DE2438206A1

DE2438206A1 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von l-glutaminsaeure und mikroorganismen zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2438206A1
Application number: DE2438206A
Authority: DE
Inventors: Ryoichi Katsumata; Mamoru Kobata; Kiyoshi Nakayama; Tadaaki Nomura; Yoshitake Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-08-11
Filing date: 1974-08-08
Publication date: 1975-02-20
Also published as: US3939042A; CA1034065A; JPS5428472B2; FR2240288B1; GB1473367A; JPS5040786A; IT1016796B; FR2240288A1

Description

"Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure" und Mikroorganismen zur Durchführung des Verfahrens"

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Priorität: 11. August 1973, Japan, Nr. 89 679/73

Es besteht ein großer Bedarf an L-Glutaminsäure, die als Würz- und Aromastoff dient.

Die biotechnische Herstellung von L-Glutaminsäure mit Methanol als Kohlenstoffquelle unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattungen Pseudomonas und Protaminobacter ist bekannt. In der US-PS 3 663 370 wird die Herstellung von L-Glutaminsäure aus Methanol durch Züchtung von Mikroorganismen beschrieben. Dabei wird auch die Gattung "Protaihinobacter verwendet. Die US-PS 3 616 224 beschreibt die Herstellung verschiedener Aminosäuren, einschließlich L-Glutaminsäure, durch Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas in einem Methanol als wesentliche Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium.

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Es besteht allerdings stets ein Bedürfnis zur Verbesserung dieser Verfahren. Der Erfindung liegt daher die. Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure zu entwickeln, das diese Aminosäure in hoher Ausbeute aus Methanol liefert. Die Lösung der Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß Mutanten, die sich von L-Glutaminsäure produzierenden und Methanol verwertenden Mikroorganismen der Gattungen Pseudomonas und Protaminobacter ableiten und die mindestens eine Eigenschaft aufweisen, nämlich

a) Bedarf an L-Methionin,

b) Bedarf an L-Isoleucin, . _:

c) Bedarf an L-Phenylalanin und

d) Resistenz gegenüber DL-Lysinhydroxamat, verglichen mit dem Elternstamm eine beträchtlich verbesserte Fähigkeit zur Herstellung von L-Glutaminsäure besitzen.

Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine aus einem Methanol verwertenden und L-Glutaminsäure produzierenden Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas oder Protaminobacter hergestellte Mutante, die mindestens eine Eigenschaft aufweist, nämlich

a) Bedarf an L-Methionin,

b) Bedarf an L-Isoleucin,

c) Bedarf an L-Phenylalanin oder

d) Resistenz gegenüber DL-Lysinhydroxamat,

in einem Methanol als wesentliche Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium züchtet und aus der Gärmaische die entstandene L-Glut-L aminsäure isoliert. . _j

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Ferner betrifft die Erfindung die zur Durchführung des Verfahrens geeigneten Mutantenstamme. .

Die erfindungsgemäß eingesetzten Mutanten mit Bedarfseigenschaften umfassen die sogenannten "leaky-type" Mutanten.

Die erfindungsgemäßen Mutanten leiten sich von Stämmen ab, die die Fähigkeit besitzten, Methanol zu verwerten und L-Glutaminsäure zu produzieren und die der Gattung Pseudomonas oder Protaminobacter angehören. Die Elternstämme sind an sich bekannt und in Hinterlegungsstellen hinterlegt oder sie werden aus isolierten Stämme'n natürlichen Ursprungs ausgewählt. Bezüglich der Leistungsfähigkeit der L-Glutaminsäureproduktion des Elternstammes gibt es keine kritische untere Grenze. Vorzugsweise soll der Elternstamm mindestens etwa 100 y/ml L-Glutaminsäure produzieren, wenn er unter den üblichen Züchtungsbedingungen 24 bis 48 Stunden in einem nachstehend in Beispiel 1 beschriebenen Nährmedium gezüchtet wird. Spezielle Beispiele für die zur Herstellung der Mutanten verwendbaren Elternstämme sind Pseudomonas insueta ATCC 21276 (vgl. US-PS 3 616 242), Pseudomonas methanolica ATCC 217O4 (vgl. US-PS 3 755 082) und Protaminobacter thiaminophagus ATCC 21371 (vgl. US-PS 3.663 370).

Der Elternstamm, der die Fähigkeit aufweist, Methanol zu verwerten und L-Glutaminsäure zu produzieren, und der der Gattung Pseudomonas oder Protaminobacter angehört, wird in an sich bekannter Weise einer mutationsauslösenden Behandlung unterzogen. Es entstehen Mutanten, die mindestens eine Eigenschaft auf-

L . _j

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weisen, nämlich den Bedarf an L-Methionin, L-Isoleucin, L-Phenylalanin oder eine Resistenz gegenüber DL-Lysinhydroxamat.

Spezielle Beispiele für die im Verfahren der Erfindung eingesetzten Ausgangsmutanten sind Pseudomonas insueta K-015 ATCC 21966 (Bedarf an L-Methionin), Pseudomonas insueta K-038 ATCC 21967. (Bedarf an L-Isoleucin "leaky-type"), Pseudomonas methanolica LHX-8 ATCC 21968 (resistent gegenüber DL-Lysinhydroxamat) und Protaminobacter thiaminophagus- K-224 ATCC 21969 (Bedarf an L-Phenylalanin). Diese Mutanten leiten sich von den vorgenannten drei Elternstämmen ab und sie wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A, hinterlegt und sind zugänglich.

Die Herstellung der für das Verfahren der Erfindung geeigneten Mutanten kann in an sich bekannter Weise durch induzierte Mutation erfolgen, bei der ein Stamm anfällt, der Bedarfs- oder Resistenzeigenschaften aufweist. Beispiele für Mutagene sind Röntgenstrahlung, Ultraviolettbestrahlung, N-Lost und Nitrosoguanidin; vgl. J. Starka, Physiologie und Biochemie der Mikroorganismen, Gustav Fischer Verlag Stuttgart, 1968, Seiten. 501-511.

Eine erfindungsgemäße Mutante_mit einem Bedarf an L-Methionin, L-Isoleucin oder L-Phenylalanin wird beispielsweise wie folgt '','; hergestellt:

Zellen des entsprechenden Elternstammes werden in einer Trismaleat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6, die 100

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N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin enthält, suspendiert. Die Zellenkonzentration /beträgt 5 χ 10 Zellen/ml. Danach wird die Suspension 1 Stunde stehengelassen. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert und mit steriler physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach werden die Zellen auf eine Nähr-.agar-Platte, die 20 g/Liter Bouillonpulver, 5 g/Liter Hefeextrakt, 20 ml/Liter Methanol und 20 g/Liter Agar enthält, überimpft.

Die Zellen der entstandenen Kolonien werden auf eine Agarplatte überimpft, die ein Minimalmedium enthält, auf dem der Elternstamm wachsen kann. Ferner werden die Zellen auf eine mit einem Nährmedium versehene Agarplatte überimpft, die das Minimalmedium sowie eine entsprechende Menge, beispielsweise 10 mg/Liter, eines erforderlichen Nährstoffs enthält, nämlich L-Methionin, L-Isoleucin oder L-Phenylalanin. Anschließend wird inkubiert. Es werden diejenigen Stämme ausgewählt, die nicht auf dem

Nähr-

Minimalmedium sondern auf dem mit dem/stoff versehenen Nährboden wachsen. Auf diese Weise erhält man einen Stamm, der einen Wachstumsbedarf aufweist.

Zur Herstellung einer Mutante, die eine Resistenz gegenüber DL-Lysinhydroxamat aufweist, werden die Zellen nach einer wie vorstehend beschriebenen Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin auf Agarplatten überimpft und inkubiert. Die Agarplatten enthalten ein Minimalmedium für den Elternstamm, dem eine entsprechende Menge an DL~Lysinhydroxamat zugesetzt wird. Der Gehalt an DL-Lysinhydroxamat im Nährboden ist so

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bemessen, daß das Wachstum des Elternstainmes gehemmt wird. Er beträgt gewöhnlich 1 mg/ml. Schließlich werden die entstandenen Kolonien isoliert. Auf diese Weise wird eine Mutante gewonnen, die eine Resistenz gegenüber DL-Lysinhydroxamat aufweist. Die Resistenz gegenüber DL-Lysinhydroxamat der für die Erfindung geeigneten Mutanten beträgt gewöhnlich mindestens 1 mg/ml.

Es ist ersichtlich, daß man durch wiederholte Anwendung der vorstehend beschriebenen Behandlung Mutanten mit mindestens zwei Eigenschaften erhalten kann.

Für das erfindungsgemäße. Verfahren ist jedes Nährmedium geeignet, das Methanol als Kohlenstoffquelle sowie eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und weitere wachstumsfördernde Faktoren aufweist, die je nach der Art des eingesetzten Stammes erforderlich sind.

Das im Medium als Kohlenstoffquelle verwendete Methanol kann in hoher Konzentration eine Wachstumshemmung der Mikroorganismen hervorrufen. Vorzugsweise wird die Methanolkonzentration im Nährmedium auf höchstens etwa 3 Volumenprozent gehalten. Gute Ergebnisse werden bei der Verwendung eines Nährmediums mit einer anfänglich niedrigen Methanolkonzentration, beispielsweise 0,5 bis 3 Volumenprozent, erzielt. Dabei wird die Züchtung unter kontinuierlicher Methanolzugabe in das Nährmedium durchgeführt, und zwar in einer Zugabemenge von 0,3 bis 0,6 Volumenprozent pro Stunde, bezogen auf das Volumen des Nährmediums. Die Zugabe kann auch anteilsweise in einer Zugabemenge von 0,5 bis 2 VoIu-L menprozent erfolgen. Die Zugabe/in dem Maße, in dem das MethanοIj

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von den Mikroorganismen verbraucht wird. Die Gesamtmenge an zugegebenem Methanol hängt von den spezifischen Eigenschaften der" Mikroorganismen sowie von den Züchtungsbedingungen, vor allem von der Züchtungsdauer ab. Bei einer langen Züchtungsdauer können bis zu 40 Volumenprozent Methanol, bezogen auf das Volumen des Nährmediums, verwendet werden.

Spezielle Beispiele für verwendbare Stickstoffquellen sind Ammoniumsalze, wie ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat und Ammoniumnitrat, sowie Ammoniak und Harnstoff. Weiterhin können Casaminsäure, Pepton und Hefeextrakt verwendet werden. Diese organischen Naturstoffe enthalten. Vitamine, Aminosäuren und weitere wuchsfördernde Verbindungen und bewirken dadurch eine Verkürzung der Züchtungsdauer sowie eine Erhöhung der L-Glutaminsäureproduktion, falls sie dem Nährmedium in kleinen Mengen als Stickstoffquelle zugesetzt werden. Es können weiterhin auch anorganische Verbindungen, wie Kaliümphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen- oder Mangansalze, zugesetzt werden.

Falls die eingesetzten Stämme einen Nährstoffbedarf besitzen, so muß das Nährmedium durch einen entsprechenden Nährstoff ergänzt werden. Die erfindungsgemäß eingesetzten Mutanten können mindestens eine Verbindung, nämlich L-Methionin, L-Isoleucin und L-Phenylalanin,- als Nährstoff benötigen. Bei Verwendung· einer Mutänte mit solchen Bedarfseigenschaften ist es erforder-. lieh, das Nährmedtum mit der erforderlichen Aminosäure oder einer geeigneten Aminosäurequelle zu versetzen. Bei Verwendung . geeigneter Mengen organischer Naturstoffe-als Stickstoffquelle .L ' ■ ' ^T J

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ist es nicht mehr erforderlich, das Nährmedium zusätzlich mit der benötigten Aminosäure oder ihrer Quelle zu versetzen, da die organischen Naturstoffe, wie Casaminsäure, Pepton oder Hefeextrakt, bereits diese Aminosäuren enthalten. Sofern ein verwendeter Stamm einen Bedarf an einem Vitamin aufweist, wie beispielsweise Protaminobacter thiaminophagus, der Thiamin benötigt, so muß das Nährmedium mit dem Vitamin versetzt werden.

Die Züchtung wird in an sich bekannter Weise, z»B. 2 bis 6 Tage bei Temperaturen von 20 bis 40 C unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Zur Erreichung einer hohen L-Glutaminsäureausbeute liegt der pH-Bereich des Nährmediums während der Züchtung vorzugsweise bei 4 bis 9, besonders bevorzugt um 7. Vorzugsweise wird Ammoniak zur Einstellung des pH-Wertes verwendet.

Nach beendeter Züchtung entfernt man die Zellen aus der Kulturbrühe, beispielsweise durch Abfiltrieren. Die Isolierung und Reinigung der in der Kulturbrühe enthaltenen L-Glutamins.äure kann in an sich bekannter Weise erfolgen,, beispielsweise durch Behandlung mit Ionenaustauschern oder Auskristallisieren.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Es werden die nachstehend in Tabelle I angegebenen Stämme eingesetzt. Jeder dieser Stämme wird in einen 20 ml Nähraeetiu« enthaltenden 250 ml-Erlenmeyerfcolben überimpft, Die weisen folgende Zusammensetzung aufs

- 9 -	Methanol	20 ml	2438206
(NH₄J₂SO₄	10 g
KH₂PO₄	2 g
K₂HPO₄	⁷. 9
MgSO₄ ^;7H₂O	0,5 g
FeSO₄'7H₂O	25 mg
MnSO.'4H₀O fs £	8 mg	-
Thiamin-hydrochlorid	1 mg
Biotin	10 ^ug
Polypepton	10 g .
Phenolrot	10 mg
Wasser auf 1 Liter	■

Der pH-Wert des Nährmediums beträgt 7,2. Die Züchtung wird Tage unter Schütteln bei 30 C durchgeführt. Nach 16 Stunden Züchtung wird 1 Volumenprozent Methanol zugegeben. Nach 27 bzw. 40 Stunden wird jeweils 2 Volumenprozent Methanol zugegeben. Während der Züchtung wird der pH-Wert dreimal täglich mit einer 3n wässrigen Ammoniaklösung auf etwa 7 eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

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Tabelle I

Stämme

Wachstum, optische Dichte

χ 40
(660 m<ti)

Ausbeute an L-Glutaminsäure, mg/ml

Pseudomonas insueta

ATCC 21276 (Eltern) 0,240

K-Ol5 ATCC 21966 (Mutants) 0,180

K-038 ATCC 21967 (Mutante) 0,150

1,2

9,7

12,9

Pseudomonas methanol!ca

ATCC 21704 (Eltern) 0,325

LHX-8 ATCC 21968 (Mutante) 0,200

0,7 7,4

Protaminobacter thiaminophagus

ATCC 21371 (Eltern) 0,316

K-224 ATCC 21969 (Mutante) 0,170

2,1 11,2

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß die Ausbeute an L-Glutaminsäure unter Verwendung der Mutanten 5 bis ΙΟ-mal höher ist, wie bei Verwendung der Elternstämme.

Beispiel

Es wird der Stamm Pseudomonas insueta K-038 ATCC 21967 verwendet. Der Stamm wird als Einsaatstamm in 20 ml eines ersten Vorkulturmediums, das sich in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben befindet, gezüchtet. Das Vorkulturmedium weist folgende Zusammensetzung auf.

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	20 ml	2438206
Methanol	5 g
(NH₄J₂SO₄	1 g
KH₂PO₄	2,5 g
K₂HPO₄	. 0,5 g ■
MgSO₄ * 7H₂O	25 mg
FeSO₄'7H₂O	8 mg
MnSO₄MH₃O .	2 mg
Thiamin-hydrochlorid	10 (Ug
Biotin	10 g
Polypepton
Wasser auf 1 Liter
(pH 7;2)

Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. Die Züchtung wird 27 Stunden unter Schütteln bei 30 C durchgeführt. Sodann wird die erste Vorkultur in 300 ml einer zweiten Vorkultur in einen 2-Liter Erlenmeyerkolben überimpft. Die Züchtung wird 28 Stunden unter Schütteln bei 30°C durchgeführt. Sodann wird die zweite Vorkultur in 2,7 Liter eines dritten Vorkulturmediums in einen 5 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Züchtung in dem Fermenter wird 24 Stunden unter Belüftung und Rühren (600 U/min) bei 30°C durchgeführt. Währenddessen wird der pH-Wert durch Zugabe konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung auf 6,8 gehalten» Nach 20 Stunden Züchtung wird 1 Volumenprozent Methanol zugegeben. Schließlich werden 300 ml-Anteile der erhaltenen dritten Vorkülturbrühe in 2_r7 Liter eines Nähr— mediums in einen 5 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des zweiten und dritten Vorkulturmediums ist

die gleiche wie die des ersten Vorkultuirmediums. Die Züchtung in dem Fermenter wird 58 Stunden unter Belüftung und Ruhten (600 U/min) bei 30⁰C durchgeführt. Der pH-Wert wird währenddessen durch Zugabe von konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung auf 6,8 gehalten. Nach 10-stündiger Fermentation wird das Nährmediüm im Verlauf von 36 Stunden kontinuierlich mit 0,40 bis Ö|55 Volumenprozent Methanol versetzt. Man erhält schließlich L-GlUtaminsäure in einer Konzentration von 32,8 mg/ml in der Gärmalsche. Der Gesamtverbrauch von Methanol während der Gärung beträgt 21,7 Volumenprozent. Zur Abtrennung der Zöllen werden 3 Liter des Nährmediums zentrifugiert. Das Filträt wird konzentriert und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,2 eingestellt* Man erhält nach dem Kristallisieren 75,3 g L-Glutamirisäurei

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird der Stamm Protaminobacter thiaminophägüs K-224 ATCC 21969 verwendet. Die Züchtung der ersten, zweiten und dritten Vorkultur sowie die Hauptgärung erfolgen gemäß Beispiel 2, mit der Ausnahme, daß das Nährmediüm anstelle von 10 g PoIypepton 0,4 g L-Phenylalanin enthält. Man erhält nach erfolgter Gärung L-Glutaminsäure in einet Konzehttatiön von 22VÖ mtj/ml in der Gärmaische. Der Gesamtverbtäüch an Methanol während der Gärung beträgt 16,7 Voiumenptozehti

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Glutaminsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man eine aus einem Methanol verwertenden und L-Glutaminsäure produzierenden Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas oder Protaminobacter hergestellte Mutante, die mindestens eine Eigenschaft auf v/ei st, nämlich

a) Bedarf an L-Methionin,

b) Bedarf an L-Isoleucin, .

c) Bedarf an L-Phenylalanin oder

d) Resistenz gegenüber DL-Lysinhydroxamat,

in einem Methanol als wesentliche Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium züchtet und aus der Gärmaische die entstandene L-Glutaminsäure isoliert*

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit einer Mutante durchführt, die aus der Art Pseudomonas insueta erhalten worden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit einer Mutante durchführt, die aus der Art Pseudomonas methanolica erhalten worden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit einer Mutante durchführt, die aus der Art Protaminobacter thiaminophagus erhalten worden ist.

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5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit Mutanten durchführt, die aus den Arten Pseudomonas insueta ATCC 21276, Pseudoraonas methanolica ATCC 21704 oder Protaminobacter thiaminophagus ATCC 21371 erhalten worden sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit Pseudomonas insueta K-015 ATCC 21966, Pseudomonas insueta K~038 ATCC 21967, Pseudomonas methanolica LHX-8 ATCC 21968 oder Protaminobacter thiaminophagus K-224 ATCC 21969 durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Methanolkonzentration von höchstens 3 Volumprozent durchführt.

8. Pseudomonas insueta K-015 ATCC 21966, Pseudomonas insueta K-038 ATCC 21967, Pseudomonas methanolica LHX-8 ATCC 21968 oder Protaminobacter thiaminophagus K-224 ATCC 21969 zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bis 7.

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