DE1767294C3 - Verfahren zur fermentativen Gewinnung von Orotidin - Google Patents

Description

Verfahren h_? gegenüber

kann (s. die Beispiele). Femet erlaubt M dan F»cl· ™^„_relial,_gewendet werden.

mann, für Henrtellung »on Orotidm auf andere ^m*"^re _s"_1)clj_lol,_qn,.,,_{e k8riM}„ versehiede»e Arten

SS B^SÄSS: Su^, wie U

Aromoniumsulfat, Ammoniumnitrat Ammoniumacetat und Annnoraumpnosphat oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie ζ, B, Maisqwellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, BouüIor, Caseinbydrolyste, Casaminosäure, gelöste Fischsubstanz und Reiskleieextrakt verwendet werden. Diese Substanzen können ebenfalls entweder einzeln oder in Kombinationen zu zweien oder mehreren angewendet werden.

Der pH-Wert des Fermentationsmediums vor der Sterilisation betrug 7,3.

Dann wurde die Kultivierung unter aerobem

Schütteln bei 30⁰C über einen Zeitraum von 120 Stunden durchgeführt Nach der Fermentation hatten sich in der erhaltenen Kulturflüssigkeit 1,23 mg Orotidin pro ml Flüssigkeit angereichert

1 Liter der erhaltenen Kulturflüssigkeit wurde durch eine 50-ml-Kolonne, die mit einem Anionen-

Zu den anorganischen Verbindlungen, die dem io austauscherharz in der Acetatform angefüllt wsr, Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören geschickt und nach dem Filtrieren wurde dann das

Oritidin mittels eines Natriumacetatpuffers (pH 4,4) mit einem Konzentrationsgradienten von 0,15- bis 0,3 molar bei einer Temperatar von 40⁰C und einer Fließguscbwindigkeit von 1 ml/Minute aus der Kolonne eluiert. Die Orotidin-Elutionsanteile wurden miteinander vereinigt und eingeengt und man erhielt 1,05 g Orotidinkristalle.

Beispiel 2

Als Mikroorganismus wurde der Stamm Corynebacterium sp. ATCC 21188 verwendet der für sein Wachstum Uracil benötigt.

Die Kultivierung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei diesmal jedoch das Fermcntationsmedium an Stelle von Kerosin 5Vo eines n-Paraffingemisches (äquivalente Mengen an C₁₂-, C₁₃- und C₁₄-n-Paraffinen)

z.B. Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, KaUummonohy drogenphosphat, Eisensulfate Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid und Zinksulfat.

Das Kulturmedium muß Uracil enthalten. Darüber hinaus sollten dem Kulturmedium Aminosäuren, Vitamine und Biotin zugesetzt werden.

Die Fermentation der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen, z. B. durch aerobes Schütteln dex Kultur oder Bewegen und Belüften einer Submerskultur, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 50⁰C und einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,0 durchgeführt. Die Kultivierung erfolgt gewöhnlich während 1 bis 10 Tagen. Dabei reichert sich das '5 Orotidin in der Kulturflüssigkeit und in den Mikroorganismenzellen an.

Nach Beendigung der Kultivierung wird das Orotidin aus der Kulturflüssigkeit auf übliche Weise,
z. B. durch Ionenaustauscherharzbehandlung, Aus- 3o enthielt,
fällung, Adsorption oder Chromatographie, ge- Nach 120stündiger Kultivierung hatten sich in

wonnen. der Kulturflüssigkeit 3,72 mg Orotidin pro ml an-

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher gereichert. Aus 1 Liter der Kulturflüssigkeit erhielt erläutern. Falls nicht anders angegeben, beziehen man, wie in Beispiel 1 beschrieben, 2,79 g Orotidinsich die Prozentangaben auf das Gewicht pro 35 kristalle.
!Wasser. Beispiel 3

Als Mikroorganismus wurde Arthrobacter paraf-

AIs Mikroorganismus wurde der Stamm Brevi- fineus ATCC 21191 verwendet, der durch UV-Bebacterium ketoglutamicum ATCC 2,1187 verwendet, 4» handlung von ArthrobacterparaffineusATCC15591 der durch Behandlung von Brevibacterium keto- erhalten worden war und der zu seinem Wachstum glutamicum ATCC 15588 mit UV-Strahlen erzeugt Uracil benötigt.

worden war und der zu seinem Wachstum Uracil Durch Übertragung mittels einer Platinöse in

benötigt Das Nährmedium enthielt l°/o Pepton, 20 ml eines Impfkulturmediums, das 1%> Glycerin, l°/o Fleischextrakt 0,5 Ve Hefeextrakt und 0,25Vo 45 IVo Pepton, IVo Fleischextrakt 0,5Vo Hefeextrakt Natriumchlorid. und 0,25% Natriumchlorid in einem Erlenmeyer-

Mittels einer Platinöse wurde der Mikroorganis- Kolben enthielt, wurde eine Impfkultur hergestellt, mus in 20 ml Kulturmedium in einem 250-ml-Erlen- Die Kultivierung erfolgte durch aerobes Schütteln meyerkolben eingeimpft. Durch Kultivieren unter der Kultur bei 30⁰C über einen Zeitraum von aerobem Schütteln bei 30⁰C über einen Zeitraum 5° 24 Stunden.

von 24 Stunden erhielt man eine Impfkultur. 2 ml der dabei erhaltenen Impfkulturflüssigkeit

2 ml der so erhaltenen Impfkulturflüssigkeit wur- wurden in 20 ml eines in einem 250-ml-Erlenmeyerden in 20 ml eines Fermentationsmediums in einem kolben enthaltenen Fermentationsmediums der fol-250-mI-ErlenmeyerkoIben eingeimpft. Das Fennen- genden Zusammensetzung eingeimpft: tationsmedium hatte die folgende Zusammensetzung: 55

Kerosin 5 °/o

(NH₄)SSO₄ 1,5V.

K^lPO₄ 0,2 V.

KH₂PO₄ 0,1·/.

MgSO₄^H₂O 0,05V.

MnSO₄'4ILO 0,001V.

FeSO₄-IH₁Q 0,001V.

Hefeextrakt 0,5 V.

Xanthin 50 ng/ml

Uracil 10.» ig/ml

Maisquellwasser 0,1 V.

Calchimcarbonat 2Vo

6o

Sorbit Mannit, Arabit, Xylit, Ri-IOVo

■bit oder Glycerin

(NHJjSO₄ 1,5%

K₂HPO₄ 0,2V.

KH₂PO₄ 0,1V.

MgSO₄ · 7H₂O 0,05V.

MnSO₄^H₂O 0,001·/·

FeSO₄-7H₂O 0,001V.

Hefeextrakt 0,5·/.

Uracil 200μβ/πι1

Thiaminhydrochlorid 5 |tg/ml

Maisquellwasser 0,1 V.

Calciumcarbonat 2·/·

Der pH-Wert des Fermentationsmediums vor der Sterilisation betrug 7,3,

Die Kultivierung erfolgte unter aerobem Schütteln der Kultur bei 3O⁰C über einen Zeitraum von 120 Stunden, Die Orotidinmengen, die dabei in der erhaltenen Kulturflüssigkeit angereichert wurden und die Ausbeuten an isoliertem Orotidin sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Kohlenstoffquelle (Menge =10·/»)	Menge des angereicherten Orotidins (mg/ml)	Ausbeute an isoliertem Orotidin (g/l)
Sorbit	8,87	7,27
Mannit	7,62 7,69 6,82 7,25	5,80 6,15 5,19 5,72
Arabit	5,34	4,00
Xylit
Ribit
Glycerin

Beispiel 4

Als Mikroorganismus wurde Brevibacterium sp. ATCC 21189 verwendet, der zu seinem Wachstum Uracil benötigt.

Die Kultivierung erfolgte wie in Beispiel 3, wobei diesmal jedoch als Kohlenstoffquelle in dem einen Nährmedium Sorbit und in dem anderen Nährmedium Glycerin verwendet wurde. Im übrigen waren die Kultivierungsbedingungen die gleichen wie in Beispiel 3.

Nach 96stündiger Kultivierung unter den in Beispiel 3 angegebenen Bedingungen hatten sich in der sorbithaltigen Kulturflüssigkeit 7,82 mg Orotidin pro ml Flüssigkeit und in der glycerinhaltigen Kulturflüssigkeit 5,77 mg Orotidin pro ml Flüssigkeit angereichert. Aus diesen beiden Flüssigkeiten wurden

auf die in Beispiel 1 angegebene Weise pro
6,65 g bzw. 4,44 g Orotidinkristalle erhalten.

Beispiel 5

Als Mikroorganismus wurde Corynebacterium sp. ATCC 21188 verwendet. Es wurde das gleiche Fermentationsmedium wie in Beispiel 3 verwendet, wobei diesmal jedoch als Kohlenstoffquelle Mannit verwendet wurde. Die übrigen Kultiyierungsbedingun-

gen waren die gleichen wie in Beispiel 3.

Nach 12Qstündiger Kultivierung hatten sich in der erhaltenen Kulturflüssigkeit 6,58 mg Orotidin pro ml Flüssigkeit angereichert. Aus 1 Liter dieser Kulturflüssigkeit konnten auf die in Beispiel 1 angege-

bene Weise 5,14 g Orotidinkristalle isoliert werden.

Beispiel 6

Als Mikroorganismus wurde Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21187 verwendet. Er wurde in

einem Fermentationsmedium der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1, das diesmal jedoch an Stelle von Kerosin als Kohle itoffquelle 5°/o Sorbit enthielt, und unter den gleichen Kultivierungsbedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert. Nach 96stündi-

^a5 ger Kultivierung hatten sich in der erhaltenen Kulturflüssigkeit 7,92 mg Orotidin pro ml Flüssigkeit angereichert.

Beispiel 7

Als Mikroorganismus wurde Arthrobacter paraffineus ATCC 21191 verwendet. Er wurde in einem Fermentationsmedium der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1, das diesmal jedoch an Stelle von Kerosin als Kohlenstoffquelle 7°/o n-Paraffin enthielt, unter den gleichen Kultivierungsbedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert. Nach 120stündiger Kultivierung hatten sich in der erhaltenen Kulturflüssigkeit 5,82 mg Orotidin pro ml Flüssigkeit angereichert.

Claims (1)

1. und *> ν»'"™* * W»eb«u.nsl,kto,

   oJäväTäskggp TZ

   men und durch Abtrennung des Orotidins aus verwenden. _Ausgestllitung verwendet manals

   L Kulturflüssigkeit nach üblichen Methoden, *«™^ _Mimnit, Arabit, RibU oder Glycerin,

   dadurch gekennzeichnet, daß man als PoJg »J erfindungsgemäßen Verfahren _elnge-

   XäcrLganifmus Brevibacterium ketoglutami. JP» ^er Vroorganismen^tämme steUet,Mu-

   cum ATCC 21187, Corynebactenum sp. ATCC « «""^ _ich bereits bekannten Mikroorganis-

   m88 Stoobacier paraffineus ATCC 21191 JJ^^fÄ künstliche Mutation von Bakte-

   oder Brevibacterium sp. ATCC 21189 verwen- men dar, me _Brevibacterium, Artoobacter und

   Set und die Kultivierung bei einer Temperatur ^JÄ» erhalten wurden. Die kunsthche

   von etwa 20 bis 50⁰C und bei einem pH-Wert JfgJgJ _{de durch} Bestrahlen mit UV-Licht, von etwa 5,0 bis 9,0 unter aeroben Bedingungen 15 ^Μ^°^Χ_α ^₁ ^Strahlen oder anderen Rea-

   in einem wäßrigen Uracil enthaltendem Nähr- ^^^^ Die erfmdungsgemaß ernzusBtzen-

   medium durchfuhrt, das als Hauptkohlenstoff- &f ^^Stanten-Stämme erfordern Uracil zum

   quelle mindestens einen Kohlenwasserstoff oder ^ⁿ ™^r

   mindestens ein Polyol enthält. ^₆ "er erfindungsgemäß verwendeten M.kro-

   >3ΚδΕ5£

   3ΚδΕ5£

   ^hTund XvS assimilieren. Deshalb werden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermente- "P'^AS_{e in dem} Nährmedium als Hauptkohlenliven Gewinnung von Orotidin unter Verwendung *5 ^^eingesetzt.

   von Mikroorganismen und durch Abtrennung des ^"^^edium, das zur Durchfuhrung des er-Orotidins aus der Kulturflüssigkeit nach üblichen _find7_ng^_gemäßen Verfahrens angwendrt werden

   ^MEs^Oist^ebereits bekannt, das Orotidin auf fermente- ^ann ^f sich ^^£"4, _Nährmedium, sotivem Wege unter Verwendung von Uracü Undin 30 medium as a _Wachstum des verwendeten Mi-

   ode: UrMylsäure erfordernden bestimmten Bacülus- to»^ ^Notwendigen Nährstoffe enthalt Der subtilis-Stämmen in einem eine assimilierbare Koh- ^°°^^._{1οίϊε άαΑ} bekannt und sie enthalten lenstoffquelle enthaltenden Nährmedium zu erzeugen arUge ™g™ _eine Kohlenstoff quelle, eine St.ck-(britische Patentschrift 1006732). Gemäß deren Stoffe wie ij. _isi±e verbindungen, d.e von

   Beispielen wird Glukose als HauptkoWenstoffquelle 35 ^*^^ Mikroorganismen in entsprecheneingesetzt. Weiterhin ist es möglich, Saccharose, aen ve j _wer(,_en

   Melassen, lösüche Stärke und Stärkehydrolysate, ^denJf "^„^ _gemäß der Erfindung wird in dLh. Kohlenhydrate bzw. Kohlehydratmatenahen, Dk Fennent g _{Koh]enw toff o}der em

   zu verwenden. Die erhaltenen Ontidinmengen he- einem^ waung ^ _erstoffen ^r em Po yol

   gen zwischen nur 0,3 mg und maximal 3,1mg pro 40 Gennsch von ^ _{polyQlen Λ H pt}tohlen-

   ml Kulturmedium. . stoffquelle enthaltenden Nährmedium durchgeführt.

   Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Ver- stonq^_{n mssigGn} Kohlenwasserstoffen gefahren zur HersteUung von Orotidm anzugeben hören geradkettige und verzweigtkettige Paraffine Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur hören ^e * _{ffatoineilj we} z. B. n-Pentan fermentative« Gewinnung von Oroüdm unter Ver- 45 mrt8to ^ „-Hexadecan, Isopentan und wendung von Mikroorganismen und durch Ab- nUcten, η _fin ^ _{z B} Cyclohexan und trennunl des Orotidins aus der Kulturflussigkeit ^Is^ⁿ' ^^{y P} _adketti_ge und verzweigtkettige Olenach üblichen Methoden, das dadurch gekennzeich- Cy-loooffln g ^ Hexen-1, Octen-1 und net ist, daß man als Mikroorganismus Brevibacte- nne, wie · ^_{6 B} Cyclohexen, aromarium ketoglutamicum ATCC 21187, Corynebacte- ₅o Octen-2_κ^¹ '_{t(jff wie Z}._B. Benzol und rium sp. ATCC 21188 Arthrobacter paraffineus ^SbA^O«^^ ^davon' ^{und gem}^^htT ^Κ<Ϊ1" ATCC 21191 oder Breyibaclerium sp. ATOC 21189 c^ y ^ beispielsweise Kerosin, Leichtverwendet und die Kultivierung bei einer Temperatur ^^w _s^_{hweroleundPara{}finöle. von etwa 20 bis 50⁰C und bei einem pH-Wert von ^ole^^we _{dbare Polyol(i sin}d z.B. Sorbit, Mannit etwa 5,0 bis 9,0 unter aeroben Bedingungen meinem 55 ™™ _t , ^ ^^ _{Es k}„_{n a h}

   ri Uil thaltenden Nj*™/^J"^; S d Khltßquellen wie z B

   ^_{dbare y} etwa 5,0 bis 9,0 unter aeroben Bedingungen meinem 55 ™™ _t , ^ ^^ _{Es k}„_{n a h}

   wäßrigen, Uracil enthaltenden Nj*™/^J"^; S Mengen anderer Kohlenstoßquellen, wie z. B.