KR910005630B1 - 발효법에 의한 오로트산의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

발효법에 의한 오로트산의 제조방법
본 발명은 발효법에 의한 오로트산의 제조방법에 관한 것이다.
오로트산은 핵산의 구성 성분인 피리미딘 화합물의 전구체이며, 강간제로서 및 우라실, 시토신 및 티미딘 같은 피리미딘 화합물 합성의 출발물질로서 유용하다.
지금까지 오로트산을 축적하는 각종 미생물의 우라실 요구성 변이주가 알려져 있다[＂Microbial Production of Nucleic Acid-Related Substances＂P.184-191, Association of Amino Acid and Nucleic Acid 편집, Kodansha (1976)].
코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속하는 미생물에 관해서는, 우라실을 요구하는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum; 구 마이크로코커스 글루타미쿠스)을 이용하는 오로트산의 제조방법에 공지되어 있다(일본국 특허 공고 제9950/63호).
그러나, 공지된 방법은 아직까지 오로트산의 생산 효율성에서 만족스럽지 못하다.
그러므로 본 발명의 목적은 고수율 및 저렴한 가격으로 오로트산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 오로트산을 생산할 수 있고 피리미딘 유사체에 대해 또는 피리미딘 유사체 및 설파제 모두에 대해 내성을 갖는 코리박테리움 속의 미생물을 이용함으로써 오로트산을 고수율로 제조할 수 있다.
본 발명에서는, 오로트산을 생산할 수 있고, 피리미딘 유사체에 대해 또는 피리미딘 유사체 및 설파제 모두에 대해 내성을 갖는 것이면 코리네박테리움 속에 속하는 모든 미생물을 사용할 수 있다.
피리미딘 유사체의 예는 5-플루오로우라실, 6-아자우라실, 2-티오우라실, 5-히드록시우라실 및 트리메토프림이고, 설파제의 예는 설파구아니딘, 설파티아졸, 설파피리딘 및 설파메라진이다.
적절한 균주의 예로는, 코리네박테리움 글루타미쿰 T-26(FERM BP-1487)(5-플루오로우라실 내성)(이후에는 T-26으로 표기), 코리네박테리움 글루타이쿰 T-29(FERM BP-1488X 5-플루오로우라실 및 트리메토프림 내성)(이후에는 T-29로 표기) 및 코리네박테리움 글루타이쿰 T-30(FERM BP-1489) (5-플루오로우라실 및 설파구아니딘 내성)(이후에는 T-30으로 표기)을 언급할 수 있다.
상술한 적절한 균주를 얻는 방법을 다음에 설명하였다.
코리네박테리움 글루타이쿰 ATCC 14275(우라실 요구성) (이후에는 ATCC 14275로 표기)를 글루코스-효모 추출액-부용배지(1.0% 글루코스, 0.5% 효모 추출액, 1.0% 펩톤, 0.7% 육즙 및 0.3% 염화나트륨, pH 7.2)내에서 30℃에서 16시간 배양한다. 동일한 배지 중에서 30℃에서 4시간 동안 더 배양한 후, 세포를 수집하고, 세척하고, M/20 트리스-말레에이트 완퉁액(pH6.0)에 현탁시며 108/ml의 세포 농도를 갖는 세포 현탁액을 만든다. 이 현탁액에 250μg/ml N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘을 가하고 현탁액을 30℃에서 20분간 유지한다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고 M/20 트리스-말레에이트 완충액으로 잘 세척한다. 세포를 하기 조성을 갖는 플루오로 우라실-함유 최소 배지상에 도포하고, 30℃에서 4일간 배양한다.
배지의 조성
5-플루오로우라실 100μg/ml
글루코스 1.0%
황산암모눔 0.1%
우레아 0.1%
인산수소이칼륨 0.1%
황산마그네슘 0.04%
염화나트륨 0.02%
황산제일철 0.001%
황산망간 0.001%
우라실 20mg/ℓ
비오틴 50μg/ℓ
티아민 (pH7.0) 200μg/ℓ
배지위에 형성된 콜로니의 세포를 글루코스-효모 추출액-부용 사면에 접종한 후, 스크리닝용 에를렌마이어 플라스크에서 배양한다. T-26을 오로트산 생산성이 우수한 균주로서 선택한다. 균주의 약제 내성을 표1에 나타낸다. T-26을 모균주로 사용하고 100μg/ml 5-플루오로우라실 대신에 100μg/ml 트리메토프림 또는 500μg/ml 설파구아니딘을 함유하는 최소 배지를 사용하는 것을 제외하고 상기와 동일한 과정을 반복한다. 결과로서, 트리메토프림 내성 균주인 T-29 및 설파구아니딘 내성 균주인 T-30을 선택한다. 균주의 약제 내성을 표1에 나타낸다.
[표 1]
Figure kpo00001
본 발명에서는 오로트산-생산 균주를 배양하기 위하여 탄소원, 질소원, 무기염, 우라실, 우라실-함유물질 등을 함유하는 한 합성 배지 또는 천연배지를 사용할 수 있다.
탄소원으로 글루코스, 수크로스, 말토스, 폐당밀, 전분당, 셀룰로스당 등을 사용할 수 있다. 질소원으로는, 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄, 인산암모늄 및 탄산암모늄 같은 암모늄염, 우레아 및 펩톤, 육즙, 효모 추출액, 옥수수 침지액, 두육(soybean meal) 및 카제인 가수분해물 같은 천연 질소원을 사용할 수 있다. 무기염으로는, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 황산마그네슘, 황산제일철, 황산망간, 염화나트륨, 염화칼슘 등을 사용할 수 있다. 우라실-요구성 미생물을 사용하는 경우에는, 우라실 또는 우라실-함유물질을 적절한 양(우라실로서 30 내지 200mg/ℓ)으로 배지에 첨가해야 한다. 우라실-함유물질로는 우리딘, 효모 추출액, 효모 세포, 리보핵산 등을 사용할 수 있다.
비오틴, 티아민, 니코틴산 및 판토텐산 같은 비타민도 미량 사용할 수 있다.
배양은 25 내지 37℃, 바람직하게는 28 내지 34℃, pH5 내지 9, 바람직하게는 6.0 내지 7.5에서 2 내지 5일간 호기적 조건하에서, 예를들면 진탕 배양하거나 또는 통기 또는 휘저음을 행하면서 심부 배양함으로써 실시한다.
중화제로서, 탄산칼슘, 수성암모니아, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨 등을 사용할 수 있다.
오로트산은 예를들면 80 내지 100℃에서 배양물을 가열하여 침전된 오로트산을 용해시키고 가열된 배양물을 여과하여 세포를 제거하고 여액을 농축 및 냉각하여 오로트산의 조결정을 수득함으로써 배양물로부터 분리 및 회수할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예를 하기예에 기술하였다.
[실시예1]
후술한 조성을 갖는 종 배양배지 10ml를 함유하는 큰 시험관에 T-26을 접종하고 30℃에서 24시간 동안 배양한다. 종 배양물 1ml를 후술한 조성을 갖는 생산 배지 20ml를 함유하는 300ml-에를렌마이어 플라스크에 접종시키고, 30℃에서 3일 또는 5일간 배양한다. 결과를 표2에 나타낸다.
대조로서, ATCC 14275를 상기와 동일한 방법으로 배양한다. 결과를 표2에 나타낸다.
종 배양배지
글루코스 5.0%
펩톤 1.0%
효모 추출액 1.0%
황산암모늄 0.5%
우레아 0.3%
염화나트륨 0.25%
비오틴 50μg/ℓ
우라실 150μmg/ℓ
탄산칼슘 (pH7.0) 2.0%
생산배지
폐당밀 20%
황산암모늄 0.5%
우레아 1.0%
인산이수소칼륨 0.05%
인산수소이칼륨 0.05%
황산마그네슘 0.05%
우라실 50 또는 100mg/ℓ
탄산칼슘(pH7.0) 2.0%
[표 2]
Figure kpo00002
[실시예2]
T-26 대신에 T-29 및 T-30을 종 균주로 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 배양 과정을 반복한다. 결과를 표3에 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00003
[실시예3]
표4에 나타낸 각각의 종 균주의 1백금이를 실시예 1에 나타낸 조성을 갖는 종 배양 배지 200ml를 함유하는 2ℓ-에를 렌마이어 플라스크에 접종시키고 30℃에서 24시간 동안 배양한다. 얻어진 종 배양물을 실시예 1에 나타낸 조성을 갖는 생상배지 2ℓ를 함유하는 5ℓ-자 발효기에 접종시키고, 33℃에서 휘저음 및 통기(회전; 600rpm, 통기;1vvm)하에 배양한다. 배양시작 24시간 후에, 멸균된 50% 폐당밀 500ml를 배양액에 가하고 배양을 계속한다. 배양중에, 진한 수성암모니아를 이용하여 배양액의 pH를 7.2 이상으로 조절한다. 결과를 표4에 나타낸다.
[표 4]
Figure kpo00004

Claims (4)

  1. 오로트산을 생산할 수 있고 피리미딘 유사체에 대해 또는 피리미딘 유사체 및 설파제 모두에 대해 내성을 갖는 코리네박테리움 속의 미생물을 오로트산이 배양물중에 축적될 때까지 배지내에서 배양하고 그로부터 오로트산을 회수함을 특징으로 하는 발효법에 의한 오로트산의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰 종에 속하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰 T-26(FERM BP-1487), 코리네박테리움 글루타미쿰 T-29(FERM BP-1488) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 T-30(FERM BP-1489)인 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 배양율 25 내지 37℃ 및 pH 5 내지 9에서 2 내지 5일간 행하는 제조방법.
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