JP3078572B2 - 発酵法によるシチジンの製法および該製法に用いられる遺伝子 - Google Patents
発酵法によるシチジンの製法および該製法に用いられる遺伝子Info
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- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、医薬品等の合成原料として有用なシチジン
の発酵法による製造方法に関する。
の発酵法による製造方法に関する。
（従来の技術） 微生物を培養してシチジンを得る方法としては、バチ
ルス・ズブチリスあるいはプロテウス・レトゲリーの変
異株を用いる方法（特公昭36−21499号公報）；ブレビ
バクテリウム属のプリン、ピリミジンおよびヒスチジン
に対してアナログ耐性の変異株を用いる方法（特公昭57
−18871号公報）；ミクロバクテリウム属のプリンに対
してアナログ耐性の変異株を用いる方法（特公昭57−18
872号公報）；バチルス属のピリミジンに対してアナロ
グ耐性の変異株を用いる方法（特開昭61−135597号公
報）等が知られている。
ルス・ズブチリスあるいはプロテウス・レトゲリーの変
異株を用いる方法（特公昭36−21499号公報）；ブレビ
バクテリウム属のプリン、ピリミジンおよびヒスチジン
に対してアナログ耐性の変異株を用いる方法（特公昭57
−18871号公報）；ミクロバクテリウム属のプリンに対
してアナログ耐性の変異株を用いる方法（特公昭57−18
872号公報）；バチルス属のピリミジンに対してアナロ
グ耐性の変異株を用いる方法（特開昭61−135597号公
報）等が知られている。
ところで、微生物体内におけるシチジンが合成される
に至る代謝経路においては、ウリジン系化合物のウラシ
ル塩基部分がアミノ化されてシチジン系化合物が生成さ
れ、該シチジン系化合物からシチジンがもたらされる。
この際の反応は、ウリジン三リン酸（以下、UTPとい
う）のアミノ化によりシチジン三リン酸（以下、CTPと
いう）が生じる反応が唯一の経路である。この反応を触
媒する酵素はシチジン三リン酸合成酵素（以下、CTPシ
ンセターゼという）であるが、この酵素は生産物である
CTPによるフィードバック阻害をうけること、発現量が
培地のシチジン量で抑制されること等、その活性は厳密
に調節されている。また、この酵素の遺伝子のクローニ
ングについて、大腸菌由来のCTPシンセターゼ遺伝子〔J
ournal of Biological Chemistry 261,5568（198
6）〕、バチルス・ズブチリス由来のCTPシンセターゼ遺
伝子〔Journal of Bacteriology 170,4194−4208（198
8）〕の報告がある。
に至る代謝経路においては、ウリジン系化合物のウラシ
ル塩基部分がアミノ化されてシチジン系化合物が生成さ
れ、該シチジン系化合物からシチジンがもたらされる。
この際の反応は、ウリジン三リン酸（以下、UTPとい
う）のアミノ化によりシチジン三リン酸（以下、CTPと
いう）が生じる反応が唯一の経路である。この反応を触
媒する酵素はシチジン三リン酸合成酵素（以下、CTPシ
ンセターゼという）であるが、この酵素は生産物である
CTPによるフィードバック阻害をうけること、発現量が
培地のシチジン量で抑制されること等、その活性は厳密
に調節されている。また、この酵素の遺伝子のクローニ
ングについて、大腸菌由来のCTPシンセターゼ遺伝子〔J
ournal of Biological Chemistry 261,5568（198
6）〕、バチルス・ズブチリス由来のCTPシンセターゼ遺
伝子〔Journal of Bacteriology 170,4194−4208（198
8）〕の報告がある。
しかしながら、上記クローニングの報告は、いずれも
CTPシンセターゼ遺伝子の産業上の利用を目的としたも
のではなく、同酵素遺伝子を微生物を用いて高度に発現
させたりしたものでもなく、また、それを利用してシチ
ジンの工業的生産を意図したものでもない。
CTPシンセターゼ遺伝子の産業上の利用を目的としたも
のではなく、同酵素遺伝子を微生物を用いて高度に発現
させたりしたものでもなく、また、それを利用してシチ
ジンの工業的生産を意図したものでもない。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は、医薬品等の合成原料として有用なシチジン
を、発酵法により多量生産できる方法を提供することに
ある。
を、発酵法により多量生産できる方法を提供することに
ある。
（課題を解決するための手段） 本発明者は、シチジン系化合物の合成系の各種酵素群
の中で、CTPシンセターゼに着目し、この酵素活性を強
化することがシチジンの生産量の上昇に寄与すると考
え、クローニングしたCTPシンセターゼ遺伝子をシチジ
ン生産菌で発現させることにより、シチジンの生産量を
増加させる研究を行ってきた。その過程で、CTPシンセ
ターゼのCTPによるフィードバック阻害を弱めることに
より、シチジンの生産量が飛躍的に増加することを見出
し、該知見に基づき本発明を完成するに至った。
の中で、CTPシンセターゼに着目し、この酵素活性を強
化することがシチジンの生産量の上昇に寄与すると考
え、クローニングしたCTPシンセターゼ遺伝子をシチジ
ン生産菌で発現させることにより、シチジンの生産量を
増加させる研究を行ってきた。その過程で、CTPシンセ
ターゼのCTPによるフィードバック阻害を弱めることに
より、シチジンの生産量が飛躍的に増加することを見出
し、該知見に基づき本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のタ
ンパク質をコードする遺伝子を提供する。
ンパク質をコードする遺伝子を提供する。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質 （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または数個のア
ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつ、シチジン三リン酸による生成物阻害に対
して耐性のシチジン三リン酸合成酵素活性を有するタン
パク質 また、本発明は、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク
質をコードする遺伝子を発現している微生物を培養して
培養物中にシチジンを生成蓄積させ、該培養物からシチ
ジンを採取することを特徴とするシチジンの製造法、さ
らに、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質を提供す
る。
ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつ、シチジン三リン酸による生成物阻害に対
して耐性のシチジン三リン酸合成酵素活性を有するタン
パク質 また、本発明は、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク
質をコードする遺伝子を発現している微生物を培養して
培養物中にシチジンを生成蓄積させ、該培養物からシチ
ジンを採取することを特徴とするシチジンの製造法、さ
らに、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質を提供す
る。
本発明において、CTPによる生成物阻害に対して耐性
とは、CTP非存在下での活性に比べたCTP存在下での活性
の減少が、通常の酵素より少ないことを意味する。この
ようなCTPシンセターゼを発現している微生物として
は、組換えDNA手法により、外部からこのようなCTPシン
セターゼをコードしている遺伝子を導入した微生物、あ
るいは各種薬剤耐性、シチジン生産量増大といったこと
を指標としてスクリーニングしてきた自然界の微生物お
よび変異株のうち、CTPによる生成物阻害に対して耐性
のCTPシンセターゼを発現している微生物が挙げられ
る。
とは、CTP非存在下での活性に比べたCTP存在下での活性
の減少が、通常の酵素より少ないことを意味する。この
ようなCTPシンセターゼを発現している微生物として
は、組換えDNA手法により、外部からこのようなCTPシン
セターゼをコードしている遺伝子を導入した微生物、あ
るいは各種薬剤耐性、シチジン生産量増大といったこと
を指標としてスクリーニングしてきた自然界の微生物お
よび変異株のうち、CTPによる生成物阻害に対して耐性
のCTPシンセターゼを発現している微生物が挙げられ
る。
このような微生物を、通常の微生物の培養と同様の方
法で培養を行う。
法で培養を行う。
すなわち、培地としては、炭素源、窒素源、菌の生育
に必要な各種の無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類等が
適宜選択の上、それぞれ単独もしくは混合して用いられ
る。培地中にpHの変動が観察される場合、硫酸、炭酸カ
ルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニア水等を適宜添
加する。
に必要な各種の無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類等が
適宜選択の上、それぞれ単独もしくは混合して用いられ
る。培地中にpHの変動が観察される場合、硫酸、炭酸カ
ルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニア水等を適宜添
加する。
培養温度は、20℃〜48℃の範囲において、使用する微
生物の生育、シチジンの蓄積量、副産物の抑制を考慮に
入れ、適宜選択できる。培養時間としては、シチジンの
蓄積量、副産物の生成量によって異なるが、通常１日〜
７日である。
生物の生育、シチジンの蓄積量、副産物の抑制を考慮に
入れ、適宜選択できる。培養時間としては、シチジンの
蓄積量、副産物の生成量によって異なるが、通常１日〜
７日である。
培養物からシチジンを分離採取する方法は、沈澱法、
イオン交換樹脂による処理、あるいは溶媒による抽出等
の公知の方法を用いることができる〔特開昭61−135597
号公報参照〕。
イオン交換樹脂による処理、あるいは溶媒による抽出等
の公知の方法を用いることができる〔特開昭61−135597
号公報参照〕。
また、バチルス・ナットウＣ−１株（微工研菌寄第11
055号）由来のCTPシンセターゼの198番目のグルタミン
酸を他のアミノ酸に置換することにより、CTPによる生
成物阻害に対して耐性のCTPシンセターゼを得た。該知
見に基づけば、バチルス・ナットウＣ−１株のCTPシン
セターゼと該領域で相同性の見出される異種の生物のCT
Pシンセターゼにおいても、CTPによる生成物阻害に対し
て耐性の変異酵素の取得は容易である。該領域で相同性
の見出される生物としては、バチルス・ズブチリス〔Jo
urnal of Bacteriology 170,4194−4208（1988）〕、大
腸菌〔Journal of Biological Chemistry 261,5568（19
86）〕等が挙げられる（第１図）。
055号）由来のCTPシンセターゼの198番目のグルタミン
酸を他のアミノ酸に置換することにより、CTPによる生
成物阻害に対して耐性のCTPシンセターゼを得た。該知
見に基づけば、バチルス・ナットウＣ−１株のCTPシン
セターゼと該領域で相同性の見出される異種の生物のCT
Pシンセターゼにおいても、CTPによる生成物阻害に対し
て耐性の変異酵素の取得は容易である。該領域で相同性
の見出される生物としては、バチルス・ズブチリス〔Jo
urnal of Bacteriology 170,4194−4208（1988）〕、大
腸菌〔Journal of Biological Chemistry 261,5568（19
86）〕等が挙げられる（第１図）。
上記のバチルス・ナットウＣ−１は、土壌から新しく
分類されたシチジン生産能を有する菌であり、その菌学
的性状は下記のとおりである。
分類されたシチジン生産能を有する菌であり、その菌学
的性状は下記のとおりである。
（ａ）形態学的形状 １）細胞の形および大きさ：短桿菌、0.7〜1.0×２〜８
μ ２）多形生：単一まれに二連 ３）運動性：なし ４）胞子：卵型の内生胞子を栄養細胞の中央付近に生じ
る。
μ ２）多形生：単一まれに二連 ３）運動性：なし ４）胞子：卵型の内生胞子を栄養細胞の中央付近に生じ
る。
５）グラム染色：陽性 ６）抗酸性：陰性 （ｂ）生育状況 １）肉汁寒天培養：灰白色で周辺が裂開状の偏平なコロ
ニーを作る ２）肉汁液体培養：表面に皮膜を作るが、他は透明 （ｃ）生理的性質 １）硝酸塩の還元：有り ２）クエン酸の利用：有り ３）プロピオン酸の利用：なし ４）VPテスト：陽性 ５）デンプンの加水分解：有り ６）カゼインの加水分解：有り ７）オキシダーゼ：微弱 ８）カタラーゼ：有り ９）インドールの生成：なし 10）酵素に対する態度：好気性 11）ビオチン要求性：有り 12）15％グルタミン酸を含む培地で粘性物質の生成：有
り 13）シチジンの培地への排出：有り （実施例） 以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。
ニーを作る ２）肉汁液体培養：表面に皮膜を作るが、他は透明 （ｃ）生理的性質 １）硝酸塩の還元：有り ２）クエン酸の利用：有り ３）プロピオン酸の利用：なし ４）VPテスト：陽性 ５）デンプンの加水分解：有り ６）カゼインの加水分解：有り ７）オキシダーゼ：微弱 ８）カタラーゼ：有り ９）インドールの生成：なし 10）酵素に対する態度：好気性 11）ビオチン要求性：有り 12）15％グルタミン酸を含む培地で粘性物質の生成：有
り 13）シチジンの培地への排出：有り （実施例） 以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。
実施例１ （工程１） 部位特異的試験管内変異による変異遺伝子作成 バチルス・ナットウＣ−１染色体由来のCTPシンセタ
ーゼ遺伝子を含むプラスミドpFS037をBgl IIおよびHind
IIIで切断することにより得られる1100bpの断片を、M1
3tv18RF（タカラ酒造製）のBamH I−Hind III断片7250b
pに挿入し、M13tv18−FSNを得た。このプラスミドより
得られる一本鎖DNAにMutanTMGキット（タカラ酒造製）
を用いて、CTPシンセターゼの開始コドンのアデニン
（Ａ）より592番目のグアニン（Ｇ）をアデニンに置換
した（第１図参照）。
ーゼ遺伝子を含むプラスミドpFS037をBgl IIおよびHind
IIIで切断することにより得られる1100bpの断片を、M1
3tv18RF（タカラ酒造製）のBamH I−Hind III断片7250b
pに挿入し、M13tv18−FSNを得た。このプラスミドより
得られる一本鎖DNAにMutanTMGキット（タカラ酒造製）
を用いて、CTPシンセターゼの開始コドンのアデニン
（Ａ）より592番目のグアニン（Ｇ）をアデニンに置換
した（第１図参照）。
また、pFS037をAcc I切断し、クレノー・フラグメン
トにより平滑末端化後、Cla Iで切断して生じる950bp断
片、バチルス・ズブチリスおよびエシエリヒア・コリ用
シャトルベクターpHY300PLK（タカラ酒造製）のSm I切
断、脱リン酸化した4.9Kb断片、および592番目のグアニ
ンがアデニンに置換されたM13tv18−FSNをDra I、Cla I
で切断した730bp断片の３断片を、T4DNAリガーゼで結合
し、CTPシンセターゼ遺伝子がテトラサイクリン耐性遺
伝子と同一方向で挿入されたプラスミドを選択し、pFS9
41を作成した（第２図）。この一連の工程により、CTP
シンセターゼの198番目のグルタミン酸（GAAでコードさ
れる）がリジン（AAAでコードされる）に変化した酵素
をコードする遺伝子が作成された。
トにより平滑末端化後、Cla Iで切断して生じる950bp断
片、バチルス・ズブチリスおよびエシエリヒア・コリ用
シャトルベクターpHY300PLK（タカラ酒造製）のSm I切
断、脱リン酸化した4.9Kb断片、および592番目のグアニ
ンがアデニンに置換されたM13tv18−FSNをDra I、Cla I
で切断した730bp断片の３断片を、T4DNAリガーゼで結合
し、CTPシンセターゼ遺伝子がテトラサイクリン耐性遺
伝子と同一方向で挿入されたプラスミドを選択し、pFS9
41を作成した（第２図）。この一連の工程により、CTP
シンセターゼの198番目のグルタミン酸（GAAでコードさ
れる）がリジン（AAAでコードされる）に変化した酵素
をコードする遺伝子が作成された。
なお、592番目のグアニンがアデニンに置換されたM13
tv18−FSN由来のDra I−Cla I断片の配列をサンガーら
の方法〔Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.74,5463（1977）〕
により決定したところ、目的の変異点以外に変異は生じ
ていないことが確認された。
tv18−FSN由来のDra I−Cla I断片の配列をサンガーら
の方法〔Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.74,5463（1977）〕
により決定したところ、目的の変異点以外に変異は生じ
ていないことが確認された。
対照として、pFS037をDra I、Acc Iで切断し、クレノ
ー・フラグメントにより平滑末端化した1680bp断片を、
pHY300PLKのSma I切断後、アルカリホスファターゼ処理
により脱リン酸化した4.9Kb断片に挿入し、CTPシンセタ
ーゼ遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と同一方向で
挿入されたプラスミドを選択し、pFS041を得た（第３
図）。
ー・フラグメントにより平滑末端化した1680bp断片を、
pHY300PLKのSma I切断後、アルカリホスファターゼ処理
により脱リン酸化した4.9Kb断片に挿入し、CTPシンセタ
ーゼ遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子と同一方向で
挿入されたプラスミドを選択し、pFS041を得た（第３
図）。
上記のベクターpFS037は特願平２−25574に記載され
た方法により得ることができる。
た方法により得ることができる。
（工程２） プラスミドpFS041、pFS941のバチルス・ナットウＣ−55
への導入 15μｇのpFS041およびpFS941を山根らのプロトプラス
トを用いる方法〔遺伝子工学,p173,共立出版,1987年〕
でバチルス・ナットウＣ−55株（微工研菌寄第11718
号）に導入し、20μg/mlのテトラサイクリン耐性コロニ
ーを選択し、バーンボイムらの方法〔Nucleicacid Rese
rch,７,1513（1979）〕でプラスミドを抽出し、制限酵
素で切断後、電気泳動し、目的のプラスミドを持つ株と
してpFS041/C−55、pFS941/C−55を選択し、得た。
への導入 15μｇのpFS041およびpFS941を山根らのプロトプラス
トを用いる方法〔遺伝子工学,p173,共立出版,1987年〕
でバチルス・ナットウＣ−55株（微工研菌寄第11718
号）に導入し、20μg/mlのテトラサイクリン耐性コロニ
ーを選択し、バーンボイムらの方法〔Nucleicacid Rese
rch,７,1513（1979）〕でプラスミドを抽出し、制限酵
素で切断後、電気泳動し、目的のプラスミドを持つ株と
してpFS041/C−55、pFS941/C−55を選択し、得た。
宿主として用いるバチルス・ナットウＣ−55株は、土
壌からシチジン生産菌として分離されたバチルス・ナッ
トウＣ−１株（微工研菌寄第11055号）に人工変異処理
を行い、シチジン要求株であるエシエリヒア・コリJF61
8（CGSC5566株：米国イエール大学、E.Coli Genetic St
ock center）の生育を促す株としてスクリーニングさ
れ、バチルス・ナットウＣ−１株よりシチジン生産量の
上昇している株である。
壌からシチジン生産菌として分離されたバチルス・ナッ
トウＣ−１株（微工研菌寄第11055号）に人工変異処理
を行い、シチジン要求株であるエシエリヒア・コリJF61
8（CGSC5566株：米国イエール大学、E.Coli Genetic St
ock center）の生育を促す株としてスクリーニングさ
れ、バチルス・ナットウＣ−１株よりシチジン生産量の
上昇している株である。
（工程３） CTPによるフィードバック阻害の測定 pFS041/C−55およびpFS941/C−55をテトラサイクリン
20μg/mlを含むSEED液体培地〔グルコース２％、NaCl0.
25％、ポリペプトン（和光純薬）１％、イースト・エキ
スD3（和光純薬）１％、ビオチン100μg/ml、ウラシル1
00μg/ml、pH7.3〕50mlに１白金耳植菌し、37℃18時間
培養する。この培養液5mlより集菌し、2mlのホモジネー
トバッファー〔トリス−塩酸20mM（pH8.0）、EDTA1mM、
メルカプトエタノール20mM、グルタミン2mM、ATT1mM〕
に懸濁後、氷中、超音波処理を施し、菌体ホモジネート
を得る。これを等量の２×反応バッファー〔トリス−塩
酸50mM（pH8.0）、MgCl225mM、UTP10mM、ATP8mM、GTP1m
M、グルタミン20mM、EDTA1mM〕と混合し、37℃１分間加
温後、３分間煮沸して反応を停止させる。同様に、反応
液中に各濃度でCTPを存在させ、阻害の程度を測定す
る。この時、ホモジネート液によるCTPの分解活性を補
正するため、反応液にUTPを入れない反応も行う。各反
応液をHPLC分析〔ワットマンSAX−10−25カラム、0.4M
リン酸−2.5％アセトニトリルバッファー（pH3.3）、流
速毎分1.5ml、波長291mmで検出〕し、CTP量を定量し、U
TP存在下でのCTP量とUTP非存在下でのCTP量の差を、CTP
シンセターゼによって生成したCTP量とし、１分間に１
μモルのCTPを生成する活性を1unitと定義する。この結
果、表１のようにpFS941/C−55はpFS041/C−55に比べ、
CTPによる阻害を受けにくくなっていることが判明し
た。
20μg/mlを含むSEED液体培地〔グルコース２％、NaCl0.
25％、ポリペプトン（和光純薬）１％、イースト・エキ
スD3（和光純薬）１％、ビオチン100μg/ml、ウラシル1
00μg/ml、pH7.3〕50mlに１白金耳植菌し、37℃18時間
培養する。この培養液5mlより集菌し、2mlのホモジネー
トバッファー〔トリス−塩酸20mM（pH8.0）、EDTA1mM、
メルカプトエタノール20mM、グルタミン2mM、ATT1mM〕
に懸濁後、氷中、超音波処理を施し、菌体ホモジネート
を得る。これを等量の２×反応バッファー〔トリス−塩
酸50mM（pH8.0）、MgCl225mM、UTP10mM、ATP8mM、GTP1m
M、グルタミン20mM、EDTA1mM〕と混合し、37℃１分間加
温後、３分間煮沸して反応を停止させる。同様に、反応
液中に各濃度でCTPを存在させ、阻害の程度を測定す
る。この時、ホモジネート液によるCTPの分解活性を補
正するため、反応液にUTPを入れない反応も行う。各反
応液をHPLC分析〔ワットマンSAX−10−25カラム、0.4M
リン酸−2.5％アセトニトリルバッファー（pH3.3）、流
速毎分1.5ml、波長291mmで検出〕し、CTP量を定量し、U
TP存在下でのCTP量とUTP非存在下でのCTP量の差を、CTP
シンセターゼによって生成したCTP量とし、１分間に１
μモルのCTPを生成する活性を1unitと定義する。この結
果、表１のようにpFS941/C−55はpFS041/C−55に比べ、
CTPによる阻害を受けにくくなっていることが判明し
た。
（工程４） シチジンの生産量の測定 pFS041/C−55、pFS941/C−55をテトラサイクリン20μ
g/mlを含むSEED液体培地で37℃18時間培養後、テトラサ
イクリン20μg/mlを含むシチジン生産培地〔グルコース
５％、CaCO33％、イーストエキスD3（和光純薬）0.3
％、KH2PO40.2％、FeSO4・7H2O0.001％、MgSO4・7H2O0.
05％、MnSO40.01％、（NH2）2CO1.0％、ビオチン100μg
/ml（pH7.2）〕50mlに２％接種し、500ml容フラスコ
中、毎日最終濃度４％のグルコースを加えながら40℃５
日間培養した。また、Ｃ−55についてテトラサイクリン
を除く以外は同様に培養した。その結果、pFS041/C−55
は4.3mg/mlのシチジンを培地中に蓄積したのに対し、pF
S941/C−55の培地中の蓄積は6.8mg/mlであり、シチジン
生産量が顕著に増大した。一方、Ｃ−55株は同条件で2.
6mg/mlの蓄積であった。
g/mlを含むSEED液体培地で37℃18時間培養後、テトラサ
イクリン20μg/mlを含むシチジン生産培地〔グルコース
５％、CaCO33％、イーストエキスD3（和光純薬）0.3
％、KH2PO40.2％、FeSO4・7H2O0.001％、MgSO4・7H2O0.
05％、MnSO40.01％、（NH2）2CO1.0％、ビオチン100μg
/ml（pH7.2）〕50mlに２％接種し、500ml容フラスコ
中、毎日最終濃度４％のグルコースを加えながら40℃５
日間培養した。また、Ｃ−55についてテトラサイクリン
を除く以外は同様に培養した。その結果、pFS041/C−55
は4.3mg/mlのシチジンを培地中に蓄積したのに対し、pF
S941/C−55の培地中の蓄積は6.8mg/mlであり、シチジン
生産量が顕著に増大した。一方、Ｃ−55株は同条件で2.
6mg/mlの蓄積であった。
実施例２ 実施例１で得られたpFS041/C−55とpFS941/C−55を、
工業的に安価な脱脂大豆0.5％をイーストエキストラの
代わりに用いる以外は、実施例１と同様の方法で培養し
たところ、それぞれ5.6mg/ml、8.3mg/mlのシチジンを蓄
積した。
工業的に安価な脱脂大豆0.5％をイーストエキストラの
代わりに用いる以外は、実施例１と同様の方法で培養し
たところ、それぞれ5.6mg/ml、8.3mg/mlのシチジンを蓄
積した。
（発明の効果） 本発明によれば、CTPシンセターゼをCTPに対する生成
物阻害に対して耐性にすることによって、シチジンの生
産性が顕著に上昇する。
物阻害に対して耐性にすることによって、シチジンの生
産性が顕著に上昇する。
第１図はCTPシンセターゼをコードする遺伝子の塩基配
列で592番目のグアニンがアデニンに置換された配列を
示す。第２図はpFS941の調製方法を示す。第３図はpFS0
41の調製方法を示す。
列で592番目のグアニンがアデニンに置換された配列を
示す。第２図はpFS941の調製方法を示す。第３図はpFS0
41の調製方法を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C12P 19/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を
コードする遺伝子。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質 （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または数個のア
ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつ、シチジン三リン酸による生成物阻害に対
して耐性のシチジン三リン酸合成酵素活性を有するタン
パク質 - 【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を
コードする遺伝子を発現している微生物を培養して培養
物中にシチジンを生成蓄積させ、該培養物からシチジン
を採取することを特徴とするシチジンの製造法。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質 （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または数個のア
ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつ、シチジン三リン酸による生成物阻害に対
して耐性のシチジン三リン酸合成酵素活性を有するタン
パク質 - 【請求項３】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質 （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１または数個のア
ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列か
らなり、かつ、シチジン三リン酸による生成物阻害に対
して耐性のシチジン三リン酸合成酵素活性を有するタン
パク質
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02276489A JP3078572B2 (ja) | 1990-10-17 | 1990-10-17 | 発酵法によるシチジンの製法および該製法に用いられる遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02276489A JP3078572B2 (ja) | 1990-10-17 | 1990-10-17 | 発酵法によるシチジンの製法および該製法に用いられる遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04152891A JPH04152891A (ja) | 1992-05-26 |
| JP3078572B2 true JP3078572B2 (ja) | 2000-08-21 |
Family
ID=17570171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02276489A Expired - Fee Related JP3078572B2 (ja) | 1990-10-17 | 1990-10-17 | 発酵法によるシチジンの製法および該製法に用いられる遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3078572B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3429213B2 (ja) | 1999-02-26 | 2003-07-22 | シャープ株式会社 | 集積回路 |
| CN107723324A (zh) * | 2017-11-28 | 2018-02-23 | 绍兴厚普生物科技有限责任公司 | 一种微生物发酵生产胞嘧啶核苷的方法 |
-
1990
- 1990-10-17 JP JP02276489A patent/JP3078572B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９８８，Ｖｏｌ．１７０，ｐ．４１９４−４２０８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04152891A (ja) | 1992-05-26 |
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