DE69333564T2

DE69333564T2 - Nisine

Info

Publication number: DE69333564T2
Application number: DE69333564T
Authority: DE
Inventors: Michael John Colney GASSON; Mair Helen DODD
Original assignee: Institute of Food Research Ltd
Current assignee: Quadram Institute Bioscience
Priority date: 1992-04-02
Filing date: 1993-04-01
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2013-04-02
Also published as: DE69333564D1; GB2280442A; GB9419872D0; EP0633939B1; EP0633939A1; GB2280442B; US6100056A; ATE270336T1; GB9207267D0; CA2133578A1; WO1993020213A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Nisinen mit technisch verändertem Protein.
Nisin ist ein stark modifiziertes Peptidantibiotikum, das beispielsweise durch bestimmte Stämme von Lactococcus lactis produziert wird. Es ist wegen seiner effizienten antimikrobiellen Aktivität gegenüber einem breiten Bereich grampositiver Organismen, die viele Fäulnisbakterien und Nahrungsmittelpathogene, beispielsweise Listeria-, Clostridia- und Bacillus-Arten, umfassen, für die Nahrungsmittelindustrie von großem Interesse (12, 25).
Die chemische Struktur von Nisin ist bekannt (16, 17, 34, 45, 9). Es ist ein Mitglied der als Lantibiotika bezeichneten Familie von Antibiotika. Diese ungewöhnlichen polycyclischen Peptide teilen die Strukturmerkmale von Dehydroresten und Sulfidbrücken in der Kette, die Lanthionin- und β-Methyllanthioninringe bilden. Die atypischen Reste werden durch posttranslationale Modifikation der Aminosäuren Serin, Threonin und Cystein in der Primärsequenz eines Vorläuferpeptids eingeführt (Lantibiotika sind Gegenstand eines vor kurzem erschienenen ausführlichen Übersichtsartikels, 26). Die Biosynthese von Nisin umfasst daher Gene für sowohl den inaktiven Vorläufer von Nisin, der als Pränisin bekannt ist, (nisA) als auch die für die Nisinreifung verantwortlichen modifizierenden Enzyme. Das reife Nisinmolekül basiert auf einer Sequenz von 34 Aminosäuren. Das durch nisA codierte Protein umfasst eine N-terminale Signalsequenz von 23 Aminosäuren, die während der Sekretion von Nisin abgespalten wird. Die Umwaldung von Pränisin, das durch nisA codiert wird, in reifes Nisin umfasst die Abspaltung der Leadersequenz und die Modifikation individuel ler Aminosäuren. Das nisA-Gen wurde kloniert und charakterisiert (1, 27, 11) und es wurde gezeigt, dass es einen Chromosomenort hat (11, 42). Eine Zahl zusätzlicher, noch nicht charakterisierter Gene, die an der enzymatischen Modifikation von Pränisin, der Translokation und Immunität beteiligt sind, wird durch Nisin produzierende Stämme codiert (42). Es wird angenommen, dass diese Determinanten zusammen mit nisA zusammen als Cluster angeordnet sind, was vor kurzem für die Lantibiotika Subtilin (28) und Epidermin (41) beschrieben wurde. Es ist seit einiger Zeit bekannt, dass Nisindeterminanten durch Konjugation übertragen werden können (14) und es wurde nun festgestellt, dass diese Fähigkeit auf deren Transport auf einem großen konjugativen Transposon, Tn5301, beruht (22, 38).
Etablierte Techniken der technischen Veränderung von Proteinen können zur Einführung von Änderungen an der Aminosäuresequenz von Nisin verwendet werden. Diese umfassen das Modifizieren der codierenden Region des Nisin-Strukturgens, nisA, beispielsweise durch positionsspezifische oder Zufallsmutagenese. Die Expression dieser Änderungen wird durch die Tatsache, dass Nisin posttranslational modifiziert wird, kompliziert.
Variante Nisine können durch die Expression von varianten nisA-Genen in einem Wirtsstamm, der die notwendige Reifungsmaschinerie codiert und daher das modifizierte Vorläuferpeptid prozessieren kann, konstruiert werden. Der einfachste Ansatz ist die Transformation eines Nisin produzierenden Stamms mit einem rekombinanten Plasmid mit Codierung für ein variantes nisA-Gen. In diesem Hintergrund stehen die Reifungsenzyme des Wirts zur Verfügung, wobei sowohl das ansässige Pränisin als auch dessen plasmidcodierte Variante prozessiert werden. Eine Strategie dieses Typs wurde für einen Stamm berichtet, der das Wildtyp-Nisin-Transposon trägt (29). Der Nachteil dieses Systems ist jedoch, dass sowohl das Nisin des Wirts als auch die technisch veränderte Variante zusammen synthetisiert werden, was komplexe chemische Trennverfahren vor der Analyse der Eigenschaften des neuen Peptids notwendig macht. Ein derartiges Verfahren ist für eine Produktion eines varianten Nisins im großtechnischen Maßstab besonders ungünstig.
Im folgenden wird ein Organismus beschrieben, der nicht sein natürliches Nisin sezerniert, sondern der exprimierbare Gene für die Modifikation, Immunität und Translokation von Nisin aus der Zelle aufweist.
Unter "einem Organismus, der nicht dessen natürliches Nisin sezerniert", verstehen wir einen Organismus, der von Natur aus kein Nisin codiert. Beispiele für Organismen, die von Natur aus kein Nisin codieren, sind Bacillus subtilis und Escherichia coli. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Organismus kein Milchsäurebakterium, in dem in einem Milchsäurebakterium exprimierbare Gene für eine Nisinmodifikation und -translokation aus der Zelle auf einem Plasmid vorhanden sind und das bei Abwesenheit des Plasmids kein Nisin sezerniert.
Zweckmäßigerweise ist der Organismus ein Laktokokkenstamm, vorzugsweise Lactococcus lactis.
Im folgenden wird auch der oben beschriebene Organismus, der derart mit einer Codierungssequenz für ein variantes Pränisin und, falls notwendig, geeigneten regulatorischen Sequenzen zur Expression desselben transformiert ist, dass der Organismus das entsprechende variante Nisin sezernieren kann, beschrieben.
Ferner wird im folgenden ein Verfahren zur Herstellung ei nes Nisins beschrieben, das das Fermentieren dieses Organismus und das Gewinnen des dadurch produzierten Nisins umfasst.
"Nisin" soll ein Peptidantibiotikum bedeuten, das durch einige natürlich vorkommende, Nisin produzierende Bakterienstämme produziert wird. Das reife Molekül basiert auf einer durch ein Gen nisA codierten Aminosäuresequenz.
"Variantes Nisin" soll eine Variante mit gentechnologisch verändertem Protein eines natürlichen Nisins bedeuten, in die Änderungen der Aminosäuresequenz des Nisins als Ergebnis einer positionsspezifischen oder Zufallsmutagenese des nisA-Gens eingeführt wurden.
Positionsspezifische Mutationen des nisA-Gens können beispielsweise durch die oligonucleotidspezifische Mutagenesetechnik von Zoller & Smith (1983) Meth. Enzymol. 100, 468–500 und Zoller & Smith (1984) DNA 3, 479–480, die nicht-übereinstimmende Oligonucleotidprimer zum Einführen der Mutation verwendet, erhalten werden.
Es ist günstig, ein Verfahren zur Verbesserung der Ausbeute von Mutanten, beispielsweise das dut-ung-Verfahren gemäß der Beschreibung bei Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488–492, zu verwenden. Alternativ kann die Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Erzeugung von Mutanten unter Verwendung von nicht-übereinstimmenden Oligonucleotiden verwendet werden (Saiki et al. (1988) Science 239, 487–491).
Zufallsmutanten des nisA-Gens können chemisch unter Verwendung von beispielsweise Natriumbisulfit oder Hydroxylamin als das Mutagen hergestellt werden. Alternativ können Zufallsmutationen in das nisA-Gen unter Verwendung von enzy matischem Fehleinbau unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit relativ niedriger Genauigkeit, beispielsweise AMV-reverse-Transkriptase oder Taq-DNA-Polymerase, oder unter Verwendung von Oligonucleotidgemischen, die während der Synthese als Schuss zugesetzt werden, zum Einbau einer kleinen Menge der einzelnen unterschiedlichen Basen an den einzelnen Positionen eingeführt werden. Diese Verfahren sind einschlägig bekannt.
Die Derivatisierung eines Organismus, der die Reifungsgene für die Nisinbiosynthese exprimiert, dem jedoch dessen natürliches nisA-Genprodukt fehlt, ergibt dadurch ein effektives Mittel zur Produktion von varianten Nisinen. Die Transformation eines derartigen Stamms mit einem Plasmidvektor, der ein eine positionsspezifische oder Zufallsmutation enthaltendes individuelles nisA-Gen trägt, erzeugt einen Stamm, der ausschließlich ein variantes Nisin produziert.
Da das Gen für nisA nur eines einer koordiniert exprimierten Gruppe von Genen, die auch die Funktionen der Nisinmodifikation, -immunität und -translokation bereitstellen, ist, ergibt die einfache Inaktivierung des nisA-Gens keinen Stamm, der das Produkt eines plasmidcodierten nisA-Gens in reifes Nisin umwandeln kann.
Im folgenden wird auch ein Verfahren zur Konstruktion eines Organismus, der nicht dessen natürliches Nisin sezerniert, jedoch zur Expression der anderen Nisingene fähig ist, beschrieben. Das Verfahren umfasst das Auswählen eines Nisin produzierenden Organismus und die selektive Deletion der codierenden Sequenz für dessen natürliches nisA-Genprodukt oder eine anderweitige Verhinderung der Sekretion des Nisinpolypeptids, beispielsweise durch Modifikation einer Aminosäure in der Leadersequenz von Pränisin, vorzugsweise der Aminosäure 4.
Ein bevorzugtes Verfahren umfasst das durch Insertion bewirkte Inaktivieren des nisA-Gens und Wiederherstellen der Aktivität der Gene für eine Nisinmodifikation, -immunität und -translokation aus der Zelle. Die Wiederherstellung der Aktivität kann durch Selektion in Medien, die Nisin in hemmenden Konzentrationen enthalten, erreicht werden.
Bei einem weiteren Verfahren wird das nisA-Gen deletiert oder eine Mutation, die dessen Translation verhindert, eingeführt und die Expression der assoziierten Nisingene beibehalten.
Einem Fachmann ist klar, dass ein Organismus, der von Natur aus kein Nisin sezerniert und von Natur aus keine Gene für eine Nisinmodifikation, -immunität und -translokation aus der Zelle enthält, in einem Organismus, der bei den hier beschriebenen Verfahren verwendbar ist, ungewandelt werden kann, indem die Gene für eine Nisinmodifikation, -immunität und -translokation aus der Zelle in diesen übertragen werden. Daher wird ein Mittel zur Umwandlung eines Organismus, der bei den hier beschriebenen Verfahren nicht verwendbar ist, in einen hierfür verwendbaren beschrieben.
Beispielsweise ist es möglich, die Gene für eine Nisinmodifikation, -immunität und -translokation aus dem Lactococcus lactis-Stamm FI7332 (wie im Beispiel offenbart) in einen Organismus, der diese Gene nicht enthält noch ein nisA-Gen enthält, beispielsweise E. coli oder B. subtilis, oder einen geeigneten Laktokokkenstamm durch Konjugation oder Transduktion oder durch Genklonierungstechnik zu übertragen. Vorzugsweise ist der Organismus B. subtilis oder ein geeigneter Laktokokkenstamm.
Ferner ist es möglich, die Gene für eine Nisinmodifikation, -immunität und -translokation von einem Stamm, der zur Produktion eines Nisins nicht fähig ist (beispielsweise die Lactococcus lactis-Stämme FI7300 und FI7304 gemäß der Offenbarung im Beispiel), auf einen Organismus, der diese Gene nicht enthält, zu übertragen, ein nisA-Gen einzuführen und dann auf die Nisinproduktion zu selektieren (d. h. unter Verwendung von zu dem in den Beispielen für die Produktion von Lactococcus lactis FI7300 offenbarten ähnlichen Verfahren). Eine derartige Übertragung von Genen kann auch durch Konjugation oder Transduktion oder Genklonierungstechnik (einschließlich von Transformation im Falle des nisA-Gens) erfolgen. Vorzugsweise ist der Organismus B. subtilis oder ein geeigneter Laktokokkenstamm.
Vorzugsweise umfasst das oben skizzierte Verfahren ferner die Transformation des Organismus mit einer codierenden Sequenz für ein variantes Pränisin und, falls notwendig, geeigneten regulatorischen Sequenzen zur Expression desselben. Der Organismus ist zur posttranslationalen Modifikation des Pränisins und Sekretion des entsprechenden varianten Nisins fähig.
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Nisin bereit, das einen von Dehydroalanin verschiedenen Rest an dem dem Rest in dem ersten Ring von natürlichem Nisin, der von dem Serinrest von nicht-modifiziertem Pränisin abgeleitet ist, entsprechenden Rest aufweist. Der erste Ring von reifem Nisin ist in 9 als Ring a angegeben.
Ein weiterer Aspekt stellt ein Nisin bereit, das im ersten Ring keinen Dehydroalaninrest aufweist. Dieses variante Nisin wird vorzugsweise unter Verwendung des hier beschriebenen Expressionssystems produziert. Eine Untersuchung des Nisinabbaus während der Lagerung ergab, dass die Aktivität verloren geht, wenn der erste Ring von reifem Nisin an der Aminosäure 5 geöffnet wird (5, 34). Dieser Rest ist Dehydroalanin in reifem Nisin und er wird durch Dehydratation eines Serinrests in Pränisin abgeleitet. Es wird angenommen, dass die Öffnung des Rings auf der Tatsache beruht, dass das Dehydroalanin labil ist. Eine positionsspezifische Mutante des nisA-Gens, in der das Codon für Serin am Rest 5 des natürlichen Pränisins zu einem verändert ist, das eine von Serin verschiedene Aminosäure codiert, kann konstruiert werden. Beispielsweise kann das Codon für Serin 5 so geändert werden, dass es Alanin, Valin, Threonin, Leucin, Isoleucin, Glycin, Histidin, Arginin, Lysin, Aspartat, Glutamat, Asparagin, Glutamin, Prolin, Methionin, Cystein, Phenylalanin, Thyrosin oder Tryptophan codiert. Alanin ist bevorzugt. Die Expression des gentechnologisch veränderten nisA-Gens in einem Nisin produzierenden Organismus gemäß der vorliegenden Beschreibung führt zur Produktion eines varianten reifen Nisins. Im Falle der bevorzugten Mutation zu einem Alanincodon wird das variante reife Nisin als NisinA S5A bezeichnet. Untersuchungen zeigen, dass dieses variante Nisin eine größere Stabilität als natürliches Nisin A besitzt und es ist daher ein Beispiel für die ausschließliche Produktion eines verbesserten Nisins. Das variante Nisin, das an Position 5 kein Dehydroalanin besitzt, kann auch andere Variationen aufweisen, obwohl der Dehydroalaninrest an Position 33 vorzugsweise beibehalten wird.
Die Aminosäuren, die Serin an Position 5 ersetzen, können posttranslational so modifiziert werden, dass eine nicht direkt codierte Aminosäure gebildet wird, wie beispielsweise hier für Threoninreste offenbart.
Offensichtlich ist es auch möglich, dieses variante Nisin durch Exprimieren des gentechnologisch veränderten varianten nisA-Gens auf einem Plasmidvektor, der in einen normales Nisin produzierenden Organismus transformiert wird, zu produzieren. Reifes variantes Nisin sowie normales Nisin werden produziert.
Auch eine chemische Synthese der varianten Nisinpeptide, worin das Serin 5 durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, kann möglich sein.
Peptide, beispielsweise die varianten Nisine, können durch den Fmoc-Polyamid-Modus der Festphasenpeptidsynthese gemäß der Offenbarung bei Lu et al. (1981) J. Org. Chem. 46, 3433, und dort angegebenen Verweisen synthetisiert werden. Ein zeitweiliger N-Aminogruppenschutz wird durch die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)gruppe geleistet. Die wiederholte Spaltung dieser stark basenlabilen Schutzgruppe wird unter Verwendung von 20% Piperidin in N,N-Dimethylformamid durchgeführt. Seitenkettenfunktionalitäten können als deren Butylether (im Falle von Serin, Threonin und Tyrosin), Butylester (im Falle von Glutaminsäure und Asparaginsäure), Butyloxycarbonylderivat (im Falle von Lysin und Histidin), Tritylderivat (im Falle von Cystein) und 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonylderivat (im Falle von Arginin) geschützt werden. Wenn Glutamin oder Asparagin Cterminale Reste sind, wird die 4,4'-Dimethoxybenzhydrylgruppe zum Schutz der Seitenkettenamidofunktionalitäten verwendet. Der Festphasenträger basiert auf einem Polydimethylacrylamidpolymer, das aus den drei Monomeren Dimethylacrylamid (Gerüstmonomer), Bisacryloylethylendiamin (Vernetzungsmittel) und Acryloylsarcosinmethylester (Funktionalisierungsmittel) aufgebaut ist. Das verwendete spaltbare Peptid-Harz-Verknüpfungsmittel ist das säurelabile 4-Hydroxymethyl-phenoxyessigsäurederivat. Alle Aminosäurederivate werden als deren vorgeformte symmetrische Anhydrid derivate zugesetzt, mit Ausnahme von Asparagin und Glutamin, die unter Verwendung eines durch N,N-Dicyclohexyl-carbodiimid/1-Hydroxybenzotriazol vermittelten Umkehrkopplungsverfahrens zugesetzt werden. Alle Kopplungs- und Entschützungsreaktionen werden unter Verwendung von Ninhydrin-, Trinitrobenzolsulfonsäure- oder Isotin-Testverfahren überwacht. Nach Durchführung der Synthese werden die Peptide von dem Harzträger unter gleichzeitiger Entfernung von Seitenkettenschutzgruppen durch eine Behandlung mit 95%-iger Trifluoressigsäure, die eine 50% Fängermischung enthält, abgespalten. Üblicherweise verwendete Fänger sind Ethandithiol, Phenol, Anisol und Wasser, wobei die genaue Wahl von den Aminosäurekomponenten des synthetisierten Peptids abhängt. Trifluoressigsäure wird durch Abdampfen unter Vakuum entfernt, wobei ein anschließendes Verreiben mit Diethylether das rohe Peptid ergibt. Etwaige vorhandene Fänger werden durch ein einfaches Extraktionsverfahren entfernt, wobei bei Lyophilisierung der wässrigen Phase das rohe Peptid frei von Fängern erhalten wird. Reagentien für eine Peptidsynthese sind im allgemeinen von Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK erhältlich. Unter Verwendung dieses chemischen Syntheseverfahrens ist es möglich, nicht natürlich vorkommende Aminosäuren in die synthetische Nisinvariante einzuführen. Die Reinigung kann durch eine oder eine Kombination von Techniken, wie Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und (hauptsächlich) Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie, durchgeführt werden. Die Analyse von Peptiden kann unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie, Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie, eine Aminosäureanalyse nach einer sauren Hydrolyse und durch Fast Atom Bombardment (FAB)-massenspektrometrische Analyse durchgeführt werden.
Alternativ können Nisinvarianten, die solche mit einer Se rin an Position 5 ersetzenden "nicht-natürlichen" Aminosäure umfassen, durch zellfreie Translation in vitro produziert werden.
Andere variante Nisine können auch unter Verwendung des hier beschriebenen Expressionssystems ausschließlich produziert werden. Das Beibehalten eines Dehydroalaninrests an den Positionen 5 oder 33 ist bevorzugt.
Eine aktive natürliche Variante von Nisin, die als Nisin Z bekannt ist, weist Asparagin anstelle von Histidin an der Aminosäure 27 auf (15, 37). Eine Variante von Nisin Z, in der beispielsweise die Asparagin entsprechende Aminosäure zu Glutamin geändert ist, kann unter Verwendung einer positionsspezifischen Mutante des nisA-Gens in dem Expressionssystem produziert werden. Dieses variante Nisin mit dem Namen NisinA H27Q besitzt volle biologische Aktivität.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung stellen die varianten Nisine, die unter Verwendung des hier beschriebenen Expressionssystems produziert wurden, und die Verwendung derartiger Nisine als antimikrobielle Mittel bereit.
Die varianten Nisine der vorliegenden Erfindung sind als antimikrobielle Mittel unter den Bedingungen, unter denen das natürliche Nisin eine Ringöffnung erfährt und dessen antimikrobielle Eigenschaften verliert, besonders verwendbar. Derartige Bedingungen umfassen die eines hohen pH-Werts, die in vielen Nahrungsmittelsituationen vorhanden sind, und unter denen die Aktivität von normalem Nisin beschränkt ist. Bevorzugte Organismen, die abgetötet werden, umfassen Listeria monocytogenes und gramnegative Bakterien.
Um die Erfindung leichter verständlich zu machen, werden bevorzugte Aspekte nun mittels Beispielen und unter Bezug auf die begleitenden Zeichnungen erläutert, wobei:
1 die Strategie für eine nisA-Gensubstitution erläutert.
Sie zeigt a) eine Karte des Gensubstitutionsvektors pFI283 und Karten, die äquivalente Regionen eines Chromosoms mit Codierung für nisA und flankierende Sequenzen in den Stämmen b) FI5876, c) FI7181 und d) FI7300 zeigen. Die dünne Linie repräsentiert Plasmid-DNA und die dicke Linie repräsentiert Laktokokkenchromosom-DNA. Die nisA- und nisB-Gene werden durch als schwarze Balken dargestellte Regionen angegeben und DNA-Sequenzen, die die Erythromycinresistenz(Em^r)-Determinante enthalten, sind als schraffierte Balken gezeigt. Die Richtung der Transkription der Gene ist durch Pfeile über den Karten angegeben. Die kleinen nummerierten Pfeile unter den Karten stehen für bei der PCR-Analyse verwendete Primer. Ein einzelnes Rekombinationsereignis zwischen Lactococcus-Sequenzen links der Em^r-Determinante auf pFI283 und homologen Sequenzen auf FI5876 (X) führt zur Campbell-Integration des Plasmids mit der wie bei FI7181 angegebenen Organisation der Sequenzen. Eine Rekombination zwischen pFI283-Sequenzen auf beiden Seiten der Em^r-Determinante und homologen FI5876-Sequenz (X und Y) führt zu einer Gensubstitution, wie sie bei FI7300 gefunden wird.
2 zeigt die Doppelstrangnucleotidsequenz des nisA-Gens und der flankierenden Regionen (SEQ 1).
Codierende Regionen, denen Ribosomenbindungsstellen (RBS) vorangehen, sind angegeben, und die primären Translationsprodukte sind unter der Sequenz angegeben. Der Pfeil zwischen dem Arginin (R) bei Codon 154–156 und Isoleucin (I) bei. Codon 157–159 zeigt den Punkt der Abspaltung der N-ter minalen Leadersequenz von Pränisin. Schraffierte Regionen stehen für die Nucleotidsequenzen synthetischer Oligomere, die als Primer für eine PCR-vermittelte positionsspezifische Mutagenese verwendet wurden. Das 3'-Ende der Primer und die Richtung, in der die PCR erfolgt, sind durch nummerierte Pfeile angegeben. Die Zahlen verweisen auf die Primer, die bei Verfahren aufgelistet sind. In den Primern enthaltene spezielle Nichtübereinstimmungen sind durch schraffierte Nucleotide über oder unter der Sequenz dargestellt. Die Primer 7 und 8 sind so gestaltet, dass sie ein Histidin(H)-Codon (Koordinaten 235–237) durch ein Glutamin(Q)-Codon ersetzen. Der Primer 11 enthält ein Alanin(A)-Codon anstelle eines Serin(S)-Codons (Koordinaten 169–171). Die Primer, die Restriktionsstellen an ihren 5'-Enden enthalten, legen die Enden von entweder PCR-erzeugten SacI/EcoRI-Restriktionsfragmenten (Primer 5 und 6) oder BamHI/SacI-Restriktionsfragmenten (Primer 9 und 10 oder 9 und 11) fest. Die im vorhergehenden genannten Basenänderungen werden in diese Fragmente eingearbeitet, die dann in die Expressionsvektoren kloniert werden (siehe 3 und 4), wobei nisA-Gene, die die spezielle Mutation enthalten, rekonstituiert werden.
3 zeigt die Konstruktion von nisA-Expressionsvektoren, die den natürlichen Nisingenpromotor verwenden.
Die Karten linearer Plasmide sind die von a) pFI172, b) pFI354, c) pFI378 und e) pFI411. Klonierte Lactococcus-DNA wird durch eine dicke Linie dargestellt und Vektorsequenzen sind durch eine dünne Linie angegeben. Gene innerhalb der klonierten Sequenzen sind als Balken dargestellt und relevante Restriktionsstellen sind über den Karten angegeben. d) erläutert die Strategie, die zur positionsspezifischen Mutagenese des nisA-Gens zur Einführung der Aminosäuresubstitution His²⁷ verwendet wurde. Die doppelsträngige DNA- Sequenz zwischen den SacI- und EcoRI-Stellen, die in pFI378 (c) angegeben sind, wird durch eine Doppellinie dargestellt. Die Stellen, an denen Primer renaturieren, sind durch Pfeile über und unter den Linien angegeben, und die Fragmente, die mittels PCR unter Verwendung von Kombinationen dieser Primer amplifiziert werden, sind durch einzelne dünne Linien dargestellt. Die in den Primern 7 und 8 eingearbeiteten Nichtübereinstimmungen (siehe 2) und die Mutation, die sie in pFI411 erzeugen (e), sind mit einem Sternchen angegeben.
4 zeigt die Konstruktion von nisA-Expressionsvektoren zur positionsspezifischen Mutagenese im gesamten nisA-Gen unter Verwendung des lac-Promotors.
Ein durch PCR erzeugtes BamHI-Fragment mit Codierung für das lacR-Gen und die divergent transkribierten lacR- und lacA-Promotoren (18, Ref.) wurde mit XmnI verdaut. Das 0,45-kb-Restriktionsfragment (siehe 5) wurde in pTG262 subkloniert, wobei pFI451 erzeugt wurde (a). Die Fragmente N und C, die die N- bzw. C-terminalen Regionen des nisA-Gens enthielten wurden mittels PCR konstruiert und in pTG262 kloniert, wobei pFI446 erzeugt wurde (b). Die nisA-Kassette enthält das nicht-unterbrochene nisA-Gen, dem 60 bp einschließlich der RBS vorangehen und dem eine Lücke zwischen den Genen und der Start des nisB-Gens folgen (die Sequenz ist in 2 angegeben). Der Vektor pFI449 (c) enthält die in pFI451 als BamHI/EcoRI-Restriktionsfragment klonierte nisA-Kassette. Der Vektor pFI480 (d) enthält das in pFI451 als BamHI/SacI-Fragment klonierte N-Fragment der nisA-Kassette. Der Vektor pFI487 (e) enthält das in pFI451 als SacI/EcoRI-Fragment klonierte C-Fragment der nisA-Kassette.
5 zeigt die Nucleotidsequenz des Lactoseoperonpromo tors (SEQ 2).
Das XmnI/BamHI-Fragment enthält den lacA-Promotor und den Start des nisA-Gens in der nisA-Kassette.
6 zeigt Plattendiffusion-Bioassays.
Agar wird mit dem Indikatorstamm Lactobacillus helveticus CH-1 besät und die Vertiefungen enthalten Proben von Überständen von verschiedenen Lactococcus lactis subsp. lactis-Stämmen. Die Platte 1 zeigt, dass Nisin A durch das FI7332-Expressionssystem als Ergebnis der Komplementierung der nisA-Defizienz der Wirte durch plasmidcodierte nisA-Gene produziert wird. Ferner wird die biologische Aktivität des varianten Nisin A/H27Q demonstriert. Die Vertiefungen enthalten Überstände von FI7330 (durch FI7332/pFI172-Plasmid codiertes nisA); FI5876 (Nisin produzierender Mutterstamm); MG1614 (kein Nisin produzierender Stamm); FI7332/pFI411 (plasmidcodiertes nisA/H27Q); FI7332/pFI378 (plasmidcodiertes nisA); plasmidfreies FI7332 und FI7332/pFI354 (Plasmidvektor zur Konstruktion von varianten nisA-Genen). Die Platte 2 demonstriert Nisinaktivität durch Stämme mit Codierung für nisA und das variante nisA/S5A-Gen unter der Kontrolle des lacA-Promotors. Die Vertiefungen enthalten Überstände von FI5876 (Nisin produzierender Mutterstamm); FI7332 (plasmidfrei); FI7332/pFI378 (plasmidcodiertes nisA, natürlicher Promotor); FI7332/pFI449 (plasmidcodiertes nisA, lacA-Promotor); und FI7332/pFI493 (plasmidcodiertes nisA/S5A, lacA-Promotor). 100 μl der folgenden Nisinstandards (in 0,02 M HCl gelöst) wurden in einige Vertiefungen geladen: 500 U/ml, 300 U/ml, 200 U/ml, 100 U/ml und 0 U/ml.
7 zeigt die Konstruktion eines Wirtsstamms zur ausschließlichen Expression von mutierten nisA-Genen.
Die Karten sind die von äquivalenten Chromosomenregionen des a) Nisin produzierenden Stamms FI5876 und der Derivate b) FI7300, c) FI7304 und d) FI7332. Das nisA-Gen und der Start des nisB-Gens sind durch schwarze Balken angegeben. Die Insertionen in nisA sind durch einen schraffierten Balken (Em^r, Erythromycinresistenz) und einen leeren Balken (IS905) gekennzeichnet. Die Primer, die zur Analyse der durch Insertion erfolgten Inaktivierung von nisA verwendet wurden, sind als nummerierte Pfeile unter den Karten angegeben. Die die Primer verbindenden Linien stehen für das amplifizierte Fragment, wobei die Größen in Kilobasen angegeben sind.
8 zeigt eine PCR-Analyse der konstruierten Wirtsstämme.
Die mit den Primern 1 und 2 erzeugten PCR-Fragmente werden durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Templat-DNA von dem kein Nisin produzierenden Stamm MG1614 wird nicht amplifiziert (Spur 2), während eine Bande von 0,9 kb von dem Nisin produzierenden Mutterstamm FI5876 erzeugt wurde (Spur 3). Diese Bande ist auch vorhanden, wenn DNA von FI7181 als Templat verwendet wird. Jedoch führt die Campbell-Integration des Gensubstitutionsvektors pFI283 in diesem Stamm (siehe 1c) zur Erzeugung einer zweiten Bande von 1,9 kb (Spur 4). In FI7330 (Spur 5) wurde das nisA-Gen als Ergebnis der Gensubstitution durch Insertion inaktiviert (siehe 1d) und die 0,9-kb-Bande ist durch die 1,9-kb-Bande, die den integrierten Em^r-Marker enthält, ersetzt. Diese Bande hat als Ergebnis der Insertion von IS905 in das Em^r-Gen in FI7304 (siehe 7c) um weitere 1,3 kb auf 3,2 kb an Größe zugenommen (Spur 6). Der Stamm FI7332 hat eine Deletion von 200 bp an einem Ende von IS905 erfahren (7d) und eine entsprechende Abnahme in dem äquivalenten, durch PCR erzeugten Fragment führt zu einer 3,0-kb-Bande (Spur 7). Die Spur 1 zeigt mit BglI verdaute λ-DNA, die als Größenstandard enthalten ist. Das 1,2% Agarosegel wurde 2,5 h mit 100 Volt laufen gelassen.
9 zeigt die Struktur von Nisin A.
Die modifizierten Reste sind Dehydroalanin (Dha), Dehydrobutyrin (Dhb), Aminobutyrat (Abu), Lanthionin (Ala-S-Ala) und β-Methyllanthionin (Abu-S-Ala). Die vorhergesagten Moleküländerungen in Nisin A/H27Q und Nisin A/S5A sind als Aminosäuresubstitutionen in Ring e bzw. Ring a angegeben.
10 erläutert das Vorhandensein von Mehrfachkopien von DNA in dem Lactococcus-Genom.
Southern-Transfer-Hybridisierungen von mit Restriktionsenzym verdauter chromosomaler DNA von MG1614 (Spuren 1 & 3) und FI5876 (Spuren 2 & 4). Die Restriktionsendonucleasen HincII (Spuren 1 & 2) und PvuII (Spuren 3 & 4) wurden verwendet. Die Filter wurden mit einem ³²P-markierten gelgereinigten PCR-Fragment, das mit den Primern 3 und 4 unter Verwendung von FI304-DNA als Templat erzeugt wurde (siehe 7c), sondiert. Mehrfachbanden zeigen, dass mehrere Regionen, die Homologie mit der Sonde zeigen, vorhanden sind, was für Mehrfachkopie-IS-Elemente in dem Chromosom dieser Lactococcus-Stämme charakteristisch ist.
11 zeigt die Einzelstrangnucleotidsequenz der Insertionssequenz IS905 (SEQ 3) und deren codierte Polypeptidsequenz (SEQ 4).
Die invertierten Repeats, die die Enden des Elements festlegen, sind unterstrichen.
12 zeigt die potentiell als Promotor aktiven Sequen zen an durch IS905-Insertion erzeugten Verbindungsstellen in den Stämmen a) FI7304 (SEQ 5) und b) FI7332 (SEQ 6).
Beispiel
Verwendete mikrobiologische Techniken und Stämme: Die meisten Lactococcus lactis subsp. lactis-Stämme, die im Laufe dieser Arbeit erzeugt wurden, wurden von dem Nisin produzierenden Stamm L. lactis FI5876 (11, 22) abgeleitet. Die Konstruktion der abgeleiteten Stämme und deren relevante Eigenschaften sind in den Ergebnissen und in Tabelle 1 beschrieben. Der plasmidfreie, kein Nisin produzierende Stamm MG1614 (13) wurde als Kontrolle mit umfasst. L. lactis-Stämme wurden routinemäßig bei 30°C in M17-Medium (43), das mit 0,5% (Gew/V) Glucose ergänzt wurde, (GM17) gezüchtet. Die Selektion auf Antibiotikaresistenzmarker war folgende: Chloramphenicolresistenz (Cm^r), 5 μg/ml; die Erythromycinresistenz (Em^r) wurde mit der subinhibitorischen Konzentration von 50 ng/ml induziert, mit einer anschließenden Selektion mit 5 μg/ml.
Tabelle 1 Charakterisierung des Nisin produzierenden Stamms FI5876 und von dessen Derivaten
Der Escherichia coli-Stamm MC1022 (3) war der zur Konstruktion rekombinanter Plasmide verwendete Wirtsstamm. Die Kulturen wurden bei 37°C in L-Nährlösung (30) weitergeführt. Die Selektion auf Ampicillinresistenz (Ap^r) erfolgte bei 100 μg/ml und auf Cm^r bei 15 μg/ml.
Die Bestimmung der Nisinproduktion durch L. lactis-Stämme basierte auf dem Plattendiffusion-Assay von Tramer und Fowler (44). Lactobacillus helveticus CH-1 (Chr. Hansens Labs, Dänemark A/S) wurde als der nisinempfindliche Indikatorstamm verwendet. 0,5 ml einer Übernachtkultur, die in MRS-Medium (9) gezüchtet wurde, wurden zum Beimpfen von 50 μl MRS-Agar (pH-Wert 6,0), der 1 ml Tween-20/Ringer-Lösung (50 : 50) enthielt, verwendet. Die Vertiefungen wurden mit 100 μl der Testprobe beladen und die Platten wurden bei 4°C mindestens 3 h inkubiert (um eine Diffusion zu ermöglichen), bevor sie über Nacht bei 42°C inkubiert wurden.
Die Nisinimmunität wurde durch Abstreichen einer Öse voll Zellen der stationären Phase auf Platten, die variierende Mengen von Nisin enthielten, bestimmt. Nisin (Koch-Light), das in 0,2 M HCl gelöst war, wurde zu GM17-Agar bis zu einer maximalen Konzentration von 5 × 10³ U/ml, bei der das Wachstum aller Stämme gehemmt wurde, gegeben. L. lactis-Stämme wurden als immun gegenüber der höchsten Nisinkonzentration, bei der ein Wachstum über den gesamten Abstrich offensichtlich war, betrachtet.
Eine Plasmidnachbehandlung wurde durch Wachstum in Gegenwart von Acriflavin erreicht (36).
Transformation: Rekombinante Plasmide wurden durch Transformation von E. coli durch das Verfahren von Cohen et al., 1972 (8) mit der Modifikation von Humphreys et al., 1979 (24) gewonnen. L. lactis-Stämme wurden durch Elektroporation gemäß der Beschreibung bei Holo und Nes, 1989 (19) mit den folgenden Modifikationen transformiert. Die Zellen wurden in mit 2% Glycin ergänzter GM17-Nährlösung gezüchtet und die Selektion erfolgte auf Antibiotikum enthaltenden GM17-Platten. Saccharose wurde von den Zuchtmedien am Anfang und den Selektionsplatten weggelassen. Die Elektroporation wurde unter Verwendung der Gene Pluser-Apparatur (Bio-Rad) durchgeführt.
Molekulare Techniken: Gesamtgenom-DNA von L. lactis-Stämmen wurde gemäß dem Verfahren von Lewington et al., 1987 (33) hergestellt. Plasmid-DNA wurde durch das SDS-alkalische-Lyse-Verfahren isoliert. Die Reinigung von CCC-DNA erfolgte durch CsCl/EtBr-Gradientenzentrifugation (35). Restriktionsenzyme und andere DNA modifizierende Enzyme von verschiedenen Quellen wurden entsprechend den Empfehlungen der Hersteller verwendet. Die zur PCR-Analyse verwendeten Bedingungen waren wie früher beschrieben (22). Die folgenden Primer wurden in dieser Untersuchung verwendet:

1. 5'-AAGAATCTCTCATGAGT; (SEQ 7)
2. 5'-CCATGTCTGAACTAACA; (SEQ 8)
3. 5'-GTGGAATACGGGTTTG; (SEQ 9)
4. 5'-TAAATAATTTATAGCTATTG; (SEQ 10)
5. 5'-CAGAGCTCTGATGGGTTG (SacI-Stelle unterstrichen); (SEQ 11)
6. 5'-GTAGAATTCCGTTTATCGTTTGGAG (EcoRI-Stelle unterstri chen); (SEQ 12)
7. 5'-GCAACTTGTCAGTGTAGTATTCAC; (SEQ 13)
8. 5'-GTGAATACTACACTGACAAGTTGC; (SEQ 14)
9. 5'-AACGGATCCGATTAAATTCTGAAGTTTG (BamHI-Stelle unterstrichen); (SEQ 15)
10. 5'-TCAGAGCTCCTGTTTTACAA (SacI-Stelle unterstrichen); (SEQ 16)
11. 5'-TCAGAGCTCCTGTTTTACAACCGGGTGTACATAGTGCAAT (SacI-Stelle unterstrichen); (SEQ 17)

Alle durch PCR amplifizierten Fragmente, die erzeugt wurden, wurden zunächst in pUC18 (47) kloniert und die Nucleotidsequenz wurde vor der Vektorkonstruktion bestätigt.
Die Nucleotidsequenzbestimmung von Plasmid-DNA wurde durch das Didesoxykettenterminationsverfahren (40) durchgeführt. Sequenase Version 2.0 wurde entsprechend den Empfehlungen der Hersteller verwendet (United States Biochemical Corp.).
Eine positionsspezifische Mutagenese wurde unter Verwendung von entweder PCR-vermittelter Überlappungsverlängerung oder durch Einbau einer speziellen Nichtübereinstimmung in den bei der Amplifikation des nisA-Fragments verwendeten speziellen Primer durchgeführt.
Southern-Blot-Hybridisierung und die Markierung von Sonden wurde gemäß veröffentlichten Techniken (22) durchgeführt.
Ergebnisse
Inaktivierung des chromosomal lokalisierten nisA-Gens durch Insertion: Der Gensubstitutionsvektor pFI283 wurde zur Inaktivierung des chromosomal codierten nisA-Gens durch Insertion konstruiert. Er trägt ein kloniertes nisA-Gen, das durch die Insertion eines Erythromycinresistenzgens auf gebrochen ist (1a). Die Plasmidkonstruktion umfasste die folgenden Stufen:
Das nisA-Gen von FI5876 wurde in den Shuttlevektor pTG262 kloniert, wobei pFI172 erzeugt wurde, das bereits beschrieben wurde (11, 22). Ein AccI/SalI-Fragment von 2 kb von diesem Konstrukt, das nisA und den Start von nisB enthielt, wurde in den auf pBR322 basierenden Vektor pMTL23P (4, 46) subkloniert. Ein 1-kb-Fragment mit Codierung für das Erythromycinresistenzgen des Staphylokokkenplasmids pE194 (20) wurde in die singuläre SacI-Stelle in dem klonierten nisA-Gen insertiert. Diese Insertion führte zum Aufbrechen des nisA-Gens. Das Erythromycinresistenzgen in diesem Konstrukt wurde in der gleichen Richtung wie das nisA-Gen transkribiert und war auf jeder der beiden Seiten von etwa 1 kb von Laktokokken-DNA-Sequenzen flankiert. Eine singuläre EcoRV-Stelle in dem angrenzenden Polylinker der Vektorsequenzen wurde zur Insertion eines 2-kb-Fragments, das das von dem Staphylokokkenplasmid pC194 (21) stammende Chloramphenicolresistenzgen trägt, verwendet. Eine Karte des gebildeten rekombinanten Plasmids pFI283 ist in 1a angegeben.
Der Nisin produzierende Stamm L. lactis FI5876 wurde mit FI283 transformiert, und erythromycinresistente Transformanten wurden erhalten. Das Plasmid codiert nicht für einen in Lactococcus funktionierenden Replikationsstartpunkt und daher erforderte die Gewinnung von Erythromycinresistenz in diesen Transformanten die Integration dieses Markers in das Empfängerchromosom.
Die wechselseitige Rekombination zwischen homologen Sequenzen auf pFI283 (1a) und dem Chromosom von FI5876 (1b) könnte zwei Arten von Transformanten erzeugen. Ein einzelnes Crossingover-Ereignis würde zur Integration des ge samten Plasmids in das Chromosom führen (Campbell-Integration). Ein doppeltes Crossingover-Ereignis, eines auf jeder der beiden Seiten des Erythromycinresistenzgens in pFI283, würde das chromosomale nisA-Gen des Wildtyps gegen die durch Insertion inaktivierte Kopie mit darauf folgendem Verlust der durch das nicht-replizierende Plasmid codierten Chloramphenicolresistenz austauschen (Gensubstitution). Es wurde gezeigt, dass beide Rekombinationsmechanismen in Lactococcus lactis arbeiten (7, 31, 32). Die zwei alternativen Rekombinationsarten können phänotypisch durch die Transformanten, die durch Durchmustern auf Chloramphenicolresistenz erhalten werden, unterschieden werden. Transformanten mit nur Erythromycinresistenz, in denen eine Gensubstitution stattgefunden hatte, wurden gewonnen (1d). Der Stamm FI7300 ist für dieses Konstrukt typisch.
Die Chromosomumlagerung wurde durch PCR-Analyse unter Verwendung der Primer 1 und 2, die spezifisch ein 0,9-kb-Fragment von Chromosomensequenzen von FI5876, die das nisA-Gen und flankierende Regionen enthalten, amplifizieren, bestätigt (1b; 8, Spur 3). Wenn DNA von FI7300 als Templat verwendet wurde, wurde ein 1,9-kb-Fragment durch die Primer 1 und 2 amplifiziert (8, Spur 5). Eine Größenzunahme dieses Fragments von 1 kb würde erwartet, wenn das Erythromycinresistenzgen in diesen Teil des Chromosoms integriert wurde (1d), und sie ist mit dem Vorschlag konsistent, dass die Gensubstitution das nisA-Muttergen des Wildtyps durch die durch Insertion inaktivierte Kopie ersetzt hat.
Der Stamm FI7300, der das nisA-Muttergen infolge der Gensubstitution verloren hatte, produzierte kein Nisin mehr. Ferner beeinflusste die Insertion in dem nisA-Gen in diesem Stamm den Nisinimmunitätsgrad, der auf unter 500 U/ml verringert wurde (Tabelle 1).
In einem Versuch zur Rückgewinnung einer Nisinproduktion in dem nisA-defizienten Wirt FI7300 wurde der Stamm mit pFI172, das nisA codiert, transformiert, und sechs Transformanten wurden auf Nisinproduktion getestet. Die Bioassays ergaben negative Ergebnisse, was anzeigt, dass die Chromosomenmutation in diesem Wirt nicht durch Bereitstellen des nisA-Genprodukts in trans komplementiert werden kann (Tabelle 2).
Aktivierung von Genen für Nisinimmunität und Modifikation
Die Verringerung der Nisinimmunität aufgrund der Inaktivierung von nisA in FI7300 durch Insertion kann durch eine polare Wirkung auf strangabwärtige Gene verursacht sein. Dies kann auch zu einer verringerten Expression von Genen, die für eine Modifikation erforderlich sind, führen, wodurch die Komplementierung der nisA-Mutation in diesem Wirt verhindert wird. Um Derivate von FI7300, in denen die Immunitäts- und Reifungsgene vollständig aktiv sind, zu selektieren, wurde eine Mutation zu Graden der Nisinimmunität des Wildtyps durch Züchten in Medien, die Nisin in Hemmkonzentrationen enthielten, selektiert. Kolonien, die auf Agarplatten, die 10³ μg/ml Nisin enthielten, wuchsen, wurden aufgenommen und die Zellen wurden in Medien, die die gleiche Nisinkonzentration enthielten, gezüchtet. Eine derartige Mutante mit der Bezeichnung FI7304 exprimierte Grade der Nisinimmunität des Wildtyps, produzierte kein Nisin und war ferner nicht mehr gegenüber Erythromycin resistent (Tabelle 1).
Die PCR-Analyse von FI7304-DNA unter Verwendung der Primer 1 und 2 führte zur Amplifikation eines 3,2-kb-Fragments (8, Spur 6), das 1,3 kb größer als das äquivalente FI7300-Fragment, das durch die gleichen Primer erzeugt wurde, (8, Spur 5) war. Dies legte nahe, dass der Ver lust der Erythromycinresistenz nicht durch eine Deletion in dieser Region des Gens verursacht war. Das Beibehalten der Erythromycinresistenzgensequenzen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 3 und 4, die für eine Region am 3'-Ende dieses Gens spezifisch sind und ein 0,4-kb-Fragment amplifizieren, bestätigt (7b). Da diese Primer ein FI7304-Fragment einer Größe von 1,7 kb erzeugten, wurde gefolgert, dass weitere 1,3 kb DNA in dieser Region des Erythromycinresistenzgens insertiert wurden (7c). Dieses Insert führt zum Verlust der Erythromycinresistenz mit gleichzeitiger Gewinnung von Nisinimmunität (siehe im folgenden). Ein Vergleich der Fragmente von FI7300 und FI7304, die durch Amplifikation zwischen den Primern 3 und 2 und den Primern 3 und 4 erzeugt wurden, war mit dieser Interpretation konsistent (7b und c).
Die durch FI7304 erhaltenen zusätzlichen DNA-Sequenzen wurden mit den Primern 3 und 4 amplifiziert (7c), und dieses PCR-Fragment wurde zur Sondierung eines Southern Blot von restriktionsenzymverdauter Genom-DNA von dem Mutterstamm FI5876 verwendet. Eine Zahl von Fragmenten hybridisierte mit der Sonde (10), was anzeigt, dass die zusätzliche DNA in FI7304 in dem Genom dieses Stamms in Mehrfachkopien vorhanden ist. Die weitere Untersuchung ergab, dass diese wiederholten Sequenzen eine neue Laktokokken-Insertionssequenz mit der Bezeichnung IS905, deren Sequenz in 11 angegeben ist, darstellen. Wie für andere IS-Elemente aufgezeigt wurde (2, 39, 48), kann das transkriptionale Durchlesen von einem potentiellen Promotor in IS905 zum Anschalten von strangabwärtigen Genen führen. Es wurde ermittelt, dass das IS-Element IS905 signifikante Homologie mit IS256, von dem bekannt ist, dass es ein angrenzendes Antibiotikumresistenzgen ausgehend von einem internen Promotor exprimiert (2, 39), aufweist. Eine derartige Promotoraktivität könnte für die beobachtete Zunahme der Nisinimmu nität, die von FI7304 gezeigt wird, die äquivalent der des Mutterstamms FI5876 ist (Tabelle 1), verantwortlich sein und sie stellte möglicherweise auch die Expression von Genen, die zur Prozessierung von Pränisin in einem Ausmaß, das zur Durchführung der nisA-Komplementierung ausreichend ist, erforderlich ist, wieder her. Die DNA-Sequenzen der Verbindungsstelle von IS905 und dem Em-Gen in FI7304 und von IS905 und dem nisA-Gen in FI7332 sind in 12 angegeben.
Expression und Reifung von plasmidcodiertem nisA: FI7304 wurde mit dem nisA codierenden Plasmid pFI172 transformiert. Transformanten wurden in geringer Häufigkeit erhalten und die Mehrzahl produzierte in Bioassays kein Nisin. Eine Transformante mit der Bezeichnung FI7330 wurde ermittelt, die Nisin in einer Menge von etwa 50% der des Mutterstamms FI5876 ergibt (6). Es wurde angenommen, dass FI7330 eine spontane Mutation entweder in dem Plasmid oder den Chromosomsequenzen, die zur Nisinproduktion führte, erfahren hatte. Die Isolierung der Plasmid-DNA von FI7330 ergab ein Molekül, das von pFI172 auf der Basis der Restriktionsenzymanalyse nicht unterscheidbar war. Das Befreien von FI7330 von Plasmid-DNA zur Erzeugung des plasmidfreien Stamms FI7332 führte zum Verlust der Nisinproduktion (6). Wenn jedoch das Plasmid pFI172 wiederum in den letzteren Stamm eingeführt wurde, wurden hohe Transformationshäufigkeiten erhalten (12), und alle Transformanten produzierten in Bioassays Nisin.
Wenn DNA von dem plasmidfreien Stamm FI7332 durch PCR unter Verwendung der Primer 1 und 2 analysiert wurde, wurde in dem amplifizierten Fragment eine geringe Größenverringerung (200 bp) beobachtet. Die Deletion erfolgte in der Nähe der IS905-Insertion in FI7304 (8, vergleiche Spuren 5 und 6). Die Primer 3 und 4 (die von den Erythromycinresistenz gensequenzen abgeleitet wurden, 7b) erzeugten mit diesem Templat kein Fragment (7d), was anzeigt, dass die deletierten Sequenzen in FI7332 eine Region am 3'-Ende des Erythromycinresistenzgens, in die IS905 insertiert worden war, umfassten. Die Deletion erstreckt sich nicht über das nisA-Gen hinaus, da der Primer 2 (der für Sequenzen am Ende von nisA spezifisch ist) zusammen mit einem der beiden Primer 1 oder 2 zur Fragmentamplifikation führte (7d). Die kleine Chromosomumlagerung in FI7332 beeinflusste die Nisinimmunität nicht, die in einem von dem des Mutterstamms nicht unterscheidbaren Grad verliehen wird (Tabelle 1).
Expression von varianten nisA-Genen: Zur Produktion gentechnologisch veränderter Nisinmoleküle wurde eine PCR-vermittelte positionsspezifische Mutagenese an der Nucleotidsequenz des nisA-Gens durchgeführt. Die Expressionsvektoren pFI354 (3b) und pFI451 (4a) wurden zur Expression der positionsspezifischen Mutanten des nisA-Gens gestaltet.
Das Plasmid pFI354 wurde durch Deletion eines SacI-Fragments von 1,25 kb von pFI172 konstruiert. Es codiert daher nur den N-terminalen Teil von nisA (3b). Unter Verwendung von PCR wurde der C-terminale Teil des nisA-Gens als SacI/EcoRI-Fragment von 254 bp amplifiziert. Durch Klonieren dieses Fragments in pFI354 konnte ein intaktes nisA-Gen wie in pFI378 rekonstituiert werden (3c). Die Anpassung dieses Verfahrens ermöglichte die Einführung vorbestimmter Substitutionen in die C-terminale Region des nisA-Gens (unter Verwendung von positionsspezifischer Mutagenese, siehe im folgenden). Diese pFI354-Derivate nützen den natürlichen Promotor des Nisinoperons, der zwischen der SalI-Stelle, die ein Ende des klonierten Chromosomfragments definiert, und dem Start des nisA-Gens liegt (3). In diesem System ist der Einbau positionsspezifischer Mutationen auf Sequenzen in der nisA codierenden Region strangabwärts der SacI-Stelle beschränkt (2).
Ursprünglich war das zur Änderung gewählte nisA-Codon das Histidin²⁷, das in Ring 5 des reifen Nisin-A-Moleküls liegt (9). Eine natürlich vorkommende Variante von Nisin A mit der Bezeichnung Nisin Z wurde identifiziert, die einen Asparaginrest anstelle von Histidin²⁷ enthält (15, 23, 37). Der technische Einbau eines ähnlich geladenen Glutamins anstelle von Asparagin an Rest 27 würde daher eine konservative Substitution in der Aminosäuresequenz von Nisin Z darstellen. Die Mutation umfasste die Veränderung eines einzelnen Basenpaars in dem durch PCR erzeugten SacI/EcoRI-Fragment, das das C-terminale Ende von nisA trägt (2). Das rekonstituierte Gen, das ein Glutamin-Codon (CAG) anstelle eines Histidin-Codons (CAT, 2) enthält, wurde gemäß der akzeptierten Nomenklatur (10) als nisA/H27Q bezeichnet. Die positionsspezifische Mutagenese wurde unter Verwendung von PCR-vermittelter Überlappungsverlängerung (3d) wie folgt durchgeführt:
Die terminalen Primer 5 und 6 enthalten eine SacI-Stelle bzw. eine EcoRI-Stelle und sie legen die Enden eines 254-bp-Fragments mit Codierung für die C-terminalen 20 Aminosäuren von Pränisin fest (2). Ein Paar überlappender komplementärer Primer (7 und 8) wurde aus Sequenzen in der C-terminalen Region von nisA, die eine einzelne Basenänderung gegenüber der ursprünglichen nisA-Sequenz umfassten, gestaltet (2). Diese wurden in PCR-Amplifikationen in Verbindung mit einem der terminalen Primer verwendet (3d), wobei zwei partiell komplementäre Fragmente mit der in der Überlappungsregion lokalisierten speziellen Mutation erzeugt wurden. Die Fragmente wurden renaturiert, wobei ein Templat für eine anschließende PCR bereitgestellt wurde, dies die gleichen terminalen Primer, die die zwei Enden des SacI/EcoRI-Fragments bestimmten (Primer 5 und 6, 3d), umfasste. Das durch PCR erzeugte fertige Fragment, das die spezielle Mutation enthielt, wurde durch Isolierung aus einem Agarosegel unter Verwendung einer DEAE-NA-45-Membran (Schleicher und Schuell) gereinigt. Die Modifikation zerrissener Enden wurde unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase und Polynucleotidkinase durchgeführt. Das glattendige Fragment wurde in die SmaI-Stelle von pUC18 kloniert und die Nucleotidsequenz der manipulierten Region wurde bestimmt, um zu bestätigen, dass die gewählte Mutation vorhanden war. Ein SacI/EcoRI-Fragment von den pUC18-Derivaten wurde dann in pFI354 subkloniert, um ein nicht-unterbrochenes nisA-Leseraster, das die vorbestimmte Mutation enthielt, zu gewinnen. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pFI411 (3e).
Die Vektoren pFI480 und pFI487 wurden konstruiert, wobei in diesen die Expression des nisA-Gens unter der Kontrolle des lacA-Promotors stand (4). Um Änderungen über das gesamte Nisinmolekül einzuführen, wurde eine nisA-Genkassette konstruiert. Unter Verwendung von PCR mit den Primern 9 und 10 (2) wurde der N-terminale Teil des nisA-Gens als BamHI/SacI-Fragment von 200 bp amplifiziert. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pFI354 strangaufwärts des SacI/EcoRI-Fragments von 254 bp mit Codierung für den C-terminalen Teil von nisA kloniert. Das letztere wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 5 und 6 wie im vorhergehenden beschrieben erzeugt. Auf diese Weise wurde eine intakte codierende Region für das gesamte nisA-Gen, die in einem BamHI/EcoRI-Fragment von 448 bp liegt, aus zwei durch PCR erzeugten Fragmenten, die die N- und C-Teile des Nisinmoleküls codierten, rekonstituiert. Das gebildete Plasmid wurde mit pFI446 bezeichnet (4). Die nisA-Kassette umfasst die strangaufwärtige nisA-Ribosomenbindungsstelle und den Start des nisB-Gens (2).
Da der natürliche Promotor von nisA kein Teil dieser Kassette ist, wurde der induzierbare lacA-Promotor des Laktokokken-Lactoseoperons (18, 5) zur Expression von nisA und nachfolgenden varianten nisA-Genen verwendet. Die Vektorkonstruktion umfasste das Klonieren eines XmnI/BamHI-Fragments, das den lacA-Promotor enthält, jedoch die lacA-Ribosomenbindungsstelle ausschließt, in pTG262 unter Erzeugung von pFI451 (4). In den angrenzenden Polylinker wurde die gesamte nisA-Kassette auf einem BamHI/EcoRI-Fragment unter Erzeugung von pFI449 kloniert. Die individuellen Komponenten des oben beschriebenen nisA-Gens, d. h. das BamHI/SacI-N-Fragment von 200 bp und das SacI/EcoRI-C-Fragment von 254 bp, wurden ebenfalls getrennt in pFI451 kloniert, wobei pFI480 bzw. pFI487 erzeugt wurden (4). Zur Rückgewinnung eines intakten nisA-Gens in diesen Plasmiden ist die Insertion des fehlenden N- oder C-Fragments erforderlich. Diese Fragmente können durch PCR erzeugt werden und unter Verwendung geeigneter Primer können positionsspezifische Substitutionen in das rekonstituierte Gen eingebaut werden (siehe im folgenden).
Unter Verwendung dieses Expressionssystems war die ursprünglich zur Änderung ausgewählte Aminosäure Serin⁵. In reifem Nisin A wird Serin⁵ zu einem Dehydroalaninrest in Ring A modifiziert (9). Das Ziel war das Ersetzen desselben mit einem Alaninrest durch Einbau der erforderlichen Mutation in dem N-terminalen Fragment der nisA-Kassette unter Verwendung von PCR-Methodik. Der Primer 11, der ein Alanincodon (TGC) anstelle des Serin⁵-Codons (CGA) enthält, wurde zusammen mit dem Primer 9 (2) zum Erzeugen eines aminoterminalen Fragments, das diese spezielle Mutation trägt, verwendet. Der Primer 11 umfasst die Sequenzen von Primer 10 mit zusätzlichen 20 Nucleotiden einschließlich eines Alanincodons anstelle des Serincodons des Wildtyps (2). Daher erzeugte die PCR-Amplifikation von nisA unter Verwendung der Primer 9 und 11 ein N-terminales Fragment, das die spezielle Substitution trägt, und die anschließende Insertion dieses BamHI/SacI-Fragments in pFI487 führte zu einem varianten nisA-Gen, das die gewünschte positionsspezifische Mutation enthlält. Das Plasmid mit Codierung für dieses variante nisA-Gen (nisA/S5A) wurde mit pFI493 bezeichnet.
Der Nis^–-Stamm FI7332 wurde mit Plasmiden, die das nisA-Gen unter der Kontrolle von entweder dessen eigenem Promotor (pFI378, 3c) oder dem lacA-Promotor (pFI449, 4c) codieren, transformiert. Wenn Transformanten in Plattendiffusion-Assays getestet wurden, wurde eine biologische Aktivität in einem Ausmaß von etwa 50% der des Wildtyp-Mutterstamms FI5876 nachgewiesen (6, Tabelle 2). Der Unterschied hinsichtlich der Expressionsvektorpromotoren schien den Grad bzw. das Ausmaß der biologischen Aktivität nicht signifikant zu beeinflussen (6, Tabelle 2).
Transformanten von FI7332, die Derivate der Expressionsvektoren mit Codierung für variante nisA-Gene enthielten, wurden ebenfalls auf biologische Aktivität getestet. Stämme mit Codierung für nisA/H27Q und nisA/S5A zeigten Nisinaktivität in einem geringeren Ausmaß als die von FI5876, jedoch vergleichbar mit dem Ausmaß, das in den Expressionssystemen, die eine nisA-Komplementierung umfassten, erreicht wurde (d. h. FI7332/pFI378 und FI7332/pFI451; Tabelle 2, 6).
Tabelle 2 Expression von nisA- und varianten nisA-Genen in unterschiedlichen Wirtsstämmen
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nisin, das einen von Dehydroalanin verschiedenen Rest an dem dem Rest in dem ersten Ring von natürlichem Nisin, der von dem Serinrest von nicht-modifiziertem Pränisin abgeleitet ist, entsprechenden Rest aufweist.
Nisin nach Anspruch 1, wobei der von Dehydroalanin verschiedene Rest aus der aus Alanin, Valin, Threonin, Leucin, Isoleucin, Glycin, Histidin, Arginin, Lysin, Aspartat, Glutamat, Asparagin, Glutamin, Prolin, Methionin, Cystein, Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Nisin nach Anspruch 2, wobei der von Dehydroalanin verschiedene Rest Alanin ist.
Verwendung eines Nisins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als antimikrobielles Mittel.