzeugt. Die Bereiche, die unmittelbar stromaufwärts und stromabwärts von yval liegen wurden aus chromosomaler DNA des Stammes DB104 als BamHI-XbaI bzw. KpnI-HincII-Kassetten amplifiziert und in pBluescript SK+ kloniert. Daraufhin wurden ein BglII-PvuII-verdauter Chloramphenicol-Resistenzmarker zwischen den BamHI- und HincII-Stellen unter Erhalt von pDELG2 plaziert. Dieser Vektor enthält den chromosomalen Bereich, wie er in DB104 vorhanden ist, wobei yvaL durch den Chloramphenicol-Resistenzmarker ausgetauscht ist.
Das Plasmid pET812, das ein synthetisches Operon von Bacillus subtilis secY, secE und E. coli secG enthält, und das Plasmid pET822, das secY und secE und yval von B subtilis enthält, wurden zur Expression in E. coli, wie zuvor beschrieben (Van der Doses et al., 1986) unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Primer erzeugt.
Die alkalischen Phosphate phoB (phoAIII) von B. subtilis wurden aus chromosomaler DNA von DB104 unter Verwendung von PCR (für Primer siehe Tabelle 1) amplifiziert und N-terminal an ein his-tag-gebunden unter Verwendung des Plasmids pET302 (van der Does et al., 1998, Biochemistry, 37: 201–210) unter Erhalt von pET461. Ein Überblick der in dieser Studie verwendeten Plasmide wird in der Tabelle 2 geliefert.
Tabelle 1 Primer, die zur PCR-Amplifizierung verwendet wurden
Die Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme sind unterstrichen. Ribosom-Bindungsstellen und Start- und Stoppcodone sind in Fett angezeigt.
Tabelle 2 Liste der in dieser Studie verwendeten Plasmide
c. Deletion von SecG aus dem Chromosom von B. subtilis
Der Vektor pDELG2 wurde mit PvuII verdaut, um ein 2,8 kb lineares Fragment zu erhalten, das die Bereiche, die das yvaL flankieren, enthält, wobei yvaL durch ein Chloramphenicol-Resistenzmarker ausgetauscht wurde. B. subtilis DB104 wurde mit dem Fragment durch Einsetzen von natürlicher Konkurrenz (Young, 1967, Nature 213: 773–775) transformiert und die Chloramphenicol-resistenten Kolonien wurden selektiert. Die richtige Position des chromosomalen Austausches wurde durch PCR bestätigt. In dem resultierenden Stamm DB104ΔG, war yval durch das Chloramphenicol-Resistenzgen ausgetauscht, während die flankierenden Bereiche intakt blieben.
d. Wachstumsexperimente
B. subtilis DB104 und DB104ΔG wurden mit jeweils sechs Plasmiden, z. B. pPRl11, pET470, pET471, pET468, pET472 und pET473 transformiert. Nach der Transformation wurden die Platten bei 30°C über Nacht inkubiert. Selektiver Druck unter Verwendung von geeigneten Antibiotika wurde von diesem Zeitpunkt an ausgeübt. Kein Chloramphenicol wurde in diesem Stadium verwendet. Eine einzelne Kolonie wurde von jedem Transformanten herhausgesucht und über Nacht bei 30°C in flüssigem Medium kultiviert. 5 μl der über Nacht stehengelassenen Kultur wurden auf Platten verteilt und bei Raumtemperaturen im Bereich 15 bis 30°C inkubiert, bis die Kolonien des Wildtypstammes einen Durchmesser von mehreren Millimetern erreichten. Die Platten wurden täglich inspiziert und das Auftreten und die Größe der Kolonien wurden vermerkt.
Zur Expression in E. coli wurden die Plasmide pET820 und pET304 in E. coli KN370 (ΔsecG::kan) wie zuvor beschrieben transformiert (Nishiyama et al., 1994, The EMBO Journal 13: 3272–3277) und auf die Bildung von einzelnen Kolonien auf Agarplatten bei entweder 20°C oder 37°C mit oder ohne Induktion unter Verwendung von IPTG (1 mM) untersucht.
e. Analyse von sekretierten Proteinen
B. subtilis DB104 und DB104ΔG, mit dem Plasmid pET468 transformiert, wurden über Nacht bei 30°C in einem flüssigen Medium wachsen gelassen. Die Kulturen wurden auf Eis gekühlt und in eine zelluläre Fraktion und Kulturmedium durch Zentrifugierung fraktioniert. Alternativ wurden die Übernachtkulturen 1 : 50 in frischem Medium verdünnt, auf eine OD₆₀₀ von 0,6 wachsen gelassen und bei 15°C über Nacht inkubiert. Der Kulturüberstand wurde mit 10% G/V TCA ausgefällt, zweimal mit kaltem Aceton gewaschen und durch SSD-PAGE analysiert. Zelluläre Pellets der Kulturen wurde wurden wieder in Probepuffer suspendiert, beschallt und durch SDS-PAGE analysiert. Zur weiteren Analyse der zellulären Fraktionen wurde die Zugänglichkeit für Proteinase K untersucht. Transformierte DB104 und DB104ΔG wurden über Nacht bei 30°C wachsen gelassen und durch Zentrifugierung geerntet. Das Zellpellet wurde einmal mit TN (50 mM TRIS-Cl, pH 7,5, 100 mM NaCl) Puffer gewaschen und in dem gleichen Puffer, enthaltend 0,5 mg/ml Lysozym, suspendiert. Nach 15-minütiger Inkubierung auf Eis wurde Proteinase K auf eine Endkonzentration im Bereich von 0 bis 2 mg/ml zugegeben und die Suspension wurde weitere 15 Minuten inkubiert. Schließlich wurde die Suspension mit TCA ausgefällt, mit Aceton gewaschen und durch SDS-PAGE analysiert.
f. Expression von pET812 und pET822 und Herstellung von eingestülpten Vesikeln (inside-out-Vesikeln)
E. coli SF100 wurde zur Überexpression von B. subtilis SecY, SecE und entweder SecG von E. coli (pET812) oder Yval von B. subtilis (pET822), verwendet. Die Expression der Proteine und die Isolierung der eingestülpten Vesikel wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Van der Does et al., 1996).
g. E. coli SecA stripping der Vesikel und in vitro Translokation
Zur Entfernung der E. coli SecA aus eingestülpten Vesikeln wurden 100 μl der Vesikel (10 mg/ml) mit 50 μl des polyklonalen Antikörpers, der gegen E. coli SecA gerichtet ist (Schiebel et al., 1991, Molecular Microbiology 22: 619– 629) inkubiert. Die in vitro-Translokation von ¹²⁵I- markierten his-prcPhob (Van Wely et al., 1998, European Journal of Biochemistry) in innere Membranvesikel wurde wie zuvor beschrieben untersucht (Cunningham et al., 1989, Van der Does et al., 1996) außer daß gereinigte B. subtilis SecA (Van der Wolk et al., 1993, Molecular Microbiology 8: 31–42) anstatt von E. Coli SecA (0,5 μg) verwendet wurde.
h. Herstellung von B. subtilis SecG polyklonalem Antikörper
Ein Peptid-polyklonaler Antikörper, der gegen die interne Yval-Sequenz Tyr-Ala-Glu-Gln-Leu-Phe-Gly-Lys-Gln-Lys-Ala-Arg-Gly-Leu-Asp, die an KLH über den Tyrosin-Rest gebunden ist, gerichtet ist, wurde in Kaninchen gemäß den Standardverfahren von NEOSYSTEM, Straßburg, Frankreich hergestellt.
Beispiel II
Dieses Beispiel veranschaulicht, daß B. subtilis SecG ein funktionales Homolog von E. coli SecG ist.
Dem Membranvesikel, der aus Zellen abstammt, die pET812 und pET822 exprimieren wurde unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers, der gegen SecA gerichtet ist, seine einheimische E. coli-SecA entnommen und unter Verwendung von ¹²⁵I-markiertem his-prePhoB einem in vitro-Translokationstest unterworfen. In 8 ist das Translokationsergebnis gezeigt. Wenn keine B subtilis SecA zugegeben wurde, zeigten beide Vesikel die entweder SecYEG oder SecYE und YVAL enthielten, nur wenig Hintergrundstranslokation. Wenn B. subtilis SecA zu den Vesikeln, die SecYE und YVAL enthalten, zugegeben wurde, wurde ein enormer Anstieg der Translokationseffizienz von ¹²⁵I-prePhoB beobachtet, während bei Vesikeln, die SecYE und E. coli SecG enthalten, keine zusätzliche Translokation beobachtet wurde. Aus diesen Daten läßt sich schlußfolgern, daß B. subtilis SecYE zusammen mit B. subtilis Yval und SecA eine funktionale Preproteintranslokase bildet, die die Translokation von Bacillus prePhoB-Protein in vitro vermittelt.
Beispiel III
Dieses Beispiel veranschaulicht das B. subtilis SecY-, Sec- und SecG (YVAL)-Proteine in E. coli überexprimiert werden können.
Um zu etablieren, ob pET812 und pET822 in E. coli SF100 exprimiert werden, wurden eingestülpte Vesikel auf einem 15%igen SDS-PAGE untersucht. Sowohl SecY als auch SecE von B. subtilis war auf einem Commassie-gefärbten Gel leicht sichtbar (7A). B. subtilis SecG und erhöhte Menge von E. coli SecG konnten auf einem Immunoblot unter Verwendung von Antikörpern, die gegen diese Proteine gerichtet sind, nachgewiesen werden (7B–7C).
Beispiel IV
Dieses Beispiel veranschaulicht die Beteiligung der Protein-Sekretionsmaschine an der Sekretion von Proteinen in Wildtypzellen und Zellen, die eine Deletion in B. subtilis SecG aufweisen.
Bei Kulturüberstandszellen, die bei verschiedenen Temperatur wachsen gelassen wurden, wurden keine Unterschiede zwischen Wildtyp- und mutanten Zellen beobachtet (6A). Die Zellfraktion zeigte einige Unterschiede im Muster der Banden. Der Unterschied betraf hauptsächlich die Abwesenheit von Banden der Mutante. Die Lokalisierung dieser Proteine wurde durch Zerfall der Zellwände durch Lysozym und darauffolgendem Proteaseverdau der verfügbaren Proteine bestimmt (6B). Einige dieser Proteinbanden wurden schon bei niedrigen Proteinase K-Konzentrationen verdaut, wohingegen der Zerfall der meisten anderen Proteine nach der Zerstörung der Zellmembran durch Triton X-100 auftrat. Diese Proteine scheinen sekretiert zu sein. Einige dieser sekretierten Proteine sind in dem Mutantenstamm abwesend. Daher scheint die B. subtilis SecG-Zerstörungsmutante in der Sekretion einiger extrazellulärer Proteine defekt zu sein.
Beispiel V
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung einer SecG-Deletion auf das Zellwachstum.
Es wurde gezeigt, daß die Zerstörung des E. coli secG-Gens bei nicht-permissiven Temperaturen von 25°C und darunter zu einem kälteempfindlichen Phänotypen führt (Nishiyama et al., 1994, EMBO Journal 13-3272-3277). Die Deletion von B. subtilis secG aus dem Chromosom führte nicht zu jedem Phänotyp, wenn die Zellen bei 37°C entweder auf reichen Media oder Minimalmedia wachsen gelassen wurden. Die Inkubierungen unter 20°C zeigten eine milde Kälteempfindlichkeit, wohingegen der DB104ΔG-Stamm ein progressiv langsameres Wachstum im Vergleich zu DB104 zeigte. Der mutante Stamm hörte jedoch nicht vollständig zu wachsen auf. Im Vergleich zum Wildtyp war das Wachstum verlangsamt wenn die Temperaturen weiter heruntergesetzt wurden. Nachdem die Zellen wieder höheren Temperaturen ausgesetzt wurden, setzte sich das Wachstum in einer schnelleren Rate fort.
Die Zellen wurden mit Plasmiden, die E. coli SecG oder Bacillus subtilis SecG exprimieren sowie einem Kontrollplasmid transformiert. Nach der Vorinkubation bei Temperaturen, die nicht das Wachstum der Mutante beeinflussen, wurden die Zellen plattiert und bei verschiedenen niedrigen Temperaturen inkubiert. Das Wachstum der Kolonien wurde über einen Zeitraum von mehreren Tagen verfolgt. Wildtyp und mutante Zellen, die mit dem Kontrollplasmid transformiert sind, verhielten sich wie die nicht-transformierten Gegenstücke, wobei verlangsamter Wachstum aber kein vollständiger Stopp bei niedrigen Temperaturen beobachtet wurde. Durch die Transformation der Mutante mit pET471, die das secG-Genprodukt exprimiert, konnte die Verlangsamung behoben werden, wodurch gezeigt wird, daß der Phänotyp der Mutante nicht durch irgendwelche polaren Wirkungen sondern durch die Deletion von secG selbst verursacht wurde. Überraschenderweise hörte das Wachstum bei Temperaturen von 20°C oder weniger vollständig auf, wenn die Mutante mit pET470, das E. coli SecG exprimiert, transformiert wurde. Wenn das gleiche Plasmid in die Wildtypzellen gebracht wurden, wurde eine leichte Wachstumsstörung bei niedrigen Temperaturen aber nicht bei 25°C beobachtet. Durch eine Zerstörung des secG-Gens wird Bacillus subtilis leicht kälteempfindlich gemacht, aber es ist nicht ein wesentliches Gen für B. subtilis. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Ergebnisse der Wachstumsuntersuchungen

++: Wachstum wie die Referenz
±: Wachstum aber langsamer als die Referenz
–: kein Wachstum

Beispiel VI
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirkung der Expression eines Sekretionsproteins.
Die mutanten secG B. subtilis-Zellen und die Wildtypzellen wurden mit dem Plasmid pET468 und Derivaten transformiert. Diese Plasmide exprimieren alpha-Amylase, wodurch Sekretionsstreß verursacht wird. Die Derivate von pET472 und pET473 exprimieren alpha-Amylase in Kombination mit E. coli SecG bzw. B. subtilis SecG. Die Expression der alpha-Amylase verlangsamte das Wachstum der Deletionsmutante bei 30°C, der Temperatur, die zur Vorkultivierung verwendet wird, nicht. Bei dieser Temperatur haben die Halos die durch die alpha-Amylase auf Stärke enthaltenden Platten durch die Transformanten des Wildtyps und der Deletionsmutanten gebildet werden, die gleiche Größe. Wenn pET468-Transformanten der Deletionsmutante niedrigeren Temperaturen ausgesetzt wurden, wurde eine deutliche und vollständige Kälteempfindlichkeit gezeigt. Schon bei 20°C hörten die Zellen vollständig auf zu wachsen. Wenn die Zellen nach einer verlängerten Inkubation bei 20°C wieder zurück zu der permissiven Temperatur von 30°C transformiert wurden, wurde das Wachstum nicht wieder aufgenommen. Die Deletionsmutante konnte ein Basisniveau der Sekretion sogar bei niedrigeren Temperaturen beibehalten aber wurde nicht mit einer Expression eines Sekretionsproteins über einen breiten Temperaturbereich fertig.
Beispiel VII
Nachweis von gram-positiven Mikroorganismen
Das folgende Beispiel beschreibt den Nachweis des gram-positiven SecG-Mikroorganismus.
Die DNA, die von einem gram-positiven Mikroorganismus abstammt, wurde gemäß dem Verfahren das in Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2 oder 3 offenbart ist, hergestellt. Die Nukleinsäure wurde der Hybridisierung und/oder PCR-Amplifizierung mit einer Sonde oder einem von SecG abstammenden Primer unterworfen. Eine bevorzugte Sonde umfaßte den Nukleinsäureabschnitt, der die konservierten Aminosäuresequenzen enthält.
Die Nukleinsäuresonde wurde durch Verbinden von 50 pmol der Nukleinsäure und 250 mCi [gamma³²P] Adenosintriphosphat (Amersham, Chicago IL) und T4 Polynukleotidkinase (DuPont NEN^®, Boston MA) markiert. Die markierte Sonde wurde mit Sephadex G-25, einer sehr feinen Harzsäule (Pharmacia), gereinigt. Ein Teil, der jeweils 107 Zählungen pro Minute enthält, wurde bei einer typischen Hybridisierungsanalyse auf Membranbasis der Nukleinsäureprobe von entweder Genom oder cDNA verwendet.
Die DNA-Probe, die dem Restriktionsendonukleasenverdau unterworfen wurde, wurde auf einem 0,7% Agarosegel fraktioniert und auf Nylon-Membranen (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH) übertragen. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden bei 40°C durchgeführt. Zur Entfernung nichtspezifischer Signale wurden die Blots nacheinander bei Raumtemperatur und steigenden stringenten Bedingungen bis zu 0,1 Kochsalzlösungnatriumcitrat und 0,9% Natriumdodecylsulfat gewaschen. Die Blots wurden mehrere Stunden einem Film ausgesetzt. Der Film wurde entwickelt und die Hybridisierungsmuster wurden visuell verglichen, um Polynukleotid-Homologe von B. subtilis SecG nachzuweisen. Die Homologe wurden der Nukleinsäuresequenzierung unterworfen. Verfahren zur Nukleinsäuresequenzierung sind im Stand der Technik bekannt. Herkömmliche enzymatische Verfahren setzen das DNA-Polymerase Kenow-Fragment, SEQUENASE^® (US Biochemical Corp. Cleveland, OH) oder Taq-Polymerase ein, um die DNA-Ketten aus einem Oligonukleotid-Primer, der an die DNA-Matrize von Interesse gebunden ist, zu verlängern.
Verschiedene andere Beispiele und Modifikationen der vorgenannten Beschreibung und Beispiele sind für den Fachmann verständlich nachdem er die Offenbarung gelesen hat und es ist beabsichtigt, daß all solche Beispiele und Modifikationen vom Umfang der beigefügten Ansprüche umfaßt sind. Alle Publikationen und Patente, auf die hier Bezug genommen wird, sind in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.

Claims

Expressionsvektor, umfassend eine Nukleinsäure, die den SecG von einem gram-positiven Mikroorganismus codiert, wobei sie mindestens 80% Identität mit der Aminosäureseuqenz von B. subtilis SecG hat, die in 1 dargestellt ist, und die Sekretion in einen gram-positiven Mikroorganismus verändern kann, wobei der Sekretionsfaktor unter der Kontrolle der Expressionssignale steht, die diesen Sekretionsfaktor in einem gram-positiven Mikroorganismus überexprimieren können.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei der gram-positive Mikroorganismus Bacillus ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, wobei der Bacillus ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und Bacillus thuningiensis.
Gram-positiver Mikroorganismus, umfassend den Expressionsvektor von Anspruch 1.
Mikroorganismus nach Anspruch 4, der Bacillus ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 5, wobei der Bacillus ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und Bacillus thuningiensis.
Mikroorganismus nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus ein heterologes Protein exprimieren kann.
Mikroorganismus nach Anspruch 7, wobei das heterologe Protein ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem Hormon, Enzym, Wachstumsfaktor und Cytokin.
Mikroorganismus nach Anspruch 8, wobei das heterologe Protein ein Enzym ist.
Mikroorganismus nach Anspruch 9, wobei das Enzym ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen, Lipasen, Reduktasen, Isomerasen, Epimerasen, Tautomerasen, Transferasen, Kinasen und Phosphatasen.
Verbessertes Verfahren zum Sekretieren eines Proteins in einem gram-positiven Mikroorganismus, umfassend die Schritte: Erhalten eines gram-positiven Mikroorganismus als Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäure transformiert ist, die SecG codiert, die mindestens 80% Identität mit der Aminosäureseuqenz von B. subtilis SecG hat, die in 1 dargestellt ist, und die Sekretion in einen gram-positiven Mikroorganismus verändern kann, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle der Expressionssignale steht, die SecG in einem gram-positiven Mikroorganismus exprimieren können und die ausserdem eine Nukleinsäure umfaßt, die das Protein codiert, und Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die sich zur Expression von SecG eignen, und Expression und Sekretion des Proteins.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der gram-positive Mikroorganismus ausserdem eine Nukleinsäure umfasst, die mindestens einen zusätzlichen Sekretionsfaktor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SecY, SecE und SecA, codiert.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Protein für die Wirtszelle homolog ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Protein für die Wirtszelle heterolog ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der gram-positive Mikroorganismus Bacillus ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Bacillus ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus und Bacillus thuningiensis.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das heterologe Protein ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Hormonen, Enzymen, Wachstumsfaktor und Cytokin.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das heterologe Protein ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Enzym ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Carbohydrasen und Lipasen, Isomerasen, wie Racemasen, Epimerasen, Tautomerasen oder Mutasen, Transferasen, Kinasen und Phosphatasen.