JP2000333690A

JP2000333690A - ガンマ−ポリグルタミン酸の製造方法

Info

Publication number: JP2000333690A
Application number: JP11149049A
Authority: JP
Inventors: Yasutaka Tawara; 康孝田原; Yoshihiro Ogawa; 善弘小川; Nobuyuki Yamatsugu; 信幸山次
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2000-12-05

Abstract

(57)【要約】【課題】微生物の培養物から、ガンマ−ポリグルタミ
ン酸を効率よく製造し、その生産収率を増大させる方法
を提供する。【解決手段】バチルス属に属し、ガンマ−ポリグルタ
ミン酸生産能を有し、かつグルタミン酸合成酵素活性が
欠損若しくは減少した微生物を培地で培養し、その培養
物からガンマ−ポリグルタミン酸を採取する、ガンマ−
ポリグルタミン酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ガンマ−ポリグル
タミン酸の製造方法、さらに詳しくはグルタミン酸合成
酵素が欠損しているか若しくは減少した微生物を用い
て、ガンマ−ポリグルタミン酸を効率よく製造する方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ガンマ−ポリグルタミン酸は、納豆の糸
引きの主体物質として知られており、食品、化粧品、医
療品などの多くの分野で、種々の用途があるものと期待
されている。そして、ガンマ−ポリグルタミン酸は、主
にガンマ−ポリグルタミン酸生産能を有する微生物、例
えば、バチルス属の菌株を培養してその培養物から製造
されている（月刊組織培養、１６巻、Ｎｏ．１０、３６
９〜３７２頁、１９９０年など参照）。しかし現在のと
ころ、いずれの菌株群においてもガンマ−ポリグルタミ
ン酸の合成経路は不明であり、ガンマ−ポリグルタミン
酸合成酵素の存在は示唆されているものの、その実態は
明らかにされてはいない。

【０００３】また、これらのガンマ−ポリグルタミン酸
生産能を有する微生物は、培地にグルタミン酸を添加す
ることにより顕著にガンマ−ポリグルタミン酸合成量が
増加する菌株群とグルタミン酸以外の窒素源（塩化アン
モニウム、尿素、クエン酸）からガンマ−ポリグルタミ
ン酸を合成する菌株群に大別することができる。このよ
うなことから、ガンマ−ポリグルタミン酸の合成と窒素
代謝との間には密接な関係があると考えられている。

【０００４】この窒素代謝、特に、グルタミン酸および
アンモニアの代謝に関与する主要な酵素としては、
（１）グルタミン酸合成酵素；グルタミン、α‐ケトグ
ルタル酸及びＮＡＤＰＨから、２グルタミン酸とＮＡＤ
Ｐを生成する反応を触媒する酵素、（２）グルタミン合
成酵素；ＮＨ₃、グルタミン酸、Ｍｅ²⁺及びＡＴＰか
ら、グルタミン、Ｍｅ²⁺、ＡＤＰ及びＰｉを生成する反
応を触媒する酵素（ただし、Ｍｅ²⁺は金属イオンを表わ
し、通常Ｍｇ²⁺またはＭｎ²⁺が用いられる）、（３）グ
ルタミン酸脱水素酵素；グルタミン酸、Ｈ₂Ｏ、ＮＡＤ
（Ｐ）⁺から、ＮＨ₃、α-ケトグルタル酸、ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈ及びＨ⁺ を生成する反応を触媒する酵素）、
（４）他のアミノ酸由来アミノ基のα‐ケトグルタル酸
への転移反応を触媒する酵素、（５）他のアミノ酸の分
解反応を触媒する酵素などを挙げることができる。細菌
の窒素代謝においては、上記グルタミン酸合成酵素とグ
ルタミン合成酵素が重要な酵素であり、共役してアンモ
ニアを同化している。しかし現在のところ、いずれの菌
株においてもガンマ−ポリグルタミン酸の合成経路、調
節機構は解明されておらず、その実態は明らかにされて
はいない。

【０００５】本発明者らは、ガンマ−ポリグルタミン酸
の発酵生産量を増大させるための方法として、ガンマ−
ポリグルタミン酸生産能を有し、低アンモニア生産性の
変異株を培養して培養物中にガンマ−ポリグルタミン酸
を生産させる方法（特開平８−１５４６１６号公報参
照）、及び醤油麹もしくはその抽出物、醤油醸造物また
はそれらの混合物を含有する培地で、ガンマ−ポリグル
タミン酸生産能を有する微生物を培養してガンマ−ポリ
グルタミン酸を生産する方法（特開平８−２４２８８０
号参照）を提案した。しかしながら、これらの方法は、
ガンマ−ポリグルタミン酸の生産量は増大するものの、
培養する過程でアンモニアの発生に起因するｐＨの上昇
によってガンマ−ポリグルタミン酸の生産が抑制される
ことがわかり（Ｏｇａｗａ，Ｙ．，Ｙａｍａｇｕｃｈ
ｉ，Ｆ．，Ｙｕａｓａ，Ｋ．ａｎｄＴａｈａｒａ，
Ｙ．：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，６１巻，１６８４−１６８７頁，１９９７年）必
ずしも満足すべき方法ではなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明が目的とすると
ころは、前記した従来技術が有する欠点がなく、微生物
の培養物からガンマ−ポリグルタミン酸を従来よりも効
率よく生産し、その生産収率を増大させるのに有効な方
法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意研究した結果、バチルス属に属
し、ガンマ−ポリグルタミン酸生産能を有する微生物に
おいて、そのガンマ−ポリグルタミン酸の生産量が窒素
代謝酵素活性、特にグルタミン酸合成酵素活性に深く関
係すること、そしてグルタミン酸合成酵素活性が欠損若
しくは減少した変異株を作成し、これを培地で培養し、
ガンマ−ポリグルタミン酸の生産量を比較したところ、
ガンマ−ポリグルタミン酸生産量が親株に比較して約
１．５倍に増大すること、またグルタミン酸合成酵素活
性が欠損若しくは減少した変異株をグルタミン酸又はそ
の金属塩を含む培地で培養するとガンマ−ポリグルタミ
ン酸の生産収量が格段に増大することなどを見出し、こ
れらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、バチルス属に属し、
ガンマ−ポリグルタミン酸生産能を有し、かつグルタミ
ン酸合成酵素活性が欠損若しくは減少した微生物を培地
で培養し、その培養物からガンマ−ポリグルタミン酸を
採取することを特徴とする、ガンマ−ポリグルタミン酸
の製造方法であり、前記方法において、グルタミン酸合
成酵素活性が０．２Ｕ／ｍｇ蛋白質以下である微生物を
用いる、ガンマ−ポリグルタミン酸の製造方法であり、
前記方法において、培地がグルタミン酸又はその金属塩
を含有させた培地である、ガンマ−ポリグルタミン酸の
製造方法であり、また前記方法における微生物が、バチ
ルス・スブチリスＵＴ−１（工業技術院生命工学工業
技術研究所寄託ＦＥＲＭＰ−１７４００）である、ガ
ンマ−ポリグルタミン酸の製造方法である。以下、本発
明を詳細に説明する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明においては、グルタミン酸
合成酵素活性が殆ど欠損しているか、若しくはグルタミ
ン酸合成酵素活性が例えば０．２Ｕ／ｍｇ蛋白質以下程
度に減少した微生物を用いることにより、目的を達成す
ることができる。先ず、前記した性質を有する微生物を
得るために用いる親株としては、バチルス属に属し、ガ
ンマ−ポリグルタミン酸生産能を有する微生物であれば
いかなるものでもよく、例えばバチルス・ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・
リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆ
ｏｒｍｉｓ）、バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス・メガテリウム
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）などが挙
げられる。さらに具体的には、例えばバチルス・ズブチ
リスＭＲ１４１（ＦＥＲＭＰ−１４６９２）、バチル
ス・ズブチリスＳ−２（ＩＦＯ１４８９８、ＦＥＲＭ
ＢＰ−２５２８）、バチルス・ズブチリスＩＦＯ１４
１８７、バチルス・ズブチリスＴＴＣＣ１６２（微工研
寄託第１１０５２号）、バチルス・ズブチリスＫ−２
（微工研寄託第９７６８号）、バチルス・ズブチリスＦ
−２−０１（ＦＥＲＭＰ−９０８２）など、あるいは
通常納豆製造に使用されている宮城野菌、高橋菌、旭川
菌、松村菌、成瀬菌などの市販のものなどを挙げること
ができる。

【００１０】これらの微生物を親株として、グルタミン
酸合成酵素活性が欠損若しくは減少した微生物とするに
は、通常に行われる変異処理方法が採用される。その変
異処理方法としては、公知の方法、例えば遺伝子操作に
よる方法、細胞または胞子に変異源性のある薬剤を接触
させる方法、またＸ線、紫外線、放射線、光などを照射
する方法などを挙げることができる。前記の薬剤を接触
させる方法に用いられる薬剤としては、例えばＮ−メチ
ル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴ
Ｇ）、メチルエチル硫酸などを挙げることができる。こ
れらの薬剤を当該微生物の細胞または胞子に接触させる
際の前記薬剤濃度は、細胞１０⁸〜１０⁹個／ｍｌの細胞
懸濁液においては、通常例えば１０〜１０００γ／ｍｌ
程度である。また接触の際の条件は、通常、温度０〜５
０℃、時間１０〜１４００分程度である。

【００１１】変異処理された細胞または胞子は、通常の
公知の栄養培地、例えば肉汁、ペプトン、大豆粉、酵母
エキス、カザミノ酸、アミノ酸類またはそれらの混合物
などを含有する培地、または必要な栄養素類を含有する
無機合成培地などの液体培地で３〜２４時間培養する。
その後、適当に希釈して前記培地組成の寒天平板培地に
塗抹する。また変異処理した細胞または胞子を前記の平
板培地に直接塗抹してもよい。そしてこれを培養後、平
板培地に出現するコロニーを一つ一つ肉汁などを含有す
る寒天斜面培地にとって培養する。その後それら培養菌
株についてそのグルタミン酸合成酵素活性を後述する実
施例２に記載の方法で測定し、グルタミン酸合成酵素活
性が０．２Ｕ／ｍｇ蛋白質以下の菌株を選択、分離した
ものを本発明に使用する微生物とする。このような分離
法は無差別スクリーニング法と云われる。

【００１２】前記した無差別スクリーニング法の他、グ
ルタミン酸合成酵素のみを特異的に欠損させる方法とし
ては、遺伝子操作による遺伝子破壊法がある。この方法
によれば、複数の遺伝子に損傷を与えることなく、目的
の遺伝子のみを破壊することができ、目的遺伝子以外の
合成経路に変動を与えることがないことから、この方法
が特に好ましい。具体的には、グルタミン酸合成遺伝子
をクローニングし、その構造遺伝子の内部に異種遺伝
子、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子（マーカー
遺伝子）断片を挿入して、不活性型のグルタミン酸合成
酵素遺伝子を構築する。この遺伝子を、親株に形質転換
すると、親株の正常なグルタミン酸合成遺伝子との間で
遺伝子の組換えがおこり、不活性型のグルタミン酸合成
遺伝子が正常遺伝子の内部に挿入された変異株を得るこ
とができる。このようにして他の遺伝子には損傷を与え
ることなく、グルタミン酸合成酵素遺伝子のみが遺伝子
破壊された、目的とするグルタミン酸合成酵素活性が欠
損した微生物とすることができる。しかし、本発明に用
いられる、グルタミン酸合成酵素活性が欠損若しくは減
少した微生物が、どのような作用機作でガンマ−ポリグ
ルタミン酸を多量に生成するかについてはいまのところ
明らかではない。

【００１３】グルタミン酸合成酵素活性が欠損した新規
変異株を取得する方法の一例として、市販の納豆から分
離したバチルス・ズブチリスＮＲ−１株を親株として
用い、前記した遺伝子操作による方法で取得したバチル
ス・ズブチリスＵＴ−１の取得例を後述の実施例１に
示す。そのバチルス・ズブチリスＵＴ−１の菌学的性
質は以下に示すとおりである。なお、菌学的性質を調べ
る実験は、「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆ
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＶ
ｏｌ．２」（１９８６年）に記載されている方法に従っ
て行った。

【００１４】〔バチルス・スブチリスＵＴ−１の菌学
的性質〕（Ａ）形態的性質顕微鏡的観察（肉汁寒天培地（ｐＨ７）において、４０
℃、２０〜２４時間培養して生育した細胞について）（１）細胞の形および大きさ：０．１〜０．５×１〜７
ミクロンの桿菌（２）運動性の有無：運動性あり。（３）胞子の有無：あり。（４）グラム染色性：陽性。（Ｂ）各培地（ｐＨ７）における生育状態（１）肉汁寒天平板培養４０℃、２０時間の静置培養で白色の円形コロニーを形
成する。色素の生産は認められない。（２）肉汁寒天斜面培養４０℃、２０時間で生育を示す。（３）肉汁液体培養４０℃、２０時間の静置培養で培地全体に生育（濁り）
が認められる。皮膜を形成する。（４）肉汁ゼラチン穿刺培養４０℃、３日間の静置培養で、ゼラチンを液化する。（Ｃ）生理的性質主に、ｐＨ７に調製した培地を用いて試験した。（１）硝酸塩の還元：還元する。（２）ＶＰテスト：陽性。（３）インドールの生成：生成しない。（４）デンプンの加水分解：加水分解する。（５）クエン酸の利用：利用する。（６）無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩共に
利用する。（７）色素の生成：生成しない。（８）カタラーゼ：陽性。（９）生育の範囲：温度；２５〜５５℃、ｐＨ；５〜９（１０）酸素に対する態度：好気性。（１１）糖類からの酸及びガスの生成の有無：Ｄ−グル
コース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マン
ニトールより酸の生成は認められるが、ガスの生成は認
められない。

【００１５】〔親株と変異株の菌学的性質の比較〕親株
である、バチルス・ズブチリスＮＲ−１の菌学的性質
を、前記したバチルス・スブチリスＵＴ−１のときと
同様にして調べた結果、その形態的性質、各培地（ｐＨ
７）における生育状態、生理的性質は、バチルス・スブ
チリスＵＴ−１と同じであった。また、上記以外の性
質、例えば７％食塩含有培地での生育状態（陽性）、ビ
オチン要求性（有り）などについても実験した結果、い
ずれも両者は一致した。

【００１６】よって上記の性質から、このＮＲ−１及び
ＵＴ−１はバチルス・ズブチリスに属すると判断され
る。また、このＵＴ−１を前述した液体培地で培養した
ときの培養物中のグルタミン酸合成酵素活性は検出され
ないほど低いことが確認された。そしてガンマ−ポリグ
ルタミン酸生産量は、親株のＮＲ−１に比べて約１．５
倍も高いことが確認された。そして、このようなグルタ
ミン酸合成酵素活性が欠損若しくは減少した、ガンマ−
ポリグルタミン酸生産量が増加するようなバチルス属に
属する変異株は現在まで全く知られていない。よって本
発明者らは、この変異株を新規変異株と認定し、バチル
ス・ズブチリスＵＴ−１と命名して工業技術院生命工
学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１７４００として寄
託した。

【００１７】次に、前記のごとくして得られた目的とす
る変異株を培地で培養する際の培地は、通常のガンマ−
ポリグルタミン酸の生産に使用されるものでよいが、そ
の培地にグルタミン酸又はその金属塩、例えばグルタミ
ン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウムなどを含有させ
ると、ガンマ−ポリグルタミン酸が効率よく生産される
ので特に好ましい。そして、液体培養の場合の培地成分
の具体例としては、次のようなものを適宜組み合わせた
ものが用いられる。

【００１８】まず、炭素源としては、ブドウ糖、果糖、
庶糖、マルトース、粗糖類、糖密類（例えば、甜菜糖
密、甘藷糖密）、各種澱粉類（例えば、タピオカ、サゴ
ヤシ、甘藷、馬鈴薯、トウモロコシ）またはその酸糖化
液類、酵素糖化液類など、あるいはそれらの２種以上を
適宜組み合わせたものが用いられる。また窒素源として
は、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルタミ
ン酸カリウム、醤油麹もしくはその抽出物、醤油又は醤
油のおりなどの醤油醸造物またはそれらの混合物、ペプ
トン、大豆粉、コーンスティープリカー、酵母エキス、
肉エキス、大豆そのものまたは脱脂大豆若しくはそれら
の粉体または粒体またはそれらの抽出液、尿素などの有
機窒素類、硫酸、硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム
塩類、アンモニアガス、アンモニア水などの無機窒素類
など、あるいはそれらの２種以上を適宜組み合わせたも
のなどが用いられる。また上記の炭素源、窒素源に加え
て、微生物の生育に必要な各種無機塩類、例えばカルシ
ウム、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガ
ン、鉄、銅、亜鉛などの硫酸塩類、塩酸塩類、リン酸塩
類、酢酸塩類、あるいはアミノ酸類、ビタミン類などが
用いられる。アミノ酸類としては、前記したグルタミン
酸のほかに、必要によりアスパラギン酸、アラニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、ヒスチジンなど、またビタ
ミン類としてはビオチン、サイアミンなどを用いること
ができる。また固体培養の場合の培地素材としては、例
えば蒸煮した大豆、大麦、小麦、そば、トウモロコシま
たはそれらの混合物、及びそれらにグルタミン酸又はそ
の金属塩を添加したものが好適なものとして用いられ
る。

【００１９】前記の培地で前記した微生物を培養するに
は、培地を通常の方法、例えば１１０〜１４０℃、８〜
１５分で殺菌した後、培地に微生物を添加する。液体培
養する場合には、振とう培養、通気攪拌培養などの好気
的条件下で行なうことが望ましい。その際の培養温度
は、２５〜５０℃、好ましくは３７〜４２℃が適当であ
る。また培地のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、アンモニア、またはそれらの水溶液などによって
調整し、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８で培養する
のが望ましい。また、培養期間は、通常２〜４日間程度
でよい。また固体培養の場合においても前記液体培養の
場合と同様に、培養温度は２５〜５０℃、好ましくは３
７〜４２℃、培養時のｐＨは５〜９、好ましくはｐＨ６
〜８が採用される。このようにして培養すると、ガンマ
−ポリグルタミン酸は、主として菌体外に蓄積されて前
記した培養物中に含まれる。

【００２０】この培養物からガンマ−ポリグルタミン酸
を分離、採取するには、公知の方法例えば、（１）固体
培養物から２０％以下の食塩水により抽出分離法する方
法（特開平３−３０６４８号公報）、（２）硫酸銅によ
る沈殿法（Ｔｈｒｏｎｅ．Ｂ．Ｃ．，Ｃ．Ｃ．Ｇｏｍ
ｅｚ，Ｎ．Ｅ．ＮｏｕｅｓａｎｄＲ．Ｄ．Ｈｏｕｓ
ｅｖｒｉｇｈｔ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，６８巻、
３０７頁、１９５４年）、（３）アルコール沈殿法
（Ｒ．Ｍ．Ｖａｒｄ，Ｒ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎａｎ
ｄＦ．Ｋ．Ｄｅａｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５巻、４１
頁、１９６３年、あるいは沢純彦、村川武雄、村尾沢
夫、大亦正次郎：農化、４７巻、１５９〜１６５頁、１
９７３年、あるいは藤井久雄：農化、３７巻、４０７〜
４１２頁、１９６３年など）、（４）架橋化キトサン成
形物を吸着剤とするクロマトグラフィー法（特開平３−
２４４３９２号公報など）、（５）分子限外濾過膜を使
用する分子限外濾過法、（６）前記（１）〜（５）を適
宜組合せた方法などが採用できる。このようにして分
離、採取したものは、必要により公知の方法で濃縮、熱
風乾燥、凍結乾燥などの操作を施して、ガンマ−ポリグ
ルタミン酸の含有液、または粉末としてもよい。

【００２１】本発明におけるガンマ−ポリグルタミン酸
の測定は、以下の方法で行った。すなわち、液体培養物
から菌体を遠心分離などの操作で除き、清澄化した試料
液を、６Ｎ塩酸で１１０℃、４時間の加水分解処理を行
い、ガンマ−ポリグルタミン酸の構成成分であるグルタ
ミン酸にまで分解し、塩酸分解処理前と処理後の各グル
タミン酸量をアミノ酸分析計で測定し、分解処理後のグ
ルタミン酸量から処理前のグルタミン酸量を減じて求め
た量をガンマ−ポリグルタミン酸量とした。

【００２２】

【実施例】以下に参考例、実施例を示して本発明をさら
に詳細に説明すが、本発明はそれらの例によってなんら
限定されるものではない。実施例１（納豆菌ＮＲ−１株のグルタミン酸合成酵素遺
伝子断片のクローニング）Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓのデータバンクの
グルタミン酸合成酵素遺伝子を参考にして下記のプライ
マーを合成した。５’ＦｏｒｗａｒｄＣＴＴＧＧＡＴＧＧＡＧＡＡＣＴ
ＧＴＡＣＣＴＧ５’ＲｅｖｅｒｓｅＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＴＡＧＧ
ＴＧＣＴＧ上記プライマーを鋳型にして、ＰＣＲ法を用いて約６ｋ
ｂｐのグルタミン酸合成酵素遺伝子断片を調製した。こ
の断片を制限酵素EcoT22Ｉ（宝酒造社製）で切断し、１
％アガロースゲルで電気泳動して約５ｋｂの断片を回収
した。この５ｋｂの断片をｐUC19（宝酒造社製）の Pst
Ｉサイトへ挿入してプラスミド（以下、ｐＧＯという）
を作製した。ｐＧＯ中の５ｋｂの断片の塩基配列を部分
的に解析した結果、その断片がグルタミン酸合成酵素遺
伝子との相同性が認められ、得られた５ｋｂの断片がグ
ルタミン酸合成遺伝子の一部であることを確認した（図
１参照）。

【００２３】＜グルタミン酸合成酵素遺伝子の破壊用プ
ラスミドの作製＞先のプラスミドｐＧＯを制限酵素 Nae
Ｉ（宝酒造社製）で切断した断片を、１％アガロースゲ
ル電気泳動によって回収し、ＤＮＡ５’末端のリン酸基
を除去するためにアルカリフォスファターゼ処理をし
た。一方、マーカーとして制限酵素Acc II（宝酒造社
製）で切断したクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ
^r）断片を先のプラスミドｐＧＯの NaeＩサイトに挿入
し、グルタミン酸合成酵素遺伝子の破壊用プラスミドｐ
ＧＯＣＭを作製した（図２参照）。

【００２４】＜グルタミン酸合成酵素遺伝子の破壊株の
調製＞納豆菌ＮＲ−１株を２ＸＴＹ培地（１．６％ポリ
ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ
７）２０ｍｌに植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで１晩培
養した。この培養液２００μｌを２０ｍｌのＳＰＩ培地
（０．６％ＫＨ₂ＰＯ₄，１．４％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．２％
硫酸アンモニウム、０．１％クエン酸ナトリウム、０．
０２％硫酸マグネシウム、０．５％グルコース、０．０
２％カザミノ酸、０．１％酵母エキス、５０ｍｇ／ｍｌ
トリプトファン、５０ｍｇ／ｍｌロイシン）に移植して
対数増殖後期まで培養した。さらにこの培養液１０ｍｌ
を１００ｍｌのＳＰII培地（０．６％ＫＨ₂ＰＯ₄，１．
４％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．２％硫酸アンモニウム、０．１％
クエン酸ナトリウム、０．０２％硫酸マグネシウム、
０．５％グルコース、７５ｍｇ／ｍｌＣａＣｌ₂、５０
８ｍｇ／ｍｌＭｇＣｌ₂）に移植して３７℃、２００ｒ
ｐｍで９０分間振とう培養し、コンピテントセルを調製
した。調製したコンピテントセルの培養液１０ｍｌを２
０ｍｌ容三角フラスコに入れ、先に作成した遺伝子破壊
用プラスミドｐＧＯＣＭを１０μｇ添加し、３７℃、１
２０ｒｐｍで６０分間培養した。培養液１００μｌを５
μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含む２Ｘ
ＹＴプレートに塗沫して、３７℃で約１５時間静地培養
して生育した形質転換株（ＵＴ−１）を得た。

【００２５】実施例２（グルタミン酸合成酵素活性の測
定）グルタミン酸合成酵素活性の測定は、Ｓｏｎｅｎｓｈｅ
ｉｎらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７
１，４７１８−４７２７（１９８９）参照）に従い、以
下のようにして行った。先ず、ＬＢ培地（１％ポリペプ
トン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７）５
ｍｌに実施例１で得られた形質転換株（ＵＴ−１）を植
菌して３７℃で１晩培養したものを、３０ｍｌのＬＢ培
地に対して０．３ｍｌ接種して、３７℃で１５時間培養
した。グルタミン酸合成酵素は主として菌体内に存在す
るので、この培養液を４℃で１２，０００ｒｐｍ、１０
分間の遠心分離して菌体を集めた。この菌体を１０ｍｌ
の洗浄液（５０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、２０
０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．９）で２回洗浄し、得られた
菌体を３ｍｌの緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−塩酸緩衝
液、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール、ｐＨ７．９）に懸濁した。これを１５０Ｗ、５
分間の超音波処理して菌体を破砕した後、遠心分離（７
０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して上清を粗酵素液とし
て用いた。

【００２６】反応液（５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８），３５ｍＭ２−オキソグルタル酸（ｐＨ
７）、０．１ｍＭＮＡＤＰＨ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ
グルタミン（ｐＨ７）、５ｍＭ２−メルカプトエタ
ノール）に、前記粗酵素液０．２ｍｌを添加して、全量
を１ｍｌとし、３０℃で反応させた後、ＮＡＤＰＨの酸
化を３４０ｎｍの吸光度で測定した。上記反応液よりグ
ルタミンを除いた反応系を用い、きょう雑する可能性の
あるＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性に由来するＮＡＤＰＨ
の増加量を減じて、グルタミン酸合成酵素活性とした。
また、グルタミン酸合成酵素活性は、１分間に１ｎｍｏ
ｌのＮＡＤＰＨを酸化する酵素量を１ユニットとした。
比活性はタンパク質１ｍｇあたりのユニットとした。な
お、タンパク質の定量は、堀尾らの方法（蛋白質・酵素
の基礎実験法改訂第２判、江南堂、１９９４年）で測
定した。すなわちＡ液（２％Ｎａ₂ＣＯ₃を含む０．１Ｎ
ＮａＯＨ溶液）とＢ液（０．５％ＣｕＳＯ₄を含む１
％クエン酸ナトリウム水溶液）を５０：１で混合してＣ
液を作成した。タンパク質濃度が５０〜３００μｇ／ｍ
ｌになるように希釈したサンプル０．３ｍｌとＣ液３ｍ
ｌとを混合し、室温で２０分間静置した。それに、２倍
に希釈したフェノール試薬（和光純薬社製）を０．３ｍ
ｌ加えて３０分間静置したのち、７５０ｎｍの吸光度を
測定した。検量線は、０〜４００μｇ／ｍｌの牛血清ア
ルブミン（和光純薬社製）を用いた。

【００２７】親株（ＮＲ−１株）とグルタミン酸合成酵
素活性が欠損した変異株（ＵＴ−１）とのグルタミン酸
要求性及びグルタミン酸合成酵素活性の比較を表１に示
す。なお、グルタミン酸要求性については、１％硫酸ア
ンモニウム、０．１％Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．１％ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄、０．０５％ＭｇＳＯ₄、０．０２％ＣａＣｌ₂、
０．００５％ＦｅＣｌ₃、０．００２％ＭｎＣｌ₂、０．
５μｇ／ｍｌビオチン、に１．５％の寒天を含むプレー
トに生育する菌株をグルタミン酸非要求性（−）とし、
上記培地に生育せず、かつ、上記培地に２％グルタミン
酸を添加した培地に生育する菌株をグルタミン酸要求性
（＋）とした。

【００２８】

【表１】表１親株と変異株とのグルタミン酸要求性、グルタミン酸合成酵素活性株名 L-Glu要求性グルタミン酸合成酵素活性（U/mgタンパク質）親株（ＮＲ−１） − １．６２変異株（ＵＴ−１）＋０

【００２９】表２に示すとおり、本発明による変異株
（ＵＴ−１）は、グルタミン酸要求性を有し、グルタミ
ン酸合成酵素活性が欠損していることがわかる。

【００３０】実施例３（ガンマ−ポリグルタミン酸の製
造及びその測定）実施例１で得たグルタミン酸合成酵素活性の欠損株ＵＴ
−１と親株であるＮＲ−１株を、３０ｍｌのガンマ−ポ
リグルタミン酸生産培地（２％グルタミン酸、１％硫酸
アンモニウム、０．１％Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．１％ＫＨ₂
ＰＯ₄、０．０５％ＭｇＳＯ₄、０．０２％ＣａＣｌ₂、
０．００５％ＦｅＣｌ₃、０．００２％ＭｎＣｌ₂、０．
５μｇ／ｍｌビオチン、ｐＨ７．５）を含む２００ｍｌ
容のひだ付き三角フラスコにそれぞれ植菌し、３７℃で
１７０ｒｐｍで、７２時間振とう培養した。培養液中の
ガンマ−ポリグルタミン酸量を前記した方法で測定した
結果、ＮＲ−１では１０ｍｇ／ｍｌの生産量であった
が、グルタミン酸合成酵素活性の破壊株では１５ｍｇ／
ｍｌの生産量を示し、ＮＲ−１株に比較して１．５倍の
ガンマ−ポリグルタミン酸生産量の増加が認められた。

【００３１】実施例４（ガンマ−ポリグルタミン酸の製
造）３０ｌ容のジャーファーメンターに、２０ｌのガンマ−
ポリグルタミン酸生産培地〔６％（ｗ／ｖ）マルトー
ス、５％（ｗ／ｖ）グルタミン酸ナトリウム、７％生醤
油、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．０５％（ｗ
／ｖ）ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＮａＣｌの最終濃度が３％
（ｗ／ｖ）〕を添加し、１２１℃、１５分間殺菌した。
実施例１で得たグルタミン酸合成酵素活性の欠損株ＵＴ
−１と親株であるＮＲ−１株を上記と同一の培地１００
ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコで１晩前培養した
後、その全量を先のジャーファーメンターに移植した。
撹拌回転数４００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、温度４０℃
の条件で７２時間培養した。その培養液を遠心分離操作
して菌体を除いた上澄液について、ガンマ−ポリグルタ
ミン酸を測定した。その結果、ＮＲ−１では１５．２ｍ
ｇ／ｍｌの生産量であったのに対し、グルタミン酸合成
酵素活性の欠損株では２３．５ｍｇ／ｍｌの生産量を示
し、ＮＲ−１株に比較して約１．５倍のガンマ−ポリグ
ルタミン酸生産量の増加が認められた。したがって、本
発明の方法によれば、ガンマ−ポリグルタミン酸を効率
よく製造できることがわかる。

【００３２】実施例５（ガンマ−ポリグルタミン酸溶液
の製造）実施例４に記載したと同様に培養して得られた培養液１
リットルに、食塩１００ｇを添加して粘度を減少させた
後、これを遠心分離して除菌し、その上澄液を０．４５
μｍの膜でろ過を行い不溶物を除去して清澄な液を得
た。この清澄液に、ｐＨ１．５程度となるまで硫酸を添
加し、１０分間室温に放置してガンマ−ポリグルタミン
酸を沈殿させた。沈殿したガンマ−ポリグルタミン酸を
ガーゼで回収し、これを再度水にけん濁し、１０ＮＮ
ａＯＨを用いてｐＨ８に調整してガンマ−ポリグルタミ
ン酸を溶解した。このようにして、粗精製された２．５
％のガンマ−ポリグルタミン酸塩の溶液１リットルを調
整した。

【００３３】実施例６（ガンマ−ポリグルタミン酸の製
造）実施例４に記載したと同様に培養して得られた培養液１
リットルに、食塩１００ｇを添加して粘度を減少させた
後、これを遠心分離して除菌し、その上澄液を０．４５
μｍの膜でろ過を行い不溶物を除去して清澄な液を得
た。この清澄液に、４リットルのエタノールを加え、生
じた沈殿物をガーゼで回収した。この沈殿物を１リット
ルの蒸留水に溶解した。この溶解物を１０リットルの水
に対して、５℃で、一晩透析して低分子物質を除去し
た。次いで、この透析液を常法により凍結乾燥し、ガン
マ−ポリグルタミン酸の白色粉末２５ｇを得た。この白
色粉末の純度は、９０％であった。

【００３４】

【発明の効果】本発明の方法によれば、ガンマ−ポリグ
ルタミン酸を、従来の方法に比べて格段に収率よく製造
することができる。そして、本発明の方法によって製造
されたガンマ−ポリグルタミン酸は、食品、化粧品、医
療品などの多くの分野で、種々の用途に用いることので
きるので、産業上極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１における、ＰＣＲによって増幅した
グルタミン酸合成酵素の遺伝子断片を示す図。

【図２】実施例１における、グルタミン酸合成酵素遺
伝子破壊用プラスミドｐＧＯＣＭの作製方法を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:125）Ｆターム(参考） 4B064 AE03 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA15X AA15Y AB01 AC14 AC20 CA17 CA41 CA44 CA50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス属に属し、ガンマ−ポリグルタミ
ン酸生産能を有し、かつグルタミン酸合成酵素活性が欠
損若しくは減少した微生物を培地で培養し、その培養物
からガンマ−ポリグルタミン酸を採取することを特徴と
する、ガンマ−ポリグルタミン酸の製造方法。
【請求項２】グルタミン酸合成酵素活性が、０．２Ｕ／
ｍｇ蛋白質以下である微生物を用いる、請求項１記載の
ガンマ−ポリグルタミン酸の製造方法。
【請求項３】培地が、グルタミン酸又はその金属塩を含
有させた培地である、請求項１記載のガンマ−ポリグル
タミン酸の製造方法。
【請求項４】微生物が、バチルス・スブチリスＵＴ−
１（工業技術院生命工学工業技術研究所寄託ＦＥＲＭ
Ｐ−１７４００である、請求項１、２又は３に記載のガ
ンマ−ポリグルタミン酸の製造方法。