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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Gen (Polynucleotid), kodierend
thermostabile Glucokinase, einen rekombinanten Vektor, umfassend
dieses Gen, einen Transformanten, transformiert mit dem rekombinanten Vektor
und ein Verfahren zur Erzeugung einer thermostabilen Glucokinase
unter Verwendung des Transformanten.
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Hintergrund
der Erfindung
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Glucokinase
[EC.2.7.1.2] ist ein Enzym, das eine wichtige Rolle in vivo bei
dem ersten Schritt des glycolytischen Wegs spielt, d.h. der Einführung von
ATP. Andererseits ist es ein industriell nützliches Enzym und wird in
verschiedenen Testreagenzien zur Messung von Glukose als essenzieller
Bestandteil in einer Testzusammensetzung oder des Verbrauchs von
Glukose in einer Probe verwendet.
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Glucokinase
zeigt eine sehr hohe Substratspezifität für Glukose. Demgegenüber ist
Hexokinase [EC.2.7.1.1], von der bekannt ist, dass es ein Enzym
ist, das ähnliche
Reaktion katalysiert, ein anderes Enzym, das auf verschiedene Saccharide
als Substrate wirkt. Weiterhin sind diese beiden Enzyme Proteine,
die im Hinblick darauf, dass sie eine niedrige Aminosäuresequenzhomologie
zeigen, vollständig
unterschiedlich voneinander sind.
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Die
gegenwärtigen
Erfinder haben festgestellt, dass eine aus Bacillus stearothermophilus
isolierte Glucokinase, wobei es sich um einen thermophilen Mikroorganismus
handelt, hoch stabil ist und ein Verfahren vorgeschlagen, um dieselbe effizient
zu produzieren (japanische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 127086/1981).
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Andererseits
wurde über
Verfahren einer Expression von Glucokinasegenen in vivo durch die
japanischen Patentanmeldungen, Veröffentlichungsnummern 102195/1985,
124390/1986, 127880/1999, in der veröffentlichten japanischen Patentübersetzung
der internationalen Patentveröffentlichungsnummer 512762/1998,
der japanischen Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 292485/1994,
den veröffentlichten
japanischen Übersetzungen
der internationalen Veröffentlichungsnummern
507084/1998, 505498/1998, 508398/1996, der Land-Wiederveröffentlichung
(domestic re-publication) der internationalen Patentveröffentlichungsnummer
012343/1998, usw. berichtet. Diese Glucokinasen unterscheiden sich
jedoch von dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Enzym
im Hinblick auf Stabilität,
Substrataffinität
usw. Außerdem
sind diese Expressionsverfahren für eine Produktion im großen Umfang
durch Isolierung und Reinigung nicht geeignet und unterscheiden
sich daher von dem in der vorliegenden Erfindung offenbarten Verfahren.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Das
von den gegenwärtigen
Erfindern vorgeschlagene, oben beschriebene Herstellungsverfahren
ermöglicht
es, eine Glucokinase mit einer hohen Hitzestabilität und einer
ausgezeichneten Lagerstabilität
zu erhalten und das Enzym einfach zu reinigen. Es wird jedoch viel
Energie für
die Erzeugung einer thermostabilen Glucokinase durch das oben erwähnte Verfahren
benötigt,
da der Mikroorganismus bei hoher Temperatur von im allgemeinen 50
bis 60°C
kultiviert wird. Zusätzlich
besteht immer noch das ungelöste
Problem, dass dieser Mikroorganismus die Glucokinase nur in geringer
Menge produzieren kann und dass es daher schwierig ist, die Glucokinase
in großem
Umfang zu erzeugen.
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Die
vorliegende Erfindung zielt auf die Bereitstellung eines Genmanipulationsmaterials
für die
biotechnologische Erzeugung einer thermostabilen Glucokinase ab,
die von einem thermophilen Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus
abstammt, und zwar in großer
Menge und auf ein Verfahren zur Erzeugung einer thermostabilen Glucokinase
unter Verwendung dieses Materials.
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Um
diese Probleme zu lösen,
haben die gegenwärtigen
Erfinder ausgedehnte Studien durchgeführt und haben im Ergebnis erfolgreich
ein Gen für
eine thermostabile Glucokinase isolieren können, erzeugt durch den oben
beschriebenen Bacillus stearothermophilus und die Bestimmung ihrer
Struktur ermöglichen
können. Weiterhin
haben sie einen rekombinanten Vektor erhalten, der das Gen aufweist,
kodierend die thermostabile Glucokinase, inseriert in eine Vektor-DNA
und festgestellt, dass die thermostabile Glucokinase effizient durch Kultivierung
eines Bakterienstamms erzeugt werden kann, der die thermostabile
Glucokinase erzeugen kann, der durch Einführung dieses rekombinanten
Vektors in einen Stamm, der z.B. zur Gattung Escherichia gehört, in ein
Medium und ähnliches
konstruiert wurde, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
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Dementsprechend
betrifft eine erste Ausführungsform
der gegenwärtigen
Erfindung ein Gen, kodierend thermostabile Glucokinase, das die
Aminosäuresequenz,
wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 umfasst oder ein Gen, kodierend
eine thermostabile Glucokinase, das eine Aminosäuresequenz umfasst, abgeleitet von
der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz durch Deletion,
Substitution oder Addition von ein oder mehreren Aminosäuren.
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Die
zweite Ausführungsform
der gegenwärtigen
Erfindung betrifft ein Gen, kodierend thermostabile Glucokinase,
das eine DNA aufweist, umfassend die durch SEQ ID NO: 2 dargestellte
Basensequenz oder ein Gen, kodierend eine thermostabile Glucokinase,
das eine Basensequenz umfasst, abgeleitet von der durch SEQ ID NO:
2 dargestellten Basensequenz durch Deletion, Substitution oder Addition
von ein oder mehreren Basen.
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Weiterhin
betrifft die dritte Ausführungsform
der gegenwärtigen
Erfindung einen rekombinanten Vektor, umfassend ein Gen gemäß der ersten
oder zweiten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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Die
vierte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft einen Transformanten, umfassend
den rekombinanten Vektor der dritten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung.
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Die
fünfte
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung
thermostabiler Glucokinase, was das Kultivieren des Transformanten
gemäß der vierten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung in einem Medium und Sammeln der thermostabilen
Glucokinase aus der Kultur umfasst.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine Konzeptansicht, die die Konstruktion eines rekombinanten Vektors,
enthaltend das thermostabile Glucokinasegen gemäß der vorliegenden Erfindung,
darstellt.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
thermostabile Glucokinase gemäß der vorliegenden
Erfindung ist ein Protein mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten
Aminosäuresequenz.
Weiterhin sind Proteine mit den von dieser Aminosäuresequenz durch
Deletion, Substitution oder Addition von ein oder mehr Aminosäuren abgeleiteten Aminosequenzen ebenfalls
im Umfang enthalten, solange solche Proteine die Glucokinaseaktivität beibehalten.
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Die
Gene (Polynucleotid) gemäß der vorliegenden
Erfindung sind Gene, die die oben beschriebene Aminosäuresequenz
kodieren. Insbesondere sind diese Gene durch die DNA typifiziert,
umfassend die Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 2 oder,
in einigen Fällen
ein Gen, umfassend eine Basensequenz, abgeleitet von der durch SEQ
ID NO: 2 dargestellten durch Deletion, Substitution oder Addition
von ein oder mehr Basen abgeleiteten Basensequenz.
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Anders
ausgedrückt
beinhaltet das Gen des betroffenen Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung ein
Polynucleotid, das ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO: 1 aufweist, worin ein oder mehr Aminosäurereste der Aminosäuresequenz
durch mindestens eine Deletion, Addition, Insertion und Substitution
modifiziert sein kann (können),
ein Gen, das mit dem Polynucleotid unter stringenten Bedingungen
hybridisiert oder mit dem Polynucleotid der SEQ ID NO: 2, ein Polynucleotid,
das eine Homologie mit dem Polynucleotid aufweist und ein Polynucleotid,
das im Hinblick auf das Polynucleotid degeneriert ist und all diese
sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung beinhaltet, mit der
Maßgabe,
dass das dadurch kodierte Polypeptid eine Enzymaktivität der vorliegenden
Erfindung aufweist.
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Die
Zahl der Deletionen, Additionen, Insertionen und/oder Substitutionen
ist nicht besonders begrenzt, solange die enzymatische Aktivität der vorliegenden
Erfindung nicht verlorengeht. Die Zahl der Deletionen, Additionen,
Insertionen und/oder Substitutionen des Polypeptids beträgt vorzugsweise
1 bis 20, noch bevorzugter 1 bis 10 und besonders bevorzugt 1 bis
5. Die Anzahl der Deletionen, Additionen, Insertionen und/oder Substitutionen
des Polynucleotids beträgt
vorzugsweise 1 bis 60, noch bevorzugter 1 bis 30 und besonders bevorzugt
1 bis 15.
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Die
Bezeichnung "unter
stringenten Bedingungen",
wie hier verwendet, bedeutet z.B. den folgenden Zustand. Das heißt, 6 × SSC, 1,0%
Blockierungsmittel, 0,1% N-Lauroylsarcosinnatrium, 0,02% SDS.
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Ein
solches Gen kann z.B. durch ein Verfahren erhalten werden, wobei
eine Teilsequenz von SEQ ID NO: 2 synthetisiert wird und das Zielgen
dann aus einer DNA-Bibliothek unter Verwendung dieser synthetischen
DNA als Sonde isoliert wird oder durch das PCR-Verfahren, wobei
das Zielgen durch Verwendung synthetischer DNAs von beiden Endteilen
der SEQ ID NO: 2 als Primer und einer chromosomalen DNA als Matrize amplifiziert
wird.
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Als
Mikroorganismus, der die thermostabile Glucokinase gemäß der vorliegenden
Erfindung bereitstellt, ist es adäquat, thermophile Mikroorganismen
zu verwenden, die zur Gattung Bacillus gehören, insbesondere Bacillus
stearothermophilus. Besondere Beispiele hierfür beinhalten UK-563 (FERM P-7275),
ACTT-7953 (FERM P-4775), ACTT-8005 (FERM P-4776), ACTT-10149 (FERM
P-4777), NCA-1503 (FERM P-4778) und SP-43 (FERM P-12754).
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Die
Isolierung des thermostabilen Glucokinasegens aus den oben beschriebenen
Bakterien, die zur Gattung Bacillus gehören, die Konstruktion einer
rekombinanten DNA, die dieses Gen enthält, die Konstruktion eines
Transformanten durch Verwendung dieser rekombinanten DNA, die Kultur
des Transformanten usw. für die
Vervollständigung
der gegenwärtigen
Erfindung können
unter Verwendung bekannter Verfahren durchgeführt werden, z.B. den Verfahren,
die in Molecular Cloning (Sambrook, J., et. al., Cold Spring Harbor,
1989) beschrieben werden.
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Als
Beispiele des hier verwendbaren Vektors können kommerziell erhältliche
Vektoren, wie z.B. pUC19, pKK223-3, pPL-λ usw. zitiert werden. Es ist
vorzuziehen, einen Vektor zu verwenden, der durch Kombination von
ori- und tac-Promotoren,
die zu einem Polykopievektor führen,
wie z.B. pUC19, konstruiert wurden.
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Beispiele
für den
verwendeten Wirt beinhalten Escherichia coli JM109, TG1, BL21 und
N4830-1. Es wird besonders bevorzugt, hierfür TG1 oder BL21 zu verwenden.
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Das
Verfahren zur Erzeugung der thermostabilen Glucokinase unter Verwendung
des oben erhaltenen Transformanten kann wie folgt durchgeführt werden.
Zunächst
wird der Transformant kultiviert und dann werden die transformierten
Zellen gesammelt. Nach Lyse der Zellen unter Verwendung einer Ultraschallbehandlung,
Lysozym usw. und Zentrifugation wird der Überstand unter Verwendung eines
kommerziell erhältlichen Ionenaustauschharzes,
eines Affinitätsharzes
oder ähnlichen
fraktioniert. Auf diese Weise kann die thermostabile Glucokinase
erzeugt werden.
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Die
Aktivität
der Glucokinase wird überprüft und durch
die folgenden Verfahren angegeben. Die Aktivität wurde nämlich durch Vermischen von
10 μl einer
Enzymlösung
mit 1,0 ml einer Lösung,
enthaltend 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0), 4 mM Adenosintriphosphat
(ATP), 20 mM Magnesiumchlorid, 0,9 mM NADP, 12 mM Glukose und 0,5
U Glukose-6-Phosphatdehydrogenase (hergestellt von Roche Diagnostics)
und Messung der anfänglichen
Rate der Veränderung
der Absorption bei 340 nm bei 30°C überprüft. Die
Einheit der Enzymaktivität
wurde als Menge des Enzyms definiert, die benötigt wird, um 1 μmol ATP pro
Minute unter den oben definierten Bedingungen zu dephosphorylieren.
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Die
vorliegende Erfindung wird jetzt im Detail und insbesondere durch
Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben.
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Beispiel 1:
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Analyse der N-terminalen
Aminosäuresequenz
der Glucokinase
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Die
N-terminale Aminosäuresequenz
der gereinigten Glucokinase wurde durch das Edman-Abbauverfahren
bestimmt. Die so bestimmte N-terminale Aminosäuresequenz ist durch die 1-
bis 65-Positionen der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz
dargestellt.
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Beispiel 2:
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Konstruktion
von DNA-Primern
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Die
Basensequenz des Glucokinasegens, kodierend die Teil-Aminosäuresequenz,
wie offenbart in Beispiel 1, wurde angenommen. Oligonucleotidsonden,
entworfen auf Basis dieser Sequenz, würden in Mehrzahl vorliegen.
In der gegenwärtigen
Erfindung wurden die Oligonucleotide, die als GKD1 bzw. GKU1 bezeichnet
wurden, mit den durch SEQ ID NO: 3 und 4 im Sequenzprotokoll dargestellten
Basesequenzen, die durch Auftrag an eine Organisation von außerhalb
(Amersham Pharmacia Biotech K.K.) synthetisiert wurden, als Oligonukleotidprimer
verwendet.
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Beispiel 3:
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Konstruktion
einer Bacillus stearothermophilus chromosomalen DNA-Bibliothek
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1
g thermophiler Bacillus stearothermophilus UK-563 (FERM P-7275)
Zellen wurden mit Lysozym (hergestellt von Seikagaku Kogyo) gemäß einem
bekannten Verfahren (Saito & Miura,
Biochim. Biophys., Acta, Band 72, Seite 619, 1963) lysiert und dann
wurde die DNA mit einem SDS-haltigen alkalischen Puffer und Phenol
extrahiert. Weiterhin wurde RNA mit RNase abgebaut und so wurde
1 mg chromosomaler DNA gereinigt.
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Ein
100 μg Teil
der erhaltenen chromosomalen DNA wurde teilweise mit einem Restriktionsenzym Sau3AI
(hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) abgebaut, um 80 μg chromosomaler
DNA-Fragmente zu
ergeben. Getrennt hiervon wurde 1 μg des Vektors pUC19 (hergestellt
von Takara Shuzo Co., Ltd.) vollständig mit dem Restriktionsenzym
BamH I (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) abgebaut und mit einer
von einem Bakterium abstammenden alkalischen Phosphatase (hergestellt
von Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um dadurch 0,8 μg Vektor-DNA-Fragmente
zu ergeben. Dann wurden 0,28 μg
der chromosomalen DNA-Fragmente und 0,1 μg der Vektor-DNA-Fragmente,
wie erhalten, einer Ligation unter Verwendung einer von einem T4-Phagen
abgeleiteten DNA-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.)
bei 16°C
für 30
Minuten unterzogen, um eine rekombinante DNA zu ergeben. Die so
erhaltene rekombinante DNA wurde mit 200 μg E. coli JM109 kompetenten
Zellen (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) vermischt und man ließ diese
1 Stunde auf Eis stehen. Dann wurde die Mischung für 120 Sekunden
auf 42°C
erwärmt,
wodurch die Transformation durchgeführt wurde.
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Zu
dem so erhaltenen Transformanten wurde 1 ml L-Medium zugefügt und der
Transformant wurde 1 Stunde bei 37°C kultiviert. Darauffolgend
wurde die flüssige
Kultur auf ein L-Agarplattenmedium, enthaltend Ampicillin, verteilt.
So wurden ampicillintolerante Stämme
erhalten. Diese Stämme
wurden in L-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, inokuliert
und darin über
Nacht kultiviert. Nach Sammeln der Zellen wurde ein Plasmid durch
das Alkali-SDS-Verfahren hergestellt, um eine Bacillus stearothermophilus
chromosomale DNA-Bibliothek zu erhalten.
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Beispiel 4:
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Isolierung eines Gens,
das thermostabile Glucokinase kodiert
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Durch
Verwendung der in Beispiel 3 erhaltenen chromosomalen DNA-Bibliothek
als Matrize wurden Genfraktionen, kodierend Bacillus stearothermophilus
Glucokinase durch das PCR-Verfahren
unter Verwendung von Kombinationen der beiden Primer, die jeweils
in der Lage sind, das N-terminale und C-terminale Ende des Glucokinasegens zu
amplifizieren, amplifiziert, nämlich
der Kombination des Primers GKD1, konstruiert in Beispiel 2 mit
einem Primer M13-20 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und
der Kombination des Primers GKU1, konstruiert in Beispiel 2 mit
einem Primer M13-20 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.).
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Die
PCR wurde durch Verwendung der Flüssigreaktionsmischung mit der
wie unten angegebenen Zusammensetzung unter den folgenden Amplifizierungsbedingungen
durchgeführt.
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Zusammensetzung
der Flüssigreaktionsmischung
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5
U/100 μl
Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von Sawady Technology Co., Ltd.),
10 μl/100 μl einer 10fachen
Konzentration Taq-DNA-Polymerasepuffer; 0,01 μg/100 μl chromosomaler DNA (Matrizen-DNA);
0,2 mM Teile dATP, dTTP, dGTP und dCTP; 1 μM von jedem Primer.
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Amplifizierungsbedingungen
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- (1) 2 Minuten bei 94°C (Denaturierung)
- (2) 45 Sekunden bei 94°C
(Denaturierung)
- (3) 30 Sekunden bei 55°C
(Annealing)
- (4) 2 Minuten bei 74°C
(Reaktion)
-
Wiederholung
von 30 Zyklen jeweils mit den Schritten (1) bis (4).
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Jedes
der amplifizierten DNA-Fragmente wurde mit einem T-Vektor pT7Blue
vermischt und einer Ligation unter Verwendung einer von T4 abstammenden
DNA-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) unterzogen und
zwar bei 16°C
für 30
Minuten, um eine rekombinante DNA zu ergeben. Die erhaltene rekombinante
DNA wurde mit 200 μg
kompetenten E. coli-Zellen vermischt (hergestellt von Toyobo Co.,
Ltd.), man ließ diese
1 Stunde auf Eis stehen und dann wurde für 120 Sekunden auf 42°C erwärmt, wodurch
die Transformation durchgeführt
wurde.
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Zu
dem so erhaltenen Transformanten wurde 1 ml L-Medium zugefügt und der
Transformant wurde 1 Stunde bei 37°C kultiviert. Darauffolgend
wurde die Flüssigkultur
auf ein L-Agarplattenmedium, enthaltend Ampicillin, verteilt. So
wurden ampicillintolerante Stämme
erhalten. Weiße
Kolonien unter diesen so gebildeten Kolonien wurden in L-Medium,
enthaltend 50 μg/ml
Ampicillin inokuliert und darin über
Nacht kultiviert. Nach einem Sammeln der Zellen wurde ein Plasmid
durch das Alkali-SDS-Verfahren hergestellt und die Basensequenz
des Glucokinase-Strukturgenbestandteils wurde durch das Dideoxyverfahren
bestimmt.
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Basierend
auf der Basensequenz, kodierend Glucokinase, wie oben bestimmt,
wurde die Synthese von zwei Primern GKD2 und GKU2, entworfen, um
das Gesamtlängengen,
kodierend Glucokinase, zu amplifizieren bei einer Organisation von
außerhalb
(Amersham Pharmacia Biotech K.K.) beauftragt, um die Oligonukleotidprimer
zu ergeben. Die Sequenz von GKD2 korrespondiert zu den 1- bis 21-Positionen
der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID NO: 2 im Sequenzprotokoll,
während
die Sequenz von GKU2 zu den 932- bis 954-Positionen in der Basensequenz,
dargestellt durch SEQ ID NO: 2 im Sequenzprotokoll, korrespondiert. Der
Primer GKD2 wurde mit einem zusätzlichen
CC am 5'-Terminus
entworfen, um eine Spaltungsstelle durch das Restriktionsenzym Nco
I an der N-terminalen Seite des amplifizierten Fragments zu bilden.
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Unter
Verwendung der in Beispiel 3 erhaltenen chromosomalen DNA als Matrize
wurde das Gesamtlängengen,
kodierend Bacillus stearothermophilus Glucokinase, durch das PCR-Verfahren
unter Verwendung der Primer GDK2 und GKU2 amplifiziert.
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Die
PCR wurde unter Verwendung der Flüssigreaktionsmischung mit der
unten angegebenen Zusammensetzung unter den folgenden Amplifizierungsbedingungen
durchgeführt.
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Zusammensetzung
der Flüssigreaktionsmischung
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5
U/100 μl
Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von Sawady Technology Co., Ltd.),
10 μl/100 μl einer 10fachen
Konzentration Taq-DNA-Polymerasepuffer; 0,01 μg/100 μl chromosomaler DNA (Matrizen-DNA);
0,2 mM Teile dATP, dTTP, dGTP und dCTP; 1 μM von jedem Primer.
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Amplifizierungsbedingungen
-
- (1) 2 Minuten bei 94°C (Denaturierung)
- (2) 45 Sekunden bei 94°C
(Denaturierung)
- (3) 30 Sekunden bei 55°C
(Annealing)
- (4) 2 Minuten bei 74°C
(Reaktion)
-
Wiederholung
von 30 Zyklen jeweils mit den Schritten (1) bis (4).
-
Jedes
der amplifizierten DNA-Fragmente wurde mit einem T-Vektor pT7Blue
vermischt und einer Ligation unter Verwendung einer von T4 abstammenden
DNA-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) unterzogen und
zwar bei 16°C
für 30
Minuten, um eine rekombinante DNA zu ergeben. Die erhaltene rekombinante
DNA wurde mit 200 μg
kompetenten E. coli-Zellen vermischt (hergestellt von Toyobo Co.,
Ltd.), man ließ diese
1 Stunde auf Eis stehen und dann wurde für 120 Sekunden auf 42°C erwärmt, wodurch
die Transformation durchgeführt
wurde.
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Zu
dem so erhaltenen Transformanten wurde 1 ml L-Medium zugefügt und der
Transformant wurde 1 Stunde bei 37°C kultiviert. Darauffolgend
wurde die Flüssigkultur
auf ein L-Agarplattenmedium, enthaltend Ampicillin, verteilt. So
wurden ampicillintolerante Stämme
erhalten. Weiße
Kolonien unter diesen so gebildeten Kolonien wurden in L-Medium,
enthaltend 50 μg/ml
Ampicillin inokuliert und darin über
Nacht kultiviert. Nach einem Sammeln der Zellen wurde ein Plasmid
durch das Alkali-SDS-Verfahren hergestellt und die Basensequenz
des Glucokinase-Strukturgenbestandteils wurde durch das Dideoxyverfahren
bestimmt. SEQ ID NO: 2 im Sequenzprotokoll zeigt diese Basensequenz.
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Beispiel 5:
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Konstruktion
des Plasmidvektors für
die Expression
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pKK223-3
(hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech K.K.) wurde an den Erkennungsstellen
von Nae I (hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) und Pvu I (hergestellt
von Toyobo Co., Ltd.) gespalten. Dann wurde das so gespaltene lineare
Plasmid durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und DNA-Fragmente,
die den Tac-Promotor enthielten, wurden gesammelt. Andererseits
wurde pUC19 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) an der Erkennungsstelle
von Eae I (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten. Nach
einem Glätten
der Enden mit einer T4-Phagen-abgeleiteten DNA-Polymerase (hergestellt
von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde an der Erkennungsstelle von PvuI
(hergestellt von Toyobo Co., Ltd.) gespalten und das so gespaltene lineare
Plasmid wurde durch Agarosegelelektrophorese abgetrennt. Dann wurden
DNA-Fragmente, die
ori enthielten, gesammelt.
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0,1 μg der oben
beschriebenen Tac-Promoter-haltigen DNA-Fragmente wurden mit 0,1 μg der ori-haltigen
DNA-Fragmente vermischt und einer Ligation unter Verwendung einer
T4-Phagen-abgeleiteten
DNA-Ligase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) bei 16°C für 30 Minuten
unterzogen. So wurde ein Expressionsplasmidvektor pUCtac erhalten.
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Beispiel 6:
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Konstruktion
des rekombinanten Vektors
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Die
Synthese einer 85 bp DNA, dargestellt durch SEQ ID NO: 5, worin
Codons, korrespondierend zu den 1- bis 25-Resten in der Aminosäuresequenz,
dargestellt durch SEQ ID NO: 1 im Sequenzprotokoll durch diejenigen
substituiert wurden, die häufig
in E. coli auftraten, wurde bei einer Organisation von außerhalb (Amersham
Pharmacia Biotech K.K.) in Auftrag gegeben. Um eine NcoI-Erkennungsstelle
einzuführen,
wurden 2 Cytosinbasen zum 5'-Ende
zugefügt.
Dieses DNA-Fragment und das Plasmid, enthaltend das im oben beschriebenen
Beispiel 4 erhaltene Glucokineasegen, wurden an der NcoI-Erkennungsstelle
und der ClaI-Erkennungsstelle, lokalisiert am N-Terminus des Glucokinasegens
gespalten und durch Agarosegelelektrophorese getrennt. So wurden
DNA-Fragmente, enthaltend den N-terminalen Teil und den C-terminalen
Teil des Glucokinasegens, jeweils von dem ersteren und dem letzteren
erhalten.
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0,1 μg Teile dieser
DNA-Fragmente wurden vermischt und eine Ligation unter Verwendung
einer T4-Phagen-abgeleiteten DNA-Ligase
(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) bei 16°C für 30 Minuten unterzogen. So
wurde ein rekombinantes Plasmid pTVOKG, enthaltend ein thermostabiles
Glucokinasegen, worin die Codons der N-terminalen 25 Reste für E. coli
optimiert worden waren, erhalten.
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Dieses
rekombinante Plasmid pTVOKG wurde an der NcoI-Erkennungsstelle, lokalisiert am N-Terminus
des Glucokinasegens gespalten, um linear zu sein und dann mit einer
T4-Phagen-abgeleiteten DNA-Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo
Co., Ltd.) mit glatten Enden versehen. Als nächstes wurde es an der HindIII-Erkennungsstelle,
lokalisiert am C-Terminus stromabwärts gespalten. Das so gespaltene
lineare Plasmid wurde durch eine Agarosegelelektrophorese getrennt
und DNA-Fragmente, die das Glucokinasegen enthielten, wurden gesammelt.
Andererseits wurde der Expressions-Plasmidvektor pUCtac, erhalten
im oben beschriebenen Beispiel 5, an der EcoRI-Erkennungsstelle,
lokalisiert 5 Basen stromabwärts
von der SD-Sequenz, zum Erhalt eines linearen Plasmids gespalten.
Nach einem Glätten
der Enden mit einer S1-Nuklease (hergestellt von Takara Shuzo Co.,
Ltd.) wurde weiter an der HindIII-Erkennungsstelle in der Multiklonierungsstelle
gespalten. Das so gespaltene lineare Plasmid wurde durch Agarosegelelektrophorese
getrennt und DNA-Fragmente, die den Tac-Promotor enthielten, wurden
gesammelt.
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0,1 μg dieser
glucokinasegenhaltigen DNA-Fragmente wurden mit 0,1 μg der Vektor-Plasmid-Fragmente
gemischt und einer Ligation unter Verwendung einer T4-Phagen-abgeleiteten
DNA-Ligase (hergestellt von
Takara Shuzo Co., Ltd.) unterzogen und zwar bei 16°C für 30 Minuten,
um einen rekombinanten Vektor pUtOGKs zu erhalten, der das thermostabile
Glucokinasegen enthielt.
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Dieser
rekombinante Vektor wurde als Plasmid pUtOGKs bei dem National Institute
of Bioscience und Human Technology, Agency of Industrial Science
and Technology (gegenwärtiger
Name: International Patent Organism Depositary, National Institute
of Advanced Industrial Science and Technology; Addresse: AIST Tsukuba
Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566,
Japan) am 29. November 2000 (Hinterlegungsnummer FERM P-18130) hinterlegt
und zu einer Hinterlegung gemäß Budapester
Vertrag am 17. Dezember 2001 (Hinterlegungsnummer FERM BP-7827) übertragen. 1 fasst
die Verfahren zur Kontruktion dieses rekombinanten Vektors pUtOKGs
zusammen.
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Beispiel 7:
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Erzeugung der thermostabilen
Glucokinase in E. coli
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Das
in Beispiel 6 konstruierte pUtOGKs wurde mit 200 μg E. coli
TG1 kompetenten Zellen vermischt, hergestellt durch das Calciumverfahren
und man ließ diese
1 Stunde auf Eis stehen. Dann wurde die Mischung für 120 Sekunden
auf 42°C
erwärmt,
wodurch die Transformation durchgeführt wurde. Zu dem so erhaltenen Transformanten
wurde 1 ml L-Medium zugefügt
und der Transformant wurde 1 Stunde bei 37°C kultiviert. Darauffolgend
wurde die Flüssigkultur
auf ein L-Agarplattenmedium,
enthaltend 50 μg/ml
Ampicillin, verteilt. So wurden 100 E. coli-Kolonien, enthaltend
das thermostabile Glucokinasegen, erhalten und als TG1/pUtOGKs bezeichnet.
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Der
Transformant E. coli TG1/pUtOGKs wurde in 300 ml L-Medium, enthaltend
50 μg/ml
Ampicillin inokuliert und darin über
Nacht bei 37°C
präkultiviert.
Als nächstes
wurde die flüssige
Vorkultur in 20 l L-Medium, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin inokuliert und
darin 10 Stunden bei 37°C
kultiviert. Dann wurde 1 mM Isopropyl-β-thiogalactopyranosid zugefügt und die
Kultivierung wurde für
zusätzliche
15 Stunden fortgesetzt. Als nächstes
wurden die Zellen gesammelt. Die so gesammelten Zellen zeigten 1.000.000
U Glucokinaseaktivität. Die
Zellen wurden in 1000 ml eines 25 mM Phosphatpuffers (pH 8,0) suspendiert
und ultraschallbehandelt. Nach Entfernung der aufgebrochenen Zellen
wurde die Glucokinase aus dem Überstand
durch Affinitätschromatographie
unter Verwendung von Blue-Sepharose und Ionenaustauschchromatographie
unter Verwendung von DEAE-Sepharose
gereinigt. So wurden 360.000 U Glucokinase gewonnen, was 50mal so
viel war wie die Menge an Glucokinase, die durch Kultivierung von
20 l Bacillus stearothermophilus UK-563 (FERM P-7275) erhalten wurde.
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Durch Überprüfung der
Eigenschaften der erhaltenen Glucokinase wurde festgestellt, dass
dieses Enzym eine Restaktivität
von 100% nach Behandlung für
1 Stunde bei 60°C
zeigte, einen pH-Optimumswert von 8,0 und eine Km gegenüber Glukose
von 0,1 mM. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde bestätigt, dass
die gemäß dem Verfahren
der gegenwärtigen
Erfindung erhaltene Glucokinase dieselben Eigenschaften wie die von
Bacillus stearothermophilus UK-563 (FERM P-7275) abstammende Glucokinase
aufwies.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann eine thermostabile Glucokinase in großer Menge
durch ein geeignetes Verfahren bei niedrigen Kosten erhalten werden.
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Diese
Anmeldung basiert auf der japanischen Patentanmeldung Nr. 2001-006391,
eingereicht am 15. Januar 2001.
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