DE2417337B2

DE2417337B2 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin

Info

Publication number: DE2417337B2
Application number: DE2417337A
Authority: DE
Inventors: Ryoichi Maebashi Gunma Katsumata; Mamoru Kawasaki Kohata; Kiyoshi Sagamihara Nakayama; Tadaaki Tokio Nomura; Yoshitake Machida Tokio Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-04-10
Filing date: 1974-04-09
Publication date: 1978-10-05
Also published as: DE2417337C3; DE2417337A1; FR2225517A1; JPS5039153B2; FR2225517B1; GB1452688A; CA1023292A; FR2225520B1; US3907637A; DE2417336A1; JPS49125590A; US3907641A; GB1446987A; DE2417336B2; DE2417336C3; FR2225520A1; CA1023291A

Description

L-Lysin ist eine essentielle Aminosäure, für die in der Nahrungsmittelindustrie ein großer Bedarf besteht. Die Herstellung von L-Lysin auf biotechnischem Wege ist bekannt. Bei diesem Verfahren wird eine Mutante eines Mikroorganismus, der bestimmte Aminosäuren benötigt und bzw. oder eine Resistenz gegenüber L-Lysinanalogen aufweist, in einem Kohlenhydrate, Kohlenwasserstoffe und organische Säuren als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium gezüchtet. In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Versuche unternommen. Alkohole, wie Methanol und Äthanol, als Kohlenstoffquelle einzusetzen. Besondere Beachtung wurde Methanol geschenkt, da dieser Alkohol nicht nur billig zur Verfügung steht, sondern bei biotechnischen Verfahren auch leicht zu handhaben ist. In den USA.-Patentschriften 37 07 441 und 37 08 395 ist die Verwendung von Alkoholen zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin vorgeschlagen, jedoch ist weder ein praktisches noch ein konkretes Verfahren in diesen Patentschriften offenbart.

In der USA.-Patentschrift 35 95 751 ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von Äthanol als Kohlenstoffquelle durch einen Stamm der Gattung Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobactsr, Bacillus und Nocardia beschrieben. Ferner ist in der USA.-Patentschrift 36 63 370 ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure unter Verwendung bestimmter Stämme der Gattung Methanomonas, Protaminobacter und Microcyclus offenbart. In der britischen Patentschrift 12 10 770 ist speziell die Herstellung von L-Lysin aus Methanol durch Züchtung von Hefen in einem Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium beschrieben. Es werden Mikrobenzellen zusammen mit bestimmten Aminosäuren, einschließlich L-Lysin, erhalten. Ferner ist in der japanischen Patentveröffentlichung 25 273/70 die Herstellung von L-Lysin und anderen Aminosäuren aus Methanol unter Verwendung von Stämmen der Gattung Achromobacter und Pseudomonas beschrieben. Keines der bekannten Verfahren verläuft jedoch in befriedigender Ausbeute hinsichtlich der Bildung von

L-Lysin.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin aus Methanol in hoher Ausbeute unter Verwendung von Mikroorganismen zu schaffen, die L-Lysin produzieren. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Befund, daß Methanol verwertende Mutanten der Gattung Protaminobacter, die gegen S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin resistent sind, beträchtliehe Mengen an L-Lysin bilden.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Diese Mutante ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V. St A, hinterlegt und

steht der Öffentlichkeit zur Verfugung. Der Elternstamm Protaminobacter thiaminophagus ist in der US-PS 36 63 370 beschrieben.

Zur Herstellung der für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Mutanten können übliche Verfahren zur Induktion der Mutation angewendet werden, wie künstliche mutagene Mittel, beispielsweise Röntgenstrahlen, UV-Strahlen, Behandlung mit Stickstoff-Lost oder mit Nitrosoguanidin. Beispielsweise werden Mikrobenzellen eines Methanol verwertenden Stammes der Gattung Protaminobacter in einem Tris-Maleat-Puffer mit einem pH-Wert von 6 suspendiert, der lOOy/ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin enthält. Die Zellenkonzentration beträgt 5 · W/ml. Die Suspension wird 1 Stunde stehengelassen, sodann werden die Zellen abgeschleudert und mit steriler physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Hierauf werden die Zellen in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und sodann auf eine Agarplatte folgender Zusammensetzung aufgestrichen und inkubiert:

L-Threonin 20 mg/ml

S-2-Aminoäthyl-L-cystein 10 mg/ml
N atriumcitrat 1,5 mg/ml

(NH-O₂SO₄ 3,0 mg/ml

KH₂PO₄ 2,0 mg/ml

K₂HPO₄ 7,0 mg/ml

MgSO₄ -7 H₂O 0,5 mg/ml

MnSO₄ · 4 H₂O 8 mg/Liter

FeSO₄-7 H₂O 10 mg/Liter
Thiamin-hydrochlorid 1,0 mg/Liter

Biotin lOy/Liter
L-Methionin 1,0 mg/ml

Methanol 20 ml/Liter

Agar 20 g/Liter

so Die erhaltenen Kolonien werden in an sich bekannter Weise isoliert. Auf diese Weise wird ein Stamm mit Resistenz gegen S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin erhalten. Die Resistenz gegen diese beiden Verbindungen, die die zu isolierenden Mutanten besitzen, hängt von der Konzentration an S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin im Medium ab. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird gewöhnlich eine Mutante mit einer Resistenz gegenüber mindestens 10 mg/ml S-2-Aminoäthyl-L-cystein und mindestens 20 mg/ml L-Threonin verwendet.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes Kulturmedium verwendet werden, sofern es Methanol als Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und andere Wuchsfaktoren enthält, die

b"> für den jeweils verwendeten Stamm erforderlich sind.

Das als Kohlenstoffquelle verwendete Methanol ruft bisweilen eine Wachstumshemmung des Mikroorganismus hervor, wenn es im Medium in hoher Konzen-

tration vorliegt. Deshalb wird die Methanolkonzentration im Medium unterhalb eines Wertes von etwa 3 Prozent (Volumen/Volumen) gehalten. Gute Ergebnisse werden mit einem Nährmedium erhalten, das anfänglich eine niedrige Kenzentra- > tion, ζ. B. 0,5 bis 3 Prozent (Volumen/Volumen) Methanol enthält und die Züchtung je nach Methanolverbrauch durch den Mikroorganismus unter kontinuierlichem Einspeisen von Methanol in einer Menge von 0,3 bis 0,6 Volumprozent, bezogen auf das Volumen des Mediums und pro Stunde oder absatzweise in einer Menge von 0,5 bis 2 Volumprozent, bezogen auf das Volumen des Mediums zu jedem Zeitpunkt, durchführt.

Als Stickstoffquelle können Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und Ammoniumnitrat, Ammoniak, oder Harnstoff verwendet werden. Ferner können als Stickstoffquelle Casaminosäure, Pepton und Hefeextrakt verwendet werden. Diese organischen Verbindungen natürlicher Herkunft enthalten Vitamine und andere wachstumsfördeirnde Stoffe, und sie sind daher gut geeignet zur Verkürzung der Züchtungsdauer und zur Förderung der Bildung von L-Lysin, wenn sie dem Medium als Stickstoffquelle in geringen Mengen einverleibt werden. Zusätzlich können anorganische Verbindungen, wie Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat, Eisen- und Mangansalze, zugesetzt werden.

Wenn der verwendete Stamm einen Nährstoffbedarf hat, muß dem Medium natürlich eine geeignete Quelle für den Nährstoff zugesetzt werden. Protaminobacter thiaminophagus benötigt Thiamin zum Wachstum.

Es muß daher reines Thiamin oder ein Naturprodukt dem Medium einverleibt werden, das Thiamin enthält.

Die Züchtung wird im allgemeinen während 2 bis 5 Tagen unter aeroben Bedingungen bei 20 bis 40⁰C durchgeführt. Zur Erzielung hoher Ausbeuten wird der pH-V/ert des Nährmediums während der Züchtung im Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise um den Neutralpunkt gehalten. Der pH-Wert kann durch Zusatz von ·ιο Calciumcarbonat, verschiedenen Pufferlösungen oder alkalisch reagierenden Lösungen eingestellt werden. Nach beendeter Züchtung werden die Mikrobenzellen aus der Gärmaische abgetrennt, beispielsweise abfiltriert. Das im Filtrat enthaltene L-Lysin wird in an sich bekannter Weise isoliert und gereinigt, beispielsweise durch Behandlung mit Ionenaustauscherharzen und Umkristallisation.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

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Beispiel

Protaminobacter thiaminophagus SLR-77 (ATCC 21926) wird in 10 ml eines Vorkulturmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einem Reagenzglas überimpft und 20 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln inkubieri:

Methanol	20 ml
(NH₄J₂SO₄	10g
KH₂PO₄	2g
K₂HPO₄	7g
MgSO₄ · 7 H₂O	0,5 g
FeSO₄ ■ 7 H₂O	10 mg
MnSO₄ · 4 H₂O	8 mg
Thiamin-hydrochlorid	1 mg
Biotin	10 μ₈
Hefeextrakt	0,1g
CaCO₃	20 g
Wasser auf	1 Liter
(pH-Wert 7,2)

Die erhaltene Vorkultur wird in jeweils 10 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung in Reagenzröhrchen in einem Verhältnis von 1 ml überimpft. Die Fermentation wird 72 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln durchgeführt. Nach 16stündiger Züchtung werden 1 Prozent Methanol und nach 25- bzw. 40stündiger Züchtung 2 Prozent Methanol zugegeben. Nach beendeter Züchtung sind in der Kulturbrühe 1,5 mg/ml (als Hydrochlorid) L-Lysin gebildet.

Die Kulturbrühen in den Reagenzgläschen werden vereinigt. Es wird ein Gesamtvolumen von 2 Liter erhalten. Die Mikrobenzellen werden aus der Kulturbrühe abgetrennt. Die zellfreie Lösung wirH an einem stark sauren Kationenharzaustauscher adsorbiert. Sodann wird der Kationenaustauscher mit wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird eingedampft und mit Salzsäure neutralisiert. Nach der Umkristallisation werden 2,4 g kristallines L-Lysin-hydrochlorid erhalten.

Zum Vergleich werden die Stämme Pichia pastoris CBS 704 (GB-PS 12 10 770) und Pseudomonas insueta G-4-1-2 (japanische Patentveröffentlichung 25 273/70) unter den Züchtungsbedingungen des vorstehenden Beispiels im gleichen Nährmedium gezüchtet. Bei der Züchtung von Pichia pastoris CBS 704 wird als Kohlenstotfquelle 1,5 Prozent (Gew./Vol.) Methanol verwendet. Man erhält L-Lysin in einer Ausbeute von 0,2 mg/ml. In der GB-PS 12 10 770 wird eine Ausbeute von 0,5 mg/ml angegeben. Bei der Züchtung von Pseudomonas insueta G-4-1-2 werden 3,5 Prozent (V0I./V0I.) Methanol als Kohlenstoffquelle verwendet. Es ergibt sich eine Ausbeute an L-Lysin von 0,1 mg/ml. In der genannten japanischen Patentveröffentlichung wird eine Ausbeute von 0,0116 mg/ml angegeben.

Aus den vorstehenden Werten ergibt sich, daß erfindungsgemäß wesentlich höhere Ausbeutm an L-Lysin erhalten werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nach üblichen Mutationsverfahren aus Protaminobacter thitminophagus ATCC 21371 hergestellte L-Lysin bildende Mutante, die Methanol verwerten kann und gegen S-2-Aminoäthyl-L-cystein und L-Threonin resistent ist, in einem Methanol als Hauptkohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und andere Wachstumsfaktoren enthaltenden Nährmedium bei einer Methanolkonzentration von unterhalb 3 Volumprozent züchtet und aus der Gärmaische L-Lysin isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit der Mutante Protaminobacter thiaminophagus ATCC 21926 durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 20 bis 40⁰C durchführt.