KR100237091B1 - 플라빈 뉴클레오타이드의 제조방법 - Google Patents

플라빈 뉴클레오타이드의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에스케리챠, 엔테로박터 또는 슈도모나스속에 속하고 FMN 및/또는 FAD의 합성과 관련한 유전 정보를 수반하는 DNA 단편과 벡터 DNA를 포함하는 재조합 DNA를 갖는 미생물의 세포 또는 배양물, 또는 이러한 미생물의 처리된 세포 또는 처리된 배양물을 사용함으로써, 플라빈 뉴클레오타이드 전구체와 ATP로부터 영양 조성물의 성분, 각종 약제물에 대한 원료 물질, 생화학 연구용 시약 등으로서 유용한 플라빈 뉴클레오타이드를 제조하는 것에 관한 것이다.

Description

플라빈 뉴클레오타이드의 제조방법
본 발명은 미생물을 사용하여 플라빈 뉴클레오타이드, 특히 플라빈 모노뉴클레오타이드(FMN) 및/또는 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
비타민 B2의 조효소 형태인 FMN 및 FAD는 영양 조성물 또는 각종 약제를 제조하는 원료물질로서 유용할 뿐만 아니라 생화학 분야에서 사용될 시약으로서도 중요하다. 이들은 현재 각종 바이오산업(bioindustry) 분야에 사용되고 있다.
플라빈 뉴클레오타이드를 제조하기 위한 각종 방법이 공지되어 있다. 예를 들면, ATP 전구체, 포스페이트 공여체 및 에너지 공여체로부터 아데노신-5′-트리포스페이트(ATP)를 형성할 수 있으며 또한 FMN과 ATP로부처 FAD를 형성할 수 있는 코리네박테륨(Corynebacterium) 또는 브레비박테륨(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물을 사용하는 방법[참조: JP-A-Sho-59-132892]과, 코리네박테륨 또는 브레비박테륨 속에 속하는 미생물로부터 유도된 바와 같은 FMN 또는 FAD의 합성과 관련한 유전 정보를 수반하는 DNA 단편을 함유하는 재조합 DNA를 갖는 코리네박테륨 또는 브레비박테륨 속에 속하는 미생물을 사용하는 방법[참조 : JP-A-Hei-2-138988]을 언급할 수 있다(본 명세서내에서 사용된 “JP-A”는 심사되지 않고 공개된 일본국 특허원을 의미한다).
추가로, 브레비박테륨 속에 속하는 미생물에서는, 리보플라빈(FR)과 ATP로부터 FMN을 형성하는 플라보키나제(FK) 활성 및 FMN과 ATP로부터 FAD를 형성하는 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 신세타제(FADS) 활성이 하나의 동일한 단백질 상에서 발생된다는 것이 공지되어 있다[참조: Journal of Biological Chemistry, 261, 16169-16173].
그러나, FMN 및/또는 FAD의 합성과 관련한 유전 정보를 수반하는 DNA 단편을 함유하는 재조합 DNA를 갖는 에스케리챠(Escherichia), 엔테로박터(Enterobacter) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 미생물을 사용하는 방법은 전혀 공지되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 영양 조성물의 성분, 각종 약제 제조용 원료 물질 및 생화학적 연구용 시약으로서 중요한 플라빈 뉴클레오타이드를 저렴한 방법으로 고수율로 제조하는 것이다.
본 발명은 에스케리챠, 엔테로박터 또는 슈도모나스 속에 속하는 미생물로부터 유도되고 FMN 및/또는 FAD의 합성과 관련한 유전 정보를 수반하는 DNA 단편을 함유하는 재조합 DNA를 갖는 미생물의 세포 또는 배양물, 또는 이러한 미생물의 처리된 세포 또는 배양물의 존재하에, 회수가능한 양의 플라빈 뉴클레오타이드가 수성 배지중에 축적될 때까지 플라빈 뉴클레오타이드 전구체를 수성 배지중에서 ATP와 반응시킨 다음, 이렇게 하여 생성된 플라빈 뉴클레오타이드를 수성 배지로부터 회수함을 포함하는 플라빈 뉴클레오타이드의 제조방법을 제공해준다.
플라빈 뉴클레오타이드 전구체로서 리보플라빈 및 플라빈 모노뉴클레오타이드가 유용하다. 제조하고자 하는 플라빈 뉴클레오타이드로는 플라빈 모노뉴클레오타이드와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드가 있다.
DNA 단편으로서, FK 활성과 FADS 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부를 함유하는 DNA 단편, 또는 FK 활성은 보유하지만 FADS 활성이 전혀 없거나 저하된 전술된 단백질의 변형 단백질을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부를 함유하는 DNA 단편을 언급할 수 있다. 전자의 예는 단백질 X를 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부를 함유하는 DNA 단편이다[참조 : Journal of Biological Chemistry, 260, 5616-5620(1985)]. 후자의 예는 N-말단으로부터의 23번째 위치의 글리신 잔기가 글리신 이외의 아미노산으로 치환된 단백질 X의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부를 함유하는 DNA 단편이다. 치환체 아미노산으로는 아르기닌, 알라닌, 아스파르트산 등이 적당하다.
DNA 단편의 공급원으로서 작용하는 미생물은 에스케리챠, 엔테로박터, 슈도모나스속 등에 속하는 어떠한 미생물일 수 있으나, 단 이러한 미생물은 FK 활성과 FADS 활성 모두를 지니거나, FK 활성은 보유하지만 FADS 활성은 전혀 없거나 저하되거나 또는 단백질 X를 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부를 함유하고 있어야 한다. FK 활성과 FADS 활성 모두를 지니고 있는 미생물의 특정예로는 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli) K12와 이의 변이체인 에스케리챠 콜라이 C600이 있다 [참조: Appleyard, R.K., Genetics, 39, 440(1954)]. 에스케리챠 속에 속하는 미생물에서 FK 활성과 FADS 활성이 하나의 동일한 단백질 상에서 발생하는지 또는 상이한 단백질 상에서 발생하는지의 여부가 공지되어 있지 않았으나, 에스케리챠 속에 속하는 미생물로부터 관련 유전자를 분리하여 분석해 본 결과, 브레비박테륨 속에 속하는 미생물에서와 같이, 양 활성이 하나의 동일한 단백질(단백질 X)상에 발생되고 N 말단부에 FADS 활성에 대한 영역이 있고 C 말단부에 FK 활성에 대한 영역이 존재한다는 것을 본 발명자들이 밝혀내었다. 이는 브레비박테륨속에 속하는 미생물과 같이, 에스케리챠속에 속하는 미생물이 FMN을 통하여 FR과 ATP로부터 FAD를 형성하는 활성을 지닌다는 것을 지시해준다. 이러한 미생물을 사용함으로써 FR뿐만 아니라 기질로서 FMN을 사용할 수 있고, 이는 FR로부터 FMN과 FAD를 제조하고 또한 FMN으로부터 FAD를 제조하는데 유효하다. 그러나, 에스케리챠 콜라이 균주가 브레비박테륨속에 속하는 미생물로부터 유도된 유전자와 하이브리드화할 수 있는 유전자를 전혀 갖지 않기 때문에, 본 발명에 따라 사용될 유전자는 브레비박테륨속에 속하는 미생물로부터 유도된 유전자와는 명백하게 상이하다는 것을 인지해야만 한다.
FK 활성은 보유하지만 FADS 활성은 전혀 없거나 저하된 변형 단백질 X를 암호화하는 유전자는 뮤턴트-K 키트(Mutant-K Kit, Takara Shuzo)를 사용하여 부위-지시된 돌연변이(site-directed mutagenesis)시킴으로써 단백질 X의 N-말단으로부터의 23번째 위치의 아미노산 잔기 글리신을 글리신 이외의 아미노산으로 치환시켜 제조할 수 있다. 이러한 변형 단백질은 FAD를 공동으로 생산하지 않으면서 FMN만을 생산하는데 유용하다.
본 발명의 실시에 사용될 숙주 미생물은 야생 균주, 내약품성 및/또는 타가 영양성 변이체(auxotrophic mutant) 및 에스케리챠, 엔테로박터 또는 슈도모나스속에 속하는 기타 균주 중 어떠한 것일 수 있으나, 단 이러한 미생물에 DNA를 혼입할 수 있어야 한다. 이의 바람직한 예는 에스케리챠 콜라이 DH5α이다[참조: Bethesda Research Laboratories, Focus, 8, 9 (1986)].
본 발명의 실시에 사용될 벡터는 파아지 벡터, 플라스미드 벡터 등일 수 있으나, 단 이러한 벡터는 에스케리챠, 엔테로박터 또는 슈도모나스속의 균주에서 자가 복제할 수 있어야 한다. 이의 바람직한 예는 pBR322[참조; Gene, 2, 95(1977)] 및 pUC19[참조: Gene, 33, 103(1985)]이다. 기타 미생물, 예를 들면, 브레비박테륨 또는 코리네박테륨속의 숙주-벡터 시스템을 사용할 수도 있다.
재조합 DNA는, 시험관 내에서 제한 효소(들)을 사용하여 절단하여 조립(fitting) 절단 말단을 수득한 다음 DNA 리가제를 사용하여 연결 반응을 수행함으로써, FMN 및/또는 FAD의 합성과 관련한 유전 정보를 수반하는 전술한 DNA 단편과 벡터 DNA로부터 각종 재조합 하이브리드와 함께 수득할 수 있다.
이렇게 수득한 재조합 하이브리드 혼합물 또는 연결 혼합물을 사용하여 에스케리챠, 엔테로박터 또는 슈도모나스 속에 속하는 미생물들 중에서 선택된 숙주 미생물을 형질전환시키고, FMN 및/또는 FAD의 합성과 관련한 유전 정보를 수반하는 DNA 단편을 함유하는 재조합 플라스미드를 갖는 형질전환체를 선별한다. 이러한 DNA를 함유하는 재조합 플라스미드는 상기 균주로부터 플라스미드를 분리시켜 수득할 수 있다.
이러한 형질전환은 문헌[참조 : Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)]의 방법으로 수행할 수 있다.
FMN 및/또는 FAD의 합성과 관련한 유전 정보를 수반하는 DNA 단편에 상응하는 아미노산 서열의 전부 또는 일부가 공지되어 있을 경우, 이러한 DNA 단편을 함유하는 재조합 플라스미드를 갖는 형질전환체를 선별하기 위해서는, 예를 들면, 상기 아미노산 서열에 상응하는 염기 서열을 갖는 DNA 올리고머를 합성한 다음 이러한 DNA와 하이브리드화하는 능력을 탐침으로서 이용함을 포함하는 선별법을 사용한다.
이어서, 적절한 제한 효소(들)를 통하여, 전술한 바와 같이 수득한 재조합 플라스미드로부터 상기 DNA 단편을 잘라낸다. 이러한 DNA 단편을 숙주 미생물 내에서 자가 복제할 수 있는 벡터 DNA 내로 삽입하여 이러한 DNA를 함유하는 재조합 플라스미드를 수득한다. 재조합 플라스미드를 사용하여 코헨(Cohen) 등의 방법으로 숙주 미생물을 형질전환시켜 목적하는 형질전환체를 수득한다.
이렇게 수득된 형질전환체(FK-FADS 또는 FK가 높은 수준으로 발현되는 균주)는 온도와 pH 및 기타 조건을 적절하게 조절하면서 호기성 조건하에 탄소 공급원(들), 질소 공급원(들), 무기물질(들), 아미노산(들), 비타민(들) 등을 함유하는 통상의 합성 또는 천연 배지 중에서 박테리아성 배양의 통상적인 방법으로 배양할 수 있다. 고밀도 배양법[참조: Biotechnology and Bioengineering, 17, 227-239(1975)]이 특히 바람직하다.
배지 중에 사용될 탄소 공급원으로는 탄수화물(예: 글루코즈, 프럭토즈, 슈크로즈, 당밀, 폐기 당밀 및 전분 가수분해물), 알코올(예: 에탄올, 글리세롤 및 솔비톨), 유기산(예: 피루브산, 락트산 및 아세트산), 아미노산(예: 글리신, 알라닌, 글루탐산 및 아스파르트산), 및 당해 미생물에 의해 동화될 수 있는 기타 유기 물질이 있다. 이들을 0.5 내지 30%의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
질소 공급원으로서 사용가능한 것은 암모니아, 각종 무기 및 유기 암모늄 염(예: 염화암모늄, 황산암모늄, 질산암모늄, 탄산암모늄, 암모늄 아세테이트 및 인산암모늄), 질소 함유 유기 화합물(예: 우레아, 펩톤, NZ 아민, 고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 어분 및 이들로부터 유도된 분해 생성물), 각종 아미노산(예: 글리신 및 글루탐산) 등이다. 이들을 0.1 내지 10%의 농도로 사용하는 것이 적합하다.
무기 물질로서 사용가능한 것은, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 황산마그네슘, 인산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산아연 및 탄산칼슘이다. 사용된 미생물이 특정의 영양분을 필요로 할 경우에는, 이의 성장을 위하여 적당량의 영양 물질, 예를 들면, 아미노산, 핵산 또는 비타민을 배지에 첨가해야 한다.
배양은, 예를 들면, 진탕하거나 통기 및 진탕하면서, 호기성 조건하에 수행한다. 일반적으로 28내지 42℃의 배양 온도가 가장 적합하다. 배양은 1 내지 24시간 내에 완료될 것이다. 일반적으로, 배지의 pH는 암모니아, 우레아, 수성 수산화나트륨 등을 사용하여 거의 중성 범위내로 유지하는 것이 바람직하다.
이렇게 수득한 형질전환체의 배양물 그 자체를 연속되는 반응 단계에 사용할 수 있지만, 상기 형질전환체의 처리된 세포 또는 처리된 배양물은 다양한 방법으로 사용할 수 있다. 이러한 처리된 세포 또는 처리된 배양물은 특히, 배양 브로쓰 농축물, 무수 배양 브로쓰, 계면활성제 처리된 배양 브로쓰, 박테리아 분해성 효소 처리된 배양 브로쓰, 배양액을 원심분리하여 수득한 세포, 무수 세포, 아세톤 처리된 세포, 계면활성제 처리된 세포, 박테리아 분해성 효소 처리된 세포 및 고정화 세포가 있다.
반응은 어떠한 수성 배지 중에서도 수행할 수 있다. 바람직하게는, FR 또는 FMN과 ATP를, 필요할 경우에는 계면활성제 및/또는 유기 용매와 함께, 미생물성 배양 브로쓰에 동시에 가하거나, 배양을 완료한 후, FR 또는 FMN과 ATP를, 필요할 경우에는 계면활성제 및/또는 유기 용매와 함께 배양물 또는 배양 세포 또는 처리된 세포 또는 처리된 배양물에 가하고 반응을 20 내지 50℃에서 1 내지 72시간 동안 수행함으로써 플라빈 뉴클레오타이드를 배양 브로쓰 또는 반응 혼합물 내에 축적시킨다. 경우에 따라, pH를 6 내지 9로 조정하고 산화 환원 포텐셜을 250 내지 -400mV로 조정하는 것이 바람직하다. 배양 배지 또는 반응 혼합물 중의 기질 농도는 일반적으로 다음과 같다 : FR 0.1 내지 20g/l, FMN 0.1 내지 40g/l 및 ATP 0.1 내지 100g/l. 높은 FK 및/또는 FADS 활성을 나타낼 수 있는 세포(형질전환체) 또는 처리된 세포를 사용할 경우에는, 배양 배지 또는 반응 혼합물중의 세포 농도는 5 내지 200g/l(단위 세포)로 조절하는 것이 바람직하다. FR이 거의 수불용성이라 할지라도, 목적물은 FR이 물에 용해되어 있지는 않지만 현탁되어 있는 상태로 획득될 수 있다.
ATP 공급원에 관해서는, 순도가 높은 제제 뿐만 아니라, 아데닌을 에너지 공여체[참조: JP-A-Sho-59-51799]의 존재하에 미생물 세포와 접촉시켜 수득한 ATP 함유 용액, 세포를 제거함으로써 이로부터 유도된 여액 또는 이의 농축물을 사용할 수도 있다. ATP 재생 활성을 갖는 미생물[참조: JP-A-Sho- 61-74595]을 반응 시스템에 첨가함으로써 글루코즈와 무기 인산염으로부터 ATP를 합성하여 공급할 수 있다. 이러한 경우, 반응은 ATP 대신 ATP 전구체, ATP 재생 에너지 공여체, 포스페이트 그룹 공여체 및 반응 혼합물 중에서 생성된 ATP 생합성 활성을 갖는 미생물의 존재하에서 수행한다. 이러한 경우에 사용될 ATP 재생 활성을 지닌 미생물 균주로서는, 예를 들면, 브레비박테륨 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes; 현재는 코리네박테륨 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)이고 이하 코리네박테륨 암모니아게네스로 후술됨)[참조: International Journal of Systematic Bacteriology, 34 (4), 442 (1987)] ATCC 21170과 에스케리챠 콜라이 ATCC 11303을 언급할 수 있다. ATP 재생 활성을 지닌 미생물 세포를 수득하기 위한 배양은 JP-A-Sho-61-74595에 기재된 방법으로 수행한다.
계면활성제로서, 예를 들면, 양이온성 계면활성제[예: 폴리옥시에틸렌스테아릴아민(예: 상표명 Nymine S-215 ; Nippon Oil & Fats Co.의 제품), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 및 세틸피리디늄 클로라이드], 음이온성 계면활성제[예: 나트륨 라우릴 설페이트 및 나트륨 올레일아미도설페이트], 비이온성 계면활성제[예: 폴리옥시에틸렌솔비탄 모노스테아레이트(예: 상품명 Nonion ST221, Nippon Oil & Fats Co.의 제품)] 및 양쪽성 계면활성제[예: 라우릴베타인(예; 상표명 Anon BF, Nippon Oil & Fats Co.의 제품)]를 언급할 수 있다. 이들은 일반적으로 0.1 내지 50g/l, 바람직하게는 1 내지 20g/l의 농도로 사용한다.
유기 용매는, 예를 들면, 톨루엔, 크실렌, 아세톤, 지방족 알코올 또는 에틸 아세테이트이다. 이는 일반적으로 0.1 내지 50ml/l, 바람직하게는 1 내지 20ml/l의 양으로 사용한다. 배지 또는 반응 혼합물내에 축적된 플라빈 뉴클레오타이드는 활성화 탄소, 이온 교환 수지 등을 사용하는 통상적인 방법으로 회수할 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명을 추가로 예시하는 것이지만, 이로써 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다.
[실시예 1]
FK-FADS를 고 발현시킬 수 있는 미생물과 FK를 고 발현시킬 수 있는 미생물의 제조
(1) FK-FADS의 정제
에스케리챠 콜라이 C600 배양 브로쓰를 원심분리시켜 습윤 세포 30g을 수득한다. 이를 정제 완충액(I)[50mM 트리스-하이드로클로라이드(pH 8), 0.1mM 에틸렌 디아민테트라아세트산 (EDTA), 1mM 디티오트레이톨] 100ml에 현탁시키고 균질기(Brown Biotech의 제품; 유리 비이드 직경 0.1mm)를 사용하여 분쇄시킨다. 분쇄 혼합물을 원심분리하여 상등액을 약 90ml 수득한다. 이러한 상등액에 프로트아민 설페이트를 가하여 최종 농도가 0.4%가 되게 하고, 반응 혼합물을 원심분리하여 침전물로서의 거대분자 핵산 성분을 제거한다. 수득한 상등액을 셀룰로오즈 막을 통하여 정제 완충액(I)에 대하여 투석하여 탈염 활성 분획(약 11ml)을 수득한다. 정제 완충액(I)으로 미리 평형시킨 CM-세파로오즈 컬럼(Pharmacia)에 상기 분획을 가하고 목적하는 효소를 0M 내지 1M의 선형 NaCl 농도 구배를 갖는 정제 완충액(I) 300ml을 사용하여 용출시킨다. 수득한 활성 분획으로 부터 효소 활성이 최대인 12ml 부분을 취한다. 이러한 활성 분획을 세파크릴 S-300 컬럼(Pharmacia)에 적용하고 정제 완충액(I)을 사용하여 용출시킨다. 이러한 겔 여과로 인해 활성 분획 5ml가 수득된다. 이 분획을 정제 완충액(I)으로 미리 평형시킨 ATP-아가로즈 컬럼에 적용한다. 0M 내지 1M의 선형 NaCl 농도 구배를 갖는 정제 완충액(I) 100ml를 사용하여 용출을 수행하고 활성 분획을 수집한다. 최종적으로, 단백질 함량이 16.7㎍/ml인 정제된 효소 분획을 3.5ml 수득한다.
(2) FK-FADS 유전자의 분리
전술한 바와 같이 수득한 정제 효소를 대상으로 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동시킨 후, PVDF(폴리비닐리덴 디플루오라이드)막 상에 블롯팅하여 N-말단 아미노산 서열을 결정한다. 14개의 N-말단 아미노산이 단백질 X의 아미노산과 동일한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 단백질 X 뉴클레오타이드 서열[참조: Kamio, Y. et al., Journal of Biological Chemistry, 220, 5616-5620(1985)]을 기준으로 하여, 5′ 말단 프라이머(서열확인번호: 1)과 3′ 말단 프라이머(서열확인번호: 2)를 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)을 위해 고안한다. 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 모델 380A 자동화 DNA 합성기를 사용하여 고체상 합성[참조: Beaucage, S.L. et al., Tetrahedron Letters, 22, 1859(1985)]하는 포스포아미다이트 법으로 이들 프라이머를 합성한다. GeneAmp DNA 증폭 시약 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 PCR을 수행한다. 에스케리챠 콜라이 C600의 염색체성 DNA를 1ng/100㎕의 양으로 하여 주형으로서 사용하고, 합성 DNA 프라이머를 각각 1.0μM의 농도로 사용하며, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 각각 200μM의 농도로 사용하고 Taq DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 2.5 단위/100μl의 양으로 사용한다. 각각의 반응 주기는 92℃x1분, 37℃x2분 및 70℃x3분으로 이루어진다. 25주기후, 단백질 X를 암호화하는 목적하는 DNA 단편을 수집한다.
(3) 재조합 DNA의 제조
전술한 바와 같이 수득한 DNA 단편 1㎍을 함유하는 용액 20μl에 Hind III과 EcoRI을 가하여 분해시킨다. 별도로, HindIII와 EcoRI을 벡터 pUC19 1㎍을 함유하는 용액 20μl에 가하여 분해시킨다. 이로써 분해된 DNA 단편과 벡터 DNA를 페놀 추출 및 에탄올 침전시켜 정제한다. 정제된 DNA(100ng)와 정제된 벡터 DNA(20ng)을 66mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.6), 66mM 염화마그네슘, 10mM DTT 및 0.1mM ATP를 함유하는 용액에 현탁시키고, T4 리가제 10단위를 가하며, 양 DNA를 서로 연결시키기 위한 연결반응을 14℃에서 16시간 동안 수행하여 재조합 DNA를 수득한다.
(4) 재조합 DNA를 갖는 에스케리챠 콜라이 균주의 제조
에스케리챠 콜라이 DH5α를 LB 액체 배지[1% 박토-트립톤, 0.5% 박토-효모 추출물, 1% 염화나트륨(pH 7.5)] 50ml에 접종한 다음 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 3,000 회전수/분(rpm)로 7분간 원심분리하여 세포를 수집한 다음 이를 0℃에서 유지시킨 50mM 염화칼슘 용액 20ml에 현탁시킨다. 0℃에서 20분 동안 정치시킨 후, 전술한 바와 동일한 원심분리방법으로 세포를 수집한 다음 0℃에서 유지시킨 50mM 염화칼슘 용액 40ml에 현탁시킨다. 이러한 현탁액을 실시예 1의 (3)하에서 기재한 바와 같이 수득한 재조합 DNA 함유 용액과 혼합하고, 혼합물을 0℃에서 10분 동안 정치시킨 다음, 42℃에서 90초 동안 열처리하며, 앰피실린 50㎍/ml와 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토사이드(Xgal) 20㎍/ml를 함유하는 LB 한천 플레이트 배지(LB 액체 배지+1.5% 한천)에 도말한다. 이러한 플레이트 배지를 37℃에서 24 내지 48시간 동안 배양한다.
(5) FK-FADS를 암호화하는 DNA의 분리
상기한 바와 같이 배양한 후 플레이트 배지 상에 콜로니가 나타난다. 콜로니중에서, 백색 콜로니를 각각 개별적으로 LB 액체 배지 중에서 배양한다. 각각의 콜로니에 대해 형질전환체의 습윤 세포를 수득한다. 수득한 세포를 실시예 1의 (1)에서 기재한 방법으로 분쇄시켜 상등액을 수집한다. 이러한 상등액은 조악한 효소인 것으로 간주되며, 이를 기질로서 FR 또는 FMN을 사용하여 문헌[참조 : D.J. Manstein et al., Journal of Biological Chemistry, 261, 16169-16173 (1986)]의 방법으로 활성 검정한다. 그 결과로서, FK 활성이 약 325배 더 강력하고 FADS 활성이 약 240배 더 강력한 균주가 발견되었고, 이는 표 1에서 나타낸 바와 같다. 이러한 균주에 함유된 재조합 플라스미드를 pFK5A라 명명하고 이러한 균주를 에스케리챠 콜라이 DH5α/pFK5A라 칭한다.
상기 균주는 부다페스트 조약하에 1991년 11월 7일자로 퍼멘테이션 리서치 인스티튜트, 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지(Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology ; FERM)에 수탁되었다. 수탁번호는 FERM BP-3643이다.
(6) FK와 FADS 영역의 위치 확인
상기(5)에서 수득한 FK-FADS 암호화 유전자 내에서의 FK와 FADS 영역의 위치를 확인하기 위하여, N-말단부를 암호화하는 영역이 결실되어 있는 FK-FADS 유전자를 갖는 재조합 플라스미드를 작제한다.
실시예 1-(2) 및 (3)에서 기재한 바와 동일한 방법으로 5′ 말단 프라이머(서열확인번호: 3, 4 및 5), 3′ 말단 프라이머 (서열확인먼호: 6) 및 pFK5A를 주형으로서 사용하여 PCR을 수행한다. 이렇게 수득한 HindIII-BamHI 단편을 각각 ATG 발현 벡터 pTrS33(JP-A-2-227075) 내로 삽입하여 재조합 플라스미드 pND12, pND18 및 pND30을 수득한다. 이들 재조합 플라스미드는 N 말단으로부터 12, 18 또는 30개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역이 결실된 FK-FADS 유전자를 함유한다. 별도로, 실시예 1-(2) 및 (3)에서 기재한 바와 동일한 방법으로 5′ 말단 프라이머(서열확인번호:1), 3′ 말단 프라미어(서열확인번호:7) 및 pFK5A를 주형으로서 사용하여 제조한 PCR 생성물인 HindIII-BamHI 단편을 pUC19 내로 삽입하여 재조합 플라스미드 pCD20을 수득한다. 이러한 플라스미드는 C 말단으로부터의 20개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역이 결실된 FK-FADS 유전자를 함유한다.
이렇게 수득한 재조합 플라스미드를 각각 사용하여 에스케리챠 콜라이 DH5α를 형질전환시킨다. 이 형질전환체로부터 조악한 추출물을 제조하고 이를 대상으로 하여 실시예 1-(5)에 기재된 바와 동일한 방법으로 효소 활성을 검정한다. 그 결과가 표 1에 기재되어 있다.
결과는 N 말단으로부터의 18개 이상의 아미노산 잔기가 결실될 경우에 FADS 활성이 현저하게 저하되기 때문에 FADS 영역은 단백질 X(FK-FADS)의 N 말단부에 존재하고 FK 영역은 단백질의 C 말단부에 존재한다는 것을 제시해준다. 결실 변이체 함유 세포의 배양 상등액으로부터 수득한 조악한 추출물의 활성은 pFK5A 함유 세포의 활성보다 낮게 나타났다. 이러한 활성의 저하는 배양 도중 봉입체가 형성되기 때문인 것으로 간주되며, 이는 수용성 효소를 감소시킨다.
[표 1]
* 괄호( )안의 값은 이.콜라이 DH5α의 형질전환되지 않은 세포로부터 수득된 활성에 대한 활성비이다.
(7) FADS 활성이 저하된 미생물의 제조
서열확인번호: 8, 9 및 10에서 구체화된 각각의 프라이머를 사용하여, 쿤켈법[Kunkel method ; Meothods in Enzymology, 154, 364 (1987)]에 따라서 각각의 재조합 플라스미드를 제조한다. 서열확인번호: 8, 9 및 10에서 구체화된 프라이머는 단백질 X의 23번째 글리신이 각각 아르기닌, 알라닌 및 아스파르트산으로 대체되도록 고안한다. 서열확인번호: 2 및 11에서 구체화된 프라이머를 사용하는 PCR을 통하여 수득한 PstI-EcoRI 단편을 플라스미드 pTZ19R[참조: Protein Engineering, 1, 67 (1986)]에 삽입하여 주형으로서 사용될 야생의 FK-FADS 유전자를 갖는 플라스미드를 수득한다. 형질전환체로부터 분리시킨 재조합 플라스미드를 자동화 DNA 서열결정기로 분석함으로써 돌연변이 여부를 확인한다. 단백질 X의 23번째 글리신 코돈을 아르기닌 코돈, 알라닌 코돈 또는 아스파르트산 코돈으로 치환시키는 돌연변이가 진행된 플라스미드를 각각 pKK11, pKK12 및 pKK13으로 명명한다. 각각의 변이된 플라스미드를 사용하여 에스케리챠 콜라이 DH5α를 형질전환시켜 형질전환체 DH5α/pKK11, DH5α/pKK12 및 DH5α/pKK13을 수득한다. 이들 균주의 조악한 추출물을 대상으로 하여 실시예 1-(5)에서와 동일한 방법으로 효소 활성을 측정한다. 그 결과가 표 2에 제시되어 있다. 이러한 결과로부터, 23번째 글리신이 아르기닌, 알라닌 또는 아스파르트산으로 치환된 단백질 X 변이체는 FK 활성은 보유하지만 FADS 활성은 거의 상실하였다는 것을 알 수 있다. 에스케리챠 콜라이 DH5α/pKK11, DH5α/pKK12 및 DH5α/pKK13은 부다페스트 조약에 따라서 1992년 10월 13일자로 FERM에 수탁되었고, 수탁번호는 각각 FERM BP-4031, FERM BP-4032 및 FERM BP-4033이다.
[표 2]
* 괄호( )안의 값은 이.콜라이 DH5α의 형질전환되지 않은 세포로부터 수득된 활성에 대한 활성비이다.
[실시예 2]
고밀도 배양법으로 배양된 바와 같은 에스케리챠 콜라이 DH5α/pFK5A의 세포 100g/l, FR 10g/l, ATP 15g/l, 크실렌 10ml/l 및 Nymine S-215 4g/l를 함유하는 반응 혼합물을 큰 시험 튜브 (내부 직경 21mm)내에 채우고, 간헐적 진탕시키면서 46℃에서 30시간 동안 배양하여 세포의 침전을 억제하고, 이와 동시에 0.2N 수산화칼륨을 사용하여 pH를 7.0 내지 7.2로 조절한다. 이렇게 생성된 FMN·Na2와 FAD·Na2의 양은 표 3에 나타나 있다. 에스케리챠 콜라이 DH5α/pFK5A 대신 에스케리챠 콜라이 DH5α, DH5α/pKK11, DH5α/pKK12 및 DH5α/pKK13을 사용하고 동일한 방법으로 수행하여 수득한 결과 또한 표 3에 나타나 있다.
[표 3]
[실시예 3]
고밀도 배양법으로 배양된 에스케리챠 콜라이 DH5α/pFK5A의 배양 세포 100g/l, FMN 20g/l, ATP 25g/l, 크실렌 10ml/l 및 Nymine S-215 4g/l를 함유하는 반응 혼합물 10ml 분획을 큰 시험 튜브 내에 놓고 간헐적 진탕시키면서 46℃에서 24시간 동안 배양하여 세포의 침전을 억제하며, 이와 동시에 0.2N 수산화칼륨을 사용하여 pH를 7.0 내지 7.2로 조정한다. 이렇게 생성된 FAD·Na2의 양이 표 4에 나타나 있다. 에스케리챠 콜라이 DH5α/pFK5A 대신 에스케리챠 콜라이 DH5α를 사용하여 동일한 방법을 수행한다. 추가로, 코리네박테륨 암모니아게네스로부터 유도된 FK-FADS 유전자를 갖는 플라스미드를 수반하는 코리네박테륨 암모니아게네스 균주인 ATCC 21170/pKH43(JP-A-2-138988) 200g/l을 사용하여, 동일한 방법으로 단 12g/l의 FAN 농도, 24g/l의 ATP 농도, 37℃의 반응온도 및 20시간의 반응시간에서 수행한다. 이들 결과 또한 표 4에 나타나있다.
[표 4]
[실시예 4]
고밀도 배양법으로 배양된 에스케리챠 콜라이 DH5α/pFK5A의 배양 세포 100g/l, FR 1g/l, 크실렌 10ml/l 및 Nymine S-215 4g/l를 함유하는 반응 혼합물 10ml 분획을 큰 시험 튜브 속에 놓고 간헐적으로 진탕시키면서 46℃에서 48시간 동안 배양하여 세포의 침전을 억제하며, 이와 동시에 0.2N 수산화칼륨을 사용하여 pH를 7.0 내지 7.2로 조정한다. 이렇게 생성된 FMN·Na2와 FAD·Na2의 양은 표 5에 나타나 있다. 에스케리챠 콜라이 DH5α/pFK5A 대신 에스케리챠 콜라이 DH5α, DH5α/pKK11, DH5α/pKK12 및 DH5α/pKK13을 사용하고 동일한 방법으로 수행하여 수득한 결과 또한 표 5에 나타나 있다.
[표 5]
[실시예 5]
고밀도 배양법으로 배양된 에스케리챠 콜라이 DH5α/pFK5A의 배양 세포 20g/l, JP-A-Sho-61-74595에 기재된 방법으로 배양한 코리네박테륨 암모니아게네스 ATCC 21170의 배양 세포 160g/l, 글루코즈 100g/l, FR 16g/l, KH2PO420g/l, MgCl2·7H2O 3g/l, 크실렌 10ml/l 및 Nymine S-215 4g/l를 함유하는 반응 혼합물 500ml 분획을 2ℓ들이 작은 발효기 내에 채운 다음, 산화 환원 포텐셜을 -350 내지 -400mV로 유지시키고 5N 수산화칼륨을 사용하여 pH를 7.0으로 조정하면서, 600rpm으로 교반하면서 46℃에서 48시간 동안 배양한다. 이렇게 생성된 FMN·Na2와 FAD·Na2의 양은 표 6에 나타나있다. 에스케리챠 콜라이 DH5α/pFK5A 대신 에스케리챠 콜라이 DH5α 및 DH5α/pKK12를 사용하고 동일한 방법을 수행하여 수득한 결과 또한 표 6에 나타나 있다.
추가로, 코리네박테륨 암모리아게네스로부터 유도된 FK-FADS 유전자를 갖는 플라스미드를 갖는 코리네박테륨 암모니아게네스 균주인 ATCC 21170/pKH43(JP-A-2-138988)을 사용하고 동일한 방법으로, 단 배양 세포 160g/l, 글루코즈 100g/l, FR 8g/l, KH2PO420g/l, MgSO4·7H2O 5g/l, ZnSO410g/l, 피로인산 나트륨 40g/l, 크실렌 10g/l 및 Nymine S-215 4g/l를 함유하는 반응 혼합물 500ml 분획을 2ℓ들이 작은 발효기내에 채운 다음, 산화 환원 포텐셜을 -300 내지 -400mV로 유지시키고 5N 수산화칼륨으로 pH를 7.8로 유지시키며 임의로 KH2PO4를 첨가하면서 수용성 KH2PO4농도를 약 30g/l로 유지하고 600rpm으로 교반하면서, 반응 혼합물을 38℃에서 55시간 동안 배양함으로써 당해 반응을 수행한다. 그 결과가 또한 표 6에 나타나 있다.
[표 6]
본 발명에 따라서, 영양 조성물의 성분, 각종 약제물의 원료물질, 생화학 연구용 시약 등으로서 중요한 플라빈 뉴클레오타이드가 저렴한 비용으로 고수율로 생성될 수 있다.
본 발명이 이의 특정 양태를 참조로 하여 상세히 기술되었지만, 본 발명의 요지와 범위를 벗어나지 않고서도 각종 변화 및 변경이 이루어질 수 있다는 것이 당해 분야의 전문가에게는 명백할 것이다.
[서열 목록]
서열확인번호 : 1
서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 26개 염기
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위상 : 선형
분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA
서열확인번호 : 2
서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 25개 염기
쇄 형태 : 일본쇄
위상 : 선형
분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA
서열확인번호 : 3
서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 50개 염기
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위상 : 선형
분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA
서열확인번호 : 4
서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 50개 염기
쇄 형태 : 일본쇄
위상 : 선형
분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA
서열확인번호 : 5
서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 50개 염기
쇄 형태 : 일본쇄
위상 : 선형
분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA
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서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 41개 염기
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위상 : 선형
분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA
서열확인번호 : 7
서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 53개 염기
쇄 형태 : 일본쇄
위상 : 선형
분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA
서열확인번호 : 8
서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 33개 염기
쇄 형태 : 일본쇄
위상 : 선형
분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA
서열확인번호 : 9
서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 33개 염기
쇄 형태 : 일본쇄
위상 : 선형
분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA
서열확인번호 : 10
서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 33개 염기
쇄 형태 : 일본쇄
위상 : 선형
분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA
서열확인번호 : 11
서열 유형 : 핵산
서열 길이 : 26개 염기
쇄 형태 : 일본쇄
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분자 유형 : 기타 핵산, 합성 DNA

Claims (15)

  1. 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)로부터 유도되고 플라빈 모노뉴클레오타이드, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 또는 이들 모두의 합성과 관련한 유전 정보를 수반하는 DNA 단편을 함유하는 재조합 DNA를 갖는 에스케리챠 콜라이의 세포 또는 배양물, 또는 이러한 에스케리챠 콜라이의 처리된 세포 또는 처리된 배양물의 존재하에, 회수가능한 양의 플라빈 뉴클레오타이드가 수성 배지내에 축적될 때까지 플라빈 뉴클레오타이드 전구체를 수성 배지중에서 아데노신-5′-트리포스페이트와 반응시킨 다음, 이렇게 하여 생성된 플라빈 뉴클레오타이드를 수성 배지로부터 회수함을 포함하는, 플라빈 뉴클레오타이드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, DNA 단편이 플라보키나제(flavokinase) 활성과 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 신세타제(synthetase) 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부를 함유하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 유전자가 에스케리챠속에 속하는 미생물로부터 유도된 단백질 X를 암호화하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, DNA 단편이 플라보키나제 활성과 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 신세타제 활성을 지닌 단백질의 변형 단백질(이는 플라보키나제 활성은 보유하지만 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 활성은 전혀 없거나 저하된다)을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 유전자가 에스케리챠 속에 속하는 미생물로부터 유도된 단백질 X의 아미노산 서열(여기서, 단백질 X의 N 말단으로부터의 23번째 글리신 잔기가 글리신 이외의 아미노산으로 치환된다)을 암호화하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 플라빈 뉴클레오타이드 전구체가 리보플라빈, 플라빈 모노뉴클레오타이드 또는 이들 모두인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 플라빈 뉴클레오타이드가 플라빈 모노뉴클레오타이드, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드 또는 이들 모두인 방법.
  8. pFK5A, pND12, pND18, pND30 및 pCD20으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 재조합 DNA.
  9. pKK11, pKK12 및 pKK13으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 재조합 DNA.
  10. pFK5A, pND12, pND18, pND30 및 pCD20으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 재조합 DNA를 갖는 에스케리챠속에 속하는 미생물.
  11. pKK11, pKK12 및 pKK13으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 재조합 DNA를 갖는 에스케리챠속에 속하는 미생물.
  12. 단백질 X의 23번째 글리신 아미노산이 알라닌, 아르기닌 및 아스파르트산으로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산으로 대체된 것을 제외하고는 단백질 X와 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질.
  13. 단백질 X의 N 말단 아미노산으로부터 12, 18 또는 30개 아미노산 잔기가 결실된 것을 제외하고는 단백질 X와 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질.
  14. 단백질 X의 C 말단 아미노산으로부터 20개 아미노산 잔기가 결실된 것을 제외하고는 단백질 X와 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기술된 단백질을 암호화하는 DNA.
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