JPH0520071B2 - - Google Patents
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
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Description
本発明はアデノシン−5′−三燐酸（以下ATP
と略称する）の製造法に関し、更に詳しくは、遺
伝子工学的手法によりグルコキナーゼ産生能を増
大させた細菌の培養処理物を用いることを特徴と
するATPの新規製造法に関する。 ATPは全ゆる生物に普遍的に存在する高エネ
ルギー燐酸化合物であつて、生体のほとんど全て
の吸エルゴン反応にエネルギー供与体として関与
し、自らはエネルギー準位の低いテデノシン−
5′−二燐酸（以下ADPと略称する）に転換され
る物質である。かかる作用を有するが故に、
ATPは脳血管障害や筋萎縮症の治療に使用され
るほか、糖ヌクレオチド、シチジン補酵素、ある
種のペプチドなど、数多くの有用な物質の生産に
使用されている。 かかる有用性を持つたATPの製造法としては
１）アデノシンまたはアデノシン−5′−燐酸（以
下AMPと略称する）、燐酸供与体および糖類を含
む反応液に、ミクロバクテリウム属またはコリネ
バクテリウム属の細菌菌体若しくはその菌体処理
物を作用させる方法（特公昭48−156356号、２）
大腸菌から分離精製したポリ燐酸キナーゼを用
い、燐酸ポリマーの存在下でADPを燐酸化する
方法（特公昭53−5752号）、および３）クレアチ
ンキナーゼを固定化し、これをADPとクレアチ
ン燐酸の混液に作用させる方法（特公昭56−
46795号）などが既に知られている。しかしなが
ら、ATP生合成系の酵素を持つた微生物または
その微生物から抽出された該酵素を用い、AMP
およびADPなどのATP前駆体をATPに変換する
これらの方法（酵素法）には、次の様な欠点があ
る。即ち、酵素法によるATPの生合成はエネル
ギー供与系との共役を必要とし、従つてこのエネ
ルギー供与系に関与するクレアチン燐酸またはア
セチル燐酸などの高価な高エネルギー燐酸化合物
を反応系に加えなければならず、一方、これらの
高エネルギー燐酸化合物に代えて細菌の解糖系ま
たは呼吸系などの準細胞分画を使用する場合は、
その活性が低い為、満足すべき結果を得ることが
できない。 細菌を培養しその培養液からATPを抽出する、
いわゆる発酵法は、培養管理が難しいだけでな
く、培養に要する時間が長い割にはATPの収穫
が低いという欠点を有する。 一方、本発明者らは、遺伝子組み換えによつて
解糖系酵素であるフオスフオフルクトキナーゼお
よびトリオース燐酸イソメラーゼ活性を増大させ
た細菌、即ち強力な解糖系角性を有する細菌を調
製し、この細菌の存在下、解糖系基質とATP前
駆体から解糖系を利用してATPを生産せしめた
ところ、効率よくATPが生産されることを見い
出し、これを特許出願した（特開昭57−166992
号）。しかしながら、この方法で使用きる解糖系
基質は特殊なものに限られ、グルコースで代表さ
れる安価な基質を用いた場合は、十分なATPを
製造することができない。 かかる状況に鑑み、本発明者らは、工業的規模
でのATPの生産に適した安価な解糖系基質を使
用しても、十分満足できる量のATPを生産し得
る改良法について鋭意研究した結果、上記の方法
に於いて、フオスフオフルクトキナーゼおよびト
リオース燐酸イソメラーゼ活性を増大させる代り
にグルコキナーゼ活性を高めた細菌を用いれば、
この目的を達成し得ることを見い出した。即ち、
より具体的には、本発明者らは解糖系酵素である
グルコキナーゼを暗号化しいる大腸菌（E.coli）
由来の遺伝子のクローニングに成功し、かかる遺
伝子を挿入した大腸菌由来のプラスミドを大腸菌
に導入し、かくして得られたグルコキナーゼ産生
能の高められた形質転換菌を培養し、その培養乾
燥処理物をATP前駆体および安価な解糖系基質
の混合物に作用させることにより、高収率で
ATPを製造し得ることを見い出し本発明を完成
したものである。 従つて本発明の目的は、グルコキナーゼを暗号
化している遺伝子を担持している細菌性プラスミ
ドを提供することにあり、更にもう１つの目的
は、該プラスミドを導入した大腸菌の培養処理物
を用いてATPを製造する方法を提供することに
ある。 以下に本発明をより詳細に説明する。 グルコキナーゼを暗号化している遺伝子のクロ
ーニングは、特開昭56−120546号に記載の方法と
本質的に同じ方法で行なう。即ち、適当な大腸菌
株から、フエノール法（Biochem.Biophys.
Acta72巻、619〜629、1963年）によつて染色体
DNAを抽出し、適当な制限酵素で断片化する。
ここで使用される制限酵素は、グルコキナーゼ暗
号化遺伝子を破壊しない限りいかなるものであつ
てもよい。一方、ベクタプラスミドpBR322を同
じ制限酵素で切断し、次いでUllrichらの方法
（Nature，196巻1313〜1319、1977年）に準じて
アルカリフオスフアターゼで処理する。こうして
得られる線状プラスミドを先に調製した染色体
DN断片と混合し、アニーリングを行なつた後
T4DNAリガーゼで処理して組み換えDNAを調
製する。 上記の操作で、染色体DNA断片の種類に応じ
た各種の組み換え体が生成するので、これらの一
群の組み換え体から、目的とするグルコキナーゼ
暗号化遺伝子が挿入された組み換え体を以下に述
べる方法で選択する。 グルコース資化能のない大腸菌、例えばE.coli
ZSC112L（gpt，mpt，glk）（この菌株はE.coliか
らEpsteinの方法で調製することができる。J.
Bactericl.Vol.122，1189〜1199（1975年）参照。）
をカルシウムイオン処理してコンピテント化し
（Melec.gen.Gent.、124巻１〜10、1973年）、これ
に組み換えDNAを導入する。かくして得られる
DNA導入株をアンピシリン含有化グルコースマ
ツコンキー培地で培養し、淡赤色コロニーを選択
する。次いでマンノースマツコンキー培地と
BCIG培地にレプリカし、前者では白色であり後
者では青色のコロニーを選択する。この様にし
て、所望のグルコキナーゼ暗号化遺伝子を担持し
ているプラスミドDNAが導入され菌株を選択、
単離することができる。 上で得た所望の菌株を培養し、常法により組み
換えプラスミドを分離し、これを適当な大腸菌株
に導入することによつてグルコキナーゼ酵素活性
の増強した菌株を得ることができる。この菌株は
常法に従つて培養することができるが、他の成分
と共に0.05〜0.3重量％のリン酸水素アンモニウ
ムおよび0.05〜５重量％のフルクトースを含有す
る培地を使用し、25〜40℃、好ましくは約28℃で
10〜20時間培養すると、最もグルコキナーゼ酵素
活性の高い培養菌を得ることができる。 この様にして培養した後、集洗菌し、破砕また
は乾燥などの処理を施す。こうして得た、グルコ
キナーゼに富んだ培養乾燥処理物は、特公昭57−
166992号に記載の方法とほゞ同様の方法で、
ATPの生産に使用することができる。即ち、
ATP前駆体５〜50mM、解糖系基質50〜
500mM、硫酸マグネシウム５〜50mM、燐酸緩
衝液50mM〜800mM、NAD（β−ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオタイド）0.1〜0.5mMおよ
びATP0.01mMからなる反応液（PH6.0〜9.5）に
培養乾燥処理物を10〜50mg／mlの割合で添加し、
25〜37℃で30分〜３時間、振盪しながら反応させ
ることにより、好収率でATPを製造することが
できる。尚、反応液中のATPは常法により単離、
精製することができる。 上記の培養乾燥処理物は、破砕した細胞をその
まま乾燥したものであるが、この他、破砕した細
胞から遠心分離で粗グルコキナーゼを抽出したも
の（無細胞抽出液）および菌体をそのまま適当な
担体に担持させたもの（固定化菌体）も同様にし
て使用することができる。本明細書に於いて、培
養処理物なる用語はこれらの全てを包括的に表わ
すものとする。 以下に実施例を挙げ、本発明の好ましい態様を
説明する。実施例中、特に明記しない限り、％は
重量％を表わす。 実施例 １ E.coli Ｂ（ATCC 23266）をＬ−培地（ペプト
ン１％、酵母エキス0.5％、グルコース0.1％、塩
化ナトリウム0.5％、PH7.2）200ml中、28℃で５
時間振とう培養した。菌体を集洗菌後、Saito
Miuraの方法〔Biochem.Biophy.Acta，72 619
〜629（1963）〕でフエノール処理し、染色体
DNA1mgを得た。次にアンピシリン耐性及びテト
ラサイクリン耐性を有する。pBR322プラスミド
のDNAを保持したＥ，coliK12ZSC112をＬ−培
地１で培養し、OD610on0.5〜0.6で200μg／mlの
クロラムフエニコールを添加して37℃で15時間培
養を続けた。菌体を集菌洗浄後リゾチーム及びソ
デイウムドデシルサルフエートで溶菌させ、
35000ｇで１時間遠心して上清を得た。上清をフ
エノール・クロロホルム混合液で等量加えて攪拌
し、遠心し（10000r.p.m10分）、タンパク等を除
き、リボ核酸分解酵素で37℃で３時間処理し、次
いでセシウムクロリド・エチジムブロミド平衡密
度勾配遠心を36000r.p.m（48時間、20℃）で行な
い、pBR322プラスミドDNA1mgを得た。先に得
た染色体DNAμgをとり制限酵素Hindと30分反
応させて部分分解し一方、ベクタープラスミド
pBR322DNA1.1μgも同じ酵素Hindと３時間反
応させ、完全に切断させた。 pBR322DNAは完全に切断させたかどうか、
アガロース電気泳動にて確認した。さらに両反応
液を各々65℃で５分間加熱処理した後、両反応液
をすぐさま混合し、T4フアージ由来のDNAリガ
ーゼを用い、４℃で16時間結合反応を行なつた。
次いで65℃で５分間加熱処理した後、反応液に２
培容の冷エタノールを加え、−20℃で一夜放置後
10000r.p.mで遠心して沈でんを集め、これを
10mMトリス・塩酸緩衝液（PH7.5）0.1mlに溶解
しDNA溶液とした。E.colik12ZSC112L（グルコ
ース資化能欠損株）を、糖源をグルコースの代り
にフラクトースとしたＬ−培地50mlにて対数増殖
中期（OD610mm0.4）まで生育させた後、塩化カ
ルシウム100mMを含むトリス緩衝液（50mMPH
7.6）で洗浄後、同じ緩衝液2.0mlに懸濁させた
後、その懸濁液0.2mlに、すでに調製した0.1mlの
DNA液を加え、０℃にて20分間保持した後、す
ぐさま37℃30分間の熱を与え、DNAを細胞内に
取り込ませた。次に、この懸濁液をＬ−培地に移
し、２時間振とう培養した。菌体を集洗菌後アン
ピシリン20μg／mlを含むグルコース・マツコン
キー培地（ペプトン２％、コール酸ナトリウム
0.15％、NaCl0.5％、ニユートラルレツド0.003
％、クリスタルバイオレツト0.00001％、グルコ
ース１％）に塗布し、30℃で一夜培養した。生じ
たコロニーより赤いコロニーについて更にマンノ
ース・マツツコンキー（グルコースの代りにマン
ノースを等量加えたもの）及びBCIG培地
（BCIG20μg／mlを含むグルコース１％、ラクト
ース0.2％を加えたDavis−mingioli最少培地）に
レプリカを行ない、マンノース・マツツコンキー
培地では白いコロニー、BCIG培地では青いコロ
ニーであるコロニーを選択し、グルコキナーゼ遺
伝子を含む形質転換体ZSC1121L／pGK100を得
た。次に形質転換体ZSC112L／pGK100のプラス
ミドpGK100DNAを抽出するが、これは先の
pBR322DNAを抽出した時と同様の操作を行な
い、pGK100プラスミドDNA1mgを１の培養か
ら得た。このDNAをE.coliBに取り込ませ、アン
ピシリンを含むＬ−培地で培養し、生じて来たコ
ロニーから形質転換体Ｅ，coliB／pGK100を取
得した。 所望の組み換えプラスミドを含有する菌株をＬ
−broth（グルコース0.2％、ポリペプトン１％、
イーストエクストラクト0.5％、NaCl0.5％、アン
ピシリン20μg／mlを含む）で培養し、常法によ
り該プラスミドを分離し、制限分析によりその構
造を確認した。このプラスミドは、8.8Mdであ
り、本発明者らによりプラスミドpGK100と命名
された。プラスミドpGK100の制限地図を第１図
Ａに示す。図中、白ヌキ環状部はpBK322由来の
DNA、黒ベタ環状部はE.coliB（ATCC 23226）
株の染色体由来のDNA断片（6.0Md）を示して
いる。グルコキナーゼ暗号化遺伝子は、制限酵素
Mluで0.82Mdに切断されるF2の範囲のDNA断
片に載つている。 このプラスミドpGK100をMluで部分分解
し、アガロース電気泳動で7.02Mdの分子量をも
つDNAフラグメントを抽出し、再びT4DNAリ
ガーゼでライゲーシヨンを行なうとF1およびF3
の範囲のDNA断片が削除された組み換え体が得
られる。このプラスミドもグルコキナーゼ暗号化
遺伝子を保持しており、本発明の目的に使用する
ことができる。このプラスミドは7.02Mdであり、
pGK100−５と命名された。その制限地図を第１
図Ｂに示す。 プラスミドpGK100およびpGK100−５は、い
づれも大腸菌Ｂ株に導入されて工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されており、（寄託日：昭
和58年10月29日）、それぞれFERMp−7319、
FERMp−7320で入手可能であり、プラスミド
pGK100およびpGK100−５の供給源として利用
することができる。 実施例 ２ Ｌ−broth培地50mlにＥ，coliをOD610nm約0.3
になるまで培養し、集菌する。集菌は殺菌したプ
ラスチツク製遠心管で10000r.p.m5分間の遠心を
行なう。次に1/2量の10mMNaClで洗浄し、遠心
でNaCl液を除いたあと、1/2量のCaCl2溶液
（30mMCaCl2−50mMTris、PH7.5）に懸濁し、
プラスミド液とともに０℃、25分間の処理をし、
次に37℃30分間処理を行ない、アンピシリンを含
むＬ−broth培地で生育させ、プラスミド
pGK100およびpGK100−５をそれぞれE.coliBに
導入した菌体を選択する。得られた形質転換菌
を、フルクトース0.5％、K2HPO40.7％、
KH2PO40.3％、MgSO4・7H2O0.01％および
（NH4）2HPO40.3％を含有する液体培地に接種し、
30℃で８時間振盪培養する。培養終了後集洗菌
し、10mMのMgCl2を含む50mMの燐酸緩衝液
（PH7.6）に懸濁して菌体を破砕した後遠心分離
（100000ｇ、60分）し、その上清を用いてグルコ
キナーゼ活性（注１）を測定した。対照として、
グルコキナーゼ欠損株であるZSC112Lおよびグ
ルコース資化能を有するC600及びＢ株について
も同様の操作を行ない、グルコキナーゼ活性を比
較した。結果を以下の表１に挙げる。
と略称する）の製造法に関し、更に詳しくは、遺
伝子工学的手法によりグルコキナーゼ産生能を増
大させた細菌の培養処理物を用いることを特徴と
するATPの新規製造法に関する。 ATPは全ゆる生物に普遍的に存在する高エネ
ルギー燐酸化合物であつて、生体のほとんど全て
の吸エルゴン反応にエネルギー供与体として関与
し、自らはエネルギー準位の低いテデノシン−
5′−二燐酸（以下ADPと略称する）に転換され
る物質である。かかる作用を有するが故に、
ATPは脳血管障害や筋萎縮症の治療に使用され
るほか、糖ヌクレオチド、シチジン補酵素、ある
種のペプチドなど、数多くの有用な物質の生産に
使用されている。 かかる有用性を持つたATPの製造法としては
１）アデノシンまたはアデノシン−5′−燐酸（以
下AMPと略称する）、燐酸供与体および糖類を含
む反応液に、ミクロバクテリウム属またはコリネ
バクテリウム属の細菌菌体若しくはその菌体処理
物を作用させる方法（特公昭48−156356号、２）
大腸菌から分離精製したポリ燐酸キナーゼを用
い、燐酸ポリマーの存在下でADPを燐酸化する
方法（特公昭53−5752号）、および３）クレアチ
ンキナーゼを固定化し、これをADPとクレアチ
ン燐酸の混液に作用させる方法（特公昭56−
46795号）などが既に知られている。しかしなが
ら、ATP生合成系の酵素を持つた微生物または
その微生物から抽出された該酵素を用い、AMP
およびADPなどのATP前駆体をATPに変換する
これらの方法（酵素法）には、次の様な欠点があ
る。即ち、酵素法によるATPの生合成はエネル
ギー供与系との共役を必要とし、従つてこのエネ
ルギー供与系に関与するクレアチン燐酸またはア
セチル燐酸などの高価な高エネルギー燐酸化合物
を反応系に加えなければならず、一方、これらの
高エネルギー燐酸化合物に代えて細菌の解糖系ま
たは呼吸系などの準細胞分画を使用する場合は、
その活性が低い為、満足すべき結果を得ることが
できない。 細菌を培養しその培養液からATPを抽出する、
いわゆる発酵法は、培養管理が難しいだけでな
く、培養に要する時間が長い割にはATPの収穫
が低いという欠点を有する。 一方、本発明者らは、遺伝子組み換えによつて
解糖系酵素であるフオスフオフルクトキナーゼお
よびトリオース燐酸イソメラーゼ活性を増大させ
た細菌、即ち強力な解糖系角性を有する細菌を調
製し、この細菌の存在下、解糖系基質とATP前
駆体から解糖系を利用してATPを生産せしめた
ところ、効率よくATPが生産されることを見い
出し、これを特許出願した（特開昭57−166992
号）。しかしながら、この方法で使用きる解糖系
基質は特殊なものに限られ、グルコースで代表さ
れる安価な基質を用いた場合は、十分なATPを
製造することができない。 かかる状況に鑑み、本発明者らは、工業的規模
でのATPの生産に適した安価な解糖系基質を使
用しても、十分満足できる量のATPを生産し得
る改良法について鋭意研究した結果、上記の方法
に於いて、フオスフオフルクトキナーゼおよびト
リオース燐酸イソメラーゼ活性を増大させる代り
にグルコキナーゼ活性を高めた細菌を用いれば、
この目的を達成し得ることを見い出した。即ち、
より具体的には、本発明者らは解糖系酵素である
グルコキナーゼを暗号化しいる大腸菌（E.coli）
由来の遺伝子のクローニングに成功し、かかる遺
伝子を挿入した大腸菌由来のプラスミドを大腸菌
に導入し、かくして得られたグルコキナーゼ産生
能の高められた形質転換菌を培養し、その培養乾
燥処理物をATP前駆体および安価な解糖系基質
の混合物に作用させることにより、高収率で
ATPを製造し得ることを見い出し本発明を完成
したものである。 従つて本発明の目的は、グルコキナーゼを暗号
化している遺伝子を担持している細菌性プラスミ
ドを提供することにあり、更にもう１つの目的
は、該プラスミドを導入した大腸菌の培養処理物
を用いてATPを製造する方法を提供することに
ある。 以下に本発明をより詳細に説明する。 グルコキナーゼを暗号化している遺伝子のクロ
ーニングは、特開昭56−120546号に記載の方法と
本質的に同じ方法で行なう。即ち、適当な大腸菌
株から、フエノール法（Biochem.Biophys.
Acta72巻、619〜629、1963年）によつて染色体
DNAを抽出し、適当な制限酵素で断片化する。
ここで使用される制限酵素は、グルコキナーゼ暗
号化遺伝子を破壊しない限りいかなるものであつ
てもよい。一方、ベクタプラスミドpBR322を同
じ制限酵素で切断し、次いでUllrichらの方法
（Nature，196巻1313〜1319、1977年）に準じて
アルカリフオスフアターゼで処理する。こうして
得られる線状プラスミドを先に調製した染色体
DN断片と混合し、アニーリングを行なつた後
T4DNAリガーゼで処理して組み換えDNAを調
製する。 上記の操作で、染色体DNA断片の種類に応じ
た各種の組み換え体が生成するので、これらの一
群の組み換え体から、目的とするグルコキナーゼ
暗号化遺伝子が挿入された組み換え体を以下に述
べる方法で選択する。 グルコース資化能のない大腸菌、例えばE.coli
ZSC112L（gpt，mpt，glk）（この菌株はE.coliか
らEpsteinの方法で調製することができる。J.
Bactericl.Vol.122，1189〜1199（1975年）参照。）
をカルシウムイオン処理してコンピテント化し
（Melec.gen.Gent.、124巻１〜10、1973年）、これ
に組み換えDNAを導入する。かくして得られる
DNA導入株をアンピシリン含有化グルコースマ
ツコンキー培地で培養し、淡赤色コロニーを選択
する。次いでマンノースマツコンキー培地と
BCIG培地にレプリカし、前者では白色であり後
者では青色のコロニーを選択する。この様にし
て、所望のグルコキナーゼ暗号化遺伝子を担持し
ているプラスミドDNAが導入され菌株を選択、
単離することができる。 上で得た所望の菌株を培養し、常法により組み
換えプラスミドを分離し、これを適当な大腸菌株
に導入することによつてグルコキナーゼ酵素活性
の増強した菌株を得ることができる。この菌株は
常法に従つて培養することができるが、他の成分
と共に0.05〜0.3重量％のリン酸水素アンモニウ
ムおよび0.05〜５重量％のフルクトースを含有す
る培地を使用し、25〜40℃、好ましくは約28℃で
10〜20時間培養すると、最もグルコキナーゼ酵素
活性の高い培養菌を得ることができる。 この様にして培養した後、集洗菌し、破砕また
は乾燥などの処理を施す。こうして得た、グルコ
キナーゼに富んだ培養乾燥処理物は、特公昭57−
166992号に記載の方法とほゞ同様の方法で、
ATPの生産に使用することができる。即ち、
ATP前駆体５〜50mM、解糖系基質50〜
500mM、硫酸マグネシウム５〜50mM、燐酸緩
衝液50mM〜800mM、NAD（β−ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオタイド）0.1〜0.5mMおよ
びATP0.01mMからなる反応液（PH6.0〜9.5）に
培養乾燥処理物を10〜50mg／mlの割合で添加し、
25〜37℃で30分〜３時間、振盪しながら反応させ
ることにより、好収率でATPを製造することが
できる。尚、反応液中のATPは常法により単離、
精製することができる。 上記の培養乾燥処理物は、破砕した細胞をその
まま乾燥したものであるが、この他、破砕した細
胞から遠心分離で粗グルコキナーゼを抽出したも
の（無細胞抽出液）および菌体をそのまま適当な
担体に担持させたもの（固定化菌体）も同様にし
て使用することができる。本明細書に於いて、培
養処理物なる用語はこれらの全てを包括的に表わ
すものとする。 以下に実施例を挙げ、本発明の好ましい態様を
説明する。実施例中、特に明記しない限り、％は
重量％を表わす。 実施例 １ E.coli Ｂ（ATCC 23266）をＬ−培地（ペプト
ン１％、酵母エキス0.5％、グルコース0.1％、塩
化ナトリウム0.5％、PH7.2）200ml中、28℃で５
時間振とう培養した。菌体を集洗菌後、Saito
Miuraの方法〔Biochem.Biophy.Acta，72 619
〜629（1963）〕でフエノール処理し、染色体
DNA1mgを得た。次にアンピシリン耐性及びテト
ラサイクリン耐性を有する。pBR322プラスミド
のDNAを保持したＥ，coliK12ZSC112をＬ−培
地１で培養し、OD610on0.5〜0.6で200μg／mlの
クロラムフエニコールを添加して37℃で15時間培
養を続けた。菌体を集菌洗浄後リゾチーム及びソ
デイウムドデシルサルフエートで溶菌させ、
35000ｇで１時間遠心して上清を得た。上清をフ
エノール・クロロホルム混合液で等量加えて攪拌
し、遠心し（10000r.p.m10分）、タンパク等を除
き、リボ核酸分解酵素で37℃で３時間処理し、次
いでセシウムクロリド・エチジムブロミド平衡密
度勾配遠心を36000r.p.m（48時間、20℃）で行な
い、pBR322プラスミドDNA1mgを得た。先に得
た染色体DNAμgをとり制限酵素Hindと30分反
応させて部分分解し一方、ベクタープラスミド
pBR322DNA1.1μgも同じ酵素Hindと３時間反
応させ、完全に切断させた。 pBR322DNAは完全に切断させたかどうか、
アガロース電気泳動にて確認した。さらに両反応
液を各々65℃で５分間加熱処理した後、両反応液
をすぐさま混合し、T4フアージ由来のDNAリガ
ーゼを用い、４℃で16時間結合反応を行なつた。
次いで65℃で５分間加熱処理した後、反応液に２
培容の冷エタノールを加え、−20℃で一夜放置後
10000r.p.mで遠心して沈でんを集め、これを
10mMトリス・塩酸緩衝液（PH7.5）0.1mlに溶解
しDNA溶液とした。E.colik12ZSC112L（グルコ
ース資化能欠損株）を、糖源をグルコースの代り
にフラクトースとしたＬ−培地50mlにて対数増殖
中期（OD610mm0.4）まで生育させた後、塩化カ
ルシウム100mMを含むトリス緩衝液（50mMPH
7.6）で洗浄後、同じ緩衝液2.0mlに懸濁させた
後、その懸濁液0.2mlに、すでに調製した0.1mlの
DNA液を加え、０℃にて20分間保持した後、す
ぐさま37℃30分間の熱を与え、DNAを細胞内に
取り込ませた。次に、この懸濁液をＬ−培地に移
し、２時間振とう培養した。菌体を集洗菌後アン
ピシリン20μg／mlを含むグルコース・マツコン
キー培地（ペプトン２％、コール酸ナトリウム
0.15％、NaCl0.5％、ニユートラルレツド0.003
％、クリスタルバイオレツト0.00001％、グルコ
ース１％）に塗布し、30℃で一夜培養した。生じ
たコロニーより赤いコロニーについて更にマンノ
ース・マツツコンキー（グルコースの代りにマン
ノースを等量加えたもの）及びBCIG培地
（BCIG20μg／mlを含むグルコース１％、ラクト
ース0.2％を加えたDavis−mingioli最少培地）に
レプリカを行ない、マンノース・マツツコンキー
培地では白いコロニー、BCIG培地では青いコロ
ニーであるコロニーを選択し、グルコキナーゼ遺
伝子を含む形質転換体ZSC1121L／pGK100を得
た。次に形質転換体ZSC112L／pGK100のプラス
ミドpGK100DNAを抽出するが、これは先の
pBR322DNAを抽出した時と同様の操作を行な
い、pGK100プラスミドDNA1mgを１の培養か
ら得た。このDNAをE.coliBに取り込ませ、アン
ピシリンを含むＬ−培地で培養し、生じて来たコ
ロニーから形質転換体Ｅ，coliB／pGK100を取
得した。 所望の組み換えプラスミドを含有する菌株をＬ
−broth（グルコース0.2％、ポリペプトン１％、
イーストエクストラクト0.5％、NaCl0.5％、アン
ピシリン20μg／mlを含む）で培養し、常法によ
り該プラスミドを分離し、制限分析によりその構
造を確認した。このプラスミドは、8.8Mdであ
り、本発明者らによりプラスミドpGK100と命名
された。プラスミドpGK100の制限地図を第１図
Ａに示す。図中、白ヌキ環状部はpBK322由来の
DNA、黒ベタ環状部はE.coliB（ATCC 23226）
株の染色体由来のDNA断片（6.0Md）を示して
いる。グルコキナーゼ暗号化遺伝子は、制限酵素
Mluで0.82Mdに切断されるF2の範囲のDNA断
片に載つている。 このプラスミドpGK100をMluで部分分解
し、アガロース電気泳動で7.02Mdの分子量をも
つDNAフラグメントを抽出し、再びT4DNAリ
ガーゼでライゲーシヨンを行なうとF1およびF3
の範囲のDNA断片が削除された組み換え体が得
られる。このプラスミドもグルコキナーゼ暗号化
遺伝子を保持しており、本発明の目的に使用する
ことができる。このプラスミドは7.02Mdであり、
pGK100−５と命名された。その制限地図を第１
図Ｂに示す。 プラスミドpGK100およびpGK100−５は、い
づれも大腸菌Ｂ株に導入されて工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されており、（寄託日：昭
和58年10月29日）、それぞれFERMp−7319、
FERMp−7320で入手可能であり、プラスミド
pGK100およびpGK100−５の供給源として利用
することができる。 実施例 ２ Ｌ−broth培地50mlにＥ，coliをOD610nm約0.3
になるまで培養し、集菌する。集菌は殺菌したプ
ラスチツク製遠心管で10000r.p.m5分間の遠心を
行なう。次に1/2量の10mMNaClで洗浄し、遠心
でNaCl液を除いたあと、1/2量のCaCl2溶液
（30mMCaCl2−50mMTris、PH7.5）に懸濁し、
プラスミド液とともに０℃、25分間の処理をし、
次に37℃30分間処理を行ない、アンピシリンを含
むＬ−broth培地で生育させ、プラスミド
pGK100およびpGK100−５をそれぞれE.coliBに
導入した菌体を選択する。得られた形質転換菌
を、フルクトース0.5％、K2HPO40.7％、
KH2PO40.3％、MgSO4・7H2O0.01％および
（NH4）2HPO40.3％を含有する液体培地に接種し、
30℃で８時間振盪培養する。培養終了後集洗菌
し、10mMのMgCl2を含む50mMの燐酸緩衝液
（PH7.6）に懸濁して菌体を破砕した後遠心分離
（100000ｇ、60分）し、その上清を用いてグルコ
キナーゼ活性（注１）を測定した。対照として、
グルコキナーゼ欠損株であるZSC112Lおよびグ
ルコース資化能を有するC600及びＢ株について
も同様の操作を行ない、グルコキナーゼ活性を比
較した。結果を以下の表１に挙げる。
【表】
尚、E.coliB株及びE.coliB／pGK100を各種の
炭素および窒素源を含む最小培地で培養した場合
のグルコキナーゼ活性を測定したところ、表２の
様な結果が得られた。この実験の結果、最もグル
コキナーゼの活性を上昇させる炭素源はフラクト
ースで、Ｎ源はリン酸水素アンモニウムであり、
これらを含む最少培地で培養すれば良いことがわ
かつた。
炭素および窒素源を含む最小培地で培養した場合
のグルコキナーゼ活性を測定したところ、表２の
様な結果が得られた。この実験の結果、最もグル
コキナーゼの活性を上昇させる炭素源はフラクト
ースで、Ｎ源はリン酸水素アンモニウムであり、
これらを含む最少培地で培養すれば良いことがわ
かつた。
【表】
を示している。
実施例 ３ E.coliBおよびE.coliB／pGK100それぞれグル
コース0.5％、K2HPO40.7％、KH2PO40.3％、
MgSO4・7H2O0.01％および（NH4）2HPO40.1％
を含有する培地（培地Ａ）、およびフルクトース
0.5％、KH2PO40.3％、K2HPO40.7％、MgSO4・
7H2O0.01％および（NH4）2HPO40.3％を含有す
る培地（培地Ｂ）で実施例２と同じ条件下で培養
し、培養終了後集洗菌し、菌体を25℃（RH60
％）で一夜乾燥した後さらに真空デシケータ内の
五酸化リンで完全に乾燥させた。 AMP30mM、グルコース200ｍＭ、燐酸緩衝液
（PH8.0）500mM、硫酸マグネシウム・７水塩
30mM、ATP1mMおよびNAD（β−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオタイド）1mMを含む反
応液0.5mlに上記乾燥菌体を100mg／mlの割合で添
加し、28℃で振盪して反応させる。反応開始から
１時間後および２時間後に於ける反応液中の
ATP含量を常法により測定した。結果を以下の
表３に示す。
実施例 ３ E.coliBおよびE.coliB／pGK100それぞれグル
コース0.5％、K2HPO40.7％、KH2PO40.3％、
MgSO4・7H2O0.01％および（NH4）2HPO40.1％
を含有する培地（培地Ａ）、およびフルクトース
0.5％、KH2PO40.3％、K2HPO40.7％、MgSO4・
7H2O0.01％および（NH4）2HPO40.3％を含有す
る培地（培地Ｂ）で実施例２と同じ条件下で培養
し、培養終了後集洗菌し、菌体を25℃（RH60
％）で一夜乾燥した後さらに真空デシケータ内の
五酸化リンで完全に乾燥させた。 AMP30mM、グルコース200ｍＭ、燐酸緩衝液
（PH8.0）500mM、硫酸マグネシウム・７水塩
30mM、ATP1mMおよびNAD（β−ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオタイド）1mMを含む反
応液0.5mlに上記乾燥菌体を100mg／mlの割合で添
加し、28℃で振盪して反応させる。反応開始から
１時間後および２時間後に於ける反応液中の
ATP含量を常法により測定した。結果を以下の
表３に示す。
【表】
実施例 ４
培地Ｂを使用し、乾燥菌体の量を50mg／mlの割
合で添加するほかは実施例３と同様の実験を行な
つた。得られた結果を表４に示す。
合で添加するほかは実施例３と同様の実験を行な
つた。得られた結果を表４に示す。
【表】
実施例 ５
培地Ａに於けるグルコースの代りに種々の解糖
系中間体を基質として用いるほかは実施例３と同
様の実験を行なつた（反応時間１時間）。得られ
た結果を以下の表５に示す。
系中間体を基質として用いるほかは実施例３と同
様の実験を行なつた（反応時間１時間）。得られ
た結果を以下の表５に示す。
【表】
表５から明らかな様に、E.coliBとE.coliB／
pGK100のATP生産量には、グルコースを使用し
た場合にのみ差が見られた。 実施例 ６ 実施例３に於いて培地Ｂを用いて培養した菌体
を用い、各種濃度の燐酸緩衝液（PH8.0）中で
ATPを製造した（反応時間：１時間）。得られた
結果を以下の表６に示す。
pGK100のATP生産量には、グルコースを使用し
た場合にのみ差が見られた。 実施例 ６ 実施例３に於いて培地Ｂを用いて培養した菌体
を用い、各種濃度の燐酸緩衝液（PH8.0）中で
ATPを製造した（反応時間：１時間）。得られた
結果を以下の表６に示す。
【表】
実施例 ７
実施例３のATP製造反応を反応液10mlを用い
て３時間行なつた後加熱して反応を止め、反応液
を過し、液に濃塩酸を加えてPH3.5に調節し
た後活性炭カラムに通す。カラムを水洗し、次い
で1.5％アンモニアを含む５％メチルエチルケト
ンを通して吸着物を溶出する溶出液を濃縮し、陰
イオン交換樹脂Dowex1（Cl-）カラムに通して
ATPを吸着させる。水洗後、塩酸と食塩水の混
液を通して溶出し、ATP画分を集めて濃縮する。
濃縮液に５倍量のエタノールを加えてMTPの結
晶を析出させる。ATPの吸量：120mg（AMPに
基づく収率：80％）。
て３時間行なつた後加熱して反応を止め、反応液
を過し、液に濃塩酸を加えてPH3.5に調節し
た後活性炭カラムに通す。カラムを水洗し、次い
で1.5％アンモニアを含む５％メチルエチルケト
ンを通して吸着物を溶出する溶出液を濃縮し、陰
イオン交換樹脂Dowex1（Cl-）カラムに通して
ATPを吸着させる。水洗後、塩酸と食塩水の混
液を通して溶出し、ATP画分を集めて濃縮する。
濃縮液に５倍量のエタノールを加えてMTPの結
晶を析出させる。ATPの吸量：120mg（AMPに
基づく収率：80％）。
第１図ＡおよびＢはそれぞれプラスミド
pGK100およびプラスミドpGK100−５の制限地
図である。
pGK100およびプラスミドpGK100−５の制限地
図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 解糖系酵素群の存在下でアデノシン−5′−三
燐酸前駆体および解糖系基質から解糖系を利用し
てアデノシン−5′−三燐酸を製造する方法であつ
て、該解糖系酵素群として、次の制限部位および
機能地図： で示される構造を有し、大腸菌のグルコキナーゼ
遺伝子を含有する分子量8.8Mdのプラスミド
pGK100、または次の制限部位および機能地図： で示される構造を有し、大腸菌のグルコキナーゼ
遺伝子を含有する分子量7.02Mdのプラスミド
pGK100−５で形質転換し培養することによつて
グルコキナーゼ活性を高めた大腸菌の培養処理物
を使用することを特徴とする方法。 ２ 形質転換した大腸菌の培養を、0.05〜0.3重
量％のリン酸水素アンモニウムおよび0.05〜５重
量％のフルクトースを含有する培地中、25〜40℃
で10〜20時間行うことを特徴とする第１項に記載
の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58208087A JPS60102195A (ja) | 1983-11-05 | 1983-11-05 | アデノシン−５’−三燐酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58208087A JPS60102195A (ja) | 1983-11-05 | 1983-11-05 | アデノシン−５’−三燐酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60102195A JPS60102195A (ja) | 1985-06-06 |
| JPH0520071B2 true JPH0520071B2 (ja) | 1993-03-18 |
Family
ID=16550420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58208087A Granted JPS60102195A (ja) | 1983-11-05 | 1983-11-05 | アデノシン−５’−三燐酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60102195A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4146095B2 (ja) | 2001-01-15 | 2008-09-03 | ユニチカ株式会社 | 耐熱性グルコキナーゼ遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いた耐熱性グルコキナーゼの製造方法 |
| CN110517776B (zh) * | 2019-08-16 | 2023-06-16 | 四川大学华西医院 | 一种老年人健康风险评估方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS535752A (en) * | 1976-07-06 | 1978-01-19 | Tokai Rika Co Ltd | Dc load control unit |
| JPS5646795A (en) * | 1979-09-22 | 1981-04-28 | Hiroichi Yamaguchi | Drawing method for panorama |
| JPS57166992A (en) * | 1981-04-08 | 1982-10-14 | Seitetsu Kagaku Co Ltd | Preparation of adenosine-5'-triphosphate |
-
1983
- 1983-11-05 JP JP58208087A patent/JPS60102195A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS535752A (en) * | 1976-07-06 | 1978-01-19 | Tokai Rika Co Ltd | Dc load control unit |
| JPS5646795A (en) * | 1979-09-22 | 1981-04-28 | Hiroichi Yamaguchi | Drawing method for panorama |
| JPS57166992A (en) * | 1981-04-08 | 1982-10-14 | Seitetsu Kagaku Co Ltd | Preparation of adenosine-5'-triphosphate |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60102195A (ja) | 1985-06-06 |
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