JPS61124390A - アデノシン−５′−三燐酸およびエタノ−ルの製造法 - Google Patents
アデノシン−５′−三燐酸およびエタノ−ルの製造法Info
- Publication number
- JPS61124390A JPS61124390A JP59247802A JP24780284A JPS61124390A JP S61124390 A JPS61124390 A JP S61124390A JP 59247802 A JP59247802 A JP 59247802A JP 24780284 A JP24780284 A JP 24780284A JP S61124390 A JPS61124390 A JP S61124390A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- yeast
- glycolytic
- hexokinase
- glucokinase
- plasmid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアデノシン−５′−三燐酸（以下ＡＴＰと略称
する）及びエタノールの製造法に関し、更に詳しくは遺
伝子工学的手法によりヘキソキナーゼおよび／またはグ
ルコキナーゼ活性を増大させた酵母の培養処理物を用い
ることを特徴とするＡＴＰ及びエタノールの新規製造法
に関する。
する）及びエタノールの製造法に関し、更に詳しくは遺
伝子工学的手法によりヘキソキナーゼおよび／またはグ
ルコキナーゼ活性を増大させた酵母の培養処理物を用い
ることを特徴とするＡＴＰ及びエタノールの新規製造法
に関する。
酵母はパン、ヒール、清酒、ワインなどの発酵食品に古
くから用いられて来た有用な微生物であり、又この微生
物は、最近の凹界的なエネルギー事情により、バイオマ
スからのエタノールの生産菌としても注目されている。
くから用いられて来た有用な微生物であり、又この微生
物は、最近の凹界的なエネルギー事情により、バイオマ
スからのエタノールの生産菌としても注目されている。
酵母は、解糖系活性が他の細菌と比較して強い上にエタ
ノール生産能ををする為、これを利用してエタノールお
よびその他の有用物質を工業的に効率よく生産するため
の数多くの検討がなされてきた。その酵母の解糖系を利
用した有用物質の代表的なものとしてＡＴＰかあげられ
る。
ノール生産能ををする為、これを利用してエタノールお
よびその他の有用物質を工業的に効率よく生産するため
の数多くの検討がなされてきた。その酵母の解糖系を利
用した有用物質の代表的なものとしてＡＴＰかあげられ
る。
ＡＴＰはあらゆる生物に普遍的に存在する高エネルギー
化合物であり、生体内では吸エルゴン反応のエネルギー
供与体として関与し、エネルギー準位の低いアデノシン
−５′−二燐酸（以下ＡＤＰと略称する）に転換される
物質である。かかる作用を有するが故に、ＡＴＰは脳血
管障害や筋萎縮症の治療に使用されるのみならず、糖ヌ
クレオチド、ノチノン補酵素、ある種のペプチドなど、
数多くの有用な物質の生産に使用されている。かかる有
用性を持ったＡＴＰの製造法としてはりアデノノンまた
はアデノシン−５′−一燐酸（以下ＡＭＰと略称する）
、燐酸供与体および糖類を含む反応液に、ミクロバクテ
リウム属またはコリネバクテリウム属の細菌菌体もしく
はその菌体処理物を作用させる方法（特公昭４ｇ（５６
３５６号）、２）大腸菌から分離精製したポリ燐酸キナ
ーゼを用い、燐酸ポリマーの存在下でＡＤＰを燐酸化す
る方法（特公昭５３−５７５２号）、および３）クレア
チンキナーゼを固定化し、これをＡＤＰとクレアチン燐
酸の混液に作用させる方法（特公昭５６−４６７９５号
）などが既に知られている。しかしながら＾ＴＰ生合成
系の酵素を持った微生物またはその微生物から抽出され
た該酵素を用い、ＡＭＰおよびＡＤＰなどのＡＴＰ前駆
体をＡＴＰに変換するこれらの方法（酵素法）には、次
の様な欠点がある。即ち、酵素法によるＡＴＰの生合成
はエネルギー供与系との共役を必要とし、従ってこのエ
ネルギー供与系に関与するクレアチン燐酸またはアセチ
ル燐酸などの、高価な高エネルギー燐酸化合物を反応系
に加えなければならず、一方、これらの高エネルギー燐
酸化合物に代えて細菌の解糖系または呼吸系などの準細
胞分画を使用する場合は、その活性が低い為、満足すべ
き結果を得ることができない。
化合物であり、生体内では吸エルゴン反応のエネルギー
供与体として関与し、エネルギー準位の低いアデノシン
−５′−二燐酸（以下ＡＤＰと略称する）に転換される
物質である。かかる作用を有するが故に、ＡＴＰは脳血
管障害や筋萎縮症の治療に使用されるのみならず、糖ヌ
クレオチド、ノチノン補酵素、ある種のペプチドなど、
数多くの有用な物質の生産に使用されている。かかる有
用性を持ったＡＴＰの製造法としてはりアデノノンまた
はアデノシン−５′−一燐酸（以下ＡＭＰと略称する）
、燐酸供与体および糖類を含む反応液に、ミクロバクテ
リウム属またはコリネバクテリウム属の細菌菌体もしく
はその菌体処理物を作用させる方法（特公昭４ｇ（５６
３５６号）、２）大腸菌から分離精製したポリ燐酸キナ
ーゼを用い、燐酸ポリマーの存在下でＡＤＰを燐酸化す
る方法（特公昭５３−５７５２号）、および３）クレア
チンキナーゼを固定化し、これをＡＤＰとクレアチン燐
酸の混液に作用させる方法（特公昭５６−４６７９５号
）などが既に知られている。しかしながら＾ＴＰ生合成
系の酵素を持った微生物またはその微生物から抽出され
た該酵素を用い、ＡＭＰおよびＡＤＰなどのＡＴＰ前駆
体をＡＴＰに変換するこれらの方法（酵素法）には、次
の様な欠点がある。即ち、酵素法によるＡＴＰの生合成
はエネルギー供与系との共役を必要とし、従ってこのエ
ネルギー供与系に関与するクレアチン燐酸またはアセチ
ル燐酸などの、高価な高エネルギー燐酸化合物を反応系
に加えなければならず、一方、これらの高エネルギー燐
酸化合物に代えて細菌の解糖系または呼吸系などの準細
胞分画を使用する場合は、その活性が低い為、満足すべ
き結果を得ることができない。
一方、エタノール生産量の高い酵母を使用したエタノー
ルの製造法において、培養内の菌濃度を上げてエタノー
ルの収率を上げる方法は既に知られているが、有用物質
であるＡＴＰと共にエタノールを製造する方法は知られ
ていない。
ルの製造法において、培養内の菌濃度を上げてエタノー
ルの収率を上げる方法は既に知られているが、有用物質
であるＡＴＰと共にエタノールを製造する方法は知られ
ていない。
本発明者らは、ＡＴＰおよびエタノールの両有用物質の
効率的な製造法を確立することを最終的な目標として鋭
意検討を開始し、まず遺伝子組み換えによって解糖系酵
素である大腸菌のフォスフォフルクトキナーゼおよびト
リオース燐酸イソメラーゼ活性を増大させた細菌、即ち
強力な解糖系活性を有する細菌を調製し、この細菌の存
在下、解糖系基質と＾ＴＰ前駆体からＡＴＰを生産せし
めたところ、効率よ＜ ＡＴＰが生産される事実を見出
だし、これを特許出願した（特開昭５７−１６６９２２
号）。しかし、この方法で使用できる解糖系基質は特殊
なものに限られ、グルコースで代表される安価な基質を
用いた場合には、十分なＡＴＰを製造することができな
かった。そこでフォスフォフルクトキナーゼ及びトリオ
ース燐酸イソメラーゼ活性を増大させろ代イつりにグル
コキナーゼ活性を高めた細菌（大腸菌）を調製し、その
細菌の存在下でＡＴＰを生産せしめ、安価な基質（グル
コース）を用いてら効率よくＡＴＰを生産できる方法を
開発した（特願昭５８−２０８０１１７号）。この様に
、解糖系酵素の一つであるグルコース燐酸化酵素の活性
強化が、訂Ｐ生産の効率化をもたらすことは判明したが
、大腸菌には、安価なＡＴＰ前駆体であるアデノノンを
ＡＭＰに変換するアデノノンキナーゼ活性がほとんどな
いため、この方法は高価なへ貯を基質として使用しなけ
ればならないという欠点を有していた。そこで本発明者
らは、アデノノンキナーゼ活性の高い酵母を使用し、か
っ、遺伝子粗塵え技術を用いてこの酵母のへキソキナー
ゼ活性および／またはグルコキナーゼ活性を強化したと
ころ、安価なアデノノンから効率よ＜ ＡＴＰが生産さ
れると共に、必然的に効率よくエタノールか生産される
ことを見出だし本発明を完成した。
効率的な製造法を確立することを最終的な目標として鋭
意検討を開始し、まず遺伝子組み換えによって解糖系酵
素である大腸菌のフォスフォフルクトキナーゼおよびト
リオース燐酸イソメラーゼ活性を増大させた細菌、即ち
強力な解糖系活性を有する細菌を調製し、この細菌の存
在下、解糖系基質と＾ＴＰ前駆体からＡＴＰを生産せし
めたところ、効率よ＜ ＡＴＰが生産される事実を見出
だし、これを特許出願した（特開昭５７−１６６９２２
号）。しかし、この方法で使用できる解糖系基質は特殊
なものに限られ、グルコースで代表される安価な基質を
用いた場合には、十分なＡＴＰを製造することができな
かった。そこでフォスフォフルクトキナーゼ及びトリオ
ース燐酸イソメラーゼ活性を増大させろ代イつりにグル
コキナーゼ活性を高めた細菌（大腸菌）を調製し、その
細菌の存在下でＡＴＰを生産せしめ、安価な基質（グル
コース）を用いてら効率よくＡＴＰを生産できる方法を
開発した（特願昭５８−２０８０１１７号）。この様に
、解糖系酵素の一つであるグルコース燐酸化酵素の活性
強化が、訂Ｐ生産の効率化をもたらすことは判明したが
、大腸菌には、安価なＡＴＰ前駆体であるアデノノンを
ＡＭＰに変換するアデノノンキナーゼ活性がほとんどな
いため、この方法は高価なへ貯を基質として使用しなけ
ればならないという欠点を有していた。そこで本発明者
らは、アデノノンキナーゼ活性の高い酵母を使用し、か
っ、遺伝子粗塵え技術を用いてこの酵母のへキソキナー
ゼ活性および／またはグルコキナーゼ活性を強化したと
ころ、安価なアデノノンから効率よ＜ ＡＴＰが生産さ
れると共に、必然的に効率よくエタノールか生産される
ことを見出だし本発明を完成した。
即ち、より具体的には、本発明者らは解糖系酵素である
ヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼを暗号化
している酵ｅ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の両遺
伝子のクローニングに成功し、かかる遺伝子を、酵母と
大腸菌の７ヤトルヘクタープラスミトに組み込んで酵母
に導入し、かくして得られたグルコース燐酸化活性の高
められた形質転換菌を培養し、その培養乾燥処理物を、
ＡＴＰの前駆体であって八ＭＰより安価なアデノノンと
、安価な解糖系基質の混合物に作用させることにより、
高収率でＡＴＰ並びにエタノールを製造し得ることを見
い出し本発明を完成したしのである。従って本発明の目
的は、グルコース燐酸化酵素であるヘキソキナーゼおよ
び／またはグルコキナーゼを暗号化している遺伝子を担
持している酵母プラスミド並びに該プラスミドの導入に
よって形質転換されたＡＴＰおよびアルコール生産能の
高い酵母を提供することにあり、更にもう一つの目的は
、該形質転換酵母の培養処理物を用いてＡＴＰ並びにエ
タノールを製造する方法を提供することにある。
ヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼを暗号化
している酵ｅ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の両遺
伝子のクローニングに成功し、かかる遺伝子を、酵母と
大腸菌の７ヤトルヘクタープラスミトに組み込んで酵母
に導入し、かくして得られたグルコース燐酸化活性の高
められた形質転換菌を培養し、その培養乾燥処理物を、
ＡＴＰの前駆体であって八ＭＰより安価なアデノノンと
、安価な解糖系基質の混合物に作用させることにより、
高収率でＡＴＰ並びにエタノールを製造し得ることを見
い出し本発明を完成したしのである。従って本発明の目
的は、グルコース燐酸化酵素であるヘキソキナーゼおよ
び／またはグルコキナーゼを暗号化している遺伝子を担
持している酵母プラスミド並びに該プラスミドの導入に
よって形質転換されたＡＴＰおよびアルコール生産能の
高い酵母を提供することにあり、更にもう一つの目的は
、該形質転換酵母の培養処理物を用いてＡＴＰ並びにエ
タノールを製造する方法を提供することにある。
以下に本発明をより詳細に説明する。
ヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼを暗号化
している遺伝子をクローニングするには、まず野性型の
Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから、フェノール法（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、 ７２巻、６
１９〜６２９．１９６３年）の改良法によって染色体Ｄ
ＮＡを抽出し、適当な制限酵素で断片化する。ここで使
用される制限酵素は、ヘキソキナーゼ並びにグルコキナ
ーゼ暗号遺伝子を破壊しない限り、いかなるものであっ
てもよい。
している遺伝子をクローニングするには、まず野性型の
Ｓ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから、フェノール法（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、 ７２巻、６
１９〜６２９．１９６３年）の改良法によって染色体Ｄ
ＮＡを抽出し、適当な制限酵素で断片化する。ここで使
用される制限酵素は、ヘキソキナーゼ並びにグルコキナ
ーゼ暗号遺伝子を破壊しない限り、いかなるものであっ
てもよい。
一方ベクタープラスミドＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ、Ｊ
、Ｒ，，５Ｌｒａｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｎ、、Ｈｉｃｋｓ、
Ｊ、Ｂ、 ：Ｇｅｎｅ、８．１２Ｈ１９７９）参照）を
制限酵素で切断し、次いでＵｌｌｒｉｃｈらの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ、１９６＠ １３１３〜Ｈ１９，１９７０年
）に準じてアルカリフォスファターゼで処理する。こう
して得られる線状プラスミドを、先に調製した染色体Ｄ
ＮＡ断片と混合し、アニーリングを行った後Ｔ、ＤＮＡ
リガーゼで処理して組み換えＤＮＡを調製する。上記の
操作で、染色体ＤＮＡ断片の種類に応じた各種の組み換
え体が生成するので、これらの一群の組み換え体から目
的とするヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼ
暗号化遺伝子が挿入されたプラスミドＤＮＡを担持して
いる形質転換体を以下に述べる方法で選択する。グルコ
キナーゼ資化能欠損株である酵母、例えばＳ、ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ ５Ｙ２１５株をアルカリ金属処理してコ
ンピテント化し０．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５３、１
６３（＋９８３））、これに組み換えＤＮＡを導入する
。
、Ｒ，，５Ｌｒａｔｈｅｒｎ、Ｊ、Ｎ、、Ｈｉｃｋｓ、
Ｊ、Ｂ、 ：Ｇｅｎｅ、８．１２Ｈ１９７９）参照）を
制限酵素で切断し、次いでＵｌｌｒｉｃｈらの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ、１９６＠ １３１３〜Ｈ１９，１９７０年
）に準じてアルカリフォスファターゼで処理する。こう
して得られる線状プラスミドを、先に調製した染色体Ｄ
ＮＡ断片と混合し、アニーリングを行った後Ｔ、ＤＮＡ
リガーゼで処理して組み換えＤＮＡを調製する。上記の
操作で、染色体ＤＮＡ断片の種類に応じた各種の組み換
え体が生成するので、これらの一群の組み換え体から目
的とするヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼ
暗号化遺伝子が挿入されたプラスミドＤＮＡを担持して
いる形質転換体を以下に述べる方法で選択する。グルコ
キナーゼ資化能欠損株である酵母、例えばＳ、ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ ５Ｙ２１５株をアルカリ金属処理してコ
ンピテント化し０．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５３、１
６３（＋９８３））、これに組み換えＤＮＡを導入する
。
ここで使用するＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ ５Ｙ２１５
株（α ｔｒｐｌ。
株（α ｔｒｐｌ。
ｈｉｓ２．ａｎｄｌｏｒ ３ｍｅｔ１４．ｈｘｋｌ、ｈ
ｘｋ２．ｇｌｋｌ）は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ ０
３０８．３株（αａｄｅ１．ｔｒｐ１．ｈｉｓ２．ｍｅ
ｔ１４．ｈｘｋｌ。
ｘｋ２．ｇｌｋｌ）は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ ０
３０８．３株（αａｄｅ１．ｔｒｐ１．ｈｉｓ２．ｍｅ
ｔ１４．ｈｘｋｌ。
ｈｘｋ２．ｇｌｋｌ）とＳ、 ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅ
ＤＫＤ−５Ｄ−８株（ａ ｔｒｐｌ。
ＤＫＤ−５Ｄ−８株（ａ ｔｒｐｌ。
１ｅｕ２−３．１ｅｕ２−１１２．ｈｉｓ３）とを、Ｌ
ｉｎｄｅｇｒｅｎの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、 、２９，３０６（１９４３））に従って
交雑させることにより調製することができる。この交雑
の出発菌株であるＤ３０ｇ、３株は、野性型Ｓ、ｃｅｒ
ｅｖｉｓｅａｅから、ＭａｉＬｒａらの方法で調製する
ことができる（Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１５
７巻、２９７（１９７７）参照）。
ｉｎｄｅｇｒｅｎの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、 、２９，３０６（１９４３））に従って
交雑させることにより調製することができる。この交雑
の出発菌株であるＤ３０ｇ、３株は、野性型Ｓ、ｃｅｒ
ｅｖｉｓｅａｅから、ＭａｉＬｒａらの方法で調製する
ことができる（Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１５
７巻、２９７（１９７７）参照）。
一方、ＤＫＤ−５Ｄ−１１出発昧は、Ｓ、 ｃｅｒｅｖ
ｉｓｅａｅ Ｄ１３−Ａ株（ａ ｈｉｓ３−５３２ ｔ
ｒｐｌ ｇａ１２ＸＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ、７６巻、１０３５〜＋０３９．１９７９
年）とＡｌ２２−１株（α１ｅｕ−３゜１ｅｕ２−１１
２）との交雑によって得られ、ここに使用するＡｌ２２
−１株は３２８８Ｃ株とＡｌ１２２を交雑させて調製す
ることができる（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ、７５巻、１９２９〜１９３３（＋９７８）
）。
ｉｓｅａｅ Ｄ１３−Ａ株（ａ ｈｉｓ３−５３２ ｔ
ｒｐｌ ｇａ１２ＸＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ、７６巻、１０３５〜＋０３９．１９７９
年）とＡｌ２２−１株（α１ｅｕ−３゜１ｅｕ２−１１
２）との交雑によって得られ、ここに使用するＡｌ２２
−１株は３２８８Ｃ株とＡｌ１２２を交雑させて調製す
ることができる（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ、７５巻、１９２９〜１９３３（＋９７８）
）。
かくして得られたＤＮＡ導入株をトリプトファンとヒス
チジンを含むＳＤ（イーストナイトロノエノベース０．
６７％、グルコース２％）最少培地で培谷し、大きく生
育したコロニーを選択する。次いで炭素源としてフルク
トースを含む最少培地にレプリカし、フルクトースでも
大きく生育する株を、ヘキソキナーゼ暗号遺伝子を担持
しているプラスミドＤにＡが導入された菌株として選択
単離することが出来る。又グルコースでのみ大きく生育
する株は、グルコキナーゼ暗号遺伝子を担持している形
質転換株として単離することが出来る。上で得た所望の
菌株を培養し、常法により組み換えプラスミドを分離し
、これを野性型Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入するこ
とによってグルコース燐酸化活性の増強した菌株を得る
ことが出来る。この菌株は、常法に従って培養すること
ができるが、グルコース濃度を１重量％に設定した培地
を使用し、２５〜３０℃で２０〜３０時間培養すると、
グルコース燐酸化活性の高い培養菌を得ることかできる
。
チジンを含むＳＤ（イーストナイトロノエノベース０．
６７％、グルコース２％）最少培地で培谷し、大きく生
育したコロニーを選択する。次いで炭素源としてフルク
トースを含む最少培地にレプリカし、フルクトースでも
大きく生育する株を、ヘキソキナーゼ暗号遺伝子を担持
しているプラスミドＤにＡが導入された菌株として選択
単離することが出来る。又グルコースでのみ大きく生育
する株は、グルコキナーゼ暗号遺伝子を担持している形
質転換株として単離することが出来る。上で得た所望の
菌株を培養し、常法により組み換えプラスミドを分離し
、これを野性型Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入するこ
とによってグルコース燐酸化活性の増強した菌株を得る
ことが出来る。この菌株は、常法に従って培養すること
ができるが、グルコース濃度を１重量％に設定した培地
を使用し、２５〜３０℃で２０〜３０時間培養すると、
グルコース燐酸化活性の高い培養菌を得ることかできる
。
この様にして培養した後、集洗菌し、破砕または乾燥な
どの処理を施す。こうして得た培養乾燥処理物は、特開
昭５７−１６６９９２号に記載の方法とほぼ同様の方法
で、ＡＴＰの生産に使用することができる。
どの処理を施す。こうして得た培養乾燥処理物は、特開
昭５７−１６６９９２号に記載の方法とほぼ同様の方法
で、ＡＴＰの生産に使用することができる。
即ち、ＡＴＰの前駆体であるアデノノン５〜３００ｍＭ
、解糖系基質であるグルコース５０〜１５００ｍＭ、硫
酸マグネンウム５〜５ｈＭ、燐酸緩衝液５０ＭＭ〜ｌｏ
ＯｈＭからなる反応液（ｐ１１６．ｏ〜９５）に培養乾
燥処理物を１〜２００１１ｇ／ｌｌｆｔの割合で添加し
、２５〜３７℃で３０分〜９時間、振盪又は静置して反
応させることにより、好収率でＡＴＰ並びにエタノール
を製造することができる。
、解糖系基質であるグルコース５０〜１５００ｍＭ、硫
酸マグネンウム５〜５ｈＭ、燐酸緩衝液５０ＭＭ〜ｌｏ
ＯｈＭからなる反応液（ｐ１１６．ｏ〜９５）に培養乾
燥処理物を１〜２００１１ｇ／ｌｌｆｔの割合で添加し
、２５〜３７℃で３０分〜９時間、振盪又は静置して反
応させることにより、好収率でＡＴＰ並びにエタノール
を製造することができる。
上記の培養乾燥処理物は、破砕した細胞をそのまま乾燥
したものであるが、この他、破砕した細胞から遠心分離
で粗酵素液を抽出したもの（無細胞抽出液）および菌体
をそのまま適当な担体に担持させたもの（固定化菌体）
も同様にして使用することができる。本明細書に於いて
、培養処理物なる用語はこれらの全てを包括的に表すも
のとする。
したものであるが、この他、破砕した細胞から遠心分離
で粗酵素液を抽出したもの（無細胞抽出液）および菌体
をそのまま適当な担体に担持させたもの（固定化菌体）
も同様にして使用することができる。本明細書に於いて
、培養処理物なる用語はこれらの全てを包括的に表すも
のとする。
以下に実施例を挙げ、本発明の好ましい態様を説明する
。実施例中、特に明記しない限り、％は重量％を表す。
。実施例中、特に明記しない限り、％は重量％を表す。
実施例ｌ
５ａｃｃｈａｒｏ＊ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ（ａ ｔｒｐｌ。
ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ（ａ ｔｒｐｌ。
１ｅｕ２−３，１ｅｕ２−１１２．ｈｉｓ３）をＹＰＤ
培地（ペプトン２％。
培地（ペプトン２％。
酵母エキス１％、グルコース２％）１４中、３０°Ｃで
２４時間振盪培養した。菌体を集洗菌後、５ａｉｔｏ
Ｍｉｕｒ。
２４時間振盪培養した。菌体を集洗菌後、５ａｉｔｏ
Ｍｉｕｒ。
の方法（Ｂｉｏｃｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔｏ、
７２．６１９−６２９（１９６３））により染色体Ｄ
ＮＡ２ｍｇを得た（ただし、溶菌酵素リゾチームをザイ
モリエース５０００（４００μｇ／ＩＩえ）に変更した
。次ぎに、大腸菌由来のアンピノリン支びテトラサイク
リン耐性遺伝子を保持しているプラスミドＤＮＡｐＢＲ
３２２Ｊ母由来の２μ彌プラスミドＤＮＡの一部および
酵母染色体ＤＮＡのロイノン合成能遺伝子（ｌｅｕ２）
からなるプラスミドＤＩＩＡ ＹＥｐ１３を保持したＥ
、ｃｏｌｉ Ｃ６００をＬ−培地（ペプトン１％、酵母
エキス０５％、グルコース０．１％、塩化ナトリウム０
５％、ｐＨ７，２）１．９で培養し、ＯＤ（６１０ｎｍ
）がｏ、ｓ〜ｏ６になった時点で２００μｇ／ｌｌｆｔ
、のクロラムフェニコールを添加し、３７℃で１５時間
培養を続けた。菌体を集菌洗浄後、リゾチーム及びドデ
シル硫酸ナトリウムで溶菌させ、３５０ＧＯｒ −ｐ
−ｍで１時間遠心して上清を得た。
７２．６１９−６２９（１９６３））により染色体Ｄ
ＮＡ２ｍｇを得た（ただし、溶菌酵素リゾチームをザイ
モリエース５０００（４００μｇ／ＩＩえ）に変更した
。次ぎに、大腸菌由来のアンピノリン支びテトラサイク
リン耐性遺伝子を保持しているプラスミドＤＮＡｐＢＲ
３２２Ｊ母由来の２μ彌プラスミドＤＮＡの一部および
酵母染色体ＤＮＡのロイノン合成能遺伝子（ｌｅｕ２）
からなるプラスミドＤＩＩＡ ＹＥｐ１３を保持したＥ
、ｃｏｌｉ Ｃ６００をＬ−培地（ペプトン１％、酵母
エキス０５％、グルコース０．１％、塩化ナトリウム０
５％、ｐＨ７，２）１．９で培養し、ＯＤ（６１０ｎｍ
）がｏ、ｓ〜ｏ６になった時点で２００μｇ／ｌｌｆｔ
、のクロラムフェニコールを添加し、３７℃で１５時間
培養を続けた。菌体を集菌洗浄後、リゾチーム及びドデ
シル硫酸ナトリウムで溶菌させ、３５０ＧＯｒ −ｐ
−ｍで１時間遠心して上清を得た。
尚、Ｅ、ｃｏｌｉ ６００株はｒＴｈｅ Ｅ、ｃｏｌｉ
Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ Ｄｅｐｔ
、ｏｆ ＨｕＩＩｌａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３１０
Ｃｅｄｅｒ ５ｏｒｅｅｎ、Ｎｅｖ Ｈａｖｅｎ、Ｃｏ
ｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、０６５１Ｇ、Ｕ、Ｓ、Ａ、 Ｊの
Ｂａｒｂａｒａ Ｂａｃｈ繭ａｎｎ博士から誰でも譲渡
を受けることができる。次いで上清にフェノール／クロ
ロホルム混合液（ｌｖｏｌ：ｌ ＶＯＩ）を等量加えて
攪拌し、遠心しく１００００ｒ・ｐ−請ｌＯ分）、タン
パク等を除き、３７℃においてリボ核酸分解酵素で３時
間処理し、次いでセンウムクロリド・エチジウムプロミ
ド平衡密度勾配遠心を３６０ＯＯｒ −ｐ −ｍ（４８
時間、２０℃）で行い、ＹＥｐ１３プラスミド１ｍｇを
得た。先に得た染色体ＤＮＡ２ｍｇを制限酵素５ａｕ３
＾１ （１００）で３０分間処理して部分分解し、得ら
れたＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にかけ、分子量７
．Ｏｋｂ程度のＤＩＩＡをゲルから抽出した。
Ｇｅｎｅｔｉｃ ５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ Ｄｅｐｔ
、ｏｆ ＨｕＩＩｌａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３１０
Ｃｅｄｅｒ ５ｏｒｅｅｎ、Ｎｅｖ Ｈａｖｅｎ、Ｃｏ
ｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、０６５１Ｇ、Ｕ、Ｓ、Ａ、 Ｊの
Ｂａｒｂａｒａ Ｂａｃｈ繭ａｎｎ博士から誰でも譲渡
を受けることができる。次いで上清にフェノール／クロ
ロホルム混合液（ｌｖｏｌ：ｌ ＶＯＩ）を等量加えて
攪拌し、遠心しく１００００ｒ・ｐ−請ｌＯ分）、タン
パク等を除き、３７℃においてリボ核酸分解酵素で３時
間処理し、次いでセンウムクロリド・エチジウムプロミ
ド平衡密度勾配遠心を３６０ＯＯｒ −ｐ −ｍ（４８
時間、２０℃）で行い、ＹＥｐ１３プラスミド１ｍｇを
得た。先に得た染色体ＤＮＡ２ｍｇを制限酵素５ａｕ３
＾１ （１００）で３０分間処理して部分分解し、得ら
れたＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にかけ、分子量７
．Ｏｋｂ程度のＤＩＩＡをゲルから抽出した。
一方、プラスミドＹＥｐｌａ ＤＮＡ１ｍｇを制限酵素
Ｂａｍ Ｉ（Ｉ（１００）で完全に切断させ、セルフラ
イゲーションを防ぐためにアルカリフォスファターゼ処
理をした。
Ｂａｍ Ｉ（Ｉ（１００）で完全に切断させ、セルフラ
イゲーションを防ぐためにアルカリフォスファターゼ処
理をした。
さらに両反応液を各々６５℃で５分間加熱処理した後、
両反応液をすぐさま混合し、Ｔ、フ７−ノ由来のＤＮＡ
リガーゼを用い、４℃で１６時間結合反応を行った。次
いで反応液に２倍容の冷エタノール（−２０℃）を加え
、−２０℃で一夜放置後１００００ｒ−ｐ ・ｍて１０
分間遠心して沈澱を集め、これを１０ｍＭ トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）０．４ａＺに溶解してＤＮＡ溶
液とした。糖源をグルコースの代わりにガラクトースと
したＹＰ−ガラクトース培地１００ｉＪＪ中、Ｓ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＹ２＋５（グルコース資化能欠損
株）を４ＸＩＯ”細胞に達するまで成育させ、集菌洗浄
後、酢酸ナトリウム１００ｍＭを含むトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７、５）に＠濁させ、３０℃で１時間保持した。次い
でこれに、先に調製した０、４ｍ、ｉのＤＮＡを加え、
３０℃でさらに３０分間保持し、その後ポリエチレング
リコール４０００を等量加え、すぐさま３０℃で１時間
保持した後、４２℃で５分間のヒートノヨブクを与えた
。次いで３００Ｏｒ・ｐ−ｍで遠心して沈澱を集め、菌
体をトリブトフ７ノ、ヒスチジンおよびメチオニンを含
むＳＤ最少培地（イーストナイトロノエノヘース０．６
７％、グルコース２％）に塗布し、３０℃で４日間培養
した。生じたコロニーの内、生育の早いコロニーをグル
コース資化能回復株として選択した。次に得られた形質
転換株１１株のグルコース燐酸化活性とフルクトース燐
酸化活性比から、ヘキソキナーゼ遺伝子を含む形質転換
体５Ｙ２１５／ｐＹ旧とグルコキナーゼ遺伝子を含む形
質転換体ＳＹ２１５／ ｐＹＧｌを得た。次に目０らの
方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１１５３．１６５（１９８
３））により、酵母から得られたプラスミドを大腸菌に
取り込ませた後、ＹＥｐｌａＤＮ＾を抽出した時と同様
の操作で、両形質転換体（ＳＹ２１５／ｐＹ旧、ＳＹ２
１５／ｐＹＧ １ ）からｌ）Ｙ旧およびｐｙｃｔプラ
スミドＤＮＡを抽出した（ｌＮの培養から各々ＩＤづつ
）。このＤＮＡをＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＫＤ−
５Ｄ−Ｈに取り込ませ、トリプト７７ン及びヒスチジン
を含むＳＤ培地で培養し、生じたコロニーから形質転換
株Ｓ、ｃｓｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹ
ｌｌｌ及びＳ、ｃｓｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄｌ［１）−５
Ｄ−１１／ｐＹＣＩを取得した。
両反応液をすぐさま混合し、Ｔ、フ７−ノ由来のＤＮＡ
リガーゼを用い、４℃で１６時間結合反応を行った。次
いで反応液に２倍容の冷エタノール（−２０℃）を加え
、−２０℃で一夜放置後１００００ｒ−ｐ ・ｍて１０
分間遠心して沈澱を集め、これを１０ｍＭ トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）０．４ａＺに溶解してＤＮＡ溶
液とした。糖源をグルコースの代わりにガラクトースと
したＹＰ−ガラクトース培地１００ｉＪＪ中、Ｓ、ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＹ２＋５（グルコース資化能欠損
株）を４ＸＩＯ”細胞に達するまで成育させ、集菌洗浄
後、酢酸ナトリウム１００ｍＭを含むトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７、５）に＠濁させ、３０℃で１時間保持した。次い
でこれに、先に調製した０、４ｍ、ｉのＤＮＡを加え、
３０℃でさらに３０分間保持し、その後ポリエチレング
リコール４０００を等量加え、すぐさま３０℃で１時間
保持した後、４２℃で５分間のヒートノヨブクを与えた
。次いで３００Ｏｒ・ｐ−ｍで遠心して沈澱を集め、菌
体をトリブトフ７ノ、ヒスチジンおよびメチオニンを含
むＳＤ最少培地（イーストナイトロノエノヘース０．６
７％、グルコース２％）に塗布し、３０℃で４日間培養
した。生じたコロニーの内、生育の早いコロニーをグル
コース資化能回復株として選択した。次に得られた形質
転換株１１株のグルコース燐酸化活性とフルクトース燐
酸化活性比から、ヘキソキナーゼ遺伝子を含む形質転換
体５Ｙ２１５／ｐＹ旧とグルコキナーゼ遺伝子を含む形
質転換体ＳＹ２１５／ ｐＹＧｌを得た。次に目０らの
方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１１５３．１６５（１９８
３））により、酵母から得られたプラスミドを大腸菌に
取り込ませた後、ＹＥｐｌａＤＮ＾を抽出した時と同様
の操作で、両形質転換体（ＳＹ２１５／ｐＹ旧、ＳＹ２
１５／ｐＹＧ １ ）からｌ）Ｙ旧およびｐｙｃｔプラ
スミドＤＮＡを抽出した（ｌＮの培養から各々ＩＤづつ
）。このＤＮＡをＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＫＤ−
５Ｄ−Ｈに取り込ませ、トリプト７７ン及びヒスチジン
を含むＳＤ培地で培養し、生じたコロニーから形質転換
株Ｓ、ｃｓｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹ
ｌｌｌ及びＳ、ｃｓｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄｌ［１）−５
Ｄ−１１／ｐＹＣＩを取得した。
所望の組み換えプラスミドを大腸菌に取り込ませＬ−ブ
ロス（グルコース０．２％、ポリペプトン１％。
ロス（グルコース０．２％、ポリペプトン１％。
イーストエフトラクト０．５％、ＮａＣ１０，５％アン
ビンリン２０μｓ／ｓ Ｉ、を含む）で培養し、常法に
よりプラスミドを分離し、制限分析によりその構造を確
認した。プラスミドＤＮＡｐＹ旧は分子量２２．７ｋｂ
、プラスミドＤＮＡｐＹＧ１は分子量１５．７ｋｂであ
った。プラスミドルｙ旧及びｐｙｃｔの制限地図をそれ
ぞれ第１図および第２図に示す。図中、白ヌキ環状部は
酵母由来の染色体ＤＩＩＡであり、ＹＥｐ１３ＤＮＡ由
来のＬｅｕ２遺伝子はＬＥＵ２で示した。黒ベタ環状部
は２μｍＤＮＡ由来であり、線で示した部分はｐＢＲ３
２２であることを示している。
ビンリン２０μｓ／ｓ Ｉ、を含む）で培養し、常法に
よりプラスミドを分離し、制限分析によりその構造を確
認した。プラスミドＤＮＡｐＹ旧は分子量２２．７ｋｂ
、プラスミドＤＮＡｐＹＧ１は分子量１５．７ｋｂであ
った。プラスミドルｙ旧及びｐｙｃｔの制限地図をそれ
ぞれ第１図および第２図に示す。図中、白ヌキ環状部は
酵母由来の染色体ＤＩＩＡであり、ＹＥｐ１３ＤＮＡ由
来のＬｅｕ２遺伝子はＬＥＵ２で示した。黒ベタ環状部
は２μｍＤＮＡ由来であり、線で示した部分はｐＢＲ３
２２であることを示している。
プラスミドルＹ旧およびｐｙｃｔはいずれら酵母ＤＫＤ
−５Ｄ−Ｈに導入されて工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されており（Ｗ託日：昭和５９年７月２６日）
、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−７７４７およびＦＥＲＮ Ｐ
−７７４６で人手可能であり、プラスミドルＹ旧および
ｐＹＧｌの供給源として利用することができる。一方、
これらの菌株は、酵母ＤＫＤ −５Ｄ−Ｈの供給源とし
ても使用し得る。すなわち、これらの寄託菌からＤＩＤ
−５０−Ｈ株を得るには、まずＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹ
旧又はＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／１）ＹＧＩをＹＰＤ培地（イ
ーストエクストラクト１％、ポリペプトン２％、グルコ
ース２％）に移植し、３０℃で４８時間培養後、滅菌水
で２回洗浄し、菌濃度が１０’細胞／ｍｉ、となる様に
滅菌水で懸濁する。そして同じ寒天を含むＹｆ’ｌ）培
地プレートに０．１ｍ、［塗布し、生育してくるコロニ
ーを２種類のＳＤ最小培地（Ａ：イーストナイトロノエ
ンベース０６７％、グルコース２％、トリプトファン２
０μｇ／＠ｉ、、ヒスチジン２０μｇ／ｓ ｉ、を含む
培地、Ｂ：＾培地にさらにロイノンを２０量ｇ／ｍ ｉ
添加した培地）にレプリカし、５Ｄ−Ｂ培地に生育しＳ
叶＾培地に生育しないコロニーを選択する。このコロニ
ーがプラスミドｐＹＨ１又はｐＹＧｌを保持しないＤＫ
Ｄ−５Ｄ−Ｈ株である。
−５Ｄ−Ｈに導入されて工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されており（Ｗ託日：昭和５９年７月２６日）
、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−７７４７およびＦＥＲＮ Ｐ
−７７４６で人手可能であり、プラスミドルＹ旧および
ｐＹＧｌの供給源として利用することができる。一方、
これらの菌株は、酵母ＤＫＤ −５Ｄ−Ｈの供給源とし
ても使用し得る。すなわち、これらの寄託菌からＤＩＤ
−５０−Ｈ株を得るには、まずＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹ
旧又はＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／１）ＹＧＩをＹＰＤ培地（イ
ーストエクストラクト１％、ポリペプトン２％、グルコ
ース２％）に移植し、３０℃で４８時間培養後、滅菌水
で２回洗浄し、菌濃度が１０’細胞／ｍｉ、となる様に
滅菌水で懸濁する。そして同じ寒天を含むＹｆ’ｌ）培
地プレートに０．１ｍ、［塗布し、生育してくるコロニ
ーを２種類のＳＤ最小培地（Ａ：イーストナイトロノエ
ンベース０６７％、グルコース２％、トリプトファン２
０μｇ／＠ｉ、、ヒスチジン２０μｇ／ｓ ｉ、を含む
培地、Ｂ：＾培地にさらにロイノンを２０量ｇ／ｍ ｉ
添加した培地）にレプリカし、５Ｄ−Ｂ培地に生育しＳ
叶＾培地に生育しないコロニーを選択する。このコロニ
ーがプラスミドｐＹＨ１又はｐＹＧｌを保持しないＤＫ
Ｄ−５Ｄ−Ｈ株である。
実施例２
ＹＰＤ培地５ｈＪｌにＳ、 ｃｓｒｅｖｉｓｉａｅ Ｄ
ＫＤ−５Ｄ−Ｈを２×１［１’細胞／ｍｚに達するまで
培養し、集菌する。集菌は、殺菌したプラスチック製遠
心管を用いＪＯＯＯｒ’ｐ’ｍで１１１分間遠心して行
う。次に等量のｌＯａＭＮａＣｌで洗浄し、遠心でＮａ
Ｃ１液を除いたあと、ｌ／１０量の１．’ｈＭ ＥＤＴ
Ａを含むｌｈ＋Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐｉ（７，５）
に懸濁する。この懸濁液の０．５ｍｌを等量の０．１Ｍ
リチウムアセテート水溶液に加え、１時間、３０℃で振
盪処理上その懸濁液の１／１０１を、別の殺菌されたチ
ューブに移し、ＩＯμｇのプラスミドｐＹｔｌｌおよび
プラスミドｐＹＧ１を夫々加えて３０℃で３０分間放置
する。
ＫＤ−５Ｄ−Ｈを２×１［１’細胞／ｍｚに達するまで
培養し、集菌する。集菌は、殺菌したプラスチック製遠
心管を用いＪＯＯＯｒ’ｐ’ｍで１１１分間遠心して行
う。次に等量のｌＯａＭＮａＣｌで洗浄し、遠心でＮａ
Ｃ１液を除いたあと、ｌ／１０量の１．’ｈＭ ＥＤＴ
Ａを含むｌｈ＋Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐｉ（７，５）
に懸濁する。この懸濁液の０．５ｍｌを等量の０．１Ｍ
リチウムアセテート水溶液に加え、１時間、３０℃で振
盪処理上その懸濁液の１／１０１を、別の殺菌されたチ
ューブに移し、ＩＯμｇのプラスミドｐＹｔｌｌおよび
プラスミドｐＹＧ１を夫々加えて３０℃で３０分間放置
する。
次に等量の７０％ＰＥＧ−４０００の水溶液を加えて懸
濁し、３０℃で１時間放置したのち、４２℃で５分間の
熱パルスを付与し、トリプトファンおよびヒスチジンを
含むＳＤ最少培地で生育させ、プラスミドｐｙｎｔおよ
びプラスミドｐＹＧｌをそれぞれＳ、 ｃｓｒｅｖｉｓ
ｉａｅ ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈに導入した菌体を選択する。
濁し、３０℃で１時間放置したのち、４２℃で５分間の
熱パルスを付与し、トリプトファンおよびヒスチジンを
含むＳＤ最少培地で生育させ、プラスミドｐｙｎｔおよ
びプラスミドｐＹＧｌをそれぞれＳ、 ｃｓｒｅｖｉｓ
ｉａｅ ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈに導入した菌体を選択する。
得られた形質転漠菌をまずＳＤ（イーストナイトロジエ
ンベース０６７％、グルコース２％、トリプトファン２
０ｕｇ／ｍ、ｉ、ヒスチジン２０μｇ／ｄ）の液体培地
に接種し、３０℃で２４時間振盪培養する。その後１０
０倍容のＹＰＤ（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、
グルコース２％）培地に移し、３０℃で１２時間振盪培
養する。培養終了後集洗菌し、１０ｄのｋｌｇｃＬを含
む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁
し、菌体を破砕した後遠心分離（１０００００Ｘ ｇ、
３０分）シ、その上清を用いてヘキソキナーゼ及びグ
ルコキナーゼ活性［注目を測定した。
ンベース０６７％、グルコース２％、トリプトファン２
０ｕｇ／ｍ、ｉ、ヒスチジン２０μｇ／ｄ）の液体培地
に接種し、３０℃で２４時間振盪培養する。その後１０
０倍容のＹＰＤ（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、
グルコース２％）培地に移し、３０℃で１２時間振盪培
養する。培養終了後集洗菌し、１０ｄのｋｌｇｃＬを含
む５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁
し、菌体を破砕した後遠心分離（１０００００Ｘ ｇ、
３０分）シ、その上清を用いてヘキソキナーゼ及びグ
ルコキナーゼ活性［注目を測定した。
対照として、ヘキソキナーゼ及びグルコキナーゼ欠損株
である５Ｙ２１５についても同様の操作を行い、ヘキソ
キナーゼ及びグルコキナーゼ活性を比較した。結果を以
下の表１に、挙げる。
である５Ｙ２１５についても同様の操作を行い、ヘキソ
キナーゼ及びグルコキナーゼ活性を比較した。結果を以
下の表１に、挙げる。
菌株 糖燐酸化活性１）ＤＩＤ
〜５Ｄ−）１ Ｇ、３５
６ ０．５１３ １．４４ＰＩＴ８Ｃ
（ｈｘｋ２．ｇｌｋの欠損株） Ｑ、１４７
０．４２５ ２．８９Ｐ２Ｔ２２Ｄ（ｈｘｋ
ｌ、ｇｌｋの欠損株）Ｇ、１７５ ０ＪＩ１ｇ
１．７６［１１０８（ｈｘｋｌ、ｈｘｋ２の欠
損株） １１．１０２ ０．０１２５
Ｇ、１２ＳＹ２１５（ｈｘｋｌ、）ｕｋ２．ｇｌｋ
の欠損株） ０．００Ｇ３ ０．００２４ −
５Ｙ２１５／ｐＹ１１１ ０．６
８０ ＋、１５９ １．７０ＳＹ２１
５／ｐＹＧｌ Ｏ，７０４０，
０１７Ｇ、０３ＤＫＤ〜５０４／ｐＹＨＩ
ｆｌ、７３ｇ ０．９７３
１Ｊ２３ＤＫＤ−５０−ｔｌ／ｐＹＧｌ
Ｏ，８４８０，４２５０，５０２注１：ヘキソナ
ーゼ活性及びグルコキナーゼ活性はＰａｒｒｙらの方法
で測定した（Ｊ、Ｂｌｏｃｈｅｓ、、（１９６６）９９
．２６６）。
〜５Ｄ−）１ Ｇ、３５
６ ０．５１３ １．４４ＰＩＴ８Ｃ
（ｈｘｋ２．ｇｌｋの欠損株） Ｑ、１４７
０．４２５ ２．８９Ｐ２Ｔ２２Ｄ（ｈｘｋ
ｌ、ｇｌｋの欠損株）Ｇ、１７５ ０ＪＩ１ｇ
１．７６［１１０８（ｈｘｋｌ、ｈｘｋ２の欠
損株） １１．１０２ ０．０１２５
Ｇ、１２ＳＹ２１５（ｈｘｋｌ、）ｕｋ２．ｇｌｋ
の欠損株） ０．００Ｇ３ ０．００２４ −
５Ｙ２１５／ｐＹ１１１ ０．６
８０ ＋、１５９ １．７０ＳＹ２１
５／ｐＹＧｌ Ｏ，７０４０，
０１７Ｇ、０３ＤＫＤ〜５０４／ｐＹＨＩ
ｆｌ、７３ｇ ０．９７３
１Ｊ２３ＤＫＤ−５０−ｔｌ／ｐＹＧｌ
Ｏ，８４８０，４２５０，５０２注１：ヘキソナ
ーゼ活性及びグルコキナーゼ活性はＰａｒｒｙらの方法
で測定した（Ｊ、Ｂｌｏｃｈｅｓ、、（１９６６）９９
．２６６）。
注２ グルコースに対する燐酸化活性とフルクトースに
対する燐酸化活性の比を示す。ヘキソナーゼ１．ヘキソ
ナーゼ２゜グルコキナーゼの酵素は特有の活性比を持つ
。
対する燐酸化活性の比を示す。ヘキソナーゼ１．ヘキソ
ナーゼ２゜グルコキナーゼの酵素は特有の活性比を持つ
。
次いで、Ｉ）Ｋｌ） −５Ｄ−ＩＩ、Ｉ）ＫＤ −５０
−１１／ｌ）Ｙ旧及びＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧ１を、
各種炭素源の濃度を変化させた最少培地で培養した場合
のへキソキナーゼ及びグルコキナーゼ活性を測定したと
ころ、表２の様な結果が得られた。この実験の結果、最
ら活性を上昇させる炭素源はフルクトースで、濃度は１
％であり、これらを含む最少培地で培養するのが好まし
いことがわかった。
−１１／ｌ）Ｙ旧及びＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧ１を、
各種炭素源の濃度を変化させた最少培地で培養した場合
のへキソキナーゼ及びグルコキナーゼ活性を測定したと
ころ、表２の様な結果が得られた。この実験の結果、最
ら活性を上昇させる炭素源はフルクトースで、濃度は１
％であり、これらを含む最少培地で培養するのが好まし
いことがわかった。
炭素源 濃度（％） グルコース燐酸
化活性グルコース １１．５ ０．４０３ ０
．８８３ ０．９０９〃１ Ｇ、４
８２ １＋’、９９Ｇ ＋、０５３〃２
Ｇ、３５３ ０７３６ ＬＩ１
４８ノ＋３０．３３２０．７０１０．８２０〃４
Ｇ、３ｆｉ２ ０．６６３ ０．７６
５フルクトース０．５ 〃ｌ Ｏ，３３６Ｇ、９９５ ０．
９＋５〃２ Ｇ、４９５ ０．７３０
０．９５０〃３ ０．４００ Ｇ、
７３０ ０．１１２８〃４ ０．３０
６ １７０５ Ｇ、１０６マノノース ０
．５ ０．３５３ ０．１１Ｇ６
Ｑ、８２２〃ｌ ＬＪＯＩ ０．８８７
０．ｕ９〃２ ０．３０８ ０．
７３０ ０．１１８１〃３ ０．３５
５ ０．７１７ ０．８Ｇ５〃４
０．３Ｇ５ ０．７０５ ０．７００りｌＪ
セｏ−ルＱ、５ ０．１００ ０．１５６
０．０６７’ ） ０．
１５２ ０．２３２ ０．１５５実施例
３ ＤＩＤ−５Ｄ−）！／ＹＥｐ１３、ＤＫＤ −５Ｄ−ｔ
ｌ／ｐＹ旧およびＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧ＋をそれぞ
れＹＰＤ（グルコース２％、イーストエクストラクト１
％、ポリペプトン２％）培地で実施例２と同じ条件下で
培養し、培養終了後集洗菌し、菌体を２５℃（Ｒ１１６
０％）で−夜乾燥した後さらに真空デンケータ内の五酸
化燐で完全に乾燥させた。
化活性グルコース １１．５ ０．４０３ ０
．８８３ ０．９０９〃１ Ｇ、４
８２ １＋’、９９Ｇ ＋、０５３〃２
Ｇ、３５３ ０７３６ ＬＩ１
４８ノ＋３０．３３２０．７０１０．８２０〃４
Ｇ、３ｆｉ２ ０．６６３ ０．７６
５フルクトース０．５ 〃ｌ Ｏ，３３６Ｇ、９９５ ０．
９＋５〃２ Ｇ、４９５ ０．７３０
０．９５０〃３ ０．４００ Ｇ、
７３０ ０．１１２８〃４ ０．３０
６ １７０５ Ｇ、１０６マノノース ０
．５ ０．３５３ ０．１１Ｇ６
Ｑ、８２２〃ｌ ＬＪＯＩ ０．８８７
０．ｕ９〃２ ０．３０８ ０．
７３０ ０．１１８１〃３ ０．３５
５ ０．７１７ ０．８Ｇ５〃４
０．３Ｇ５ ０．７０５ ０．７００りｌＪ
セｏ−ルＱ、５ ０．１００ ０．１５６
０．０６７’ ） ０．
１５２ ０．２３２ ０．１５５実施例
３ ＤＩＤ−５Ｄ−）！／ＹＥｐ１３、ＤＫＤ −５Ｄ−ｔ
ｌ／ｐＹ旧およびＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧ＋をそれぞ
れＹＰＤ（グルコース２％、イーストエクストラクト１
％、ポリペプトン２％）培地で実施例２と同じ条件下で
培養し、培養終了後集洗菌し、菌体を２５℃（Ｒ１１６
０％）で−夜乾燥した後さらに真空デンケータ内の五酸
化燐で完全に乾燥させた。
アデノシン１３ｈ
８、０）ＩＭ、硫酸マグネノウム７水和物３０ｄを含む
反応液０５ＩＩｌに上記乾燥菌体を１００ｍｇ／ｌｌｌ
えの割合で添加し、２８℃で振盪して反応させる。反応
開始から４時間、６時間、８時間に於ける反応液中の＾
ＴＰ含量を常法により測定した。又乾燥処理によるヘキ
ソキナーゼ及びグルコキナーゼ活性変化ら測定した。
反応液０５ＩＩｌに上記乾燥菌体を１００ｍｇ／ｌｌｌ
えの割合で添加し、２８℃で振盪して反応させる。反応
開始から４時間、６時間、８時間に於ける反応液中の＾
ＴＰ含量を常法により測定した。又乾燥処理によるヘキ
ソキナーゼ及びグルコキナーゼ活性変化ら測定した。
結果を以下の表３に示す。
表３から明らかな様に、安価なアデノシンは、ヘキソキ
ナーゼあるいはグルコキナーゼ遺伝子を導入した菌株に
より、１００％＾ＴＰに変換されていた。
ナーゼあるいはグルコキナーゼ遺伝子を導入した菌株に
より、１００％＾ＴＰに変換されていた。
割敷鯉１
反応組成をグルコースＩＭ，燐酸緩衝液ＩＭ（ｐＨ８．
０）、アデノノン１００ｍＭおよび硫酸マグネンウム７
永和物３０ｍＭとし、乾燥菌体を５０ｍｇ／ｄの割合で
添加するほかは実施例３と同様に操作し、ＡＴＰ含量を
測定した。得られた結果を表４に示す。
０）、アデノノン１００ｍＭおよび硫酸マグネンウム７
永和物３０ｍＭとし、乾燥菌体を５０ｍｇ／ｄの割合で
添加するほかは実施例３と同様に操作し、ＡＴＰ含量を
測定した。得られた結果を表４に示す。
ＡＴＰ生成量（ｓｇ／ｄ） グルコース燐酸化活性
ｌ）菌株 ４時間 ６時間 ８時間
乾燥菌体ｏＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ＹＥｐ１３ ２．０
３ ２．５４ １２．１７ ０．３６
７Ｄ瓢Ｄ−５Ｄ−１１／ｐＹｌｌＩＬ１３８５．９１５
０．７１．３２３１）μモル／分／蛋白質（ａｇ） 表４ ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ＹＥｐ１３− １．５２
２．５４ ４．０６ＤＫＤ−５Ｄ−１１／ｐＹ
ＨＩ １．５５ ３．５５ ２２
．８１ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧＩ １．５０
３．０４ ２１．３０実施例５ グルコースの代わりに種々の解糖系中間体を基質として
用いるほかは実施例３と同様の実験を行った（反応時間
は６時間）。得られた結果を以下の表５に示す。
ｌ）菌株 ４時間 ６時間 ８時間
乾燥菌体ｏＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ＹＥｐ１３ ２．０
３ ２．５４ １２．１７ ０．３６
７Ｄ瓢Ｄ−５Ｄ−１１／ｐＹｌｌＩＬ１３８５．９１５
０．７１．３２３１）μモル／分／蛋白質（ａｇ） 表４ ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ＹＥｐ１３− １．５２
２．５４ ４．０６ＤＫＤ−５Ｄ−１１／ｐＹ
ＨＩ １．５５ ３．５５ ２２
．８１ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧＩ １．５０
３．０４ ２１．３０実施例５ グルコースの代わりに種々の解糖系中間体を基質として
用いるほかは実施例３と同様の実験を行った（反応時間
は６時間）。得られた結果を以下の表５に示す。
表５から明らかな様に、ヘキソキナーゼあるいはグルコ
キナーゼ活性を強化した菌体を用いると、安価なグルコ
ースから満足すべきＡＴＰ生産量が得られることが判明
した。
キナーゼ活性を強化した菌体を用いると、安価なグルコ
ースから満足すべきＡＴＰ生産量が得られることが判明
した。
実施例６
酵母の場合、解糖系を利用してＡＴＰを生産させると、
必然的にエタノールも生産されることになる。そこで、
プラスミドルＹ旧あるいはｐＹＧＩを導入した株でのエ
タノール生成量を測定した。即ち、グルコース１０％、
ＫＨｔＰＯｔＯ：１％、Ｍｇ５Ｏ，０４％、アスパラギ
ン０２５％および乾燥菌体２ｍｇ／ｍ ｆｌを用い、３
０°Ｃで振盪することなく反応させた。常法通り、反応
系の重量減少からエタノール生成量を計算した（重量減
少法）。得られた結果を以下の表６に示す。
必然的にエタノールも生産されることになる。そこで、
プラスミドルＹ旧あるいはｐＹＧＩを導入した株でのエ
タノール生成量を測定した。即ち、グルコース１０％、
ＫＨｔＰＯｔＯ：１％、Ｍｇ５Ｏ，０４％、アスパラギ
ン０２５％および乾燥菌体２ｍｇ／ｍ ｆｌを用い、３
０°Ｃで振盪することなく反応させた。常法通り、反応
系の重量減少からエタノール生成量を計算した（重量減
少法）。得られた結果を以下の表６に示す。
解糖系中間体（ｍ ＾ＴＰ生成！ｌ（ａｇ
／ｍｉ、）ＤＩＤ−５Ｄ−１１／ＹＥｐ１３ ＤＩＤ−
５０−１１／ｐＹＨＩ ＤＩＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧｌグ
ルコース ２．５４ ６５．９１
５０．７１グルコース−６−燐酸 ８０．
３１ ６４．８１ ８５．２０フルク
ト−スート燐酸 ６Ｇ、００ ６５．０５
Ｈ，９ａ’フルクト−２−１，６Ｊ酸６５．９０
８２．０１ ６５．９０表６ ＤＩＤ−５Ｄ４／ＹＥｐ１３ Ｂ １４
２２ ４６Ｄ［Ｄ−５Ｄ−１１／ｐＹＩ
Ｉ ２０ ２７ ４０ ７５ＤＩＤ−
５０−１１／ＩＩＹＧＩ ＩＩ Ｉ８
２８ ５６表６から明らかな様に、＾ＴＰ生成量
の増加した菌体はエタノール生成量も増加することが明
らかとなった。
／ｍｉ、）ＤＩＤ−５Ｄ−１１／ＹＥｐ１３ ＤＩＤ−
５０−１１／ｐＹＨＩ ＤＩＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧｌグ
ルコース ２．５４ ６５．９１
５０．７１グルコース−６−燐酸 ８０．
３１ ６４．８１ ８５．２０フルク
ト−スート燐酸 ６Ｇ、００ ６５．０５
Ｈ，９ａ’フルクト−２−１，６Ｊ酸６５．９０
８２．０１ ６５．９０表６ ＤＩＤ−５Ｄ４／ＹＥｐ１３ Ｂ １４
２２ ４６Ｄ［Ｄ−５Ｄ−１１／ｐＹＩ
Ｉ ２０ ２７ ４０ ７５ＤＩＤ−
５０−１１／ＩＩＹＧＩ ＩＩ Ｉ８
２８ ５６表６から明らかな様に、＾ＴＰ生成量
の増加した菌体はエタノール生成量も増加することが明
らかとなった。
実施例７
実施例３の＾ＴＰ製造反応を、反応液ｌｌ］ＩＲ１，を
用いて６時間行った。次いで反応液を加熱して反応を止
め、反応液を？過し、シ涙液に濃塩酸を加えて１１１１
３．５に調節した後活性炭カラムに通した。カラムを水
洗し、次いで１．５％のアンモニアを含む５％メチルエ
チルケトンを通して吸着物を溶出した。溶出液を濃縮し
、陰イオン交換樹脂Ｄｏｖｅｘ Ｈｄ−）カラムに通し
てＡＴＰを吸着させた。水洗後塩酸と食塩水のａ液を通
して溶出し、ＡＴＰ画分を集めて濃縮した。
用いて６時間行った。次いで反応液を加熱して反応を止
め、反応液を？過し、シ涙液に濃塩酸を加えて１１１１
３．５に調節した後活性炭カラムに通した。カラムを水
洗し、次いで１．５％のアンモニアを含む５％メチルエ
チルケトンを通して吸着物を溶出した。溶出液を濃縮し
、陰イオン交換樹脂Ｄｏｖｅｘ Ｈｄ−）カラムに通し
てＡＴＰを吸着させた。水洗後塩酸と食塩水のａ液を通
して溶出し、ＡＴＰ画分を集めて濃縮した。
ａ輸液に５倍量のプロパツールを加えてＡＴＰの結晶を
析出させた。ＡＴＰの収憬：５８０Ｂ（収率：９１％）
析出させた。ＡＴＰの収憬：５８０Ｂ（収率：９１％）
第１図および第２図はそれぞれプラスミドｐＹＨ１およ
びプラスミドｐＹＧ１の制限地図を示す模式図である。 ［１図 三 で −一 第２図 手続補正書、ヵよ） 昭和６０年 ４月２３日 昭和５９年特許願第 ２４７８０２ 万３、補正
をする者 ４、代理人 （ＧｅｎｅＮとＭＩ丁すみ− ７、補正の内容 明細書中、下記の箇所を補ｉ１’、 ４°る。 イ）特許請求の範囲の砺 別紙の通り 口）発明の詳細な説明の欄 Ｉ）第６頁第１７行、第１頁第３行、第１頁第３行、第
９頁第１行、第２〜３行、第４行、第８〜９行、第１Ｉ
行、第１０頁ｔＪ１０行、第１４頁第３行、第１５頁第
７行、第９行、第１０行、第１７頁第５行、および末行
記載のｒＳ、 ｃｅｒｅｖｌ−ｓｉａｅＪを、［Ｓ、セ
レビンｚ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｊと補正
する。 ２）第１頁第３行記載のｒＢ １ｏｃｈｅｓ、 Ｂ １
ｏｐｈｙｓ、 ＡｃｒａＪを、［バイオケミカル・アン
ド・パイオフイノカル・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｔ Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ）Ｊと補正する。 ３）第８頁第４〜第５行記載のｒＢｒｏａｃｈ、 −＝
ＧｅｎｅＪを、「ブローチ、Ｊ、Ｒ，、ストラサーン。 Ｊ、Ｎおよびヒフゲス、 Ｊ、Ｂ、（Ｂｒｏａｃｈ、
Ｊ、Ｒ１５ＬｒａＬｈｅｒｎ、 Ｊ、Ｎ、、 Ｈｉｃｋ
ｅｓ、 Ｊ、Ｂ、）： ノー７＋ａ）ｆｆｉ＋９百２ｆ
ｌ Ｑ Ｇ； Ｌ’ ＋ｉｌのｒ ｒＪ １ｎｒｈａａ
ｎ ｔｎｎｈｎｎ−（Ｎ ａｔｕｒｅ’）Ｊと補正
する。 ５）第８頁下ｑ２？テ記載のｒＪ 、 Ｈａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、 Ｊを、「ジャーナル・オフ・バクテリオロノー
（ＪＢ ａｃｔｅｒｉｏｌ 月と補正する。 ６）第９頁第６行、第１２行および第１６行記載のｒＰ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｊを、
【プロン−ディンゲス・才プ・ナノヨナル・アヵデミイ
・オフ・サイエンスイズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄＳｃｉ、 ）Ｊと補正する。 ７）第９頁第２行記載ノｒａｎｄ１０ｒＪを、「および
／または」と補正する。 ８）第９頁第１０行記載のｒＭｏｌｅｃ、 Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｉ Ｊを、「モレキュラー・アンド・フェネテ
ル・フェネティツクス（Ｍｏｌｅｃ、 Ｇｅｍ、 Ｇｅ
ｎｅｔ、 ）Ｊと補正する。 ９）第１Ｉ頁下第２行記載のｒ Ｓ ａｃｃｈａｒｏｓ
ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪを、［ザッカロミヶス
・セレヒノエ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ ｃｃ
ｒｅｖｉｓｉａｃ）Ｊと捕１１．４−る。 ＩＵ 舗１ ｒ ｔ ｎ９Ｓ Ｊ ＩＴ＆＄ｕ
、、＋１ ｏ ＋ｏｃ＋＋ｅ閘、 ｕ ＋ｕｐｕオ
フイノカル・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｓ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、 Ａｃ【ａ）」と補正する。 ＩＩ） 第１４頁第３行〜末行記載のｒＴｈｅ ・−
Ｃｏｎｎｅｃｔ １ｃｕＬ Ｊを、［ノーＥ コリ・
ノエネティック・ストック・センター・デパートメノト
・オフ・ヒフ−マノ・フェネティツクス、３１０ セグ
ー・ストリート・二ニー・ヘブン・コネクティカッ）（
Ｔｈｅ Ｅ、 ｃｏｌｉ ＣｅｎｅＬｉｃ ５Ｌ
ｏｃｋ ＣｅｎｔｅｒＤｅｐｔ、 ｏｒ Ｈｕｔｍ
ａｎ ＧｅｎｅｔＩｃｓ、 ３１０ Ｃｅ１ｄｅｒ
ｓｔｒｅｅｔ、 Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、 Ｃｏｎｎｅｃ
ｔ：ｃｕｔ月七浦正する。 以上 （別 紙） ２、特許請求の範囲 １解糖系酵素の存在下、アデノツノ−５′−三燐酸前駆
体および解糖系基質から、解糖系を利用してアデノシン
−５′−三燐酸を製造する方法であって、該解糖系酵素
としてヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼ活
性が高められた酵母の培養処理物中に含まれる該解糖系
酵素を使Ｉｌ＋することを特徴とする方法。 ２解糖系酵素の存在下、解糖系基質から、解糖系を利用
してエタノールを製造する方法であって、該解糖系酵素
としてヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼ活
性が旨められた酵母の培養処理物中に含まれる該解糖系
酵素を使用することを特徴とする方法。 ３ヘキソキナーゼ活性および／またはグルコキナーゼ活
性か高められた酵母が、ヘキソキナーゼおよび／または
グルコキナーゼ暗号遺伝子を担持しているプラスミドの
導入によって杉質転換された酵母である第１項に記載の
方法。 ４、プラスミド ｐＹ旧。 ５プラスミドｐＹＧ＋。 ６、サッカａミケス・セレビンよりＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐ
Ｙ旧。 ７す１力【Ｊミケス・セレビノよりＫＤ−５Ｄ−Ｉｆ／
ｐＹＧｌ。
びプラスミドｐＹＧ１の制限地図を示す模式図である。 ［１図 三 で −一 第２図 手続補正書、ヵよ） 昭和６０年 ４月２３日 昭和５９年特許願第 ２４７８０２ 万３、補正
をする者 ４、代理人 （ＧｅｎｅＮとＭＩ丁すみ− ７、補正の内容 明細書中、下記の箇所を補ｉ１’、 ４°る。 イ）特許請求の範囲の砺 別紙の通り 口）発明の詳細な説明の欄 Ｉ）第６頁第１７行、第１頁第３行、第１頁第３行、第
９頁第１行、第２〜３行、第４行、第８〜９行、第１Ｉ
行、第１０頁ｔＪ１０行、第１４頁第３行、第１５頁第
７行、第９行、第１０行、第１７頁第５行、および末行
記載のｒＳ、 ｃｅｒｅｖｌ−ｓｉａｅＪを、［Ｓ、セ
レビンｚ（Ｓ 、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｊと補正
する。 ２）第１頁第３行記載のｒＢ １ｏｃｈｅｓ、 Ｂ １
ｏｐｈｙｓ、 ＡｃｒａＪを、［バイオケミカル・アン
ド・パイオフイノカル・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｔ Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ）Ｊと補正する。 ３）第８頁第４〜第５行記載のｒＢｒｏａｃｈ、 −＝
ＧｅｎｅＪを、「ブローチ、Ｊ、Ｒ，、ストラサーン。 Ｊ、Ｎおよびヒフゲス、 Ｊ、Ｂ、（Ｂｒｏａｃｈ、
Ｊ、Ｒ１５ＬｒａＬｈｅｒｎ、 Ｊ、Ｎ、、 Ｈｉｃｋ
ｅｓ、 Ｊ、Ｂ、）： ノー７＋ａ）ｆｆｉ＋９百２ｆ
ｌ Ｑ Ｇ； Ｌ’ ＋ｉｌのｒ ｒＪ １ｎｒｈａａ
ｎ ｔｎｎｈｎｎ−（Ｎ ａｔｕｒｅ’）Ｊと補正
する。 ５）第８頁下ｑ２？テ記載のｒＪ 、 Ｈａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、 Ｊを、「ジャーナル・オフ・バクテリオロノー
（ＪＢ ａｃｔｅｒｉｏｌ 月と補正する。 ６）第９頁第６行、第１２行および第１６行記載のｒＰ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｊを、
【プロン−ディンゲス・才プ・ナノヨナル・アヵデミイ
・オフ・サイエンスイズ（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄＳｃｉ、 ）Ｊと補正する。 ７）第９頁第２行記載ノｒａｎｄ１０ｒＪを、「および
／または」と補正する。 ８）第９頁第１０行記載のｒＭｏｌｅｃ、 Ｇｅｎ、
Ｇｅｎｅｉ Ｊを、「モレキュラー・アンド・フェネテ
ル・フェネティツクス（Ｍｏｌｅｃ、 Ｇｅｍ、 Ｇｅ
ｎｅｔ、 ）Ｊと補正する。 ９）第１Ｉ頁下第２行記載のｒ Ｓ ａｃｃｈａｒｏｓ
ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪを、［ザッカロミヶス
・セレヒノエ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｃｓ ｃｃ
ｒｅｖｉｓｉａｃ）Ｊと捕１１．４−る。 ＩＵ 舗１ ｒ ｔ ｎ９Ｓ Ｊ ＩＴ＆＄ｕ
、、＋１ ｏ ＋ｏｃ＋＋ｅ閘、 ｕ ＋ｕｐｕオ
フイノカル・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｓ、 Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、 Ａｃ【ａ）」と補正する。 ＩＩ） 第１４頁第３行〜末行記載のｒＴｈｅ ・−
Ｃｏｎｎｅｃｔ １ｃｕＬ Ｊを、［ノーＥ コリ・
ノエネティック・ストック・センター・デパートメノト
・オフ・ヒフ−マノ・フェネティツクス、３１０ セグ
ー・ストリート・二ニー・ヘブン・コネクティカッ）（
Ｔｈｅ Ｅ、 ｃｏｌｉ ＣｅｎｅＬｉｃ ５Ｌ
ｏｃｋ ＣｅｎｔｅｒＤｅｐｔ、 ｏｒ Ｈｕｔｍ
ａｎ ＧｅｎｅｔＩｃｓ、 ３１０ Ｃｅ１ｄｅｒ
ｓｔｒｅｅｔ、 Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、 Ｃｏｎｎｅｃ
ｔ：ｃｕｔ月七浦正する。 以上 （別 紙） ２、特許請求の範囲 １解糖系酵素の存在下、アデノツノ−５′−三燐酸前駆
体および解糖系基質から、解糖系を利用してアデノシン
−５′−三燐酸を製造する方法であって、該解糖系酵素
としてヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼ活
性が高められた酵母の培養処理物中に含まれる該解糖系
酵素を使Ｉｌ＋することを特徴とする方法。 ２解糖系酵素の存在下、解糖系基質から、解糖系を利用
してエタノールを製造する方法であって、該解糖系酵素
としてヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼ活
性が旨められた酵母の培養処理物中に含まれる該解糖系
酵素を使用することを特徴とする方法。 ３ヘキソキナーゼ活性および／またはグルコキナーゼ活
性か高められた酵母が、ヘキソキナーゼおよび／または
グルコキナーゼ暗号遺伝子を担持しているプラスミドの
導入によって杉質転換された酵母である第１項に記載の
方法。 ４、プラスミド ｐＹ旧。 ５プラスミドｐＹＧ＋。 ６、サッカａミケス・セレビンよりＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐ
Ｙ旧。 ７す１力【Ｊミケス・セレビノよりＫＤ−５Ｄ−Ｉｆ／
ｐＹＧｌ。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、解糖系酵素の存在下、アデノシン−５′−三燐酸前
駆体および解糖系基質から、解糖系を利用してアデノシ
ン−５′−三燐酸を製造する方法であって、該解糖系酵
素としてヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼ
活性が高められた酵母の培養処理物中に含まれる該解糖
系酵素を使用することを特徴とする方法。 ２、解糖系酵素の存在下、解糖系基質から、解糖系を利
用してエタノールを製造する方法であって、該解糖系酵
素としてヘキソキナーゼおよび／またはグルコキナーゼ
活性が高められた酵母の培養処理物中に含まれる該解糖
系酵素を使用することを特徴とする方法。 ３、ヘキソキナーゼ活性および／またはグルコキナーゼ
活性が高められた酵母が、ヘキソキナーゼおよび／また
はグルコキナーゼ暗号遺伝子を担持しているプラスミド
の導入によって形質転換された酵母である第１項に記載
の方法。 ４、プラスミドｐＹＨ１。 ５、プラスミドｐＹＧ１。 ６、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＨ１。 ７、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ ＤＫＤ−５Ｄ−Ｈ／ｐＹＧ１。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59247802A JPS61124390A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | アデノシン−５′−三燐酸およびエタノ−ルの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59247802A JPS61124390A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | アデノシン−５′−三燐酸およびエタノ−ルの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61124390A true JPS61124390A (ja) | 1986-06-12 |
Family
ID=17168868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59247802A Pending JPS61124390A (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | アデノシン−５′−三燐酸およびエタノ−ルの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61124390A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6566109B2 (en) | 2001-01-15 | 2003-05-20 | Unitika Ltd. | Gene for thermostable glucokinase, recombinant vector containing the same, transformant containing the recombinant vector and process for producing thermostable glucokinase using the transformant |
| JP2011024500A (ja) * | 2009-07-27 | 2011-02-10 | Toyota Central R&D Labs Inc | 発酵能力が向上された酵母及びその利用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS509873A (ja) * | 1973-06-02 | 1975-01-31 | ||
| JPS53136591A (en) * | 1977-04-28 | 1978-11-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Preparation of adenosine-5'-triphosphoric acid |
-
1984
- 1984-11-22 JP JP59247802A patent/JPS61124390A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS509873A (ja) * | 1973-06-02 | 1975-01-31 | ||
| JPS53136591A (en) * | 1977-04-28 | 1978-11-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Preparation of adenosine-5'-triphosphoric acid |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6566109B2 (en) | 2001-01-15 | 2003-05-20 | Unitika Ltd. | Gene for thermostable glucokinase, recombinant vector containing the same, transformant containing the recombinant vector and process for producing thermostable glucokinase using the transformant |
| JP2011024500A (ja) * | 2009-07-27 | 2011-02-10 | Toyota Central R&D Labs Inc | 発酵能力が向上された酵母及びその利用 |
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