JP2819181B2 - 微生物によるシチジンの製造方法 - Google Patents
微生物によるシチジンの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医薬品等の合成原料として有用なシチジン
の発酵法による製造方法に関する。
の発酵法による製造方法に関する。
微生物を培養してシチジンを得る方法としては、バチ
ルス・ズブチルス或いはプロテウス・レトゲリーの変異
株を用いる方法（特公昭36−21499号公報）；ブレビバ
クテリウム属のプリン、ピリジン及びヒスチジンに対し
てアナログ耐性の変異株を用いる方法（特公昭57−1887
1号公報）；ミクロバクテリウム属のプリンに対してア
ナログ耐性の変異株を用いる方法（特公昭57−18872号
公報）；バチルス属のピリミジンに対してアナログ耐性
の変異株を用いる方法（特開昭61−135597号公報）等が
知られている。
ルス・ズブチルス或いはプロテウス・レトゲリーの変異
株を用いる方法（特公昭36−21499号公報）；ブレビバ
クテリウム属のプリン、ピリジン及びヒスチジンに対し
てアナログ耐性の変異株を用いる方法（特公昭57−1887
1号公報）；ミクロバクテリウム属のプリンに対してア
ナログ耐性の変異株を用いる方法（特公昭57−18872号
公報）；バチルス属のピリミジンに対してアナログ耐性
の変異株を用いる方法（特開昭61−135597号公報）等が
知られている。
本発明は、医薬品等の合成原料として有用なシチジン
を微生物により多量生産できる方法を提供することにあ
る。
を微生物により多量生産できる方法を提供することにあ
る。
本発明者らは、微生物によるシチジンの生産量に増大
させるべく種々検討した結果、バチルス属細菌に６−ジ
アゾ−５−オキソ−ノルロイシン（以後、DONと略す）
に対する耐性を付与する事により、シチジンの生産量が
飛躍的に増加することを見い出し、該知見に基づき本発
明を完成した。
させるべく種々検討した結果、バチルス属細菌に６−ジ
アゾ−５−オキソ−ノルロイシン（以後、DONと略す）
に対する耐性を付与する事により、シチジンの生産量が
飛躍的に増加することを見い出し、該知見に基づき本発
明を完成した。
即ち、本発明は、バチルス属に属し、DONに耐性を有
する微生物を培養して培養中にシチジンを生成させ、該
培養物からシチジンを採取することを特徴とするシチジ
ンの製造法、及びDONに耐性を有するバチルス・ナット
ウを提供する。
する微生物を培養して培養中にシチジンを生成させ、該
培養物からシチジンを採取することを特徴とするシチジ
ンの製造法、及びDONに耐性を有するバチルス・ナット
ウを提供する。
本発明において使用する薬剤DONとしては、６−ジア
ゾ−５−オキソ−Ｄ−ノルロイシン、６−ジアゾ−５−
オキソ−Ｌ−ノルロイシン、６−ジアゾ−D,L−ノルロ
イシン等が挙げられるが、これらの少なくとも一つに耐
性を有すればよい。また、耐性株の分離には親株の生育
を阻害する濃度、通常は１〜1000mg/ml程度で使用され
る。
ゾ−５−オキソ−Ｄ−ノルロイシン、６−ジアゾ−５−
オキソ−Ｌ−ノルロイシン、６−ジアゾ−D,L−ノルロ
イシン等が挙げられるが、これらの少なくとも一つに耐
性を有すればよい。また、耐性株の分離には親株の生育
を阻害する濃度、通常は１〜1000mg/ml程度で使用され
る。
本発明において使用する微生物としては、バチルス属
に属し、DONに耐性を有し、シチジン生産能を有する微
生物であればいずれも用いられ、一般にはバチルス属に
属する菌株を親株とし、これにＮ−メチル−Ｎ′−ニト
ロソグアニジン等の変異薬剤による処理、あるいは紫外
線照射等を施してDON耐性を有する変異株を選択、分離
する。あるいは、DON含有培地に馴致培養することによ
っても分離される。
に属し、DONに耐性を有し、シチジン生産能を有する微
生物であればいずれも用いられ、一般にはバチルス属に
属する菌株を親株とし、これにＮ−メチル−Ｎ′−ニト
ロソグアニジン等の変異薬剤による処理、あるいは紫外
線照射等を施してDON耐性を有する変異株を選択、分離
する。あるいは、DON含有培地に馴致培養することによ
っても分離される。
他方、自然界に広く存在している野生株の中には人為
的な処理を経なくても、ある程度DONに耐性を有するも
のがある可能性を否定することはできず、かかる歯株を
スクリーニングすることにより新たに見いだした場合か
かる歯株が本発明の範囲に包含されることは言うまでも
ない。
的な処理を経なくても、ある程度DONに耐性を有するも
のがある可能性を否定することはできず、かかる歯株を
スクリーニングすることにより新たに見いだした場合か
かる歯株が本発明の範囲に包含されることは言うまでも
ない。
本発明において使用される微生物の具体例としては、
バチルス・ナットウＣ−55株を親株として、DON耐性株
として誘導されたバチルス・ナットウＤ−18株が挙げら
れる。
バチルス・ナットウＣ−55株を親株として、DON耐性株
として誘導されたバチルス・ナットウＤ−18株が挙げら
れる。
親株として用いるバチルス・ナットウＣ−55株は、土
壌からシチジン生産菌として分離されたバチルス・ナッ
トウＣ−１株（微工研菌寄第11055号）に人工変異処理
を行ない、シチジン要求株であるエシエリヒア・コリJF
618〔CGSC 5566株：米国イエール大学、E.COli genetic
Stock cehter）の生育を促す株としてスクリーニング
され、バチルス・ナットウＣ−１株よりシチジン生産量
の上昇している株である。
壌からシチジン生産菌として分離されたバチルス・ナッ
トウＣ−１株（微工研菌寄第11055号）に人工変異処理
を行ない、シチジン要求株であるエシエリヒア・コリJF
618〔CGSC 5566株：米国イエール大学、E.COli genetic
Stock cehter）の生育を促す株としてスクリーニング
され、バチルス・ナットウＣ−１株よりシチジン生産量
の上昇している株である。
上記バチルス・ナットウＣ−１株の菌類学的性状は、
下記の通りである。
下記の通りである。
（ａ）形態学的形状 １）細菌の形および大きさ：短桿菌、0.7〜1.0×２〜
８μ ２）多形生：単一まれに二連 ３）運動性：なし ４）胞子：卵型の内生胞子を栄養細胞の中央付近に生
じる ５）グラム染色：陽性 ６）抗酸生：陰性 （ｂ）生育状況 １）肉汁寒天培養：灰白色で周辺が裂開状の扁平なコ
ロニーを作る ２）肉汁液体培養：表面に皮膜を作るが、他は透明 （ｃ）生理的性質 １）硝酸塩の還元：有り ２）クエン酸の利用：有り ３）プロピオン酸の利用：なし ４）VPテスト：陽性 ５）デンプンの加水分解：有り ６）カゼインの加水分解：有り ７）オキシダーゼ：微弱 ８）カタラーゼ：有り ９）インドールの生成：なし 10）酸素に対する態度：好気性 11）ビチオン要求性：有り 12）1.5％グルタミン酸を含む培地で粘性物質の生
成：有り 13）シチジンの培地への排出：有り なお、このバチルス・ナットウＤ−18は、平成２年３
月６日付で、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第11348号（FERM P−11348）の寄託番
号で寄託してある。
８μ ２）多形生：単一まれに二連 ３）運動性：なし ４）胞子：卵型の内生胞子を栄養細胞の中央付近に生
じる ５）グラム染色：陽性 ６）抗酸生：陰性 （ｂ）生育状況 １）肉汁寒天培養：灰白色で周辺が裂開状の扁平なコ
ロニーを作る ２）肉汁液体培養：表面に皮膜を作るが、他は透明 （ｃ）生理的性質 １）硝酸塩の還元：有り ２）クエン酸の利用：有り ３）プロピオン酸の利用：なし ４）VPテスト：陽性 ５）デンプンの加水分解：有り ６）カゼインの加水分解：有り ７）オキシダーゼ：微弱 ８）カタラーゼ：有り ９）インドールの生成：なし 10）酸素に対する態度：好気性 11）ビチオン要求性：有り 12）1.5％グルタミン酸を含む培地で粘性物質の生
成：有り 13）シチジンの培地への排出：有り なお、このバチルス・ナットウＤ−18は、平成２年３
月６日付で、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第11348号（FERM P−11348）の寄託番
号で寄託してある。
以上のように分離されたシチジン生産菌の培養には通
常の微生物の培養と同様な方法が用いられる。即ち、培
地としては、炭素源、窒素源、菌の生育に必要な各種の
無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類等が適宜選択の上、
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。培地中にpH
の変動が観察される場合、硫酸、炭酸カルシウム、水酸
化ナトリウム、アンモニア水等を適宜添加する。また、
培地中にウラシル、ウリジン、UMP等の化合物を多量に
入れ、これをシチジンにサルベージ合成させる方法も有
効である。培養温度は、20℃〜48℃の範囲において、使
用する微生物の成育、シチジンの蓄積量、副産物の抑制
を考慮に入れ、適宜選択できる。培養時間としては、シ
チジンの蓄積量、副産物の生成量によって異なるが、通
常１日〜７日である。
常の微生物の培養と同様な方法が用いられる。即ち、培
地としては、炭素源、窒素源、菌の生育に必要な各種の
無機塩類、アミノ酸類、ビタミン類等が適宜選択の上、
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。培地中にpH
の変動が観察される場合、硫酸、炭酸カルシウム、水酸
化ナトリウム、アンモニア水等を適宜添加する。また、
培地中にウラシル、ウリジン、UMP等の化合物を多量に
入れ、これをシチジンにサルベージ合成させる方法も有
効である。培養温度は、20℃〜48℃の範囲において、使
用する微生物の成育、シチジンの蓄積量、副産物の抑制
を考慮に入れ、適宜選択できる。培養時間としては、シ
チジンの蓄積量、副産物の生成量によって異なるが、通
常１日〜７日である。
培養物からシチジンを分離最終する方法は、沈澱法、
イオン交換樹脂による処理、或いは溶媒による抽出等の
公知の方法を用いることができる〔特開昭61−135597号
公報参照〕。
イオン交換樹脂による処理、或いは溶媒による抽出等の
公知の方法を用いることができる〔特開昭61−135597号
公報参照〕。
実施例 以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明する。
実施例１ 〔工程１〕 DON耐性株の取得 バチルス・ナットウＣ−55株をニトロソグアニジン処
理（100mg/、15分間）した後、下記寒天培地に菌数１
×105個を塗布し、５日間、37℃にて培養した。
理（100mg/、15分間）した後、下記寒天培地に菌数１
×105個を塗布し、５日間、37℃にて培養した。
培地組成（pH7.2）： グルコース 1.0 ％ 硫酸アンモニウム 0.2 ％ クエン酸ナトリウム・2H2O 0.1 ％ KH2PO4 1.4 ％ MgSO4・7H2OH 0.02％ カザミノ酸 0.05％ ビチオン 100μg/ DON（Ｄ体） 10mg/ 寒天 1.8 ％ 上記培養で出現した25個のコロニーをDON耐性株とし
て分離した。
て分離した。
〔工程２〕 DON耐性株のシチジン生産量の測定 上記の方法で取得したDON耐性各をSEED液体培地〔グ
リコース２％、NaCl0.25％、ポリペプトン（和光純薬）
１％、イースト・エキスD3（和光純薬）１％、ビチオン
100ng/ml、pH7.3〕で、37℃18時間培養後、シチジン生
産培地〔グルコース10％、CaCO31％、イーストエキスD3
（和光純薬）0.5％、KH2PO40.8％、（NH4）2SO40.4％、
（NH2）2CO0.4％、ビオチン100ng/ml（pH7.2）〕50mlに
２％接種し、500ml容フラスコ中,39℃５日間培養した。
その結果、親株であるＣ−55が2.1mg/mlのシチジンの生
産量であったのに対し、Ｄ−１株は2.8mg/ml、Ｄ−２株
は2.5mg/ml、Ｄ−18株は3.4mg/ml、Ｄ−20株は3.3mg/m
l、Ｄ−24株は3.3mg/ml、Ｄ−25株は3.2mg/ml、と多数
のシチジン生産量の顕著に増大した数が得られた。この
うちＤ−18株を代表株として工業技術院微生物工業技術
研究所へ寄託した。
リコース２％、NaCl0.25％、ポリペプトン（和光純薬）
１％、イースト・エキスD3（和光純薬）１％、ビチオン
100ng/ml、pH7.3〕で、37℃18時間培養後、シチジン生
産培地〔グルコース10％、CaCO31％、イーストエキスD3
（和光純薬）0.5％、KH2PO40.8％、（NH4）2SO40.4％、
（NH2）2CO0.4％、ビオチン100ng/ml（pH7.2）〕50mlに
２％接種し、500ml容フラスコ中,39℃５日間培養した。
その結果、親株であるＣ−55が2.1mg/mlのシチジンの生
産量であったのに対し、Ｄ−１株は2.8mg/ml、Ｄ−２株
は2.5mg/ml、Ｄ−18株は3.4mg/ml、Ｄ−20株は3.3mg/m
l、Ｄ−24株は3.3mg/ml、Ｄ−25株は3.2mg/ml、と多数
のシチジン生産量の顕著に増大した数が得られた。この
うちＤ−18株を代表株として工業技術院微生物工業技術
研究所へ寄託した。
実施例２ 実施例１で得られたバチルス・ナットウＤ−18株をSE
ED液体培地で、37℃18時間培養後、シチジンサルベージ
生産培地〔グリコース５％、シラウル4mg/ml、（NH2）2
CO0.8％、MnSO4（無水）0.01％、FeSO4・7H2O0.001％、
MgSO4・7H2O0.05％、K2HPO40.2％、イースト・エキスD3
（和光純薬）0.3％、CaCO32.0％、pH8〕50mlに２％接種
し、24時間ごとに４％のグルコースを追加しながら、50
0ml容フラスコ中39℃５日間培養した。その結果、Ｄ−1
8株は9.6mg/mlのシチジンを培地中に蓄積したのに対
し、その親株のＣ−55株の培地中の蓄積は4.7mg/mlであ
った。
ED液体培地で、37℃18時間培養後、シチジンサルベージ
生産培地〔グリコース５％、シラウル4mg/ml、（NH2）2
CO0.8％、MnSO4（無水）0.01％、FeSO4・7H2O0.001％、
MgSO4・7H2O0.05％、K2HPO40.2％、イースト・エキスD3
（和光純薬）0.3％、CaCO32.0％、pH8〕50mlに２％接種
し、24時間ごとに４％のグルコースを追加しながら、50
0ml容フラスコ中39℃５日間培養した。その結果、Ｄ−1
8株は9.6mg/mlのシチジンを培地中に蓄積したのに対
し、その親株のＣ−55株の培地中の蓄積は4.7mg/mlであ
った。
参考例 Ｄ−18のCTPシニセターゼ活性 バチルス・ナットウＤ−18株を実施例１と同様の方法
で培養し、この培養液5mlより集菌し、2mlのホモジネー
トバッファー〔トリス−塩酸20mM（pH8.0）EDTA1mM、AT
P1mM、メルカプトエタノール20mM〕に懸濁後、水中超音
波処理を施し、菌体ホモジネートを得る。これを等量の
２×反応バッファー〔トリス−塩酸50mM（pH8.0）MgCl2
25mM、UPT10mM、ATP8mM、GTP1mM、グルタミン20mM、EDT
A1mM〕と混合し、37℃５分間加熱後、３分間煮沸して反
応を停止させる。この反応液をHPLC分析〔ワットマンSA
X−10−25カラム、0.4Mリン酸−2.5％アセトニトリルバ
ーファー（pH3.3）、流速毎分1.5ml、波長291nmで検
出〕し、生成したCTPを定量し、１分間に１μモルのCTP
を生成する活性を1Unitと定義する。
で培養し、この培養液5mlより集菌し、2mlのホモジネー
トバッファー〔トリス−塩酸20mM（pH8.0）EDTA1mM、AT
P1mM、メルカプトエタノール20mM〕に懸濁後、水中超音
波処理を施し、菌体ホモジネートを得る。これを等量の
２×反応バッファー〔トリス−塩酸50mM（pH8.0）MgCl2
25mM、UPT10mM、ATP8mM、GTP1mM、グルタミン20mM、EDT
A1mM〕と混合し、37℃５分間加熱後、３分間煮沸して反
応を停止させる。この反応液をHPLC分析〔ワットマンSA
X−10−25カラム、0.4Mリン酸−2.5％アセトニトリルバ
ーファー（pH3.3）、流速毎分1.5ml、波長291nmで検
出〕し、生成したCTPを定量し、１分間に１μモルのCTP
を生成する活性を1Unitと定義する。
その結果、バチルス・ナットウＤ−18株は培養開始８
時間後で、ホモジネートタンパク1mg当たり487×10-3Un
its、72時間後で432×10-3Unitsという値を示した。そ
れに対し、親株のバチルス・ナットウＣ−55は、培養開
始８時間後で15×10-3、Units、72時間後で７×10-3と
いう活性値であった。この事から、バチルス・ナットウ
Ｄ−18のシチジン生産量増加は、本酵素の飛躍的な活性
上昇に伴うものと推測される。
時間後で、ホモジネートタンパク1mg当たり487×10-3Un
its、72時間後で432×10-3Unitsという値を示した。そ
れに対し、親株のバチルス・ナットウＣ−55は、培養開
始８時間後で15×10-3、Units、72時間後で７×10-3と
いう活性値であった。この事から、バチルス・ナットウ
Ｄ−18のシチジン生産量増加は、本酵素の飛躍的な活性
上昇に伴うものと推測される。
本発明によると、バチルス属に属し、かつDONに耐性
を有し、シチジン生産能を有する微生物を培養すること
によって、シチジンの生産性が顕著に上昇する。また、
培養液中にラウシル系化合物を入れた場合、ピリミジン
サルベージ系路により、シチジン系化合物の蓄積量がさ
らに増加する。
を有し、シチジン生産能を有する微生物を培養すること
によって、シチジンの生産性が顕著に上昇する。また、
培養液中にラウシル系化合物を入れた場合、ピリミジン
サルベージ系路により、シチジン系化合物の蓄積量がさ
らに増加する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (2)
- 【請求項１】バチルス属に属し、６−ジアゾ−５−オキ
ソ−ノルロイシンに耐性を有し、シチジン生産能を有す
る微生物を培養して培養物中にシチジンを生成蓄積さ
せ，該培養物からシチジンを採取することを特徴とする
シチジンの製造方法。 - 【請求項２】６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシンに
耐性を有するバチルス・ナットウ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5820990A JP2819181B2 (ja) | 1990-03-12 | 1990-03-12 | 微生物によるシチジンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5820990A JP2819181B2 (ja) | 1990-03-12 | 1990-03-12 | 微生物によるシチジンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03262496A JPH03262496A (ja) | 1991-11-22 |
| JP2819181B2 true JP2819181B2 (ja) | 1998-10-30 |
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ID=13077658
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5820990A Expired - Fee Related JP2819181B2 (ja) | 1990-03-12 | 1990-03-12 | 微生物によるシチジンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2819181B2 (ja) |
-
1990
- 1990-03-12 JP JP5820990A patent/JP2819181B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JPH03262496A (ja) | 1991-11-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |