DE60125155T2

DE60125155T2 - Mutantenstämmme von Bakterien der Gruppe Lactobacillus casei, die bezüglich eines Kohlenstoff-Katabolismus-Regulationswegs defektiv sind

Info

Publication number: DE60125155T2
Application number: DE60125155T
Authority: DE
Inventors: Josef Deutscher; Gaspar Perez Martinez; Vicente Monedero Garcia; Rosa Viana Ballester; Laurent Benbadis; Anne Pierson; Jean-Michel Faurie
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Gervais Danone SA
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Gervais Danone SA
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2021-03-31
Also published as: US8551729B2; US20040038340A1; DE60139167D1; CA2404389A1; EP1268808A1; CA2404389C; ATE348166T1; DE60125155D1; DK1268808T3; ES2334050T3; WO2001073039A1; EP1808485B1; EP1808485A3; EP1808485A2; ATE435287T1; US20110212223A1; AU2001250416A1; DK1808485T3; EP1268808B1; ES2278737T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Mutantenstämme von Bakterien der Gruppe Lactobacillus casei, die bezüglich eines Kohlenstoff-Katabolismus-Regulationswegs defektiv sind, und auf ihre Verwendung beim Prozessieren von fermentierten Nahrungsmitteln.
Die Gruppe Lactobacillus casei umfasst die Spezies L. casei wie auch die Spezies L. paracasei (früher L. casei subsp. paracasei), L. rhamnosus (früher L. casei subsp. rhamnosus) und L. zeae. Solche Spezies sind phylogenetisch sehr eng miteinander verwandt und ihre entsprechenden 165- und 23S-rDNA-Gene zeigen immer eine Ähnlichkeit von größer als 97,5% [MORI et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 54-57, (1997)].
L. casei ist als ein Probiotikum anerkannt, d.h. als ein lebendes mikrobielles Nahrungsergänzungsmittel, das eine positive Wirkung auf die Gesundheit des Konsumenten hat; es wird in großem Umfang als Starter in der Milchindustrie und bei der Herstellung von fermentierten Nahrungsmitteln, spezifischer Nahrungsmitteln, die lebende Fermente enthalten, verwendet.
Kohlenstoff-Katabolit-Repression (CCR) ist ein regulatorischer Mechanismus, der es erlaubt, dass Bakterien zwischen verschiedenen Kohlenstoffquellen entsprechend ihren metabolischen Wert wählen und in Abhängigkeit von ihrer Verfügbarkeit im Wachstumsmedium von einer Kohlenstoffquelle zu einer anderen umschalten. Eine gut bekannte Manifestation katabolischer Repression ist das diauxische Wachstum, das auftritt, wenn Bakterien in Gegenwart von Glucose und Lactose wachsen gelassen werden. Diauxische Wachstumskurven zeigen zwei unterschiedliche Phasen exponentiellen Wachstums, die durch eine lag-Phase getrennt sind. Während der ersten Wachstumsphase unterdrückt Glucose die Synthese der Enzyme, die zur Lactosenutzung notwendig sind, und ist daher die einzige Energiequelle der Bakterien. Wenn die ganze Glucose verbraucht ist, tritt die lag-Phase auf, während der die Enzyme zur Lactosenutzung synthetisiert werden, was es ermöglicht, dass Lactose als Energiequelle während der zweiten Wachstumsphase verwendet wird.
Ein Hauptziel der Katabolitrepression ist der Transport von Zuckern in die Bakterienzelle. In L. casei wird dieser Transport vornehmlich durch das Phosphoenolpyruvat:Kohlenhydrat-Phosphotransferase-System (PTS) durchgeführt.
Das PTS von Gram-positiven Bakterien wurde hauptsächlich in Bacillus subtilis studiert; es wurde gezeigt, dass es die Phosphorylierung von Zuckern und ihren Transfer in die Zelle durch eine Kaskade von Phosphorylierungen durchführt, welche die allgemeinen nicht-zuckerspezifischen Enzyme EI und HPr und die zuckerspezifischen Enzyme EIIA, EIIB und EIIC involvieren. Der erste Schritt ist die Phosphorylierung von EI aus Phosphoenolpyruvat (PEP). Das phosphorylierte EI (EI-P) katalysiert die Phosphorylierung von HPr am katalytischen His-15. HPr, das am His-15 phosphoryliert ist (als P-His-HPr bezeichnet), transferiert seine Phosphorylgruppe auf EIIA, welches wiederum EIIB phosphoryliert. Phosphoryliertes EIIB (P-EIIB), das mit dem Membranprotein EIIC assoziiert ist, katalysiert die gleichzeitige Aufnahme und Phosphorylierung eines spezifischen Kohlenhydrats.
Es wurde gezeigt, dass Komponenten des PTS und spezifischer das Enzym HPr auch in anderen regulatorischen Wegen involviert sind.
Beispielsweise kann P-His-HPr seine Phosphorylgruppe auch auf Nicht-PTS-Proteine übertragen, zum Beispiel auf Glycerinkinase [CHARRIER et al., J. Biol. Chem., 272, 14166-14174, (1997)] oder Antiterminatoren oder Transkriptionsaktivatoren, die die PTS-Regulationsdomäne (PRD) besitzen, welche mehrere Phosphorylierungsstellen enthält, die durch P-His-HPr erkannt werden [TORTOSA et al., J. Biol. Chem., 272, 17230-17237, (1997); STÜLKE et al., Mol. Microbiol., 28, 865-874, (1998); LINDNER et al., Mol. Microbiol., 31, 995-1006, (1999)]. In allen Fällen führt die P-His-HPr-abhängige Phosphorylierung zu der Aktivierung der Funktion der nicht-PTS-Proteine, und es wurde gezeigt, dass diese Phosphorylierung als sekundärer Kohlenstoff-Katabolit-Repressionsmechanismus bei Grampositiven Bakterien dient [DEUTSCHER et al., J. Bacteriol., 175, 3730-3733, (1993); KRÜGER et al., J. Bacteriol., 178, 2637-2644, (1996); MARTIN-VERSTRAETE et al., Mol. Microbiol., 28, 293-303, (1998)]. In Lactobacillus casei enthält der Antiterminator LacT, der die Expression des lac-Operons reguliert, zwei PRD und scheint durch diesen Mechanismus kontrolliert zu werden.
In Gram-positiven Bakterien kann HPr auch durch die bifunktionelle HPr-Kinase/Phosphatase HprK phosphoryliert werden [GALINIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1823-1828, (1998); REIZER et al., Mol. Microbiol., 27, 1157-1169, (1998); BROCHU und VADEBONCOEUR, J. Bacteriol., 181, 709-717, (1999); KRAVANJA et al., Mol. Microbiol., 31, 59-66, (1999)]. Bei Bacillus subtilis wird diese Phosphorylierung, die am regulatorischen Ser-46 erfolgt [DEUTSCHER et al., Biochemistry, 25, 6543-6551, (1986)], durch Fructose-1,6-bisphosphat stimuliert und durch anorganisches Phosphat inhibiert [GALINIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1823-1828, (1998)]. HPr, das am Ser-46 phosphoryliert ist (als P-Ser-HPr bezeichnet), ist funktionell im Hauptmechanismus der CCR/Kohlenstoff-Katabolit-Aktivierung bei Bacilli und vermutlich anderen Gram-positiven Bakterien beteiligt [DEUTSCHER et al., Mol. Microbiol., 42, 171-178, (1997)]. Es fungiert als Corepressor für das Katabolit-Kontrollprotein CcpA, ein Mitglied der LacI/GalR-Familie von transkriptionalen Repressoren/Aktivatoren [HENKIN et al., Mol. Microbiol., 5, 575-584, (1991)]. Es wurde gezeigt, dass der zwischen CcpA und P-Ser-HPr gebildete Komplex an Katabolit-Antwortelemente (cre) [FUJITA und MIWA, J. Bacteriol., 176, 511-513, (1994); GÖSSERINGER et al., J. Mol. Biol., 266, 665-676, (1997); KIM et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9590-9595, (1998); GALTNIER et al., J. Mol. Biol., 286, 307-314, (1999); MARTIN-VERSTRAETE et al., Mol. Microbiol., 28, 293-303, (1999)], Operatorstellen, die den Promotoren vorausgehen oder diese überlappen oder innerhalb der 5'-Region der Katabolit-unterdrückten Gene und Operone bindet [HUECK et al., Res. Microbiol., 145, 503-518, (1994)]. Ein funktionelles cre-Element wird zum Beispiel in der Promotorregion des Lactoseoperons lacTEGF von L. casei gefunden, das die Gene lacE und lacF, die für die Lactose-Transportenzyme EIICB^Lac und EIIA^Lac codieren, zusammen mit den Genen, die für ein Antiterminatorprotein (lacT) und eine Phospho-beta-galactosidase (lacG) codieren, umfasst [GOSALBES et al., J. Bacteriol., 181, 3928-3934, (1999)].
Gene, die für Komponenten des CCR-Systems codieren und spezifischer Gene, die mit den PTS in Verbindung stehen, zum Beispiel ptsI und ptsH, die für die Enzyme EI und HPr des PTS-Systems codieren, hprK, das für die HPr-Kinase/Phosphatase codiert, und ccpA wurden in einigen Spezies Gram-positiver Bakterien charakterisiert.
In L. casei wurden bis jetzt das Gen ccpA [MONEDERO et al., J. Bacteriol., 179, 6657-6664, (1997)] und die Gene lacT, lacE, lacG und lacF [GOSALBES et al., oben genannt; POTER und CHASSY, Gene, 62, 263-276, (1988); ALPERT und CHASSY, Gene, 62, 277-288, (1988); ALPERT und CHASSY, J. Biol. Chem., 265, 22561-22568, (1990); ALPERT und SIEBERS, J. Bacteriol., 179, 1555-1562, (1997)] kloniert und characterisiert.
Die Erfinder haben kürzlich die ptsI-, ptsH- und hprK-Gene von L. casei identifiziert, kloniert und sequenziert.
Die Nukleotidsequenzen des ptsHI-Operons und die Peptidsequenzen von HPr und EI von L. casei sind jeweils in dem beigefügten Sequenzprotokoll unter den Bezeichnungen SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3 offenbart. Die Sequenz des hprK-Gens ist in GENBANK unter der Eingangsnummer Y18948 erhältlich.
Die Erfinder haben nun die Wirkung von Mutationen bei ptsI, ptsH und hprK, wie auch die Wirkungen von Mutationen bei ccpA auf Wachstums- und metabolische Eigenschaften von L. casei untersucht. Sie stellten überraschenderweise fest, dass L.-casei-Stämme, die Mutationen haben, welche die Regulation der Kohlenstoff-Katabolit-Repressionsmechanismen verschlechtern, welche das PTS-Enzym HPr involvieren, und spezifischer Mutationen, die die Regulation des PTS verschlechtern, eine verbesserte Fähigkeit zur Produktion von Verbindungen, die in der Nahrungsmittelindustrie einsetzbar sind, zum Beispiel Aromaverbindungen und/oder Polysaccharide, besitzen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Mutante von L. casei, die wenigstens eine Mutation in dem ptsI-Gen hat, die die Regulation eines Kohlenstoff-Katabolit-Repressionsmechanismus, involvierend das PTS-Enzym HPr, beeinträchtigt, zur Herstellung eines Nahrungsmittelprodukts.
Vorzugsweise hat die genannte Mutante wenigstens eine Mutation im ptsI-Gen, die die Fähigkeit von EI, HPr zu phosphorylieren, beeinträchtigt.
Nicht-limitierende Beispiele von L. casei, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind Mutanten, die wenigstens eine Mutation in dem ptsI-Gen haben, die im Fehlen der Expression des Enzyms EI oder in der Expression eines Enzyms EI, das von wenigstens einer aktiven Domäne des Wildtyp-EI frei ist, resultiert. Beispielsweise kann eine Mutante der Erfindung durch Einführung einer Rasterverschiebungsmutation an der Stelle 870 der Sequenz SEQ ID NO:1 erhalten werden. Die Insertion von vier Nukleotiden (Sequenz AATT) an dieser Stelle resultiert in einem Stoppcodon vier Codons nach der Insertionsstelle. Dies resultiert in der Expression eines trunkierten EI-Proteins, das frei ist von wenigstens den Aminosäuren 110 bis 574 des Wildtyps-EI mit der Addition von vier neuen Codons vor dem ersten translationalen Stoppcodon.
Die Erfindung stellt auch Mutanten von L. casei bereit, die wenigstens eine Mutation in wenigstens dem ptsI-Gen haben, wobei die genannte Mutation wenigstens eine der Funktionen des Produkts des genannten Gens beeinträchtigt.
Diese beinhaltet insbesondere Mutanten von L. casei mit Lebensmittelqualität, die wenigstens eine Mutation haben, die wenigstens eine der Funktionen des ptsI-Gens verschlechtert, das bei der Regulation eines Kohlenstoff-Katabolit-Repressionsmechanismus durch das PTS-Enzym HPr involviert ist.
„Mutanten mit Lebensmittelqualität" sind hierin als mutante Bakterien definiert, die zur Verwendung bei der Herstellung von Nahrungsmitteln annehmbar sind. Um Lebensmittelqualität zu haben, dürfen die Mutanten keine Sequenzen umfassen, die von anderen Mikroorganismen als denen, die in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden, stammen. Vorzugsweise dürfen sie keine Sequenzen umfassen, die von anderen Mikroorganismen als denen, die zu den Spezies gehören, aus denen die Mutante abgeleitet ist, abgeleitet sind. Sie dürfen auch keine potentiell gefährlichen DNA-Sequenzen, zum Beispiel Antibiotikumresistenzgene, umfassen.
Mutanten der Erfindung können durch herkömmliche Molekularbiologieverfahren erhalten werden. Aus der Sequenz des pstI-Gens von L. casei kann der Fachmann leicht Werkzeuge entwickeln, die es erlauben, die gewünschten Mutationen durch ort-spezifische Mutagenese durchzuführen. Die genannten Mutationen können durch die Insertion, Deletion und/oder Substitution eines Nukleotids oder mehrerer Nukleotide, die benachbart sind oder nicht, erhalten werden.
Die genannten Mutationen können zum Beispiel durch die Deletion einer regulatorischen DNA-Sequenz oder Insertion, Deletion und/oder Substitution eines Nukleotids oder mehrerer Nukleotide, die benachbart sind oder nicht, erhalten werden.
Solche Mutationen beinhalten auch jede Mutation, die in der Produktion eines Proteins resultiert, das wenigstens eine Deletion, Insertion oder nicht-konservative Substitutionen eines oder mehrerer Aminosäurereste in einer Domäne, die für die biologische Aktivität des genannten Proteins essentiell ist, hat.
Das so erhaltene mutierte Gen wird dann in einen Vektor, vorzugsweise einen Expressionsvektor, kloniert und verwendet, um L.-casei-Wirtszellen durch ein geeignetes Verfahren, das an sich bekannt ist, zu transformieren. Verfahren und Vektoren, die für die Transformation von L. casei geeignet sind, werden zum Beispiel von POSNO et al. [Appl. Environ. Microbiol., 57, 1822-1828, (1991)] offenbart.
Beispielsweise kann man einen extrachromosomalen Vektor verwenden, der fähig ist, in L. casei zu replizieren. Um aller dings stabile Mutanten zu erhalten, wird ein Vektor, der die Integration des mutierten Gens in das Chromosom von L. casei ermöglicht, bevorzugt werden.
Eine Integration des mutierten Gens in das bakterielle Chromosom erfolgt durch Rekombination des Vektor-genetischen Materials an einer homologen Stelle (im Allgemeinen das Wildtyp-Allel des mutierten Gens) an dem bakteriellen Chromosom. Eine Integration kann aus einem einzelnen oder doppelten Rekombinationsereignis resultieren. Einzelne Rekombinationsereignisse resultieren in einer Integration des gesamten Vektors. Doppelte Rekombinationsereignisse führen zur Exzision der exogenen Vektorsequenzen.
Beispielsweise ist ein Verfahren zur Integration eines mutierten lacT-, lacE- oder lacF-Gens in das Chromosom von L. casei in GOSALBES et al. [J. Bacteriol. 181, 3928-3934, (1999)] offenbart. Dieses Verfahren beinhaltet ein Klonieren eines Wildtyp-Gens in ein integratives Plasmid (pRV300, das einen Erm^R-Marker hat), Induzieren einer Mutation in dem klonierten Gen (zum Beispiel durch Schneiden des Gens mit einem Restriktionsenzym und durch Einführen einer Mutation, in dem die Restriktionsstelle stumpf gemacht wird), Transformieren von L. casei mit dem Plasmid, das das mutierte Gen umfasst, Kultivieren der Bakterien in einem Selektionsmedium, das Erythromycin enthält, um die Bakterien zu selektieren, die das Plasmid durch ein einzelnes Rekombinationsereignis integriert haben (welche Erm^R sind). Eine weitere Kultivierung dieser Erm^R-Bakterien in nicht-selektivem Medium (d.h. ohne Erythromycin) erlaubt es, Bakterien zu erhalten, die ein doppeltes Rekombinationsereignis durchgemacht haben, was zur Exzision der Vektorsequenzen führt.
Ein derartiges Verfahren kann zum Beispiel verwendet werden, um Mutanten mit Lebensmittelqualität zu erhalten, worin die Funktion von EI vollständig oder teilweise beeinträchtigt ist. Dieses Verfahren umfasst:

– Transformieren von L. casei mit einem integrativen Vektor, der ein mutiertes ptsI-Gen umfasst und außerdem ein selektives Markergen umfasst;
– Kultivieren der Bakterien unter selektiven Bedingungen für das Markergen (zum Beispiel, wenn das Markergen ein Antibiotikum-Resistenzgen ist in Gegenwart des entsprechenden Antibiotikums) und Gewinnen der Bakterien, die unter diesen Bedingungen wachsen können, d.h. den Vektor durch ein einzelnes Rekombinationsereignis in ihr Chromosom integriert haben;
– Kultivieren der genannten Bakterien unter nicht-selektiven Bedingungen für das Markergen um Bakterien zu erhalten, die ein doppeltes Rekombinationsereignis durchgemacht haben, das zur Exzision der Vektorsequenzen führt.

Dieses doppelte Rekombinationsereignis produziert Bakterien, die einen Wildtyp-Phänotyp haben, und Bakterien, die die gewünschte Mutation haben. Die Letztgenannte kann auf der Basis ihre phänotypischen Eigenschaften und/oder durch PCR-Amplifikation der Chromosomenregion, in der die Mutation targetiert war, und Analyse der Amplifikationsprodukte (zum Beispiel Vergleich der Restriktionsprofile) gescreent werden. Das Vorliegen der gewünschten Mutation kann außerdem durch DNA-Sequenzierung bestätigt werden.
Mutantenstämme der Erfindung können auch aus Wildtyp-Stämmen von L. casei durch klassische Mutationsverfahren, zum Beispiel durch Chemikalien oder UV-induzierter Mutagenese, er halten werden. Sie können auch natürlich auftretende Mutanten sein, die aus L.-casei-Populationen isoliert wurden.
Beispielsweise können mutierte Stämme bzw. Mutanten-Stämme der Erfindung auf der Basis ihrer metabolischen Eigenschaften selektiert werden. Beispielsweise können Mutanten in dem ptsI-Gen auf der Basis ihrer Resistenz gegenüber 2-Desoxyglucose selektiert werden. Mutanten bezüglich des ptsI-Gens, die eine inaktive EI haben, können ebenfalls auf der Basis ihrer Fähigkeit, auf nicht-PTS-Zucker, nicht aber auf PTS-Zuckern zu wachsen, selektiert werden.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Nahrungsmittelprodukts oder Nahrungsmittelzusatzstoffes bereit, wobei das Verfahren Fermentieren eines Nahrungsmittelsubstrats mit einem Mutantenstamm von L. casei, wie er oben definiert ist, umfasst.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung hat das erhaltene Nahrungsmittelprodukt eine verbesserte Textur und ein verbessertes Aroma.
Vorzugsweise ist das genannte Nahrungsmittelprodukt ein Molkereiprodukt bzw. Milchprodukt.
Nach einer besonderen Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung Herstellen eines Nahrungsmittelprodukts, das mit Aromaverbindungen angereichert ist (zum Beispiel mit Acetat, Acetoin, Diacetyl, Hydroxy-3-pentanon, Propionat), durch Fermentieren eines Nahrungsmittelsubstrats mit einem Stamm von L. casei, der eine zusätzliche Mutation hat, welche die Funktion von CcpA beeinträchtigt.
L.-casei-Mutanten des ccpA-Gens [MONEDERO et al., J. Bacteriol., 179, 6657-6664, (1997)] sind auf dem Fachgebiet bereits bekannt. Sie sind Mutanten ohne Lebensmittelqualität, allerdings kann der Fachmann durch dasselbe Verfahren wie das oben zum Erhalt von ptsI-Mutanten mit Lebensmittelqualität beschrieben ist, in einfacher Weise ccpA-Mutanten mit Lebensmittelqualität erhalten.
Die Erfindung stellt auch fermentierte Nahrungsmittelprodukte bereit, die durch das Verfahren der Erfindung erhältlich sind, und sie stellt insbesondere fermentierte Nahrungsmittelprodukte bereit, die wenigstens einen mutanten Stamm von L. casei, wie er oben definiert ist, umfassen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die zusätzliche Beschreibung, die folgt, weiter veranschaulicht werden, wobei sich die Beschreibung auf Konstruktionsbeispiele und die Verwendung von mutanten Stämmen von L. casei der Erfindung bezieht. Es sollte allerdings selbstverständlich sein, dass diese Beispiele nur zur Erläuterung der Erfindung angeführt werden und in keiner Weise eine Beschränkung derselben darstellen sollen.
BEISPIEL 1: CHARAKTERISIERUNG VON L.-CASEI-ptsH- UND -ptsI-GENEN
Stämme, Plasmide und Kulturbedingungen
Die L.-casei-Stämme und -Plasmide, die für die Charakterisierung von ptsH- und ptsI-Genen und die Konstruktion von ptsI-Mutanten verwendet werden, sind in Tabelle 1a und 1b unten aufgelistet.
TABELLE 1a
TABELLE 1b
L.-casei-Zellen wurden bei 37°C unter statischen Bedingungen in MRS-Medium (OXOID) oder MRS-Fermentationsmedium (ADSA-MICRO, Scharlau S.A., Barcelona, Spanien), das 0,5% der angegebenen Kohlenhydrate enthält, wachsen gelassen.
Für diauxische Wachstumsexperimente wurden L.-casei-Stämme in MRS-Basalmedium wachsen gelassen, das in 1 l enthält: Poly pepton (DIFCO), 10 g); Fleischextrakt (DIFCO), 10 g; Hefeextrakt (DIFCO), 5 g; K₂HPO₄·3H₂O, 2 g; Natriumacetat, 5 g; Diammoniumcitrat, 2 g; MgSO4, 0,1 g; MnSO₄, 0,05 g und TWEEN 80, 1 ml. Das Basalmedium wurde mit unterschiedlichen Zuckern in einer Endkonzentration von 0,5% supplementiert, allerdings wurden die Zuckerkonzentrationen für die diauxischen Wachstumsexperimente verändert, wie es im Text angegeben ist. E. coli DH5α wurde unter Schütteln bei 37°C in Luria-Bertani (LB)-Medium wachsen gelassen. Transformierte Bakterien wurden auf den entsprechenden festen Medien, die 1,5% Agar enthalten, plattiert. Die Antibiotikakonzentrationen, die für die Selektion von E.-coli-Transformanten verwendet wurden, waren 100 μg Ampicillin pro ml und 300 μg Erythromycin pro ml und für die Selektion von L.-casei-Integranten 5 μg Erythromycin pro ml. Das Zucker-Nutzungsmuster bestimmter Stämme wurde mit den API50-CH-Galerien bestimmt (BIOMERIEUX, Marcy l'Etoile, Frankreich).
Reinigung von HPr
Zellen aus einer Übernacht-Kultur (1 l MRS-Medium) wurden zentrifugiert und zweimal mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, gewaschen. Die Zellen wurden in 20 mM Ammoniumbicarbonatpuffer, pH 8, resuspendiert (2 ml pro Gramm Zellpellet), ultraschallbehandelt (BRANSON SONIFIER 250) und dann zentrifugiert, um das Zelldebris zu entfernen. Da HPr eine Wärmebehandlung aushält, wurde der Überstand für 5 min bei 70°C gehalten, um die meisten der anderen Proteine zu präzipitieren. Ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt wurde durchgeführt, um die hitzedenaturierten Proteine zu entfernen. Der Überstand wurde auf eine Sephadex-G-75-Säule (42 cm × 1,6 cm) aufgegeben, mit 20 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8, äquilibriert, das mit demselben Puffer eluiert wurde, und es wurden Fraktionen von 1,5 ml gesammelt. Um auf das Vorliegen von HPr in diesen Fraktionen zu testen, wurde ein Mutantenkomplementierungsassay mit dem S.-aureus-Stamm, ptsH mutiert, S797A durchgeführt [HENGSTENBERG et al., J. Bacteriol., 99, 383-388, (1969)]. HPr-Aktivität wurde in den Fraktionen 48 bis 56 detektiert. Diese Fraktionen wurden gesammelt und zu einem Endvolumen von 500 μl konzentriert.
Die Hälfte des partiell gereinigten HPr wurde durch Umkehrphasenchromatographie an einer VYDAC-C-I8-HPLC-Säule (300 Å, 250 mm × 4,6 mm; TOUZART ET MATIGNON, Frankreich) gereinigt. Lösungsmittel A war eine wässrige Lösung von 0,1% (V/V) Trifluoressigsäure und Lösungsmittel B enthielt 80% Acetonitril und 0,04 Trifluoressigsäure. Proteine wurden mit einem linearen Gradienten von 5 bis 100 Lösungsmittel B in 60 min bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 500 μl/min eluiert. Fraktionen mit einem Volumen von etwa 500 μl wurden manuell gesammelt. Das Vorliegen von HPr in den Fraktionen wurde durch einen PEP-abhängigen Phosphorylierungsassay getestet, der 10 mM MgCl₂, 50 mM Tris-HCl, pH 7, 4, 10 μl Aliquots der Fraktionen, 10 μM [³²P]PEP und 1,5 μg B.-subtilis-Enzym I(His)₆ enthielt. Enzym I(His)₆ und HPr(His)₆ von B. subtilis wurden durch Ionenchelatchromatographie an einer Ni-NTA-SEPHAROSE-Säule (QIAGEN) nach Expression aus den Plasmiden pAG3 und pAG2 gereinigt [GALINIER et al., Proc Natl Acad Sci USA 94, 8439-8444, (1997)]. HPr(His)₆ aus B. subtilis wurde als Standard in den Phosphorylierungsreaktionen verwendet. [³²P]PEP wurde aus γ-[³²P]ATP über die Pyruvatkinase-Austauschreaktion [ROOSSIEN et al., Biochim. Biophys. Acta., 760, 185-187, (1983)] hergestellt. Die Assaygemische wurden 10 Minuten bei 37°C inkubiert und an 15% Polyacrylamidgelen, die 1% SDS enthalten, getrennt [LAEMMLI, Nature, 227, 680-685, (1970)]. Nach Trocknung der Gele wurden radioaktiv markierte Proteine durch Autoradiographie detektiert. Es wurde festgestellt, dass HPr bei 60% Acetonitril in den Fraktionen 44 bis 46 eluiert. Diese Fraktionen wurden gesammelt, lyophilisiert und Aliquots, die etwa 0,5 nmol HPr entsprechen, wurden verwendet, um die ersten 21 N-terminalen Aminosäuren von HPr durch automatisierten Edman-Abbau an einen 473A-APPLIED-BIOSYSTEMS-Mikrosequenzierer zu bestimmen.
Klonierung von PCR-amplifizierten Z.-casei-ptsHI-Fragmenten
Um L.-casei-DNA-Fragmente, die ptsH und einen Teil von ptsI enthalten, zu amplifizieren, wurden die folgenden degenerierten Oligonukleotide basierend auf der N-terminalen Sequenz von HPr und stark konservierten Regionen im Enzym I, die durch Ausführen einer vergleichenden Anordnung verschiedener Enzym-I-Sequenzen detektiert wurden, entwickelt: PTS-H2 (5'-ATG GAA AAR CGN GAR TTY AAY-3') (MEKREFN); PTS-I3 (5'-GCC ATN GTR TAY TGR ATY ARR TCR TT-3') (NDLIQYTMA); PTS-I4 (5'-CCR TCN SAN GCN GCR ATN CC-3') (GIAASDG); worin R für A oder G steht, Y für C oder T steht, S für C oder G steht und N für ein beliebiges Nukleotid steht. Die N-terminale Aminosäuresequenz von HPr und die konservierten Enzym-I-Sequenzen, die zum Aufbau der Primer dienten, sind unterstrichen in Klammern angegeben.
Eine PCR-Amplifikation der zwei Fragmente, die einen Teil des ptsHI-Operons umfassen, wurde mit einem PROGENE-Thermocycler (REAL, S.L., Valencia, Spanien) durchgeführt, der für 30 Zyklen programmiert war, die die folgenden drei Schritte beinhalteten: 30 s bei 95°C, 30 s bei 50°C und 1 min bei 72°C, gefolgt von einem abschließenden Verlängerungszyklus bei 72°C für 5 min.
Zwei Primerkombinationen (PTS-H2/PTS-I3 und PTS-H2/PTS-I4) ergaben PCR-amplifizierte Fragmente mit 1,6 kb bzw. 0,3 kb. Eine Sequenzierung der PCR-Produkte zeigte, dass die abgeleiteten Aminosäuresequenzen starke Ähnlichkeit zu den Sequenzen des bekannten Enzyms I und HPr aufwiesen. Wie erwartet, begannen beide DNA-Fragmente mit dem 5'-Ende von ptsH und erstreckten sich zu der Region in ptsI, die für die konservierte Sequenz codiert, welche als Basis für den zweiten Primer gewählt worden war. Das größere der zwei Fragmente, die mit dem Primer PTS-I3 erhalten worden waren, wurde in pUC18 kloniert, wodurch Plasmid pUCR-H1 bereitgestellt wurde. Eine Klonierung von PCR-Fragmenten wurde mit dem SURECLONE Ligationskit (Pharmacia BIOTECH, Ltd., Uppsala, Schweden) erreicht.
Ein 865 bp EcoRI-Fragment, das einen inneren Teil des ptsI-Gens enthielt, wurde aus Plasmid pUCR-H1 erhalten und in den Suizidvektor pRV300 subkloniert [LELOUP et al., Appl. Environm. Microbiol., 63, 2117-2123, (1997)], wodurch Plasmid pVME800 erhalten wurde.
Dieses Plasmid wurde verwendet, um den L.-casei-Wildtyp-Stamm BL23 zu transformieren, und eine Integration des Plasmids an der korrekten Stelle (ptsI::pVME800) wurde durch PCR und Southern-Blot verifiziert.
Eine Restriktionsanalyse der ptsHI-Region wurde durch Southern-Hybridisierung unter Verwendung von DNA, die aus einer Integranten (BL124) isoliert worden war, mit dem Ziel durchgeführt, Restriktionsenzyme zu identifizieren, die eine Klonierung der ptsH- und ptsI-Gene zusammen mit ihren flankierenden Regionen erlauben.
Eine Klonierung der Regionen, die die Insertionsstelle von Plasmid pRV300 flankieren, wurde wie folgt durchgeführt: DNA (10 μg) von L. casei BL124 wurde mit SacI oder HindIII verdaut, 500-fach verdünnt, mit T4-DNA-Ligase religiert, und verschiedene Aliquots wurden verwendet, um E. coli DH5α zu transformieren. Plasmid-DNA wurde aus verschiedenen Transformanten isoliert und anschließend sequenziert.
Ein Verdau von BL124-DNA mit SacI und eine Religation der erhaltenen DNA-Fragmente ermöglichte es, Plasmid pVMS1, das ein etwa 9-kb-Insert trägt, zu isolieren. Eine partielle Sequenzierung dieses Inserts zeigte, dass es den 3'-Teil von ptsI und seine stromabwärts gelegene Region enthielt. Dasselbe Experiment, das mit HindIII durchgeführt wurde, erlaubte die Isolierung von Plasmid pVMH1, das ein 2,4-kb-Insert trägt, das das vollständige ptsH-Gen zusammen mit einem Teil seiner Promotorregion und dem 5'-Teil von ptsI umfasst.
Die Sequenz, die den vollständigen ptsH-Promotor und 560 bp der stromaufwärts gelegenen Region enthält, wurde anschließend durch reverse PCR erhalten. Zu diesem Zweck wurde DNA, die aus dem L.-casei-Wildtyp-Stamm BL23 isoliert worden war, mit PstI geschnitten und mit T4-DNA-Ligase (GIBCO-BRL) religiert. 20 ng der ligierten DNA und zwei Primer, die aus dem 5'-Teil von ptsH abgeleitet waren und in entgegengesetzte Richtungen orientiert waren, wurden verwendet, um durch PCR ein 2,3-kb-Fragment zu amplifizieren, das die stromaufwärts gelegene Region von ptsH enthielt. Die Sequenz, die 560 bp stromaufwärts vom ptsHI-Promotor umfasst, wurde in diesem Fragment bestimmt.
Insgesamt wurde in kontinuierlicher „Stretch" von 4150 bp gesequenziert. Dieser enthielt die vollständigen ptsH- und ptsI-Gene und ein offenes Leseraster (ORF), das stromabwärts von ptsI lokalisiert ist. Es wurde festgestellt, dass das Stoppcodon von ptsH um 1 bp mit dem Initiationscodon von ptsI überlappt, was nahe legt, dass diese zwei Gene in einem Operon organisiert sind. Während das codierte L.-casei-HPr und Enzym I Sequenzähnlichkeiten aufwiesen, die von 65 bis 85% reichten, wenn Vergleiche mit ihren Homologen in B. subtilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus sakei, Streptococcus salivarius oder Enterococcus faecalis angestellt wurden, wies das Protein, das durch das ORF, welches stromabwärts von ptsI lokalisiert war, codiert wurde, Ähnlichkeit zu den Zuckerpermeasen XylE [DAVIS und HENDERSON, J. Biol. Chem., 262, 13928-13932, (19879] und GalP [PAO et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 1-34, (1998)] von Escherichia coli auf. Kein ORF konnte in der 560-bp-Region stromaufwärts zum ptsHI-Promotor detektiert werden.
1 ist eine schematische Darstellung des sequenzierten chromosomalen L.-casei-DNA-Fragments, das das ptsHI-Operon enthält. Gezeigt sind die drei ORFs, die in diesem Fragment detektiert werden, der Promotor und der Terminator des ptsHI-Operons und einige wichtige Restriktionsstellen. Die anfänglich isolierten PCR-Fragmente H2/I4 und H2/I3 flankiert von Pfeilen) und das 865-bp-EcoRI-Fragment, das E800 genannt wurde und in pRV300 subkloniert wurde, sind oben in der schematischen Darstellung des gesamten DNA-Fragments gezeigt.
Transkriptionsanalyse des L.-casei-ptsHI-Operons Um die Größe der ptsHI-Transkripte zu bestimmen und die Wirkung einer man- (verhindert die Aufnahme von Glucose über das PTS) und einer ccpA-Mutation auf die ptsHI-Expression zu untersuchen, wurden Northern-Blot mit RNA durchgeführt, die nicht nur aus dem L.-casei-Wildtyp BL23, sondern auch aus den Mutantenstämmen BL30 (man) [VEYRAT et al., Microbiology, 140, 1141-1149, (1994)], BL71 (ccpA) [MONEDERO et al., J. Bacteriol., 179, 6657-6664, (1997)] und BL72 (man ccpA) [GOSALBES et al., FEMS Microbiol. Lett., 148, 83-89, (1997)], die im Medium wachsen gelassen wurden, das Glucose, Lactose oder Ribose enthielt, isoliert worden war.
L.-casei-Stämme wurden in MRS-Fermentationsmedium, supplementiert mit 0,5% der verschiedenen Zucker, zu einer OD bei 550 nm zwischen 0,8 und 1 wachsen gelassen. Zellen aus einer 10-ml-Kultur wurden durch Zentrifugation gesammelt, mit 50 mM EDTA gewaschen und in 1 ml TRIZOL (GIBCO BRL) resuspendiert. 1 g Glasperlen (Durchmesser 0,1 mm) wurde zugesetzt und die Zellen wurden durch Schütteln der Zellsuspension in einer FASTPREP-Apparatur (BIOSPEC, Bartlesville, OK, USA) zweimal für 45 s gebrochen. RNA wurde nach dem Verfahren, das vom Hersteller von TRIZOL empfohlen wurde, isoliert, durch Formaldehyd-Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt und auf HYBOND-N-Membranen (AMERSHAM) transferiert.
Hybridisierungsexperimente wurden entweder mit ptsH- oder ptsI-spezifischen Sonden durchgeführt. Mit beiden Sonden konnte eine mRNA-Bande mit etwa 2,1 kb detektiert werden, was in guter Übereinstimmung mit der für die kombinierten ptsH- und ptsI-Gene steht, wodurch bestätigt wird, dass diese zwei Gene in einem Operon organisiert sind und dass eine Transkription an der Stammschleifenstruktur, die stromabwärts von ptsI lokalisiert ist, stoppt.
Ein densitometrische Messung der hybridisierenden Bande in der RNA, die aus Zellen der verschiedenen Mutanten isoliert worden war, die in Glucose-, Lactose- oder Ribose-enthaltendem Medium gewachsen waren, zeigte, dass eine Expression des ptsHI-Operons moderat durch Glucose im Wildtyp und der ccpA-Mutante induziert wurde, während diese Wirkung in den Stämmen, die die man-Mutation tragen, weniger ausgeprägt ist.
BEISPIEL 2: KONSTRURTION UND CHARAKTERISIERUNG VON ptsI-MUTANTEN
Mutante BL124
Diese Mutante resultiert aus einer Transformation von L.-casei-Wildtyp-Stamm BL23 mit Plasmid pVME800, wie es in Beispiel 1 oben beschrieben ist.
Im Gegensatz zum Wildtyp-Stamm kann diese Mutante nicht länger Säure aus Fructose, Mannose, Mannit, Sorbose, Sorbit, Amygdalin, Arbutin, Salicin, Cellobiose, Lactose, Tagatose, Trehalose und Turanose produzieren. Allerdings kann er noch Ribose, Galactose, Glucose, N-Acetylglucosamin, Aesculin, Maltose und Gluconat metabolisieren, was nahe legt, dass in L. casei PTS-unabhängige Transportsysteme für diese zweite Klasse von Zuckern existieren.
Mutante BL126
Plasmid pVMH1 wurde mit EcoRI partiell verdaut und an den Enden geglättet (mit Klenow-Fragment aufgefüllt), bevor es religiert wurde und verwendet wurde, um E. coli DH5α zu transformieren. Aus einer der resultierenden Transformanten konnte ein Plasmid (pVMR10) isoliert werden, das eine Rasterverschiebungsmutation an der EcoRI-Stelle, lokalisiert am Nukleotid 327 des ptsI-Gens, trägt, was durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt wurde (Insertion von 4 zusätzlichen Basenpaaren). Plasmid pVMR10 wurde anschließend verwendet, um L. casei BL23 zu transformieren, und es wurde eine Erythromycin-resistente ptsI⁺-Integrante, die auf einer Campbell-artigen Rekombination resultiert, isoliert.
Aus diesem Stamm konnte eine ptsI-Mutante (ptsI1, BL126) durch eine zweite Rekombination erhalten werden. BL126 war Erythromycin-empfindlich und wies ein Fermentationsmuster auf, das identisch mit dem ist, das für die ptsI::pVME800-Mutante BL124 gefunden wurde. Interessanterweise konnte keine ptsHI-mRNA durch Northern-Blot-Analyse in BL126 detektiert werden.
BEISPIEL 3: KONSTRUKTION UND CHARAKTERISIERUNG VON ptsI-MUTANTEN MIT LEBENSMITTELQUALITÄT
Eine Mutante von ptsI-Genen mit Lebensmittelqualität wurde im industriellen Stamm von L. paracasei subsp. paracasei CNCM I-1518 konstruiert; dieser Stamm ist in EP 0 794 707 offenbart.
Diese Mutante wurde unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1 konstruiert.
Plasmid pVMR10 wurde verwendet, um L. casei CNCM I-1518 zu transformieren.
Der transformierte Stamm wurde in MRS-Medium, das 5 μg/ml Erythromycin umfasst, wachsen gelassen. Eine Erythromycinresistente ptsI⁺-Integrante wurde isoliert. Diese Integrante wurde für 200 Generationen in MRS-Medium ohne Erythromycin wachsen gelassen, um die zweite Rekombination zu ermöglichen, die zu der Exzision des pVMR10-Plasmids führt.
Ein Erythromycin-empfindlicher Lac^--Klon wurde isoliert, wie es in Beispiel 2 oben offenbart wurde, durch PCR untersucht und sein ptsI-Gen sequenziert. Das Fermentationsmuster dieses Klons in API-CH50L zeigte, dass diese Mutanten im Vergleich zu dem Wildtyp CNCM I-1518 nicht länger Adonitol, Fructose, Mannose, Sorbose, Mannit, Sorbit, Amygdalin, Arbutin, Salicin, Cellobiose, Saccharose und Trehalose verwenden können.
Diese Mutante wurde bei 37°C in fettarmer Milch (13 g Fett/kg) oder Magermilch wachsen gelassen. In Magermilch wurde nach 34 h ein pH von 4,45 erreicht (unter denselben Bedingungen wurden ein pH von 4,45 nach 30 h mit dem Wildtyp-Stamm CNCM I-1518 erreicht).
In einer anderen Testreihe wurde standardisierte Milch mit 170 g Protein/kg, 13 g Fett/kg und supplementiert mit 50 g Glucose/kg verwendet.
Die fermentierten Produkte, die aus standardisierter Milch, supplementiert mit Glucose, mit dem mutanten Stamm ptsI erhalten wurden, haben eine Gelfestigkeit, die um etwa 15-25% niedriger ist als die von fermentierten Produkten, die mit dem Wildtyp-Stamm erhalten wurden. Dies erlaubt, ein elastischeres Gel mit etwa 15-25% zu erhalten und die Synerese zu verringern.
Sie haben auch eine leicht niedrigere Viskosität als die fermentierten Produkte, die mit dem Wildtyp-Stamm erhalten wurden. Allerdings ist der Viskositätsverlust bei Scherbehandlung im Fall der Produkte, die mit dem Mutanten Stamm erhalten wurden, weniger wichtig. Diese Eigenschaften erlaubt eine bessere Konservierung der Textur während industrieller Prozesse, bei denen Scherung auftreten kann, zum Beispiel die Herstellung von gerührter fermentierter Milch.
Die fermentierten Produkte, die mit dem mutanten Stamm erhalten wurden, hatten ein sahnigeres Aroma als die fermentierten Produkte, die mit dem Wildtyp-Stamm erhalten wurden. Dies steht mit einem höheren Gehalt an C4-, C6-, C8-, C12-, C14- und C16-Fettsäuren in Beziehung.
BEISPIEL 4: POST-ACIDIFIZIERUNGSEIGENSCHAFTEN DER ptsI-MUTANTE MIT LEBENSMITTELQUALITÄT
Die ptsI-Mutante von Beispiel 3 wurde wie oben beschrieben auf standardisierter Milch, supplementiert mit Glucose, bis zu einem pH von 4,55 wachsen gelassen.
Die so erhaltene fermentierte Milch wird bei 4°C, 8°C oder 13°C gelagert und der pH wird nach 7, 14, 21 oder 28 Tagen Lagerung gemessen.
2 stellt die Post-Acidifizierung während der Lagerung bei verschiedenen Temperaturen für fermentierte Milch dar, die mit dem Wildtyp-Stamm oder mit der ptsI-Mutante erhalten wurde.
Legende von Figur 2:
Diese Resultate zeigen, dass die ptsI-Mutante in jedem Fall eine reduzierte Post-Acidifizierung bzw. Nach-Acidifizierung hat, wenn man mit dem Wildtyp-Stamm vergleicht.
Diese reduzierte Post-Acidifizierung ist nicht durch ein geringeres Überleben des mutanten Stamms bedingt. Dies wurde durch Messen der Überlebensrate bei 28 Tagen kontrolliert. Sie ist für die ptsI-Mutante wie auch für den Wildtyp-Stamm höher als 60%. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer Mutante von L. casei, die wenigstens eine Mutation im ptsI-Gen hat, wobei die genannte Mutation die Regulation eines Kohlenstoff-Katabolit-Repressions (CCR)-Mechanismus, involvierend das PTS-Protein HPr, beeinträchtigt, zur Herstellung eines Nahrungsmittelproduktes.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die genannte Mutation im ptsI-Gen die Fähigkeit von EI, HPr zu phosphorylieren, beeinträchtigt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Mutante wenigstens eine Mutation im ptsI-Gen hat, die in der Expression eines EI-Proteins resultiert, das frei von wenigstens den Aminosäuren 110 bis 574 von Wildtyp-EI ist.
Mutante von L. casei, die wenigstens eine Mutation in wenigstens dem ptsI-Gen hat, wobei die genannte Mutation wenigstens eine der Funktionen des Produkts des genannten Gens beeinträchtigt.
Für Nahrungsmittel geeignete Mutante von L. casei, die wenigstens ein Mutation im ptsI-Gen hat, wobei die genannte Mutation wenigstens eine der Funktionen des Produkts des genannten Gens beeinträchtigt.
Verfahren zum Erhalt einer für Nahrungsmittel geeigneten Mutante nach Anspruch 5, wobei das Verfahren umfasst: – Transformieren von L. casei mit einem integrativen Vektor, der das mutierte ptsI-Gen umfasst, wobei die genannte Mutation wenigstens eine der Funktionen des Produkts des ge nannten Gens beeinträchtigt, und der außerdem ein selektives Markergen umfasst; – Kultivieren der Bakterien unter für das Markergen selektiven Bedingungen, um die Bakterien, die das Plasmid in ihr Chromosom integriert haben, durch ein einzelnes Rekombinationsereignis zu erhalten; – Kultivieren der genannten Bakterien unter für das Markergen nicht selektiven Bedingungen, um Bakterien zu erhalten, die ein doppeltes Rekombinationsereignis durchgemacht haben, was zu der Excision der Vektorsequenzen führt.
Verfahren zur Herstellung eines Nahrungsmittelprodukts oder Nahrungsmitteladditivs, wobei das genannte Verfahren Fermentieren eines Nahrungsmittelsubstrats mit einer Mutante von L. casei, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert ist, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Nahrungsmittelprodukt ein Milchprodukt ist.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8 zur Herstellung eines Nahrungsmittelprodukts, das mit Aromaverbindungen angereichert ist, umfassend Fermentieren eines Nahrungsmittelsubstrats mit einem Stamm von L. casei, der außerdem eine Mutation hat, die die Funktion von CcpA beeinträchtigt.
Fermentiertes Nahrungsmittelprodukt, das wenigstens eine Mutante von L. casei, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert ist, umfasst.