KR960004034B1 - 발효법에 의한 5'-이노신산의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

발효법에 의한 5'-이노신산의 제조방법

본 발명은 발효법에, 의해 5'-이노신산을 제조하는 방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 아데닌, 구아닌, 비오틴 요구성이며 고농도의 5'-이노신산에 내성을 가지고 있는 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스(Brecibacterium ammoniagenes)를 배양함으로써 고농도의 5'-이노신산을 축적시키는 방법에 관한 것이다.

5'-이노신산은 정미성을 가지고 있는 핵산계 조미료로 널리 알려져 있는 물질이다. 종래에 미생물적인 방법을 사용하여 5'-이노신산을 제조하는 방법은 아데닌 요구성 균주를 이용하는 방법(일특공소 49-24474), 망간 비감수성주를 이용하는 방법(USP 3745087)등이 있다. 그러나 상기한 방법을 포함하는 대부분의 공지 방밥들은 5'-이노신산 축적량이 적거나 하이포크산틴이 부생되고 발효배지중의 망간이온 농도 혹은 아데닌 농도를 제한하여 주어야 하는 어려움이 있다.

이와같은 문제점을 해결하기 위하여 브레비박테리움 암모니아게네스속에 속하며, 아데닌 요구성이고 구아닌 또는 크산틴에 의해 생육이 촉진되며 세포막 투과성을 변화시킨 세포막 투과성 변이주 MW-2369가 본 발명자들에 의해 개량된 바 있다.(한국특허공고 85-1233)

본 발명자들은 변이주 MW-2369를 보다 더 개량하여 5'-이노신산의 생선성을 향상시키고자 하는 목적하에 통상의 변이처리 방법을 통하여 균주를 개량하던 중 5'-이노신산-함유 발효액에 대하여 내성을 갖는 변이주중 친주에 비하여 생산성이 향상된 균주를 건별함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명의 목적은 5'-이노신산을 고농도로 생산 및 축적할 수 있는 브레비박테리움 아모니아게네스 속 미생물을 배양하여 5'-이노신산을 고농도로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 아데닌, 구아닌, 비오틴 요구성이며, 고농도의 5'-이노신산에 내성을 갖는 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-5520(KFCC 11786)를 배양함으로써 고농도의 5'-이노신산을 생산 및 축적시키는 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-5520은 그의 친 주인 MW-2369로부터 다음과 같은 방법으로 얻을 수 있다.

즉, 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-2369를 후술하는 배지 1에 접종하여 30-32℃에서 15-22시간 배양하고, 균체를 0.2M 트리스-말레이트 완충액(pH 6.0) 10ml에 잘 현탁시킨 후 50-250㎍/ml 농도의 n-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘 용액 (0.2M 트리스-말레이트 완충액에 용해) 3ml를 첨가하고, 상온에서 1-2시간 진탕시킨다. 이어, 원심분리 및 세척에 위하여 균체와 변이원인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘을 분리시키고, 균체는 후술하는 배지 2에 접종하여 3-5일간 배양한다. 3-5일간 배양하여 생존한 균체를 후술하는 배지 3에 평탄배양한 후 2-5일동안 관찰하며 새성된 균집락을 선별한다. 선별된 균주를 다시 후술하는 배지 4에 식균 배양하고 5'-이노신산의 생산성이 가장 우수한 균주를 최종 선별하고 MW-5520으로 명명하였다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 본 발명의 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-5520은 한국종균협회(KFCC)에 1992년 12월 21일자로 기탁번호 KFCC-11786호로 기탁되어 있다.

본 발명에 따른 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-5520은 그 친주와 유사한 형태학적 및 배양학적 특성을 나타낸다. 즉, 그람양성균이며, 포자를 형성하지 않고, 불규칙한 형태를 갖는다. 그러나, 주인 MW-2369로부터 다음과 같은 방법으로 얻을 수 있다.

즉, 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-2369를 후술하는 배지 1에 접종하여 30-32℃에서 15-22시간 배양하고 균체를 0.2M 트리스-말레이트 완충액(pH 6.0) 10ml에 잘 현탁시킨 후 50-250㎍/ml 농도의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘 용액(0.2M 트리스-말레이트 완충액에 용해) 3ml를 첨가하고, 상온에서 1-2시간 진탕시킨다. 이어, 원심분리 및 세척에 의하여 균체와 변이원인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘을 분리시키고, 균체는 후술하는 배지 2에 접종하여 3-5일간 배양한다. 3-5일간 배양하여 생존한 균체를 후술하는 배지 3에 평판배양한 후 2-5일동안 관찰하며 생성된 균집락을 선별한다. 선별된 균주를 다시 후술하는 배지 4에 식균 배양하고 5'-이노신산의 생산성이 가장 우수한 균주를 최종 선별하고 MW-5520으로 명명하였다.

상기와 같은 방법으로 얻어진 본 발명의 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-5520은 한국종균협회(KFCC)에 1992년 12월 21일자로 기탁번호 KFCC-11786호로 기탁되어 있다.

본 발명에 따른 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-5520은 그 친주와 유사한 형태학적 및 배양학적 트성을 나타낸다. 즉, 그람 양성균이며, 포자를 형성하지 않고, 불규칙한 형태를 갖는다. 그러나, 본 발명의 변이주는 친주와 비교하여 5'-이노신산을 함유하는 발효액에 대하여 높은 내성을 갖기 때문에 배지에 고농도의 5'-이노신산을 축적할 수 있다. 균주의 배양조건은 호기성 조건하에서 진탕배양하고, 배지의 조성은 후술하는 배지들의 조성과 같다.

〈배지 1〉

포도당 4%, 비프 엑기스 0.5% 펩톤 0.5%, 호메엑기스 1%, 비오틴 100ppm, 제일인산칼륨 0.1%, 제이인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.1%, 황산망간 10ppm, 황산제일철 10ppm, 염화칼슘 100ppm, 니코틴 5ppm, 아데닌 100ppm, 구아닌 100ppm, 암모늄 설페이트 0.3%, 요소 0.25%.

〈배지 2〉

배지 1에 5'-이노신산 고농도 발효 농축액 30-50%를 첨가하여 제조한 배지. 5'-이노신산 고농도 발효액은 통상의 방법으로 수득한 이노신산 모노포스페이트 발효종료액을 원심분리하여 상등액을 취하고 이것을 회전농축기를 사용하여 5'-이노신산 농도가 10% 되도록 농축하여 제조한다.

〈배지 3〉

포도당 1%, 펩톤 1%, 효모엑기스 0.5%, NaCl 0.3%, 아데닌 10ppm, 구아닌 100ppm, 비프엑기스 2%, 한천 2%를 증류수에 용해시켜 pH 7.7로 맞춘후 120℃에서 20분간 멸균하여 제조한다.

〈배지 4〉

포도당 7.5%, 과당 7.5%, CLS 3%, 황산마그네슘 0.5% 염화칼슘 0.1%, 황산망간 0.01%, 황산아연 0.01%, 글루탐산나트륨 0.1%, 시스테인 0.02%, 베타알라닌 0.02%, 니코틴산 0.05%, 염산티아민 0.05%, 비오틴 100ppm, 제일인산칼륨 1.0%, 제이인산칼륨 1.0%, 아데닌 0.05%, 구아닌 0.05%를 증류수에 용해시켜 pH를 8.3으로 맞추고 120℃에서 20분간 가열 멸균한다.

[실험예 1]

본 발명의 변이주 MW 552와 친주 MW 2369의 고농도 5'-이노신산-함유 발효액에 대한 내성을 알아보기 위하여, 5'-이노신산을 하기 표 1에 나타낸 농도로 함유하는 액체 배지 2에서 30-32℃, 1-2일간 배양하고 생육도를 측정하였다. 균 생육도는 배양 종료액에 대해 610㎚에서의 광학밀도를 측정하여 계산하였다. 결과는 표 1과 같다.

[표 1] 5'-이노신산 농도에 따른 균생육도(OD 610㎚×100)의 비교

[실험예 2]

본 발명의 변이주 MW 5520과 친주 MW 2369의 NaCl, KCl, CaCl₂및 MgSO₄에 대한 내성을 알아보기 위하여, NaCl, KCl, CaCl₂및 MgSO₄를 각각 표 2-5에 나타낸 농도로 함유하는 한천 배지에서 양균주를 30℃에서 5일간 배양하고 실험예 1과 같은 방법으로 생육도를 측정하였다. 결과를 표 2-5에 나타내었다. 5'-이노신산 발효액의 내성주는 5'-이노신산 고농도에 내성을 갖는 것과 동시에 고삼투압성 물질은 NaCl, KCl, CaCl₂및 MgSO₄에도 내성을 갖는 것으로 나타났다.

[표 2] MW 5520와 MW 2369의 NaCl 내성 비교

[표 3] MW 5520와 MW 2369의 NCl 내성 비교

[표 4] MW 5520와 MW 2369의 CaCl₂내성 비교

[표 5] MW 5520와 MW 2369의 MgSO₄내성 비교

상기 표 1-5의 결과에서 알수 있듯이, 본 발명의 변이주는 친주에 비하여 고농도의 5'-이노신산에 대해 내성을 갖는 것과 동시에 고삼투압성 물질은 NaCl, KCl, CaCl₂및 MgSO₄에 대해서도 내성을 갖는다.

[실험예 3]

본 발명의 변이주 MW 5520과 친주 MW 2369주와의 영양요구성을 비교하기 위하여 하기 표 6에 나타낸 배지를 이용하여 두 균주를 배양하고 생육상태를 관찰하였다. 결과를 표 6과 같으며, 두 균주 사이에 영양요구성의 차이는 없으나 칼슘 판토테인산에 의한 생육척진 현상이 친주인 ME 2369에는 약간 있으나 본 발명 변이주에서는 발견되지 않은 것으로 나타났다.

[표 6] 변이주와 친주의 영양요구 특성 비교

이하 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

본 발명의 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스 MW 5520을 배지 1에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕 배양하여 종배양액을 제조하였다. 배지 4에 종배양액을 10%의 농도로 접종하여 30-32℃에서 요소 50% 용액으로 pH를 6.5-7.5 수준으로 맞추면 약 96시간 배양한 결과, 5'-이노신산 축적량은 23.2mg/ml이었으며 5'-이노신산 이외의 핵사관련물질은 검출되지 않았다.

이와 동일한 방법으로 친주인 MW-2369를 접종 배양하였을때에는 18.5mg/ml 농도의 5'-이노신산이 생성되었다.

[실시예 2]

실시예 1의 발효배지중에 5'-이노신산 농도를 3-5%되게 첨가하여 배양한 결과, 발명의 변이주 MW-5520은 균 생육도(OD 610㎚×100)가 0.935로 좋았으며 발효 완료후 배양액의 5'-이노신산 분석치는 60.6mg/ml이며, 이는 본 발명의 균주가 5'-이노신산 40mg/ml을 빼더라도 5'-이노신산 축적량은 20.6mg/ml이며, 이는 본 발명의 균주가 5'-이노신산을 고농도로 함유하는 배양액에서도 5'-이노신산을 생성 및 축적하는 것을 의미한다.

친주인 MW-2369주는 상기와 같은 배지에 접종배양하였을 경우 균생육도가 0.356이었고, 5'-이노신산 분석치는 45.6mg/ml로 실질적으로는 5.6mg/ml의 5'-이노신산이 축적되었다.

[실시예 3]

본 발명 변이주 MW-5520을 30L 발효조에서 실시예 1의 배지를 10L 삽입한 후 종 배양액을 10% 농도로 되게 접종하여 교반수 500rpm, 통기량 0.5vvm, 33℃에서 암모니아로 pH 7.0-72로 조절하며 배양하였다. 배양중 잔당 농도가 2%일 때 70% 포도당액을 배양액의 5% 농도로 10회 첨가하였으며 발효시간은 100시간이었다. 발효완료후 5'-이노신산 농도는 75mg/ml이었다. 친주인 MW-2369는 상기와 동일한 방법으로 배양했을 때 52.25mg/ml의 5'-이노신산이 축적되었다.

균체를 제거한 발효액을 통상의 방법에 따라 이온교환수지에 흡착하여 탈색한후 농축하여 5'-이노신산 670g을 분리하였다.

Claims (4)

1. 고농도의 5'-이노신산 및 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘 등의 삼투압성 물질에 대해 내성이 있으며, 5'-이노신산 생성능을 갖는 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) MW-5520(KFCC-11786).
2. 고농도의 5'-이노신산 및 삼투압성 물질에 대해 내성이 있으며, 5'-이노신산 생성능을 갖는 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) MW-5520(KFCC-11786)를 배양하여 배지중에 5'-이노신산을 축적시키고 발효액으로부터 5'-이노신산을 회수함을 특징으로 하는 발효법에 의한 5'-이노신산의 제조방법.
3. 제 2 항에 있어서, 고농도의 5'-이노신산은 5'-이노신산의 농도가 3-5%임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 고삼투압성 물질은 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염임을 특징으로 하는 방법.