DE2417336B2

DE2417336B2 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin, L-Asparaginsäure, L-Alanin, L-Valin, L-Leucin und L-Arginin

Info

Publication number: DE2417336B2
Application number: DE2417336A
Authority: DE
Inventors: Ryoichi Maebashi Gunma Katsumata; Mamoru Kawasaki Kohata; Kiyoshi Sagamihara Nakayama; Tadaaki Tokio Nomura; Yoshitake Machida Tokio Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-04-10
Filing date: 1974-04-09
Publication date: 1979-01-11
Also published as: JPS5039153B2; US3907637A; CA1023292A; DE2417337B2; DE2417336C3; FR2225520B1; GB1446987A; CA1023291A; DE2417336A1; US3907641A; DE2417337C3; FR2225517A1; DE2417337A1; GB1452688A; JPS49125590A; FR2225520A1; FR2225517B1

Description

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Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren auf biotechnischem Wege unter Verwendung entweder von Wildstämmen oder Mutanten von Mikroorganismen in einem Kohlenhydrate, Kohlenwasserstoffe und organische Säuren als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium bekannt In den letzten Jahren wurde versucht, Alkohole, wie Methanol und Äthanol, zur Fermentation zu verwenden. Besondere Beachtung wurde Methanol geschenkt, da Methanol nicht nur billig zugänglich ist, sondern bei Fermentationsverfahren auch leicht zu handhaben ist In den US-Patentschriften 37 07 441 und 37 08 395 ist die Verwendung von Alkoholen zur biotechnischen Her- η stellung von L-Lysin vorgeschlagen; es sind jedoch weder praktische noch konkrete Verfahrensbeispiele offenbart. In der US-PS 35 95 751 ist die Herstellung von L-Lysin aus Äthanol unter Verwendung eines Stammes der Gattungen Corynebacterium, Brevibacte- 4η Hum, Arthrobacter, Bacillus und Nocardia beschrieben. In der US-PS 36 63 370 ist ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure aus Methanol unter Verwendung bestimmter Stämme der Gattungen Methanomonas, Protaminobacter und Mi- r, crocyclus beschrieben. In der britischen Patentschrift 12 10 770 ist die Züchtung von Hefen in einem Methanol enthaltenden Nährmedium zur Herstellung von Mikrobenzellen sowie bestimmter Aminosäuren beschrieben. Schließlich ist in der japanischen Patentveröffentlichung ->o 25 273/70 beschrieben, daß bei der Züchtung von Stämmen der Gattungen Achromobacter und Pseudomonas unter Verwendung von Methanol als Kohlenstofr'quelle Aminosäuren im Nährmedium angereichert werden. Die bekannten Aminosäurebildner aus Me:ha- v, nol sind jedoch unbefriedigend, da sie entweder eine zu geringe Produktivität aufweisen oder die Zahl der herzustellenden Aminosäuren zu gering ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Amino- wi säuren der eingangs genannten Art zu schaffen, bei dem diese Aminosäuren in beträchtlichen Mengen in einem Methanol als Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium gebildet werden. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Befund, daß eine neue Mutante, die sich *-, von Protaminobacter thiaininophagus ATCC 21 371 ableitet, die in der US-PS 36 63 370 beschrieben ist, sich durch eine verbesserte Aminosäureproduktion aus

zeichnet Gegenstand der Erfindung ist der in den Ansprüchen definierte Gegenstand.

Die erfindungsgemäß verwendete Mutante Protaminobacter thiaminophagus K-217 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland V. St A, unter der Nummer ATCC 21927 hinterlegt und steht der Öffentlichkeit zur Verfugung. Diese Mutante wurde durch Screening einer Population von Protaminobacter thiamonophagus ATCC 21 371 isoliert

Als Nährmedium kann im erfindungsgemäßen Verfahren jedes synthetische oder natürliche Nährmedium verwendet werden, sofern es Methanol als Kohlenstoffquelle, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen, Vitamine und wachstumsfördernde Nährstoffe in entsprechender Konzentration enthält

Methanol, das als Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird, erzeugt bisweilen eine Wachstumshtf-imung der Mikroorganismen, wenn es in hohen Konzentrationen im Nährmedium vorliegt Vorzugsweise wird die Konzentration des Methanols im Medium unter einem Wert von etwa 3 Prozent (Volumen/Volumen) gehalten. Gute Ergebnisse können erhalten werden, wenn ein Nährmedium eingesetzt wird, das zu Beginn eine niedrige Konzentration von beispielsweise 04 bis 3 Prozent (Volumen/Volumen) Methanol enthält und die Züchtung unter kontinuierlichem Einspeisen von Methanol in einer Menge von 0,3 bis 0,6 Prozent (Volumen/Volumen), bezogen auf das Volumen des Mediums und pro Stunde oder absatzweise in einer Menge von 0,5 bis 2 Prozent (Volumen/Volumen), bezogen auf das Nährmedium zu jedem Zeitpunkt und in dem Maße eingespeist wird, wie das Methanol vom Mikroorganismus verbraucht wird.

Als Stickstoffquelle können Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und Ammoniumnitrat Ammoniak oder Harnstoff verwendet werden. Ferner können Casaminosäure, Pepton und Hefeextrakt als Stickstoffquelle verwendet werden. Diese organischen Verbindungen natürlicher Herkunft enthalten Vitamine und andere wachstumsfördernde Stoffe, die deshalb wirkungsvoll die Züchtungsdauer vermindern und die Bildung der Aminosäuren fördern, wenn sie in geringen Mengen dem Medium als Stickstoffquelle einverleibt werden. Ferner können anorganische Verbindungen, wie Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat, Eisen- und Magnesiumsalze verwendet werden. Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Stamm Protaminobacter thiaminophagus K-217 (ATCC 21 927) benötigt fü.- sein Wachstum Thiamin. Deshalb müssen dem Nährmedium Thiamin oder Produkte natürlicher Herkunft einverleibt werden, die Thiamin enthalten.

Die Züchtung wird im allgemeinen 2 bis 5 Tage unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 20 bis 40° C durchgeführt. Zur Erzielung hoher Ausbeuten wird der pH-Wert des Nährmediums während der Züchtung bei 4 bis 9, vorzugsweise um den Neutralpunkt gehalten. Der pH-Wert kann durch Zusatz von Calciumcarbonat, verschiedenen Pufferlösungen oder alkalischen Lösungen eingestellt werden.

Nach beendeter Züchtung werden die Zellen aus der Kulturbrühe abfiltriert, und aus dem Filtrat werden die gebildeten Aminosäuren in an sich bekannter Weise abgetrennt und isoliert, z. B. durch Behandlung mit einem lonenaustauscherhar/, und beispielsweise durch Umkristallisation gereinigt.

Das Beispiel erläutert die Erfindung. Beispiel

Protaminobacter thiaminophagus K-217 (FERM-P Nr. 2021; ATCC 21 927) wird in IO mi eines Vorkulturraediums der nachstehend aufgeführten Zusammensetzung in einem Reagensgias aberimpft und 20 Stunden unter Schütteln bei 30° C gezüchtet:

Methanol	20 ml
(NHj)₂SO₄	6g
KH₂PO₄	2g
K₂HPO₄	7g
MgSO₄ · 7 H₂O	0,5 g
FeSO₄ · 7 H₂O	10 mg
MnSO₄ · 4 H₂O	8 mg
Thiamin-hydrochlorid	1 mg
Biotin	10 ug
Hefeextrakt	0,1g
Phenolrot (pH-Indikator)	10 mg
Wasser auf	1 Liter
(pH-Wert 7,2>

IO

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Die erhaltene Vorkultur wird in einer Menge von jeweils 1 ml in 10 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung in Reagensgläschen überimpft Die Züchtung wird 96 Stunden unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt. Nach 24, 48 und 72 Stunden werden jeweils 2 Prozent Methanol zugesetzt Die Gesamtmenge an Methanol beträgt 6 Prozent Der pH-Wert der Kulturflüssigkeit wird mit 14prozentiger wäßriger Ammoniaklösung auf einen Wert um den Neutralpunkt eingestellt Nach b^ndeter Züchtung haben sich in der Kulturbrühe 0,2 mg/ml L-Aspara^üisäure, 0,8 mg/ml L-Alanin, 1,0 mg/ml L-Valin, 1,2 mg/ml L-Leucin, 0,7 mg/ml L-Arginin und 0,3 mg/H L-Lysin (als L-Lysin-hydrochlorid) angesammelt Nach dem Abtren- 25

nen der Mikrobenzellen durch Filtrieren werden die Aminosäuren in an sich bekannter Weise durch Ionenaustauscbbehandlung isoliert Aus 1 Liter der Kulturbrühe werden 0,14 g L-Asparaginsäure, 0,48 g L-Alanin, 0,6 g L-Valin, 0,72 g L-Leucin, 0,49 g L-Arginin und 0,21 g L-Lysin erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist gegenüber den bekannten Verfahren in mindestens einem der folgenden Punkte überlegen:

1. Größere Produktivität

2. Größere Zahl an gebildeten, verschiedenen Aminosäuren

3. Verwertung des billigen und leicht zu handhabenden Methanols.

Die US-PS 37 07 441 und 37 08 395 betreffen die Herstellung von L-Lysin aus Alkoholen. Jedoch sind die in diesen Verfahren verwendeten Bakterienstämme nicht zu einer Verwertung von Methanol in der Lage, wie aus den nachstehenden Untersuchungsergebnissen hervorgeht

Die US-PS 35 95 751 betrifft die Bildung von L-Lysin aus Äthanol. Im Gegensatz dazu wird beim anmeldungsgemäßen Verfahren Methanoi eingesetzt

Die US-PS 36 63 370 betrifft die Bildung von L-Glutaminsäure aus Methanol. Demgegenüber wird nach dem erfindungsjjemäßen Verfahren eine große Anzahl von Aminosäuren mit Ausnahme von L-Glutaminsäure gebildet

Die GB-PS 12 10 770 und die japanische Patentveröffentlichung 45/25 2Γ3 betreffen die Herstellung von verschiedenen Aminosäuren unter Verwendung von Methanol. Die Ausbeuten an den verschiedenen Aminosäuren unter Verwendung der in diesen Druckschriften angegebenen Stämme sind in folgender Tabelle aufgeführt

Druckschrift

Versuch

Stamm

Gebildete Aminosäuren

y/ml

GB-PS 12 10 770

japanische Patentveröffentlichung 45/25273

Pichia pastoris CBS 704

Hansenula wickerhamii NRRL YB-4943

Pichia haplophyla CBS 2028

Achromobactcr methanolophila E 95-1
Achromobacter methanolophila E 91-1
Achromobacter methanolophila F 48-3
Achromobacter metnanolophila E 19-2
Achromobacter methanolophila F 73-1
Pseudomonas insueta G8-3-2-Pseudomonas insueta G4-1-2
Pseudomonas insueta F27-3
Achromobacter methanolophila F 73-1
Pseudomonas insueta G8-3-2

Pseudomonas insueta F 27-3
Pseudomonas insueta G 4-1-2
Achromobacter methanolophila F 54-2
Achromobacter methanolophila E ·)5-Ι
Achromobacter methanolonhila E ¹M-I

GA	1000, Lys 500
GA	1500, Th r 500
AIa	300
GA	800, VaI 500
GA	310
GA	350
GA	100
GA	300
GA	300
GA	146
GA	280
GA	230
Phe	17
GA	466, GIy 23
Arg	13
GA	335. Phc 31
Lys	11,6
CiA	KX)
GA	605
GA	565

Fortsetzung

Druckschrift

Versuch

Stamm Gebildete Aminosäuren

y/ml

japanische PatentverölTentlichung 45/25273

Achromobacter methanolophila F 36-1 Achromobacter methanolophila E 19-2 Achromobacter methanolophila F 73-1 Pseudomonas insueta F 27-3
Pseudomonas insueta G 8-3-2
Pseudomonas insueta F 27-3

Achromobacter methanolophila E 19-2 Achromobacter methanolophila F 73-1

Anmerkung: GA:	5 5 5 Glutaminsäure	A A P GIy:	xhromob xhromob seudomoi Glycin
Lys:	Lysin	Arg:	Arginin
Thr:	Threonin	He:	Isoleucin
AIa:	Alanin	Leu:	Leucin
VaI:	Valin	Pro:	Prolin
Phe:	Phenylalanin	Tyr:	Tyrosin
Asp:	Asparaginsäure	Ser:	Serin

GA GA GA GA GA

AIa 117, He 45, Leu 125, Thr II, Pro 17, Tyr

VaI 314, Pro 23, Tyr

Heu 82, Leu 171, Thr

AIa Ser VaI

In Tabelle I sind die Ausbeuten nach Beispiel 1 des erfindungsgemäßen Verfahrens den gemäß den Verfahren der vorgenannten Druckschriften erhaltenen Ausbeuten gegenübergestellt.

Tabelle I	Ausbeuten	(VmI)
	Beispiel 1	bekannte Verfahren
Aminosäuren	200	_
L-Asparaginsäure	8(F	117, 187,300
L-Alanin	1000	136,314,500
L-Valir	1200	125, 171
L-Leucin	700	13
L-Arginin	300	11,6 500
L-Lysin

Aus Tabelle I ergibt sich, daß man beim erfindungsge- Ferner wurden folgende aus den US-PS 37 07 441 und

mäßen Verfahren höhere Ausbeuten an L-Asparagin- 37 08 395 bekannten Stämme in bezug auf ihre

säure, L-Alanin, L-Valin, L-Leucin und L-Arginin als bei >o Aminosäurebildung in einem Methanol enthaltenden

den Verfahren de! vorgenannten Druckschriften erhält. Nährmedium untersucht:

Verwendete Stämme

Brevibacterium flavum ATCC 21475 Corynebacterium acetoglutamicu.n AFCC 21491 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 21490 Micrococcus glutamicus ATCC 21492

Brevibacterium flavum LT-I ATCC 21528 Brevibacterium flavum T-JOl ATCC 21529 Corynebacterium glutamicum BL-25 ATCC 215Γ0 Corynebacterium glutamicum T-135 ATCC 21527 Corynebacterium glutamicum RL-9 ATCC 21543 Corynebacterium glutamicum LY-32-6 ATCC 21544 US-PS 3707441

US-PS 37 08

Diese Stämme wurden in 10 ml des Anzuchtmediums gemäß Beispiel I der vorliegenden Erfindung 20 Stunden bei 30⁰C ohne Schütteln gezüchtet. Es wurde festgestellt, daß sich in der Gärflüssigkeit keine <r> Aminosäuren anreicherten. Dies bedeutet, daß die vorgenannter Stämme nicht zu einer Verwertung von Methanol in der Lage sind.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin, L-Asparaginsäure, L-Alanin, L-Valin, L-Leucin und L-Arginin, dadurch gekennzeichnet, daß man Protaminobacter thiaminophagus K-217 (ATCC 21 927) in einem Methanol als Kohlenstoffquelle, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen, Vitamine und wachstumsfördernde Nährstoffe in entsprechender Konzentration enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 20 bis 40" C durchführt

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