DE69634853T2

DE69634853T2 - Ftsy-exprimierende gram-positive mikroorganismen mit verbesserten sekretionseigenschaften

Info

Publication number: DE69634853T2
Application number: DE69634853T
Authority: DE
Inventors: Johannes Wilhelmus QUAX; Richard Kerkman; Petrus Cornelis BROEKHUIZEN
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1995-07-07
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2016-07-06
Also published as: EP0837940B1; WO1997003197A1; US6410262B1; US20030077729A1; DE69634853D1; ATE297990T1; PT837940E; ES2244972T3; AU6320296A; CA2226287C; US6692951B2; EP0837940A1; CA2226287A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Proteinen mittels Mikroorganismen. Insbesondere betrifft sie die Sekretion von heterologen Proteinen durch Mikroorganismen, insbesondere Gram-positive Bakterien, vorzugsweise den bakteriellen Wirt Bacillus.
Sie betrifft ferner ein neues Gen (resp. dessen Überexpression), das für ein Protein codiert, welches an den frühen Stadien der prokaryotischen Proteinsekretion beteiligt ist. Insbesondere betrifft sie die Überexpression dieses Gens innerhalb eines Bacillus-Wirtes, der heterologe Proteine (über)exprimiert.
B. subtilis und (nah) verwandte Bacilli sekretieren Proteine direkt in das Wachstumsmedium in hohen Konzentrationen. Die Sekretion als Produktionsart von interessanten Proteinen, sei es homolog zum Wirt oder heterolog zum Wirt, sei es rekombinanten Ursprungs oder nicht, stellt mehrere Vorteile im Vergleich zu intrazellulären Produktionen bereit. Sie erleichtert beispielsweise die Reinigung des Produktes, sie führt theoretisch zu einer höheren Ausbeute, keine Aggregation des Produktes wird auftreten und sie eröffnet die Möglichkeit einer kontinuierlichen Kultivierung und Produktion. Jedoch waren Versuche zur Sekretion von heterologen Proteinen aus B. subtilis und (nah) verwandten Organismen in kommerziell bedeutsamen Konzentrationen, mit wenigen Ausnahmen, wenig erfolgreich.
Nahezu alle sekretierten Proteine verwenden eine Amino-terminale Proteinverlängerung, bekannt als das Signalpeptid, das eine entscheidende Rolle beim Targeting zu und Translokation von Vorläuferproteinen durch die Membran spielt und das proteolytisch durch eine Signalpeptidase während oder unmittelbar nach dem Membrantransfer entfernt wird. Die neu synthetisierten Vorläuferproteine werden von bestimmten Proteinen im Zytoplasma erkannt, die kollektiv als Chaperone bezeichnet werden. Diese Chaperone verhindern, dass Polypeptide, die für eine Translokation bestimmt sind, aggregieren oder frühzeitig falten, was zu einer Export-inkompatiblen Konformation führt.
Beispielsweise handelt es sich bei SecB, GroEL/GroES und Dank/DnaJ um die derzeit bekannten Chaperone im Export-Weg von E. coli. Für eine produktive Bindung der Vorläuferproteine an Translokationsstellen in der zytoplasmatischen Membran wird SecA benötigt. SecA, ein Protein, von dem zytoplasmatische, periphere wie auch integrale Membranformen entdeckt worden sind, besitzt eine ATPase-Aktivität, die die anfängliche Kanalisierung der Vorläuferproteine in den Export-Weg vermittelt.
Die SecA-Untereinheit dient als ein Rezeptor, der die Führungsdomänen und reifen Domänen der Vorläuferproteine (Lill et al., 1990) wie auch den SecB-Chaperon (Hartl et al., 1990) erkennt. Es wurde vorgeschlagen, dass SecA in die Membran penetriert, nach Bindung von ATP, und so die Co-Insertion des Vorläuferproteins fördert. Nach Hydrolyse von gebundenem ATP wird das Vorläuferprotein (preprotein) vom SecA-Protein freigesetzt (Schiebel et al., 1991). Die Translokation wird mit der Protonenantriebskraft als Hauptantriebskraft vollendet und erfordert Mitglieder des integralen Membranteils des Vorprotein-Translokasekomplexes wie z. B. SecY, SecE und SecG (p12/Bandl). SecD und SecE sind ebenfalls integrale Membranproteine und nehmen vermutlich an den späten Schritten der Proteintranslokation teil.
Für viele Jahre wurde die Proteinsekretionsmaschinerie in Prokaryoten als vom Proteinsekretionssystem, das in höheren Eukaryoten gefunden wurde, unabhängig angesehen (Luirink et al., 1992). In Säugern wird das Targeting von sekretorischen Proteinen an das endoplasmatische Retikulum (ER) durch das Signalerkennungspartikel (signal recognition particle, SRP) vermittelt, bei dem es sich um ein Ribonucleoprotein-Partikel handelt, zusammengesetzt aus einem RNA-Molekül (SRP 7S RNA) und sechs Polypeptiden mit 9, 14, 19, 54, 68 und 72 kD. Die SRP-Proteine sind mit der RNA entweder als Monomere (SRP 19 und SRP 54) oder als Heterodimere (SRP 9/14 und SRP 68/72) assoziiert.
Sobald das Signalpeptid von sekretierten Proteinen und Transmembranproteinen auf dem Ribosom auftaucht, wird es durch SRP erkannt und gebunden, das auch eine Affinität für das Ribosom aufweist. Diese Assoziation verlangsamt die Verlängerung der Polypeptidkette (Verlängerungseinhalt). Wenn der Komplex von SRP, wachsender Polypeptidkette und Ribosom an den SRP-Rezeptor (SR oder Andockprotein), assoziiert mit der ER-Membran, binden, wird die wachsende Polypeptidkette vom SRP in einer GTP-abhängigen Reaktion verlagert und die Proteintranslation wird aufgenommen.
Die Translokation des Polypeptids in das ER findet co-translational durch eine Protein-Pore statt, dem Translokon (Gilmore et al., 1993). Somit fungiert das SRP sowohl als zytosolischer Chaperon, der eine frühzeitige Faltung des Vorproteins verhindert, indem die Translation an die Translokation gekoppelt wird, als auch als ein Lotse zum Führen des Vorproteins zu dem SRP-Rezeptorkomplex in der Membran. Die 54 kD Untereinheit von SRP (SRP 54) bindet an das Signalpeptid, wenn es auf dem Ribo som auftaucht, und scheint somit eine Schlüsselfunktion in dem SRP-vermittelten Prozess der Proteinsekretion aufzuweisen.
Heutzutage stehen immer mehr Daten zur Verfügung, die darauf hinweisen, dass ein SRP-vermittelter Export-Weg auch in anderen Organismen funktionieren kann. Homologe von Säuger-SRP-Komponenten sind aus Hefe (Hann et al. 1989), E. coli (Bernstein et al. 1989 und Rymisch et al. 1989), Mycoplasma mycoides (Samuelsson, 1992) und Bacillus subtilis (Struck et al. 1989 und Honda et al. 1993) isoliert worden.
Es ist von daher wahrscheinlich, dass ein SRP-vermittelter Weg in Prokaryoten in einem separaten Sekretionsweg wirkt oder Teil des allgemeinen Sekretionswegs darstellt.
In E. coli wurden Bestandteile eines SRP-artigen Sekretionswegs identifiziert. Bei diesen Bestandteilen handelt es sich um Ffh (Fifty four homologue, 54 Homolog) und um ein 4,5 S RNA-Molekül, die zu dem SPR54 und SPR 7S RNA der eukarytischen SRPs homolog sind (Ribes et al. 1990). Es wurde gezeigt, dass Ffh spezifisch mit der Signalsequenz von wachsenden vorsekretorischen Proteinen interagiert (Luirink et al. 1992). Das E. coli-Protein FtsY, das ursprünglich mit der Zellteilung in Zusammenhang gebracht wurde (da dessen Gen in einem Operon zusammen mit FtsE und FtsX angeordnet ist), zeigt eine auffallende Sequenzähnlichkeit mit der Untereinheit des Säugerandockproteins (docking protein). Mehrere Beobachtungen deuten darauf hin, dass FtsY das funktionelle E-coli.-Homolog des SRP-Rezeptors von Säugern ist (Luirink et al. 1994). Eine Depletion von entweder FtsY, Ffh oder der RNA-Komponente von dem E. coli SRP beeinträchtigt den Export von mehreren sekretorischen Proteinen.
Auch in B. subtilis wurden Bestandteile des SRP-artigen Sekretionswegs gefunden. Es konnte gezeigt werden, dass die kleine zytoplasmatische RNA (small cytoplasmic RNA, scRNA) eine funktionale Beziehung mit der humanen SRP 7S RNA und der E. coli 4,5S RNA aufweist (Nakamura et al, 1992). Die scRNA aus B. subtilis wird von dem scr-Gen als ein 354 Nukleotid-Vorläufer transkribiert, welcher dann anschließend zu einer 271-Nukleotid-RNA am 5'- und 3'-Ende prozessiert wird (Struck et al., 1989), welche ähnlich zu dem eukaryotischen Homolog (300 Nukleotide), jedoch sehr viele größer als die 4,5S RNA aus E. coli (114 Nukleotide) ist. Auch die Sekundärstruktur der scRNA ist sehr ähnlich zur eurkyotischen SRP 7S RNA, wobei lediglich die Domäne III feht (Struck und Erdmann, 1990). Dies ist im Gegensatz zu den weiteren eubakteriellen SRP-artigen RNAs, die lediglich in einer einzigen Haarnadelstruk tur gefaltet werden, die der Domäne IV entspricht (Poritz et al, 1988). Folglich entspricht die scRNA aus B. subtilis sowohl im Hinblick auf die Größe als auch die Sekundärstruktur einem Zwischenprodukt zwischen prokaryotischer und eurkaryotischer SRP-artiger RNA.
Neben dem scr-Gen wurde ein weiteres Gen, das für einen SRP-Bestandteil kodiert, aus B. subtilis isoliert. Es wurde gefunden, dass das ffh-Gen für das Ffh-Protein kodiert, das eine Homologie zu sowohl dem E. coli als auch dem eurkaryotischen SRP54-Protein zeigt (Hona et al, 1993).
Es ist nicht unwahrscheinlich, dass Chaperone oder Bestandteile des SRP-artigen Sekretionswegs zu einem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Sekretionsweg werden, dessen Ergebnis darin besteht, dass der Großteil der exprimierten heterologen Proteine aggregieren oder sich verfrüht falten werden. Dieser Effekt könnte der Grund dafür sein, warum Versuche zur Sekretion von heterologen Proteinen in großen Mengen aus Gram-positiven Mikroorganismen, insbesondere B. subtilis und (nah) verwandte Mikroorganismen, so wenig erfolgreich waren. Eine Überexpression von bestimmten Bestandteilen der B. subtilis-Sekretionsmaschinerie, insbesondere der Chaperon-artigen Proteine, die den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Sekretionsweg darstellen, würde dieses Problem lösen. Es versteht sich, dass die Bezeichnungen "Chaperone" und "Sekretionsfaktor" nicht völlig eindeutig definiert sind. Beide Gruppen von Proteinen überlappen zumindest und können in einigen Fällen identisch sein. Da der Wirkungsmechanismus über Proteine noch nicht vollständig aufgeklärt ist, werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen die beiden Bezeichnungen abwechselnd verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt somit eine Methode zur Bereitstellung einer Grampositiven Wirtszelle bereit, die fähig ist, ein Protein von Interesse verstärkt zu sekretieren, wobei das Verfahren umfasst:
Bereitstellen einer Gram-positiven Wirtszelle mit (i) einer ersten DNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, und (ii) einer zweiten DNA-Sequenz, die mehr als 85% Sequenzhomologie zur Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 7 aufweist und für ein Protein mit einer Chaperon-Funktion kodiert,
so dass die Kultivierung der transformierten Gram-positiven Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen eine verstärkte Sekretion des Proteins von Interesse ermöglicht.
Wenn Gram-positive Bakterien, insbesondere Bacillus-Spezies und genauer gesagt Bacillus subtilis und nahe verwandte Organismen, mit der proteinartigen Substanz versehen werden, deren Funktionalität definiert ist, befähigt zu sein, ein zu sekretierendes Protein von Interesse zu erkennen und in den Sekretionsweg zu führen, werden sie eine verstärkte Fähigkeit zur Sekretion von Proteinen aufweisen. Es ist sehr wahrscheinlich, dass zu sekretierende Proteine eine Signalsequenz aufweisen müssen, die entweder ihre eigene Signalsequenz oder eine Signalsequenz eines homologen Proteins des Wirtsbakteriums oder eine Signalsequenz ist, die homolog zu dem Mikroorganismus ist, aus dem die proteinöse Substanz, das heißt der Sekretionsfaktor gemäß der vorliegenden Erfindung, stammt.
Bei dem Protein von Interesse kann es sich um jedes beliebige Protein handeln, das bis heute für eine Expression in Prokaryoten in Betracht gezogen worden ist, so lange es bereitgestellt werden kann oder seine eigene Signalsequenz aufweist, die es für eine Sekretion in einem Gram-positiven Wirt geeignet macht. Selbstverständlich muss es auch erkannt werden können (wenn möglich nicht sehr effizient) und in den Sekretionsweg mithilfe der Chaperon-artigen Proteine, die im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, geleitet werden. Es könnte unzutreffend sein, dass die Chaperon-artigen Proteine in der Lage sein würden, jedes Protein zu erkennen und zur Sekretion zu führen.
Weitere Sekretionsfaktoren können zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt werden, wenn der vorliegende erfindungsgemäße Sekretionsfaktor in ausreichenden Mengen bereitgestellt wird. In diesem Fall ist es bevorzugt, die Wirte ebenfalls mit den Sekretionsfaktoren, die zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt werden können, in ausreichenden Mengen zu versehen. Da wir davon ausgehen, dass eine SRP-artige Route in Bacillus-Spezies und weiteren Gram-positiven Bakterien vorliegt, wäre es von Vorteil, den Mikroorganismus mit erhöhten Mengen FtsY, der 7S scRNA und Ffh zu versehen.
Das Protein von Interesse kann entweder homolog oder heterolog zum Wirt sein. Im ersten Fall sollte eine Überexpression als eine Expression über den normalen Niveaus in diesem Wirt angesehen werden. Im letzteren Fall stellt im Grunde jede Expression selbstverständlich eine Überexpression dar.
Die proteinöse Substanz, die in den in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen offenbarten Methoden verwendet wird, die zur Einfachheit häufig als Chaperon, Sekretionsfaktor oder Chaperon-artiges Protein bezeichnet wird, kann zu dem Wirt homolog sein, was bevorzugt ist, es kann jedoch auch zu dem Wirt heterolog sein, solange es mit der Sekretionsmaschinerie des Wirts kompatibel ist. Es liegt nahe, dass dies in nah verwandten Organismen am Wahrscheinlichsten ist. Im Fall eines Sekretionsfaktors aus Bacillus subtilis wäre es daher bevorzugt, diesen in einem Bacillus einzusetzen.
Die dargestellte Sequenz, die ein Beispiel einer Sequenz darstellt, die für ein Chaperon-artiges Protein kodiert, welches in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, wird angegeben, um dem Fachmann zu ermöglichen, homologe Sequenzen aufzufinden, die für ähnliche oder funktionell gleichartige Chaperon-artige Proteine in weiteren Gram-positiven Bakterien kodieren, insbesondere von anderen Bacillus-Spezies. In Anbetracht des allgemeinen Fachwissens stellt es eine Routinearbeit dar, beispielsweise Primer herzustellen, die auf der angegebenen Sequenz basieren, und für weitere homologe Sequenzen zu screenen, die für diese Chaperon-artigen Proteine kodieren. Diese Chaperon-artigen Proteine aus anderen verwandten Organismen sollten folglich als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen werden. Ihre DNA- und/oder Aminosäuresequenzen werden in der Regel recht homolog sein. Als Regel wird die Homologie größer als 70 % insgesamt sein, insbesondere Homologien von mehr als 85 % insgesamt sind zu erwarten. Es versteht sich, dass sämtliche homologe Gene, die mit der in der Seq. ID Nummer 7 dargestellten Sequenz hybridisieren können, und die für ein Protein mit im Wesentlichen gleicher Struktur oder Funktion kodieren, in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können. Die folgende Gleichung, die aus der Analyse des Einflusses von verschiedenen Faktoren auf die Hybridstabilität abgeleitet wurde, Tm = 81 + 16,6 (log10 Ci) + 0,4 (% G + C) – 600/n – 1,5%mismatch (Ausubel et al., supra)
worin n = Länge der kürzesten Kette der Sonde
Ci = Ionenstärke (M)
G + C = Basenzusammensetzung,
kann verwendet werden, um zu bestimmen, welches Homologieniveau unter Verwendung von DNA-DNA-Hybridisierungstechniken detektiert werden kann.
Daher soll die Bezeichnung "im Wesentlichen einer Struktur" Sequenzen umfassen, die konservative Mutationen enthalten können, wobei die Sequenz für die gleiche Aminosäure kodiert, die sich jedoch bis zu 35 % in der DNA-Sequenz nach der vorstehend angegebenen Gleichung unterscheidet, häufiger durch bis zu 10 %. Es ist nicht immer notwendig, ein vollständiges Chaperon-artiges Protein zur Verfügung zu haben, um die Funktionen der Erkennung des zu sekretierenden Proteins und des Führens dieses Proteins in den Sekretionsweg auszuführen. Wenn möglich, können die Wirte auch mit funktionellen Teilen dieses Sekretionsfaktors versehen werden. Es ist auch möglich und sogar wahrscheinlich, dass eine Assoziation mit Nicht-Proteinmaterial wie der 7S-RNA auftreten kann, wenn der Sekretionsfaktor seine Funktionen ausführt. Die Bezeichnung proteinöse Substanz ist gewählt worden, um solche Assoziationen zu umfassen. Es ist jetzt schon in der Fachwelt bekannt, dass Mutationen in Proteinen zu einer höheren Aktivität, längeren Halbwertszeiten, einer besseren Stabilität des mutierten Proteins führen können. Solche Derivate der Sekretionsfaktoren können in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, da es aufgrund der in der vorliegenden Beschreibung dargestellten Informationen eine Routinearbeit darstellt, schwache Stellen oder weitere Stellen, die für Mutationen in den Sekretionsfaktoren gemäß der vorliegenden Erfindung von Interesse sein können, aufzufinden und ortsspezifische Mutationen durchzuführen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt eine proteinöse Substanz ein, bei der es sich um ein Chaperon-artiges Protein handelt, das wenigstens teilweise durch das ftsY-Gen einer Bacillus-Art kodiert wird. Bacillus-Arten sind stark bevorzugte Organismen zur Expression von den interessierenden Genen und einige Entwicklungs- und Produktionserfahrung steht zur Verfügung. Wie jedoch vorstehend angegeben, trat immer ein Problem mit der Sekretion von insbesondere heterologen Proteinen aus Bacillus auf. Dieses Problem kann in vielen Fällen gelöst werden, indem die Bacillus-Organismen mit Chaperon-artigen Proteinen aus anderen verwandten Art versehen werden, es ist jedoch einleuchtend, dass die Chancen eines guten funktionalen Sekretionsfaktors in Bacillus, einschließlich der Erkennung des heterolgen Proteins, bei Verwendung eines Chaperon-artigen Proteins am höchsten sind, das von einem Sekretionsfaktor einer Bacillus-Spezies abgeleitet ist. Von besonderem Interesse als Chaperon-artiges Protein ist eine proteinöse Substanz, die mindestens zum Teil durch das ftsY-Gen von Bacillus subtilis oder anderen Bacillus-Arten kodiert wird. Diese proteinösen Substanzen sind sehr wahrscheinlich analog zu dem eukaryotischen Docking-Protein (oder SRP-Rezeptor) wie in dem Fall von Produkten, die von dem E. coli ftsY-Gen abgeleitet sind. Ein Mangel ausreichender Mengen dieses Chaperon-artigen Proteins wird eindeutig einen großen Einfluss auf die Fähigkeit des Wirtsmikroorganismuses haben, irgendwelche Proteine zu sekretieren, ganz zu schweigen von heterologen Proteinen. Zur Zeit gehen wir davon aus, dass heterologe Proteine vorwiegend unter Verwendung des SRP-artigen Weges sekretiert werden können, das heißt durch Bindung an Ffh, 7S RNA und FtsY, während homolo ge Proteine den allgemeinen Sekretionsweg benutzen. Es ist ferner selbstverständlich, dass wenn ein heterologes Protein, das sekretiert werden soll, mit einem Signal versehen wird, das homolog oder nah verwandt zu einem Signal ist, welches in Bacillus-sekretorischen Proteinen vorliegt, dass dann das Vorliegen einer ausreichenden Menge des Sekretionsfaktors, der üblicherweise die Funktion der Erkennung eines solchen Signals aufweist, zu einer verstärkten Sekretion führen wird.
Die bevorzugte Methode zur Bereitstellung einer Gram-positiven Bakterie, insbesondere einer Bacillus-Art mit der Möglichkeit der Exprimierung ausreichender Mengen der Chaperon-artigen Proteine (und zum Beispiel scRNA), in der Methode gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, besteht selbstverständlich im Versehen dieses Mikroorganismus mit der genetischen Information, um dieses Chaperon-artigen Protein überzuexprimieren. Die Methode der vorliegenden Erfindung setzt folglich auch ein rekombinantes DNA-Molekül ein, das mindestens einen Teil eines ftsY-Gens umfasst, welches für ein Chaperon-artiges Protein von Gram-positiven Bakterien kodiert, wobei dieser Teil mindestens einen funktionellen Teil dieses Chaperon-artigen Proteins kodiert, wodurch ein Vertreter des Gens die Sequenz der Seq. ID Nr. 7 aufweist.
Wie für die proteinösen Substanzen, die in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wird die dargestellte Sequenz angegeben, um dem Fachmann zu ermöglichen, homologe Sequenzen, die für ähnliche Sekretionsfaktoren kodieren, aufzufinden. Es können Varianten innerhalb der Bacillus-Spezies und weiteren Gram-positiven Bakterien existieren. Es ermöglicht auch dem Fachmann, stille Mutationen, vorteilhafte Mutationen oder Mutationen, die keine Wirkung auf die Aktivität des Chaperons, welche aus der Expression stammt, aufweisen, zu konstruieren. Für unterschiedliche Arten kann die Codon-Präferenz unterschiedlich sein, wobei Degenerierungen zu berücksichtigen sind. Die Definition, welche Gene noch in der Methode gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, kann wirklich nur über ihre Funktionalität vorgenommen werden. Wenn sie für eine Substanz kodieren, die die gleiche Aktivität (im Hinblick auf die Art, nicht die Menge) wie die vorliegenden erfindungsgemäßen Chaperon-artigen Proteine besitzt, dann kann das Gen (oder das rekombinante DNA-Molekül) in der Methode gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, wenn das Molekül von einer Gram-positiven Bakterie, insbesondere einer Bacillus-Spezies, abgeleitet ist. Im Allgemeinen wird dies mit einem recht hohen Homologiegrad übereinstimmen, von beispielsweise 70–95 % insgesamt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens verwendet ein Gen oder ein rekombinantes DNA-Molekül, das mindestens einen Teil des ftsY-Gens einer Bacillus-Spezies umfasst. Der Hauptgrund für diese Präferenz liegt natürlich darin, dass Bacillus-Spezies wohlbekannte Produktionsorganismen darstellen, in denen es aus den vorgenannten Gründen nützlich wäre, ein autologes (zum Teil auch als homolog bezeichnetes) Chaperon-artiges Protein bereit zu stellen. Das am stärksten bevorzugte Chaperon-artige Protein zur Zeit ist jenes, das durch ein rekombinantes DNA-Molekül kodiert wird, das mindestens einen Teil des ftsY-Gens von Bacillus subtilis umfasst.
Für einen einfachen Transfer der genetischen Information der Sekretionsfaktoren, die in der Methode gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, ist es bevorzugt, das rekombinante DNA-Molekül als einen Vektor bereit zu stellen. Die vorliegende Erfindung verwendet folglich auch einen rekombinanten Vektor, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül wie vorstehend offenbart und geeignete regulatorische Elemente zur Replikation und/oder Expression. Die Natur und Art eines solchen Vektors ist nicht von Bedeutung, solange er fähig ist, die gewünschte genetische Information in den gewünschten Mikroorganismus zu transferieren, und vorzugsweise fähig ist, in solch einem Mikroorganismus zu replizieren oder repliziert zu werden. Diese können viele zusätzliche vorteilhafte Merkmale wie zum Beispiel Markergene, Restriktionsstellen und so weiter umfassen. Eine chromosomale Integration von (einem Teil) des Gens in Übereinstimmung mit dem Sekretionsfaktor ist ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. Es wäre natürlich vorteilhaft, nur einen Mikroorganismus mit einem Vektor transferieren zu müssen. Vorzugsweise verwendet die Methode gemäß der vorliegenden Erfindung einen rekombinanten Vektor, der wie vorstehend beschrieben ist, der zusätzlich ein Gen umfasst, das für ein zu sekretierendes Protein von Interesse kodiert.
Die Methode gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch Mikroorganismen verwenden, die durch beliebige Methoden mit der genetischen Information versehen wurden, um für ein Chaperon-artiges Protein zu kodieren. Die Erfindung kann folglich eine Zelle einsetzen, die von einer Gram-positiven Wirtszelle abgeleitet ist, welche ein rekombinantes DNA-Molekül oder einen Vektor, wie vorstehend definiert, umfasst. Vorzugsweise ist die Zelle von einer Bacillus-Spezies abgeleitet.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wurde die Zelle auch mit der Fähigkeit versehen, entweder 7S scRNA und Ffh oder beide auf ähnliche Art und Weise wie bei der Bereitstellung der (Über-) Expression von FtsY zu überexprimieren.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wurde die Zelle ferner mit der Fähigkeit versehen, ein homolges Protein überzuexprimieren, oder ein heterologes Protein zu exprimieren. Ein geeigneter Weg, um zu solch einer Zelle zu gelangen, besteht darin, diese mit der genetischen Information für das Protein von Interesse zu versehen, was zu einer Zelle führt, umfassend einen Vektor mit der genetischen Information, die für ein Chaperon-artiges Protein, das im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, kodiert, zusätzlich umfassend einen Vektor, der ein Gen umfasst, das für ein zu sekretierendes Protein von Interesse kodiert. Alle Methoden, die zu den Produkten gemäß der vorliegenden Erfindung führen, sind selbstverständlich auch Teil der vorliegenden Erfindung. Besonders wichtig sind Methoden, die zu einer verstärkten Produktion von Proteinen, die im Kulturmedium sekretiert werden, führen. Die vorliegende Erfindung umfasst folglich auch eine Methode zur Verstärkung der Sekretion eines Proteins von Interesse aus einem Grampositiven Mikroorganismus, umfassend die Schritte des Versehens dieses Mikroorganismus mit der Möglichkeit, das Protein von Interesse überzuexprimieren, Versehen des Mikroorganismus mit der Möglichkeit der Überexpression einer proteinösen Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung, und Kultivieren dieses Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen.
Vorzugsweise wird die Möglichkeit der Überexpression des Proteins von Interesse durch einen Vektor bereitgestellt, wie in der vorliegenden Beschreibung vorstehend offenbart, und die Möglichkeit der Überexpression einer proteinösen Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls durch einen Vektor bereitgestellt, der wie vorstehend in der vorliegenden Beschreibung offenbart ist.
Die vorliegende Erfindung wird nun in der folgenden ausführlichen Beschreibung und den Beispielen näher erläutert.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es liegen nun steigende Belege dafür vor, dass eine geringe Expression und/oder Sekretion durch eine falsche Faltung des heterologen Proteins in der Wirtszelle verursacht wird. Der Grund für diesen Effekt kann in der Inkompatibilität der Chaperon-artigen Proteine des normalen Sekretionswegs der Wirtszelle mit dem heterologen Protein liegen. Als Ergebnis werden die neu synthetisierten heterologen Proteine nur sehr ineffizient erkannt und auf diese Art werden sie zu einem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Translokationsprozess. Dies wird sogar noch deutlicher, wenn das heterologe Protein überexpremiert wird. Eine Möglichkeit, diesem Problem zu begegnen, besteht darin, die heterologen Chaperon-artigen Proteine, die zu dem zu sekretierenden heterologen Protein homolog sind, zu exprimieren. Der Expression von E. coli SecB in B. subtilis hat gezeigt, dass eine erleichterte Sekretion des SecB-abhängigen Maltose-Bindungsproteins von E. coli stattfindet (Collier, 1994). Diese Option ist vermutlich nicht anwendbar, wenn das heterologe Protein und der Sekretionsfaktor aus einem phylogenetisch weiter entferntem Organismus stammen. Auf diese Art könnte die normale Sekretionsmaschinerie der Wirtszelle mit dem heterologen Chaperon-artigen Protein selbst inkompatibel werden, was zum gleichen Effekt führt: extrem niedrige Sekretionseffizienz. Eine weitere Möglichkeit, die Teil der vorliegenden Erfindung ist, liegt in der Überexpression von einem oder mehreren der Chaperon-artigen Proteine der Wirtszelle, vorzugsweise der SRP-artigen Chaperon-artigen Proteine, um dadurch die Verfügbarkeit dieser Chaperon-artigen Proteine für das heterologe Protein zu erhöhen.
Da Homologe von SecA (Sadiae et al. 1991), SecE (Jeong et al. 1993), SecY (Su et al. 1990) und Lep (Van Dijl et al. 1992) in B. subtilis identifiziert worden sind, ist vorgeschlagen werden, dass die Signalpeptid-abhängige Proteinsekretion in B. subtilis einen Sec-Weg verwendet, der ähnlich zu jenem von E. coli ist. SecB, das als Hauptchaperon in E. coli angesehen wird, scheint bislang das einige Chaperon zu sein, das eine direkte Bindungsaffinität für SecA aufweist und so zum genauen Targeting des Vorproteins-SecB-Komplexes an die membrangebundene Translokase beiträgt. Das SecB-Protein wird nur für eine Subgruppe der Hüllproteine benötigt, so dass SecB-unabhängige Proteine in den Sec-Weg mit Hilfe von Helferproteinen wie zum Beispiel GroEL/GroES, Dnak/DnaJ oder weiteren Proteinen wie SRP eintreten. In eukaryotischen Organismen ist SRP hauptsächlich für die Translokation durch die ER-Membran verantwortlich. Vor kurzem wurden weitere Belege für die Existenz einer SRP-vermittelten Sekretionsroute in Bakterien verfügbar. Da der eukaryotische Weg vermutlich aus der Bakterie entstanden ist, ist es denkbar, dass diese Proteine ebenfalls von diesem Weg abhängen, wenn diese Proteine in Bakterien wie Bacillus exprimiert werden. Folglich wäre eine Optimierung dieses bestimmten Wegs in Bacillus nutzbringender für eine heterologe (eukaryotische) Proteinsekretion als die Optimierung des wohlbekannten Sec-Wegs. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Klonierung des Bacillus ftsY-Gens und dessen Wirkung nach (Über)expression, allein oder in Kombination mit weiteren Bestandteilen des bakteriellen SRP, auf heterologe Proteine.
Für die Klonierung von B. subtilis ftsY wurden degenerierte Primer synthetisiert, wobei die existierenden Homologieboxen zwischen den SRα-Homologen unterschiedlicher Organismen verwendet wurden (2a). Nach einer invertierten PCR-Reaktion unter Verwendung eines 110 bp-Fragments, abgeleitet von einer "nested" PCR-Reaktion, als Templat konnte ein 4 kb-Fragment detektiert werden. Die Sequenzierungsergebnisse (2b) zeigten ein offenes Leseraster von 329 Aminosäuren. Dieses Protein zeigte 48,2 % Aminosäureidentität und 65 % Ähnlichkeit (similarity) mit dem ftsY-Gen von E. coli.
Wie in den Beispielen gezeigt werden wird, führten die Hybridisierungsexperimente ursprünglich zu einem unerwünschten Ergebnis, das heißt zu einer Schmiere von verschwommenen Banden. Überraschenderweise waren wir in der Lage, durch Ausschneiden einer Region um die erwartete Größe des amplifizierten Fragments und erneutes Anwenden von PCR auf diese Region diese Schmiere in eine Gruppe von einzelnen Banden aufzulösen. Unglücklicherweise konnte praktisch keine Bande bei der erwarteten Größe des Fragments, das hätte verstärkt werden sollen, gesehen werden. Jedoch waren wir in einer dritten Amplifizierungsrunde trotzdem in der Lage, ein Fragment zu erhalten, das weiter eingesetzt werden konnte.
BEISPIEL 1
Konstruktion eines Promotorvektors zur Sekretionsfaktor-Überexpression
phB201 ist für eine autonome Replikation in sowohl E. coli-Stämmen (high-copy) als auch Bacillus-Stämmen (low copy) befähigt. Dieses Plasmid verleiht eine Resistenz gegen die Antibiotika Chloramphenicol und Erythromycin in E. coli und Bacillus. Ferner trägt das Plasmid ein CAT86:IacZ-Fusionsgen, vorausgegangen von dem starken Lactococcus lactis-Promotor 59, der auch als starker Promotor in B. subtilis fungiert (Van der Vossen et al. 1987).
Durch Ersetzen des SalI/EcoRI-Fragments dieses Plasmids durch ein synthetisches DNA-Fragment (SEQ ID NO:1) wurde CAT86::IacZ deletiert und eine einzige NdeI-Restriktionsstelle eingeführt, die mit der Translationsinitiationsstelle überlappte, die pHBNde erzeugt (1a). Dies ermöglichte es uns, die Chaperon-Gene direkt abwärts von dem starken Lactococcal-Promotor 59 zu exprimieren, ohne Fusionsproteine zu erzeugen, wie das mit dem ursprünglichen PHB201-Vektor der Fall gewesen wäre (1b).
BEISPIEL 2
Molekulare Klonierung von Bacillus subtilis-DNA-Fragmenten, die mit dem humanen SRα-Gen homolog sind.
Ein Set von drei Polymerasekettenreaktionen (PCR) wurden wie folgt durchgeführt. Chromosomale DNA aus B. subitilis 168 wurde als Templat in einer PCR-Reaktion mit degenerierten Primern AB4229 (SEQ ID Nummer: 2) und AB4230 (SEQ ID Nummer: 3) verwendet. Nach 30 Cyclen und einer Annealing-Temperatur von 40°C wurde die amplifizierte DNA mittels Elektrophorese auf einem 2 % Metaphor (FMC BioProducts) Agarose-Gel fraktioniert. Die Ergebnisse zeigten eine Schliere von schlecht-aufgelösten Banden. DNA-Fragmente mit Größen im Bereich von 220 bp bis 300 bp wurden aus dem Agarose-Gel mit einer QIAquick-Gel-Extraktionssäule (QIAGEN) gereinigt.
1/50 dieser isolierten Fragmente wurden in einer zweite PCR mit degenerierten Primern AB4229 und AB4241 (SEQ ID Nummer: 4) unter Verwendung der gleichen Reaktionsbedingungen wie in der ersten PCR eingesetzt. Das Ergebnis dieser PCR zeigte eine Reihe von verschiedenen Banden, jedoch war eine Bande der erwarteten Größe (± 120bp) nur schwer erkennbar. Fragmente von ± 120 bp wurden aus dem Agarose-Gel wie vorstehend beschrieben isoliert und in einer dritten PCR mit den gleichen Primern und Bedingungen wie für die zweite PCR eingesetzt. Das resultierende einzelne Fragment wurde isoliert, gereinigt und nach Behandlung mit T4-Polynukleotidkinase in dephosphoryliertes pUC18, linerarisiert mit SmaI, ligiert.
Nach Elektroporation zu E. coli JM109, Selektion auf IPTG/X-gal-Platten wurde die DNA aus sechs weißen Kolonien für eine automatische Sequenzierung eingesetzt. In allen sechs Isolaten konnte ein offenes Leseraster (Open Reading Frame ORF) detektiert werden. Dieses ORF zeigte mehr als 70 % Ähnlichkeit mit einem Allignment von Homologen aus mehreren anderen Organismen (2b).
BEISPIEL 3
Sequenzieren von unbekannten DNA-Sequenzen, die zu einem kurzen Teil mit einer bekannten Sequenz benachbart sind
Unter Verwendung eines markierten internen ftsY-Fragments, das aus Beispiel 2 stammt, konnten wir eine einzelne 4 kb PstI-Bande in einem Hybridisierungsexperi ment detektieren. Keiner der Versuche zur Klonierung dieses Fragments direkt in pUC war erfolgreich, was darauf hindeutet, dass die Klonierung dieses Fragments in E. coli letal sein könnte. Eine inverse PCR (ICPR) wurde zur Bestimmung der Sequenz verwendet.
Ein vollständiger PstI-Verdau von chromosomaler DNA aus B. subtilis 168 wurde als Templat in der IPCR mit den Primern AB5356 (SEQ ID Nummer: 5) und AB5357 (SEQ ID Nummer: 6) verwendet. Das resultierende Fragment wurde direkt für eine automatisierte Sequenzierung unter Verwendung der gleichen Primer eingesetzt. Die Sequenz des Rests des PstI-chromosomalen DNA-Fragments, das aufwärts des Primers AB5357 und abwärts des Primers AB5357 angeordnet war, wurde mittels einer automatisierten Sequenzierung bestimmt, wobei neu entwickelte Primer verwendet wurden, während die Sequenz unverschleiert war. Die gesamte 4370 bp DNA-Sequenz des PstI-Fragments ist in der 3 dargestellt.
Eine Analyse der Sequenz zeigte das Vorliegen von mehreren offenen Leserastern (ORFs), einschließlich dem einen für FtsY. Bei Vergleich der Gesamtstruktur der SRα-artigen Proteine und SRP54-artigen Proteine wird eine gemeinsame Domäne offenkundig, die GTP-Bindungsboxen umfasst (die G-Domäne, siehe 4). Auch aus dieser Figur wird deutlich, dass das FtsY-Protein aus B. subtilis nur eine sehr kurze N-terminale Domäne enthält, im Gegensatz zu den eukaryotischen und E. coli-Homologen. Da die N-terminale Domäne in diesen Organismen als Membrananker dient, ist es möglich, dass in B. subtilis FtsY mit einem anderen Mechanismus fungiert und möglicherweise in seiner Wirkung Chaperon-artiger ist, auch wenn es nach wie vor Membran-gebunden ist.
Eine Analyse der Sequenz zeigte das Vorliegen von zahlreichen weiteren ORFs, einschließlich eines trunkierten ORF, das eine Homologie zu dem Ffh-Protein zeigt, und eines trunkierten ORF, das eine Homologie zu mehreren DNA-Segregationsproteinen wie dem Hefeprotein SMC1 zeigt.
Die chromosomale Organisation der Gene in dem PstI-Fragment ist in der 5 dargestellt.
BEISPIEL 4
Effekt der FtsY-Depletion auf die Sekretion von heterologen Proteinen
Die Effekte einer Depletion von FtsY in Bacillus auf die Prozessierung und/oder Sekretion von heterologen Proteinen wurden untersucht, indem das chromosomale ftsY-Gen unter die Kontrolle des induzierbaren SPAC-Promotors gestellt wurde (Yansura et. al). Dafür wurde der N-terminale Teil des ftsY-Gens in eine multiple Kodierungsstelle von pDG148 direkt abwärts des SPAC-Promotors geklont. Das SPAC-ftsY-penP-lacI-Fragment aus dem resultierenden pDGFtsY'-Plasmid wurde in pPPNeo2 rekloniert, wobei das finale Integrationskonstrukt pNSFtsY' hergestellt wurde (6).
pNSRtsY' ist zur autonomen Replikation in E. coli, jedoch nicht in Bacillus, befähigt. Es verleiht eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin, das für eine Selektion in E. coli verwendet werden kann, und Neomycin, zur Selektion in Bacillus. Eine Integration von pNSFtsY' in den ftsY-Locus führt zu einer trunkierten Kopie von ftsY (ftsY') unter Kontrolle des authentischen Promotors und einer intakten Kopie von ftsY unter Kontrolle des SPAC-Promotors.
Neomycin-resistente pNSFtsY'-Integranten konnten nach Protoplastentransformation von B. subtilis 168 selektiert werden.
Die Integranten, die in einem Medium mit 0,5 mM IPTG gezüchtet wurden, zeigten Wachstumscharakteristika vergleichbar mit einem B. subtilis-Wirt, dem das integrierte Plasmid fehlte. Die Wachstumsrate von Integranten nahm weder nach Inkubation in Abwesenheit von IPTG ab, noch tat dies die Zellmorphologie.
Die Effekte einer Depletion von FtsY auf die Proteintranslokation wurden mit Hilfe von Fermentationsexperimenten untersucht, bei denen heterologe Proteine exprimierende Wirte eingesetzt wurden. Ein pUB110-artiger Vektor, enthaltend regulatorische Sequenzen des α-Amylase-Gens aus B. licheniformis oder B. amyloliquefaciens, wurde für die Expression von heterologen Proteinen verwendet. Einige der heterologen Proteine wurden in leicht höheren Niveaus in Zellen, die in Gegenwart von IPTG kultiviert wurden, produziert, jedoch wurde die Produktion der heteologen Proteine in Abwesenheit von IPTG nicht vollständig aufgehoben.
Diese Effekte waren unerwartet, da in E. coli eine Depletion von FtsY eine tiefgreifende Wirkung auf die Zellmorphologie und Wachstumsrate aufweist. Es ist folglich möglich, dass trotz der Abwesenheit von IPTG eine FtsY-Bildung auftritt, was auf ein transkriptionelles Read-Through hinweist. Es sollte möglich sein, diese durch Insertion eines starken Terminatorsignals aufwärts von dem SPAC-Promotor in dem Integ rationskonstrukt zu korrigieren. Um zu bestätigen, dass die Abwesenheit von FtsY für die Zelle gefährlich ist, wurden Versuche unternommen, das ftsY-Gen zu spalten.
BEISPIEL 5
Konstruktion von Bacillus-Stämmen ohne ein funktionales ftsY-Gen.
Da die im Beispiel 4 beschriebenen Experimente in dem Sinne unerwartet waren, dass Stämme, die das ftsY-Gen unter der Kontrolle des SPAC-Promoters enthielten, noch immer entwicklungsfähig waren, und keinen klaren Phänotyp in Abwesenheit des Induktionsmittels IPTG zeigten, stellten wir die Hypothese auf, dass das von uns verwendete Konstrukt "leaky" war, so dass selbst in Abwesenheit von IPTG eine geringe Menge von FtsY produziert werden würde. Um die Produktion von ftsY zu eliminieren, versuchten wir, das ftsY-Gen durch Insertion eines Meomycinresistenz-Markers zu spalten. Wir konstruierten ein Plasmid pBHdSFtsYNeo, das das 5'- und 3'-Ende des ftsY-Gens trägt, getrennt von dem Neomycinresistenzgen, in einem Vektor, der unfähig ist, in B. subtilis zu replizieren.
Das Plasmid pBHdSFtsYNeo wurde linerarisiert, indem mit HpaI geschnitten wurde, und eingesetzt, um B. subtilis 168 mit Neomycinresistenz zu transformieren. Dies sollte zu Stämmen führen, bei denen das ursprüngliche ftsY-Gen durch den fstY::Neo-Konstrukt über einen doppelten Kreuzungsvorgang ersetzt ist (siehe 7). Wir waren jedoch nicht in der Lage, unter Verwendung dieser linearen DNA auf Neomycin-resistente Kolonien zu selektieren, was auf die Möglichkeit hindeutet, dass eine Spaltung des ftsY-Gens für die Zelle tödlich ist.
Wir wiederholten folglich die Transformationexperimente mit intakter, ungeschnittener Plasmid-DNA. In diesem Fall kann die Integration des Plasmids in das ftsY-Gen über einen einzigen Kreuzungsvorgang (cross-over event) stattfinden (Integration vom Campbell-Typ), was zu Neomycin-resistenten Kolonien führte, die sowohl eine intakte als auch eine gespaltene Kopie des ftsY-Gens aufwiesen (siehe 8). Wir isolierten wesentliche Stämme, von denen einer die in der 8 dargestellte chromsomale Organisation aufwies. Da in diesem Stamm zwei Kopien des 3'-Endes des ftsY-Gens vorliegen, ist eine Rekombination zwischen diesen möglich, was zu einer Entfernung der Plasmidsequenzen dazwischen und zur Bildung eines Stamms, der nur eine Kopie des ftsY-Gens, getrennt durch den Neomycinresistenz-Marker, enthält, führt. Trotz mehrerer Versuche waren wir nicht fähig, solche rekombinanten Stämme zu isolieren, was wiederum darauf hindeutet, dass solche Stämme nicht lebensfähig sind.
BEISPIEL 6
Wirkung der FtsY-Überexpression bei der Lokalisierung von Vorläufern und reifen heterologen Proteinen
Die Wirkungen einer Überexpression von FtsY in Bacillus auf die Prozessierung und/oder Sekretierung von heterologen Proteinen wurde untersucht, indem das gesamte ftsY-Gen unter Kontrolle des konstitutiven P59-Promoters in pHBNde eingeführt wurde (siehe Beispiel 1), was zum Plasmid pHBFtsY führte. Die Wirkungen einer Überexpression von FtsY auf die Proteintranslokation wurden mittels Puls-Chase-Experimenten unter Verwendung von Wirten, die heterologe Proteine exprimieren, untersucht.
B. Licheniformis T399 wurde mit dem Plasmid pLAT-IL3 transformiert, das das humane Interleukin-3 (h-IL-3)-Gen enthielt, exprimiert aus dem B. licheniformis α-Amylasepromoter, und versehen mit der B. licheniformis α-Amylase-Signalsequenz, oder mit dem Plasmid pLP10-AB transformiert, das das Prochymosin-Gen unter den gleichen Expressionssignalen enthielt. Die resultierenden Stämme T399IL und T399Chy wurde mit dem Plasmid pHBNFtsY transformiert, das das ftsY-Gen enthielt. Als Kontrolle wurden beide Stämme T399IL und T399Chy mit dem Vektor pHBNde transformiert.
Einzelkolonien von allen Stämmen wurden in 5 ml des Mangelmediums S7+ (enthaltend Methionin und Cystein) inokkuliert und bei 37°C über Nacht gezüchtet. Aliquotes von 200 µl wurden in 5 ml S3- (ohne Methionin und Cystein)-Medium inokkuliert und für weitere 5 Stunden gezüchtet.
Nach Wachstum auf eine OD = 0,3 bis 0,7 wurde eine Probe von 3,2 ml zentrifugiert, mit dem S7- -Medium gewaschen und in 3,2 ml frischen S7- -Medium resuspendiert. Die Probe wurde für 20 Minuten bei 37°C inkubiert und mit 25μ (Ci L-[³⁵S]-Methionin (> 1000 Ci/mmol) pro ml während 60 Sekunden bei 37°C gepulst. Dann wurde ein "Chase" durch Zugabe von 50 μl (2 mg/ml) l-Methionin pro ml durchgeführt. Der Chase-Vorgang wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten (0, 15, 30 und 60 Sekunden) durch Mischen von 600 μl der Reaktion mit 600 μl eiskalter 20%iger TCA und Inkubation auf Eis für mindestens 30 Minuten gestoppt. Die Proben wurden zentrifugiert, und der Überstand wurde direkt für eine Immunpräzipitation, SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Autoradiographie unter Verwendung von Standardprotokollen eingesetzt.
Das Zellpellet wurde mit 1 ml Aceton gewaschen und getrocknet. Die Zellen wurden in 50/l Lysepuffer 10 mM Tris pH8, 25 mM MgCl₂, 200 mM NaCl, 5 mg/ml Lysozym) resuspendiert und für 3 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 50 μl TES (20 mM Tris, 2 mM EDTA, 2 % SDS, pH8) wurden die Proben für 5 Minuten gekocht. Zu den Proben wurden 900 μl STDT (10 mM Tris, 0,9 % NaCl, 1 % Triton, 0,5 % Natriumdeoxycholat, pH8,2) zugegeben, die Mischung wurde für 15–60 Minuten auf Eis inkubiert, und der Debris wurde ausgefällt. Der Überstand wurde für eine Immunpräzipitierung mit Antiserum, das gegen h-IL-3 oder Chymosin gezüchtet worden war, und eine anschließende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Autoradiographie unter Anwendung von Standardprotokollen verwendet.
Eine Überexpression von FtsY erhöhte die Sekretion der reifen Form von Interleukin-3 und die Prozessierung des Vorläufers von Prochymosin.
BEISPIEL 7
Wirkung der Überexpression von Ffh auf die Sekretion von humanem Interleukin-3.
Das ffh-Gen, das für das B. subtilis-Homolog des eukaryotischen SRP54-Proteins kodiert, wurde als ein PCR-Fragment, das unter Verwendung von Primern auf der Basis der veröffentlichten DNA-Sequenz (Honda et. al, 1993) erhalten wurde, kloniert. Das Gen wurde in den Vektor pHBNde kloniert (siehe Beispiel 1) unter der Kontrolle des starken Lactococcal P59-Promotors, um das Plasmid pHBNFfh zu bilden.
Puls-Chase-Experimente wurden wie im Beispiel 6 beschrieben mit B. licheniformis-Stämmen durchgeführt, die sowohl das Plasmid pHBNffh als auch das Plasmid pLAT-IL3, das das humane Interleukin-3 (h-IL-3)-Gen unter der Expression und den Sekretionssignalen des B. licheniformis α-Amylasegens trug, enthielten.
Wie in der 9 dargestellt, ist die Prozessierung von h-IL-3 sehr schnell, da kein Vorläufer detektiert werden kann. Die Menge an reifem h-IL-3 in der überstehenden Fraktion ist in allen Fällen in den Proben, die von dem Ffh überproduzierendem Stamm erhalten wurden, höher als in dem Stamm, der nur das Vektor-Plasmid enthielt.
BEISPIEL 8
Wirkungen einer Überexpression von scRNA auf die Sekretion von humanen Interleukin 3
Das scr-Gen, das für scRNA aus B. subtilis kodiert, wurde als ein PCR-Fragment unter Verwendung von Primern auf der Basis der veröffentlichten DNA-Sequenz (Struck et. al, 1989) geklont, nach dem Ansatz (einschließlich des gleichen 5'-Primers), der von Nakamura (Nakamura et al, 1992) beschrieben wurde, nachdem eine HindIII-Stelle genau aufwärts der scr-DNA und eine SphI-Stelle abwärts der Terminatorsequenz eingeführt wurden.
Der P59-Promoter wurde aus dem Vektor pHB210 deletiert durch Ersetzen des AlwNI-SmaI-Fragments, das den Ursprung der Replikation (ori) enthielt, zusammen mit dem P59-Promoter durch das AlwNI-PvuII-Fragment aus dem Vektor pBR322, das lediglich den gleichen ori enthielt. Dieser neue Vektor pBHk wurde verwendet, um das EcoRI-PvuII-Fragment durch EcoRI-BamHI (durch T4-Polymerase mit glatten Enden) zu ersetzen, das die SPAC-penP-lacI-Kassette aus pD-G148 enthielt, um den Vektor pBHSpac zu konstruieren.
Das PCR-Fragment, das das scr-Gen enthielt, wurde mit HindIII und SphI verdaut und in pBHSpac ligiert, mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut, um das Plasmid pBHSscr zu konstruieren. Auf diesem Weg wurde das scr-Gen unter die Kontrolle des SPAC-Promotors gesetzt.
Puls-Chase-Experimente wurden wie im Beispiel 6 beschrieben durchgeführt, mit B. licheniformis-Stämmen, die sowohl das Plasmid pBHSscr als auch das Plasmid pLAT-IL3, welches das Interleukin-3 (h-IL-3)-Gen unter der Expression und den Sekretionssignalen des B. licheniformis α-Amylase-Gens trug, enthielten.
Auch in diesem Fall war die Prozessierung von h-IL-3 sehr schnell, da kein Vorläufer detektiert werden konnte. Jedoch war die Menge an reifem h-IL-3 in der überstehenden Fraktion in allen Fällen in den Proben, die aus dem scRNA überproduzierendem Stamm erhalten worden waren, höher im Vergleich zu dem Stamm, der nur das Vektorplasmid enthielt, oder mit dem Plasmid pBHSscr in Abwesenheit des Induktors IPTG.
BEISPIEL 9
Wirkungen von simultan überexprimierten Signalerkennungspartikelkomponenten auf die Sekretion von heterologen Proteinen.
Die Wirkungen, die in den Beispielen 6, 7 und 8 beschrieben worden sind, waren sogar noch deutlicher, wenn mehr als eine der Komponenten des bakteriellen Signalerkennungspartikels simultan exprimiert wurden. Zu diesem Zweck wurde das ftsY-Gen aus dem IPTG-induzierbaren Promotors exprimiert, der in dem Chromosom wie im Beispiel 4 angeordnet war, durch Zugabe von 3 mM IPTG, während die Komponenten Ffh oder scRNA aus ihren pHB210-abgeleiteten Vektoren, wie vorstehend in den Beispielen 7 und 8 beschrieben, exprimiert wurden.
Referenzen

Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc., New York.
Bernstein, H.D., M.A. Poritz, K. Strub, P.J. Hoben, S. Brenner, and P. Walter. 1989.
Nature (London) 340, 482–486.
Collier, D.N., 1994. J. Bacteriol. 176, 1937–1940.
Gilmore, R., 1993. Cell 75, 589–592.
Hann, B.C., M.A. Poritz, and P. Walter. 1989. J. Cell Biol. 109, 3223–3230.
Hartl, F-U., S. Lecker, E. Schiebel, J.P. Hendrick, and W. Wickner. 1990. Cell 63, 269–279.
Honda, R., K. Nakamura, M. Nishiguchi, and K. Yamane. 1993. J. Bacteriol. 175, 4885–4894.
Jeong, S.M., H. Yoshikawa, and H. Takahashi. 1993. Mol. Microbiol. 10, 133–142.
Kim, Y.J., T. Rajapandi, and D. Oliver. 1994. Cell 87, 845–853.
Kumamoto, C.A., and J. Beckwith. 1983. J. Bacteriol. 154, 253–260.
Kumamoto, C.A., and J. Beckwith. 1985. J. Bacteriol. 163, 267–274.
Lill, R., w. Dowhan, and W. Wickner. 1990. Cell 60, 259–269.
Luirink, J., S. High, H. Wood, A. Giner, D. Tollerrey, and B. Dobberstein. 1992. Nature 359, 741–743.
Luirink, J., C.M. ten Hagen-Jongman, C.C. van der Weyden, B. Oudega, S. High, B. Dobberstein, and R. Kusters. 1994.
EMBOJ. 13, 2289–2296.
Nakamura K., Y. Imai, A. Nakamura, and K. Yamane. 1992. J. Bacteriol. 174, 2185–2192.
Oliver, D.H., and J. Heckwith. 1981. Cell 25, 765–772.
Poritz, M.A., K. Strub, and P. Walter. 1988. EMBO J. 3, 3303–3310.
Ribes, U., K. R^misch, A. Giner, B. Dobberstein, and D. Tollerrey. 1990. Cell 63, 591–600.
Romisch, K., J. Webb, J. Herz, S. Prehn, R. Frank, M. Vingron, and B. Dobberstein. 1989. Nature 340, 478–482.
Sadaie, Y., H. Takamatsu, K. Nakamura, and K. Yamane. 1991. Gene 98, 101–105.
Samuelsson, T. 1992. Nucleic Acids Res. 20, 5763–5770.
Schiebel, E., A.J.M. Driessen, F-U. Hartl, and W. Wickner. 1991. Cell 64, 927–939.
Struck, J.C.R., R.K. Hartmann, H.Y. Toschka, and V.A. Erdmann. 1989. Mol. Gen. Genet. 215, 478–482.
Struck, J.C.R., and V.A. Erdmann. 1990. Eur. J. Biochem. 192, 17–24.
Su, J-W., A. Boylan, S.M. Thomas, K.M. Dolan, D.B. Oliver, and C.W. Price. 1990. Mol. Microbiol. 4, 305–314.
Van der Vossen, J.M.B.M., D. van der Lelie, and G. Venema. 1987, Appl. Environ. Microb. 53, 2452–2457.
Van Dijl, J.M., A. de Jong, J. Vehmaanperä, G. Venema, and S. Bron. 1992. EMBO J. 11, 2819–2828.
Yansura, D.G., and D.J. Henner. 1984. Proc.Natl.Acad.Sci. 81, 439–443.

Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Bereitstellung einer Gram-positiven Wirtszelle, die fähig ist, ein Protein von Interesse verstärkt zu sekretieren, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen einer Gram-positiven Wirtszelle mit (i) einer ersten DNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, und (ii) einer zweiten DNA-Sequenz, die mehr als 85% Sequenzhomologie zur Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 7 aufweist und für ein Protein mit einer Chaperon-Funktion kodiert, so dass die Kultivierung der transformierten Gram-positiven Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen eine verstärkte Sekretion des Proteins von Interesse ermöglicht.
Verfahren, umfassend das Bereitstellen der Gram-positiven Wirtszelle gemäß Anspruch 1 und den weiteren Schritt der Kultivierung der transformierten Gram-positiven Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die zweite DNA-Sequenz eine Sequenz umfasst, die für ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 8 kodiert.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die zweite DNA-Sequenz die SEQ ID NO: 7 umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Wirtszelle zusätzlich eine DNA-Sequenz umfasst, die für Ffh kodiert, und Ffh in der Wirtszelle überexprimiert ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, zusätzlich umfassend eine DNA-Sequenz kodierend für 7S scRNA, und wobei 7S scRNA in der Wirtszelle überexprimiert ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Protein von Interesse für die Wirtszelle heterolog ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Grampositiven Wirtszelle um eine Bacillus-Art handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die Bacillus-Art Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus alcalophilus, Bacillus lentus oder Bacillus stearothermophilus ist.