JPS60102195A - アデノシン−５’−三燐酸の製造法 - Google Patents
アデノシン−５’−三燐酸の製造法Info
- Publication number
- JPS60102195A JPS60102195A JP58208087A JP20808783A JPS60102195A JP S60102195 A JPS60102195 A JP S60102195A JP 58208087 A JP58208087 A JP 58208087A JP 20808783 A JP20808783 A JP 20808783A JP S60102195 A JPS60102195 A JP S60102195A
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- Japan
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- glucokinase
- plasmid
- atp
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアデノシン−５−三燐酸（Ｊ２Ｊ、下ＡＴＰと
略称する）の製造法に関し、更に詳しくは、遺伝子工学
的手法によりグルコキナーゼ産生能を増大させた細菌の
培養処理物を用いることを特徴とするＡＴＰの新規製造
法に関する。
略称する）の製造法に関し、更に詳しくは、遺伝子工学
的手法によりグルコキナーゼ産生能を増大させた細菌の
培養処理物を用いることを特徴とするＡＴＰの新規製造
法に関する。
ＡＴＰは全ゆる生物に普遍的に荏在する高エネルギー燐
酸化合物であって、生体のほとんど全ての吸エルゴン反
応にエネルギー供学体として関与し、自らはエネルギー
準位の低いテデノシンー５−二燐酸（以下ＡＤＰと略称
する）に転換される物質である。かかる作用を有するが
故に、ＡＴＰは脳血管障害や筋萎縮症の治療に使用され
るほか、糖ヌクレオチド、シチジン補酵素、ある種のペ
プチドなど、数多くの有用な物質の生産に使用されてい
る。
酸化合物であって、生体のほとんど全ての吸エルゴン反
応にエネルギー供学体として関与し、自らはエネルギー
準位の低いテデノシンー５−二燐酸（以下ＡＤＰと略称
する）に転換される物質である。かかる作用を有するが
故に、ＡＴＰは脳血管障害や筋萎縮症の治療に使用され
るほか、糖ヌクレオチド、シチジン補酵素、ある種のペ
プチドなど、数多くの有用な物質の生産に使用されてい
る。
かかる有用性を持ったＡＴＰの製造法としては１）アデ
ノシンまたはアデノシン−５’ −−燐酸（以下ＡＭＰ
と略称する）、燐酸供与体および糖類を含む反応液に、
ミクロバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の細
菌菌体若しくはその菌体処理物を作用させる方法（特公
昭４８−１５６３５６号）、２）大腸菌から分離精製し
たポリ燐酸キナーゼを用い、燐酸ポリマーの存在下でＡ
Ｄ Ｐを燐酸比する方法（特公昭５３−５７５２号）
、および３）クレアチンキナーゼを固定化し、これをＡ
Ｄｒとクレアチン燐酸の混液に作用さぜる方法（特公昭
５６−４６７９５号）などが既に知られて・いる。しか
しながら、ＡＴＰ生合成系の酵素を持った微生物または
その微生物から抽出された該酵素を用い、ＡＭＰおよび
ＡＤＰなどのＡＴＰ前駆体をＡＴＰに変換するこれらの
方法（酵素法）には、次の様な欠点がある。即ち、酵素
法によるＡＴＰの生合成はエネルギー供与系との共役を
必要とし、従ってこのエネルギー供与系に関与するクレ
アチン燐酸またはアセチル燐酸などの高価な商エネルギ
ー燐酸化合物を反応系に加えなければならず、一方、こ
れらの高エネルギー燐酸化合物に代えて細菌の解糖系ま
たは呼吸系などの準細胞分画を使用する場合は、その活
性が低い為、満足すべき結果を得ることができない。
ノシンまたはアデノシン−５’ −−燐酸（以下ＡＭＰ
と略称する）、燐酸供与体および糖類を含む反応液に、
ミクロバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の細
菌菌体若しくはその菌体処理物を作用させる方法（特公
昭４８−１５６３５６号）、２）大腸菌から分離精製し
たポリ燐酸キナーゼを用い、燐酸ポリマーの存在下でＡ
Ｄ Ｐを燐酸比する方法（特公昭５３−５７５２号）
、および３）クレアチンキナーゼを固定化し、これをＡ
Ｄｒとクレアチン燐酸の混液に作用さぜる方法（特公昭
５６−４６７９５号）などが既に知られて・いる。しか
しながら、ＡＴＰ生合成系の酵素を持った微生物または
その微生物から抽出された該酵素を用い、ＡＭＰおよび
ＡＤＰなどのＡＴＰ前駆体をＡＴＰに変換するこれらの
方法（酵素法）には、次の様な欠点がある。即ち、酵素
法によるＡＴＰの生合成はエネルギー供与系との共役を
必要とし、従ってこのエネルギー供与系に関与するクレ
アチン燐酸またはアセチル燐酸などの高価な商エネルギ
ー燐酸化合物を反応系に加えなければならず、一方、こ
れらの高エネルギー燐酸化合物に代えて細菌の解糖系ま
たは呼吸系などの準細胞分画を使用する場合は、その活
性が低い為、満足すべき結果を得ることができない。
細菌を培養しその培養液からＡＴＰを抽出する。
いわゆる発酵法は、培養管理が離しいだけでなく、培養
に要する時間が長い割にはＡ ＴＩ’の収穫が低いとい
う欠点を有する。。
に要する時間が長い割にはＡ ＴＩ’の収穫が低いとい
う欠点を有する。。
一方、本発明者らは、遺伝子組み換えによって解糖系酵
素であるフオスフオフルクトキナーゼおよびトリオース
燐酸イソメラーゼ活性を増大させた細菌、即ち強力な解
糖系活性を有する細菌を調製し、この細菌の存在下、解
糖系基質とＡ Ｔ Ｐ前駆体から解糖系を利用してＡ
ＴＰを生産せしめたところ、効率よ（ＡＴＰが生産され
ることを見い出し、これを特許出願した（特開昭５７−
１６６９９２号）。しかしながら、この方法で使用でき
る解糖系基質は特殊なものに限られ、グルコースで代表
される安価な基質を用いた場合は、十分なＡ −１”
ｌ）を製造することができない。
素であるフオスフオフルクトキナーゼおよびトリオース
燐酸イソメラーゼ活性を増大させた細菌、即ち強力な解
糖系活性を有する細菌を調製し、この細菌の存在下、解
糖系基質とＡ Ｔ Ｐ前駆体から解糖系を利用してＡ
ＴＰを生産せしめたところ、効率よ（ＡＴＰが生産され
ることを見い出し、これを特許出願した（特開昭５７−
１６６９９２号）。しかしながら、この方法で使用でき
る解糖系基質は特殊なものに限られ、グルコースで代表
される安価な基質を用いた場合は、十分なＡ −１”
ｌ）を製造することができない。
かかる状況に鑑み、本発明者らは、工業的規模でのＡＴ
Ｐの生産に適した安価な解糖系基質を使用しても、十分
満足できる量のＡＴＰを生産し得る改良法について鋭意
研究した結果、上記の方法に於いて、フオスフオフルク
トキナーゼおよびトリオース燐酸イソメラーゼ活性を増
大させる代りにグルコキナーゼ活性を高めた細菌を用い
れば、ハ ルコキナーゼを暗号化している大腸菌（Ｅ、［０１ｉ）
由来の遺伝子のクローニングに成功し、かかる遺伝子を
挿入した大腸菌由来のプラスミドを大腸菌に導入し、か
くして得られたグルコキナーゼ産生能の高められた形質
転換菌を培養し、その培養乾燥処理物をＡＴＰ前駆体お
よび安価な解糖系基質の混合物に作用させることにより
、高収率でＡ Ｔ Ｉ）を製造し得ることを見い出し本
発明を完成したものである。
Ｐの生産に適した安価な解糖系基質を使用しても、十分
満足できる量のＡＴＰを生産し得る改良法について鋭意
研究した結果、上記の方法に於いて、フオスフオフルク
トキナーゼおよびトリオース燐酸イソメラーゼ活性を増
大させる代りにグルコキナーゼ活性を高めた細菌を用い
れば、ハ ルコキナーゼを暗号化している大腸菌（Ｅ、［０１ｉ）
由来の遺伝子のクローニングに成功し、かかる遺伝子を
挿入した大腸菌由来のプラスミドを大腸菌に導入し、か
くして得られたグルコキナーゼ産生能の高められた形質
転換菌を培養し、その培養乾燥処理物をＡＴＰ前駆体お
よび安価な解糖系基質の混合物に作用させることにより
、高収率でＡ Ｔ Ｉ）を製造し得ることを見い出し本
発明を完成したものである。
従って本発明の目的は、グルコキナーゼを暗号化してい
る遺伝子を担持している細菌性プラスミドを提供するこ
とにあり、更にもう１つの目的は、該プラスミドを導入
した大腸菌の培養処理物を用いてＡＴＰを製造する方法
を提供することにある。
る遺伝子を担持している細菌性プラスミドを提供するこ
とにあり、更にもう１つの目的は、該プラスミドを導入
した大腸菌の培養処理物を用いてＡＴＰを製造する方法
を提供することにある。
以下に本発明をより詳細に説明する。
グルコキナーゼを暗号化している遺伝子のクローニング
は、特願昭５６−１２０５４６号に記載の方法と本質的
に同じ方法で行なう。即ち、適当な大腸菌株から、フェ
ノール法（Ｂｉｏｃｂｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ・ＡｃＬａ
７２巻、６１９〜６２９．１９６３年）によって染色体
ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素で断片化する。ここで
使用される制限酵素は、グルコキナーゼ暗号化遺伝子を
破壊しない限りいかなるものであってもよい。一方、ベ
クタプラスミドｐＢＲ３２２を同じ制限酵素で切断し、
次いでＵ／／ｒｉｃｈらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、 １９
６巻１３１３〜１３１９，１９７７年）に準じてアルカ
リフォスファターゼで処理する。こうして得られる線状
プラスミドを先に調製した染色体ＤＮＡ断片と混合し、
アニーリングを行なった後Ｔ４ＤＮＡ リガーゼで処理
して組み換えＤＮＡを調製する。
は、特願昭５６−１２０５４６号に記載の方法と本質的
に同じ方法で行なう。即ち、適当な大腸菌株から、フェ
ノール法（Ｂｉｏｃｂｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ・ＡｃＬａ
７２巻、６１９〜６２９．１９６３年）によって染色体
ＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素で断片化する。ここで
使用される制限酵素は、グルコキナーゼ暗号化遺伝子を
破壊しない限りいかなるものであってもよい。一方、ベ
クタプラスミドｐＢＲ３２２を同じ制限酵素で切断し、
次いでＵ／／ｒｉｃｈらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、 １９
６巻１３１３〜１３１９，１９７７年）に準じてアルカ
リフォスファターゼで処理する。こうして得られる線状
プラスミドを先に調製した染色体ＤＮＡ断片と混合し、
アニーリングを行なった後Ｔ４ＤＮＡ リガーゼで処理
して組み換えＤＮＡを調製する。
上記の操作で、染色体ＤＮＡ断片の神順に応じた各種の
組み換え体が生成するので、これらの一群の組み換え体
から、目的とするグルコキナーゼ暗号化遺伝子が挿入さ
れた組み換え体を以下に述べる方法で選択する。
組み換え体が生成するので、これらの一群の組み換え体
から、目的とするグルコキナーゼ暗号化遺伝子が挿入さ
れた組み換え体を以下に述べる方法で選択する。
グルコース資化能のない大腸菌、例えばＥ、（ｏｌｉＺ
ＳＣ１１２Ｌ（ｇｐｔ、ｍｐｃ、ｇｌｋ）に（７）’１
７４株ＬｔＥ。
ＳＣ１１２Ｌ（ｇｐｔ、ｍｐｃ、ｇｌｋ）に（７）’１
７４株ＬｔＥ。
［０１ｉからＥｐｓｃｅｉｎの方法で調製することがで
きる。Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 Ｖｏｌ、 １２２
＋ １１８９〜１１９９（１９７５年）参照。）をカル
シウムイオン処理してコンピテント化しく Ｍｏｌ ｅ
ｃ 、 ｇｅｎ、 Ｇｅｎｔ 、 、 １２４巻１〜１
０，１９７３年）、これに組み換え］） Ｎ Ａを導入
する。かくして得られるＩ） Ｎ Ａ導入様をアンピシ
リン含有グルコースマツコン＋ −培ｔ１１で培養し、
淡赤色コロニーを選択する。次いでマンノースマツコン
キー培地とＢＣＩＧ培地にレフ”リカし、前者では白色
であり後者では青色のコロニーを選択する。この様にし
て、所望のグルコキナーゼ暗号化遺伝子を担持している
プラスミドＤＮＡが導入され菌株を選択、単離すること
ができる。
きる。Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 Ｖｏｌ、 １２２
＋ １１８９〜１１９９（１９７５年）参照。）をカル
シウムイオン処理してコンピテント化しく Ｍｏｌ ｅ
ｃ 、 ｇｅｎ、 Ｇｅｎｔ 、 、 １２４巻１〜１
０，１９７３年）、これに組み換え］） Ｎ Ａを導入
する。かくして得られるＩ） Ｎ Ａ導入様をアンピシ
リン含有グルコースマツコン＋ −培ｔ１１で培養し、
淡赤色コロニーを選択する。次いでマンノースマツコン
キー培地とＢＣＩＧ培地にレフ”リカし、前者では白色
であり後者では青色のコロニーを選択する。この様にし
て、所望のグルコキナーゼ暗号化遺伝子を担持している
プラスミドＤＮＡが導入され菌株を選択、単離すること
ができる。
丑で得た所望の菌株を培養し、常法により組み換えプラ
スミドを分離し、これを適当な大腸菌株に導入すること
によってグルコキナーゼ酵素活性の増強した菌株を得る
ことができる。この菌株はと共に０．０５〜０．３重量
外の１す；）、アンモニウムおよび０．０５〜５重量％
のフルクトースを含有する培地を使用し、２５〜４０°
Ｃ１好ましくは約２８′Ｃで１０〜２０時間培養すると
、最もグルコキナーゼ酵素活性の高い培養菌を得ること
ができる。
スミドを分離し、これを適当な大腸菌株に導入すること
によってグルコキナーゼ酵素活性の増強した菌株を得る
ことができる。この菌株はと共に０．０５〜０．３重量
外の１す；）、アンモニウムおよび０．０５〜５重量％
のフルクトースを含有する培地を使用し、２５〜４０°
Ｃ１好ましくは約２８′Ｃで１０〜２０時間培養すると
、最もグルコキナーゼ酵素活性の高い培養菌を得ること
ができる。
この様にして培養した後、集洗菌し、破砕または乾燥な
どの処理を施す。こうして得た、グルコキナーゼに富ん
だ培養乾燥処理物は、特公昭５７−１６６９９２号に記
載の方法とはソ同様の方法で、ＡＴＰの生産に使用する
ことができる。即ち、ＡＴＰ前駆体５〜５０ｍＭ、解糖
系基質５０〜５００ｍＭ、硫酸マグネシウム５〜５ Ｑ
！１１Ｍ、燐酸緩衝液５０ ｍＭ〜８００ｍＭ、 Ｎ
Ａ Ｄ （β−ニコチンアミドアデニンジヌク１／オ
タイド）０．１〜Ｑ、５ｍＭおよびＡＴＰＱ、ＱｌｍＭ
からなる反応液（ＰＩ−１６，０〜９．５）に培養乾燥
処理物を１０〜５０１ＭＱ／ｍｔの割合で添加し、２５
〜３７°Ｃで３０分〜３時間、振盪しながら反応させる
ことにより、好収率でＡ ’［Ｉ’を製Ｊ告することが
できる。尚５反応液中のＡ Ｔ Ｐは常法により単離、
精製することができる。
どの処理を施す。こうして得た、グルコキナーゼに富ん
だ培養乾燥処理物は、特公昭５７−１６６９９２号に記
載の方法とはソ同様の方法で、ＡＴＰの生産に使用する
ことができる。即ち、ＡＴＰ前駆体５〜５０ｍＭ、解糖
系基質５０〜５００ｍＭ、硫酸マグネシウム５〜５ Ｑ
！１１Ｍ、燐酸緩衝液５０ ｍＭ〜８００ｍＭ、 Ｎ
Ａ Ｄ （β−ニコチンアミドアデニンジヌク１／オ
タイド）０．１〜Ｑ、５ｍＭおよびＡＴＰＱ、ＱｌｍＭ
からなる反応液（ＰＩ−１６，０〜９．５）に培養乾燥
処理物を１０〜５０１ＭＱ／ｍｔの割合で添加し、２５
〜３７°Ｃで３０分〜３時間、振盪しながら反応させる
ことにより、好収率でＡ ’［Ｉ’を製Ｊ告することが
できる。尚５反応液中のＡ Ｔ Ｐは常法により単離、
精製することができる。
上記の培養乾燥処理物は、破砕した細胞をそのまま乾燥
したものであるが、この他、破砕した細胞から遠心分離
で粗グルコキナーゼを抽出したもの（無細胞抽出液）お
よび菌体をそのまま適当な担体に担持させたもの（固定
化菌体）も同様にして使用することができる。本明細再
に於いて、培養処理物なる用語はこれらの全てを包括的
に表わすものとする。
したものであるが、この他、破砕した細胞から遠心分離
で粗グルコキナーゼを抽出したもの（無細胞抽出液）お
よび菌体をそのまま適当な担体に担持させたもの（固定
化菌体）も同様にして使用することができる。本明細再
に於いて、培養処理物なる用語はこれらの全てを包括的
に表わすものとする。
以下に実施例を挙げ、本発明の好ましい態様を説明する
。実施例中、特に明記しない限り、％は重量％を表わす
。
。実施例中、特に明記しない限り、％は重量％を表わす
。
実施例Ｉ
Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｂ （ＡＴＣＣ２３２２６）をＬ−培
地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、グルコース０
．１％、塩化ナトリウム０．５％、ｐｉ−１７，２）
２００ ｔｕｔ中、２８°Ｃで５時間振とう培養した。
地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、グルコース０
．１％、塩化ナトリウム０．５％、ｐｉ−１７，２）
２００ ｔｕｔ中、２８°Ｃで５時間振とう培養した。
菌体を集洗菌後、５ａｉｔｏ Ｍｉｕｒａ の方法［Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、ＡｃＬａ。
ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、ＡｃＬａ。
７２ ６１９〜６２９（１９６３））でフェノール処理
し、染色体ＤＮＡ１ｑを得た。次にアンピシリン耐性及
びテトラサイクリン耐性を有するｐＢＲ３２２プラスミ
ド（７）ＤＮＡを保持したＥ、 ｃｏｌ ｉ Ｋ１２Ｚ
ＳＣ１１２をＬ−培地１ｅで培養し、ＯＤ６□。ｎｍ０
．５〜０．６で２００μｇ／ｍｅのクロラムフェニコー
ルをで 添加して３７°ＣＡ１５時間培養を続けた。菌体を集菌
洗浄後リゾチーム及びソディウムドデシルサルフエート
で溶菌させ、３５０００ｇで１時間ａｌｔ＞して上清を
得た。上清をフェノール−クロロホルム混合液で等量加
えて攪拌し、遠・［ｙＬ（１００００ｒ、ｐ、ｍ ｌ
０分）、タンパク等を除き、リボ核酸分解酵素で３７°
Ｃで３時間処理し、次いでセシウムクロリドーエチジム
ブロミド平衡密度勾配遠心を３６００Ｏｒ、ｐ、ｍ（４
８時間、２０°Ｃ）て行ない、ｐ ＢＲ３２２プラスミ
ドＩ） Ｎ Ａ ｌりを得た。先に得た染色体ＤＮＡ３
μｇをとり制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌと３０分反応させて
部分分解し一方、ベクターフ”ラスミドｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡ１．１１１ｇも同じ酵素１１ｉｎｄｌと３時間反応
させ、完全に切断させた。
し、染色体ＤＮＡ１ｑを得た。次にアンピシリン耐性及
びテトラサイクリン耐性を有するｐＢＲ３２２プラスミ
ド（７）ＤＮＡを保持したＥ、 ｃｏｌ ｉ Ｋ１２Ｚ
ＳＣ１１２をＬ−培地１ｅで培養し、ＯＤ６□。ｎｍ０
．５〜０．６で２００μｇ／ｍｅのクロラムフェニコー
ルをで 添加して３７°ＣＡ１５時間培養を続けた。菌体を集菌
洗浄後リゾチーム及びソディウムドデシルサルフエート
で溶菌させ、３５０００ｇで１時間ａｌｔ＞して上清を
得た。上清をフェノール−クロロホルム混合液で等量加
えて攪拌し、遠・［ｙＬ（１００００ｒ、ｐ、ｍ ｌ
０分）、タンパク等を除き、リボ核酸分解酵素で３７°
Ｃで３時間処理し、次いでセシウムクロリドーエチジム
ブロミド平衡密度勾配遠心を３６００Ｏｒ、ｐ、ｍ（４
８時間、２０°Ｃ）て行ない、ｐ ＢＲ３２２プラスミ
ドＩ） Ｎ Ａ ｌりを得た。先に得た染色体ＤＮＡ３
μｇをとり制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌと３０分反応させて
部分分解し一方、ベクターフ”ラスミドｐＢＲ３２２Ｄ
ＮＡ１．１１１ｇも同じ酵素１１ｉｎｄｌと３時間反応
させ、完全に切断させた。
ＰＢＲ３２２ＤＮＡは完全に切断させたかどうか、アガ
ロース電気泳動にて確認した。さらに両反応液で を各々６５°Ｃ５分間加熱処理した後、両反応液を△ すぐさま混合し、１゛４フアージ由来のＩ） Ｎ Ａリ
ガーゼを用い、４°Ｃで１６時間結合反応を行なった。
ロース電気泳動にて確認した。さらに両反応液で を各々６５°Ｃ５分間加熱処理した後、両反応液を△ すぐさま混合し、１゛４フアージ由来のＩ） Ｎ Ａリ
ガーゼを用い、４°Ｃで１６時間結合反応を行なった。
次いで６５°Ｃで５分間加熱処理した後、反応液に２倍
容の冷エタノールを加え、−２０°Ｃで一夜放置後１０
０００ ｒ、ｐ、ｍで遠心して沈でんを集め、これをｌ
Ｑ ｍＭ Ｉ−リス−塩酸緩衝液（１）ＩＩ ７．５
）０．１πｔに溶解しＤＮＡ溶液とした。Ｅ、ｃｏｌ
ｉｋ１２ＺＳＣＩ １２Ｌ（グルコース資化能欠損株）
を、糖源をグルコースの代りにフラクトースとしたＩ、
−培地５０ｍ１にて対数増殖中期（ＯＤ６１０ａ＋ｇ
Ｏ，４）まで生育させた後、塩化カルシウムｌ ＯＱｍ
Ｍを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ ｐ）−１７，６）で
洗浄後、同じ緩衝液２． Ｏｔｔｔｔに懸濁させた後、
その懸濁液０．２ ｍｌに、すでに調製した０、１πｔ
のＤＮＡ液を加え、０’Ｃにて２０分間保持した後、す
ぐさま３７°Ｃ３０分間の熱を与え、ＤＮＡを細胞内に
取り込ませた。
容の冷エタノールを加え、−２０°Ｃで一夜放置後１０
０００ ｒ、ｐ、ｍで遠心して沈でんを集め、これをｌ
Ｑ ｍＭ Ｉ−リス−塩酸緩衝液（１）ＩＩ ７．５
）０．１πｔに溶解しＤＮＡ溶液とした。Ｅ、ｃｏｌ
ｉｋ１２ＺＳＣＩ １２Ｌ（グルコース資化能欠損株）
を、糖源をグルコースの代りにフラクトースとしたＩ、
−培地５０ｍ１にて対数増殖中期（ＯＤ６１０ａ＋ｇ
Ｏ，４）まで生育させた後、塩化カルシウムｌ ＯＱｍ
Ｍを含むトリス緩衝液（５０ｍＭ ｐ）−１７，６）で
洗浄後、同じ緩衝液２． Ｏｔｔｔｔに懸濁させた後、
その懸濁液０．２ ｍｌに、すでに調製した０、１πｔ
のＤＮＡ液を加え、０’Ｃにて２０分間保持した後、す
ぐさま３７°Ｃ３０分間の熱を与え、ＤＮＡを細胞内に
取り込ませた。
次に、この懸濁液をＬ−培地に移し、２時間振とう培養
した。菌体を集洗菌後アンピシリン２０μｇ／ ｒｔｔ
ｌ ヲ含ｔｒ クルコース・マツコンキー培地（ヘフ”
トン２外、コール酸ナトリウム０．１５％、ＮａＣ，５
０，５％、ニュートラルレッド０．００３％、クリスタ
ルバイオレット０．００００１％、グルコース１％）に
塗布し％３０°Ｃで一夜培養した。生じたコロニーヨリ
赤イコロニーについて更にマンノース・マツツコンキ−
（グルコースの代りにマンノースを等量加えたもの）及
びＢ Ｃｊ Ｇ培地（１１ＣＩ Ｇ ２０μｇ／Ｍｌを
含むグルコース１％、ラクトース０．２係を加えたＤａ
ｖ ｉ ｓ−ｍ５−ｍ１ｎ目最少培地）にレプリカを
行ない、マンノース・マツコンキー培地では白いコロニ
ー、ＢＣＩＧ培地では青む）ヨ。ニーであるコロニーを
選択し、グルコキナーゼ遺伝子を含む形質転換体ＺＳＣ
Ｉ １２Ｌ／Ｉ）ＧＫＩ ００ を得た。
した。菌体を集洗菌後アンピシリン２０μｇ／ ｒｔｔ
ｌ ヲ含ｔｒ クルコース・マツコンキー培地（ヘフ”
トン２外、コール酸ナトリウム０．１５％、ＮａＣ，５
０，５％、ニュートラルレッド０．００３％、クリスタ
ルバイオレット０．００００１％、グルコース１％）に
塗布し％３０°Ｃで一夜培養した。生じたコロニーヨリ
赤イコロニーについて更にマンノース・マツツコンキ−
（グルコースの代りにマンノースを等量加えたもの）及
びＢ Ｃｊ Ｇ培地（１１ＣＩ Ｇ ２０μｇ／Ｍｌを
含むグルコース１％、ラクトース０．２係を加えたＤａ
ｖ ｉ ｓ−ｍ５−ｍ１ｎ目最少培地）にレプリカを
行ない、マンノース・マツコンキー培地では白いコロニ
ー、ＢＣＩＧ培地では青む）ヨ。ニーであるコロニーを
選択し、グルコキナーゼ遺伝子を含む形質転換体ＺＳＣ
Ｉ １２Ｌ／Ｉ）ＧＫＩ ００ を得た。
次に形質転換体ＺＳＣ１１２Ｌ／ＰＧＫ１００の１ラス
ミドＰＧＫ１００ＤＮＡ を抽出するが、これは先の、
ＢＲ３２２ＤＮＡを抽出した時と同様の操作を行ない、
ＰＧＫＩ００７リスミ）’ＤＮＡ１ｆｆ／を１６（７）
培養から得た。このＤＮＡをｈ 、 ｃ ｏ Ｉ ｉ
Ｂに取り込ませ、アンピシリンを含むし一培地で培養し
、生じて来たコロニーから形質転換株Ｅ ＋ ｔ ｏ
Ｉ ； Ｂ／ｐ Ｇ Ｋ１００を取得した、 所望の組み換えプラスミドを含有する菌株をＬ −ｂｒ
ｏｔｈ （グルコース０．２％、ポリペプトン１％、イ
ーストエクストラクト０．５％、ＮａＣ１０，５％、ア
ンピシリン２０μｇ／ｍｅを含む）で培養し、常法によ
り該プラスミドを分離し、制限分析によりその構造を確
認した。このフ”ラスミドは、８．８Ｍｄであり、本発
明者らによりプラスミドｐｃ＋（１ｏ。
ミドＰＧＫ１００ＤＮＡ を抽出するが、これは先の、
ＢＲ３２２ＤＮＡを抽出した時と同様の操作を行ない、
ＰＧＫＩ００７リスミ）’ＤＮＡ１ｆｆ／を１６（７）
培養から得た。このＤＮＡをｈ 、 ｃ ｏ Ｉ ｉ
Ｂに取り込ませ、アンピシリンを含むし一培地で培養し
、生じて来たコロニーから形質転換株Ｅ ＋ ｔ ｏ
Ｉ ； Ｂ／ｐ Ｇ Ｋ１００を取得した、 所望の組み換えプラスミドを含有する菌株をＬ −ｂｒ
ｏｔｈ （グルコース０．２％、ポリペプトン１％、イ
ーストエクストラクト０．５％、ＮａＣ１０，５％、ア
ンピシリン２０μｇ／ｍｅを含む）で培養し、常法によ
り該プラスミドを分離し、制限分析によりその構造を確
認した。このフ”ラスミドは、８．８Ｍｄであり、本発
明者らによりプラスミドｐｃ＋（１ｏ。
と命名された。プラスミドｐＧＫ １００の制限地図を
第１図へに示す。図中、白ヌキ環状部は１）旧（３２２
由来のＤＮＡ、黒ベタ環状部はＥ・ｃｏｌｉＪ３（ＡＴ
ＣＣ２３２２６）株の染色体出来の］）Ｎへ断片（６，
０Ｍｄ）を示している。グルコキナーゼ暗号化遺伝子は
、制限酵素Ｍｌｕ）て０．８２Ｍｄに切断されるＦ２の
範囲のＤＮＡ断片に載っている。
第１図へに示す。図中、白ヌキ環状部は１）旧（３２２
由来のＤＮＡ、黒ベタ環状部はＥ・ｃｏｌｉＪ３（ＡＴ
ＣＣ２３２２６）株の染色体出来の］）Ｎへ断片（６，
０Ｍｄ）を示している。グルコキナーゼ暗号化遺伝子は
、制限酵素Ｍｌｕ）て０．８２Ｍｄに切断されるＦ２の
範囲のＤＮＡ断片に載っている。
このプラスミドＰＧＫｉ００をＭｌｕｉで部分分解し、
アガロース電気泳動で７．０２ Ｍｄの分子量をもつＤ
ＮＡフラグメントを抽出し、再びＴ４１）ＮＡ＋リガー
ゼでライゲーションを行なうとＦｌおよびＦ３の範囲の
ＤＮＡ断片が削除された組み換え体が得られる。このプ
ラスミドもグルコキナーゼ暗号化遺伝子を保持しており
１本発明の目的に使用することができる。このプラスミ
ドは７．０２Ｍｄであり１．ＧＫｌｏｏ−５と命名され
た。その制限地図を第１図Ｂに示す。
アガロース電気泳動で７．０２ Ｍｄの分子量をもつＤ
ＮＡフラグメントを抽出し、再びＴ４１）ＮＡ＋リガー
ゼでライゲーションを行なうとＦｌおよびＦ３の範囲の
ＤＮＡ断片が削除された組み換え体が得られる。このプ
ラスミドもグルコキナーゼ暗号化遺伝子を保持しており
１本発明の目的に使用することができる。このプラスミ
ドは７．０２Ｍｄであり１．ＧＫｌｏｏ−５と命名され
た。その制限地図を第１図Ｂに示す。
プラスミド ＧＫｌｏｏおよび、）ＧＪ（ＩＱＯ−５は
。
。
いづれも大腸菌Ｂ株に導入されて工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託されており（寄託日：昭和５８年１０
月２９日）、それぞれＦ Ｉ！、 ＲＭ Ｉ） −７３
１９、ＦＥＲＭｐ−７３２０で入手可能であり、プラス
ミド ＧＫｌｏｏおよび、、にＫ１００−５の洪給源と
して利用することができる。
技術研究所に寄託されており（寄託日：昭和５８年１０
月２９日）、それぞれＦ Ｉ！、 ＲＭ Ｉ） −７３
１９、ＦＥＲＭｐ−７３２０で入手可能であり、プラス
ミド ＧＫｌｏｏおよび、、にＫ１００−５の洪給源と
して利用することができる。
実施例２
Ｌ”ｂｒｏｔｈ培地５０ｍ１にＥ 、 ｃａｌ ｉをＱ
Ｉ） ６１Ｑ ｎ Ｉ１１約０．３になるまで培養し
、集菌する。集菌は殺菌したプラスチック製遠心管で１
０００Ｏｒ、ｐ、ｍ５分間の遠心を行なう。次に１／２
量のｌ Ｑ ＋ｕＭＮａＣ１で洗浄し、遠心でＮａＣ
７１液を除いたあと、１／２ 量のＣａ ＣＮ ２溶液
（３０ｍＭ Ｃａ Ｃ（Ｊ ２．５０ ｍＭ Ｔｒ ｉ
ｓ、 ｐＨ７，５）に懸濁し、ブラスミナド液ととも
に０°Ｃ１２５分間の処理をし、次に：３７°Ｃ３０分
間処理を行ない、アンピシリンを含ム＋−−ｂｒｏｔｂ
培地で生育させ、プラスミドｐＧＫ １００およびＰＧ
Ｋｌｏｏ−５をそれぞれＥ 、 ｃｏｌ ｉ Ｉｓにｉ
Ｈ”Ｊ入した菌体を選択する。得られた形質転換菌を、
フルクトース０．５外、Ｋ２ＨＰＯ４０，７％、Ｋ１１
２１）０４０．３襲、Ｍ ｇ Ｓ ０４ ・７ Ｈ２０
０，０１％およヒ（Ｎ １４ ）２１ Ｉ＋）０４Ｑ、
３％を含有する液体培地に接種し、３０”Ｃで８時間振
借培養する。培養終了後集洗菌し、ｌ Ｑ ＋ｎＭ（７
） Ｍ ｇ Ｃ（１２を含む５０ｍＭの燐酸Ｍ １Ｊｉ
ｊ液（ｐＨ７，６）に懸濁して菌体を破砕した後遠心分
ｔｉｌｔ （１００，０００ｆ、６０分）シ、その上清
を用いてグルコキナーゼ活性（注１）を測定した。対照
として、グルコキナ−セ欠損株であるｚｓｃ１１２Ｌお
よびグルコース資化能を有するＣ６００及びＢ株につい
ても同様の操作を行ない、グルコキナーゼ活性を比較し
た。
Ｉ） ６１Ｑ ｎ Ｉ１１約０．３になるまで培養し
、集菌する。集菌は殺菌したプラスチック製遠心管で１
０００Ｏｒ、ｐ、ｍ５分間の遠心を行なう。次に１／２
量のｌ Ｑ ＋ｕＭＮａＣ１で洗浄し、遠心でＮａＣ
７１液を除いたあと、１／２ 量のＣａ ＣＮ ２溶液
（３０ｍＭ Ｃａ Ｃ（Ｊ ２．５０ ｍＭ Ｔｒ ｉ
ｓ、 ｐＨ７，５）に懸濁し、ブラスミナド液ととも
に０°Ｃ１２５分間の処理をし、次に：３７°Ｃ３０分
間処理を行ない、アンピシリンを含ム＋−−ｂｒｏｔｂ
培地で生育させ、プラスミドｐＧＫ １００およびＰＧ
Ｋｌｏｏ−５をそれぞれＥ 、 ｃｏｌ ｉ Ｉｓにｉ
Ｈ”Ｊ入した菌体を選択する。得られた形質転換菌を、
フルクトース０．５外、Ｋ２ＨＰＯ４０，７％、Ｋ１１
２１）０４０．３襲、Ｍ ｇ Ｓ ０４ ・７ Ｈ２０
０，０１％およヒ（Ｎ １４ ）２１ Ｉ＋）０４Ｑ、
３％を含有する液体培地に接種し、３０”Ｃで８時間振
借培養する。培養終了後集洗菌し、ｌ Ｑ ＋ｎＭ（７
） Ｍ ｇ Ｃ（１２を含む５０ｍＭの燐酸Ｍ １Ｊｉ
ｊ液（ｐＨ７，６）に懸濁して菌体を破砕した後遠心分
ｔｉｌｔ （１００，０００ｆ、６０分）シ、その上清
を用いてグルコキナーゼ活性（注１）を測定した。対照
として、グルコキナ−セ欠損株であるｚｓｃ１１２Ｌお
よびグルコース資化能を有するＣ６００及びＢ株につい
ても同様の操作を行ない、グルコキナーゼ活性を比較し
た。
結果を以下の表１に挙げる。
表 １
注１：グルコキナーゼ活性はＦｒａｅｎｋｃｌ らの方
法で測定した（ Ｊ、 Ｂｉｏｌ 、 Ｃｂｃ口’、（
１９６４）２３９゜２７６５〜２７７１）。
法で測定した（ Ｊ、 Ｂｉｏｌ 、 Ｃｂｃ口’、（
１９６４）２３９゜２７６５〜２７７１）。
尚、Ｅ、 ｃａｌ ｉ Ｂ株及びＥ、ｃｏｌｉｌｓ／、
）ＧＫｌｏｏを各種の伏素および窒素源を含む最小培地
で培養した場合のグルコキナーゼ活性を測定したところ
。
）ＧＫｌｏｏを各種の伏素および窒素源を含む最小培地
で培養した場合のグルコキナーゼ活性を測定したところ
。
表２の様な結果が得られた。この実験の結果、最もグル
コキナーゼの活性を上昇させる灰素源はフこれらを含む
最少培地で培養すれば良いことかわかった。
コキナーゼの活性を上昇させる灰素源はフこれらを含む
最少培地で培養すれば良いことかわかった。
表 ２
注ａ：グルコキナーゼ活性はμＩＴ１（ｌ ｌ１分／蛋
白質〜で表わした。（）内は１行目に記載の最小培地で
培養した場合の活性を１００とした場合の相対的活性を
示している。
白質〜で表わした。（）内は１行目に記載の最小培地で
培養した場合の活性を１００とした場合の相対的活性を
示している。
実施例３
Ｅ、ｃｏｄｉＢオよびＥ、ｃｏｌｔＢ／１）ＧＫｌｏｏ
ヲソｈ ’Ｃれグルコース０．５ ％、 Ｋ２ＨＰＯ
４０，７外、ＫＨ２１３０４０，３％、ＭｙＳ０４・７
Ｉ−１２００，０１％ および（Ｎｌ−１４） ２［−
１ＰＯ４０，１％を含有する培地（培地Ａ）、およびフ
ルクトース０，５％、Ｋ１−１２１）０４０．３％、
Ｋ２１１１．’０４０．７へＭｐＳ０４・７Ｈ２００，
０１％および（Ｎｉ１４） ２ＰＯ４０，３％を含有す
る培地（培地Ｂ）で実施例２と同じ条件下で培養し、培
養終了後集洗菌し、菌体を２５′Ｃ（ＲＨ６０％）で−
夜乾燥した後さらに真空デシケータ内の五酸化リンで完
全に乾燥させた。
ヲソｈ ’Ｃれグルコース０．５ ％、 Ｋ２ＨＰＯ
４０，７外、ＫＨ２１３０４０，３％、ＭｙＳ０４・７
Ｉ−１２００，０１％ および（Ｎｌ−１４） ２［−
１ＰＯ４０，１％を含有する培地（培地Ａ）、およびフ
ルクトース０，５％、Ｋ１−１２１）０４０．３％、
Ｋ２１１１．’０４０．７へＭｐＳ０４・７Ｈ２００，
０１％および（Ｎｉ１４） ２ＰＯ４０，３％を含有す
る培地（培地Ｂ）で実施例２と同じ条件下で培養し、培
養終了後集洗菌し、菌体を２５′Ｃ（ＲＨ６０％）で−
夜乾燥した後さらに真空デシケータ内の五酸化リンで完
全に乾燥させた。
ＡＭＰ ３ Ｑ ｍＭ、グルコ−７、２００ｎｔＭ、燐
酸緩衝液（ＰＨ８，０） ５００ ｍＭ、硫酸マグネシ
ウム・７水塩３ Ｑ ｍＭ、ＡＴ Ｐ ｌ ｍＭおよび
Ｎ Ａ Ｉ） （β−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オタイド）り／πｌの割合で添加し、２８°Ｃで待判張
碌して反応させる。反応開始から１時間後および２時間
後に於ける反応液中のＡ Ｔ Ｐ含量を常法により測定
した。結果を以下の表３に示す。
酸緩衝液（ＰＨ８，０） ５００ ｍＭ、硫酸マグネシ
ウム・７水塩３ Ｑ ｍＭ、ＡＴ Ｐ ｌ ｍＭおよび
Ｎ Ａ Ｉ） （β−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オタイド）り／πｌの割合で添加し、２８°Ｃで待判張
碌して反応させる。反応開始から１時間後および２時間
後に於ける反応液中のＡ Ｔ Ｐ含量を常法により測定
した。結果を以下の表３に示す。
表 ３
実施例４
培地Ｉ３を使用し、乾燥菌体の量を５０ ’ｉｆ／／ｍ
ｌ の割合で添加するほかは実施例３と同様の実験を行
なった。得られた結果を表４に示す。
ｌ の割合で添加するほかは実施例３と同様の実験を行
なった。得られた結果を表４に示す。
表 ４
実施例５
培地へに於けるグルコースの代りに種々の解糖系中間体
を基質として用いるほかは実施例３と同様の実験を行な
った（反応時間１時間）。得られた結果を以下の表５に
示す。
を基質として用いるほかは実施例３と同様の実験を行な
った（反応時間１時間）。得られた結果を以下の表５に
示す。
表 ５
表５から明らかな様に、 Ｅ、ｃｏｌｉＢとＦ、、ｃｏ
ｌｉ１７ＰＧＫ１００のＡＴＰ生産量には、グルコース
を使用した場合にのみ差が見られた。
ｌｉ１７ＰＧＫ１００のＡＴＰ生産量には、グルコース
を使用した場合にのみ差が見られた。
実施例６
実施例３に於いて培地Ｂを用いて培養した菌体を用い、
各種濃度の燐酸緩衝液（１） ｔｌ、Ｂ、 ０ ）中で
Ａ−１” Ｐを製造した（反応時間：１時間）。得られ
た結果を以下の表６に示す。
各種濃度の燐酸緩衝液（１） ｔｌ、Ｂ、 ０ ）中で
Ａ−１” Ｐを製造した（反応時間：１時間）。得られ
た結果を以下の表６に示す。
表６
実施例７
実施例３のＡ Ｔｉ’製造反応を反応液１０ｍ１を用い
て３時間行なった後加熱して反応を止め、反応液を沖過
し、ｒ液に濃塩酸を加えてｐＨ３，５に調節した後活性
炭カラムに通ず。カラムを水洗し、次いで１．５％アン
モニアを含む５％メチルエチルケトンを通して吸着物を
溶出する。溶出液をａ縮し、陰イオン交換樹脂１）ｏｗ
ｃｘ １（ｃ６ ）カラムに通してＡＴＰを吸着させる
。水洗後、塩酸と食塩水の混液を通して溶出し、Ａ １
１１画分を集めてａｍする。濃縮液に５倍量のエタノー
ルを加えてＡＴＰの結晶を析出させる。Ａ’ｌ″Ｐの収
Ｉｆ、 ： １２０ ’！／ （ＡＭＰに基づく収率：
８０％）。
て３時間行なった後加熱して反応を止め、反応液を沖過
し、ｒ液に濃塩酸を加えてｐＨ３，５に調節した後活性
炭カラムに通ず。カラムを水洗し、次いで１．５％アン
モニアを含む５％メチルエチルケトンを通して吸着物を
溶出する。溶出液をａ縮し、陰イオン交換樹脂１）ｏｗ
ｃｘ １（ｃ６ ）カラムに通してＡＴＰを吸着させる
。水洗後、塩酸と食塩水の混液を通して溶出し、Ａ １
１１画分を集めてａｍする。濃縮液に５倍量のエタノー
ルを加えてＡＴＰの結晶を析出させる。Ａ’ｌ″Ｐの収
Ｉｆ、 ： １２０ ’！／ （ＡＭＰに基づく収率：
８０％）。
第１図ＡＪよび１３はそれぞれブ″ラスミドＩ）Ｇ Ｋ
１００およびプラスミドＰＧＫ１００−５の制限地図
である。 特許出願人 和光産業株式会ト１ニ 代理人 弁理士 前出 葆 外１名
１００およびプラスミドＰＧＫ１００−５の制限地図
である。 特許出願人 和光産業株式会ト１ニ 代理人 弁理士 前出 葆 外１名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、解糖系酵素の存在下でアデノシン−５−三燐酸前駆
体および解糖系基質から解糖系を利用してアデノシン−
５−三燐酸を製造する方法であって、該解糖系酵素とし
てグルコキナーゼ活性が高められた大腸菌の培養処理物
中に含まれるグルコキナーゼを使用することを特徴とす
る方法。 ２、グルコキナーゼ活性が高められた大腸菌が、グルコ
キナーゼ暗号化遺伝子を担持しているブ′ラスミドの導
入によって形質転換された大腸菌である第１項に記載の
方法。 ０．０５〜５重量％のフルクトースを含有する培地中、
２５〜４０°Ｃで１０〜２０時間培養して得られる培養
処理物を使用する第１項に記載の方法。 ４、プラスミドｐＧＫｌ ００゜ ５．１ラスミドＰＧＫ１００−５゜ ５、Ｅ、Ｃｏ＄ｉ Ｂ／ＰＧＫ１００゜７、ｈ−Ｃｑ
ｌ ｉＢ／ｐ Ｇ Ｋ１００−５゜
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58208087A JPS60102195A (ja) | 1983-11-05 | 1983-11-05 | アデノシン−５’−三燐酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58208087A JPS60102195A (ja) | 1983-11-05 | 1983-11-05 | アデノシン−５’−三燐酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60102195A true JPS60102195A (ja) | 1985-06-06 |
| JPH0520071B2 JPH0520071B2 (ja) | 1993-03-18 |
Family
ID=16550420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58208087A Granted JPS60102195A (ja) | 1983-11-05 | 1983-11-05 | アデノシン−５’−三燐酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60102195A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6566109B2 (en) | 2001-01-15 | 2003-05-20 | Unitika Ltd. | Gene for thermostable glucokinase, recombinant vector containing the same, transformant containing the recombinant vector and process for producing thermostable glucokinase using the transformant |
| CN110517776A (zh) * | 2019-08-16 | 2019-11-29 | 四川大学华西医院 | 一种老年人健康风险评估方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS535752A (en) * | 1976-07-06 | 1978-01-19 | Tokai Rika Co Ltd | Dc load control unit |
| JPS5646795A (en) * | 1979-09-22 | 1981-04-28 | Hiroichi Yamaguchi | Drawing method for panorama |
| JPS57166992A (en) * | 1981-04-08 | 1982-10-14 | Seitetsu Kagaku Co Ltd | Preparation of adenosine-5'-triphosphate |
-
1983
- 1983-11-05 JP JP58208087A patent/JPS60102195A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS535752A (en) * | 1976-07-06 | 1978-01-19 | Tokai Rika Co Ltd | Dc load control unit |
| JPS5646795A (en) * | 1979-09-22 | 1981-04-28 | Hiroichi Yamaguchi | Drawing method for panorama |
| JPS57166992A (en) * | 1981-04-08 | 1982-10-14 | Seitetsu Kagaku Co Ltd | Preparation of adenosine-5'-triphosphate |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6566109B2 (en) | 2001-01-15 | 2003-05-20 | Unitika Ltd. | Gene for thermostable glucokinase, recombinant vector containing the same, transformant containing the recombinant vector and process for producing thermostable glucokinase using the transformant |
| CN110517776A (zh) * | 2019-08-16 | 2019-11-29 | 四川大学华西医院 | 一种老年人健康风险评估方法及其应用 |
| CN110517776B (zh) * | 2019-08-16 | 2023-06-16 | 四川大学华西医院 | 一种老年人健康风险评估方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0520071B2 (ja) | 1993-03-18 |
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