DE3442960A1

DE3442960A1 - Neue l-prolin produzierende mikroorganismen

Info

Publication number: DE3442960A1
Application number: DE19843442960
Authority: DE
Inventors: Gary Jim Elkridge Calton, Md.; Susan Ann Columbia Whitehead, Md.
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1983-12-02
Filing date: 1984-11-24
Publication date: 1985-10-31
Also published as: NL8402275A; JPS60120982A; GB2150559A; SE8405871D0; IT8423547A0; GB8429179D0; SE8405871L; IT1177172B; IT8423547A1; AU3096784A; FR2556009A1

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft neue L-Prolin produzierende Mikroorganismen.

Die fermentative Herstellung von L-Prolin (erfindungsgemäß als "Prolin" bezeichnet) und anderen Aminosäuren war Gegenstand umfangreicher Forschungsarbeiten. Den Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium und anderen angehörende Mikroorganismen benötigen zum Überleben eine bestimmte Menge an Prolin und produzieren ihr eigenes Prolin. Eine derartige Prolinproduktion ist nicht notwendigerweise abhängig von einem Prolinmangel in dem Medium, d.h., einige Mikroorganismen können immer bestimmte Mengen an Prolin produzieren. Es wird jedoch angenommen, daß die mikrobielle Produktion von Prolin zumindest teilweise von bestimmten Feedback-Mechanismen reguliert wird, so daß die Mikroorganismen gewöhnlich die Bildung von Prolin abbrechen oder reduzieren, wenn ihnen ausreichende Mengen zur Verfügung stehen.

Wenn ein Analoges von Prolin vorhanden ist, so erkennen die Mikroorganismen dieses im allgemeinen und verwenden es als Prolin, wobei auf diese Weise der Feedback-Mechanismus in der Richtung ausgelöst wird, daß die Prolinproduktion unterbrochen oder verlangsamt wird. In Abwesenheit von entweder aus der Umgebung stammenden oder intern gebildetem Prolin sterben die Mikroorganismen ab. Bestimmte Mutanten sind unempfindlich oder

resistent gegenüber Prolin und Prolinanaloge. Der Feedback-Mechanismus dieser Mutanten wird weder durch Prolin noch durch Prolinanaloge ausgelöst. Diese Mutanten produzieren demgemäß fortdauernd mehr Prolin als sie benötigen.

Die Patent- und technische Literatur enthält zahlreiche Veröffentlichungen, in denen Resistenz gegenüber Prolinanalogen als Mittel zum Selektionieren von Mikroorganismen beschrieben wird, die Prolin überproduzieren. Beispielsweise beschreibt die JA-PS 55-148096 ein Verfahren zur Herstellung von Prolin durch Kultivieren von Mikroorganismen, die den Gattungen Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium oder Microbacterium angehören und die resistent gegenüber Strukturanalogen des Prolins wie 3,4-Dehydroprolin, Hydroxyprolin, Azetidin-2-carbonsäure, Prolinhydroxamat und D-Prolin sind. Die US-PS
4 244 409 beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Prolin, bei dem Mutanten verwendet werden, die den Gattungen Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium angehören und die resistent gegenüber DL-3,4-Dehydroprolin sind. Gewöhnlich werden die gegenüber Prolinanalogen restistenten Mikroorganismen erhalten, indem man bekannte Prolinproduzenten oder bekannte Glutaminsäureproduzenten mit einem Mutagen behandelt und anschließend durch Screening solche Mutanten erhält, die in Gegenwart des Prolinanalogen Prolin produzieren.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß besondere Mikro-Organismen, die durch doppelte Resistenz gegenüber Prolinanalogen charakterisiert sind, für die Herstellung von Prolin in kommerziellen Mengen geeignet sind. Insbesondere wurde ein Stamm von Brevibacterium ammoniagenes identifiziert, der signifikant mehr Prolin produziert als entweder der nicht resistente Elternstamm oder

ein eine einfache Resistenz gegenüber Analogen aufweisender Zwischenstamm. Der neue Stamm ist sowohl gegenüber L-Azetidin-2-carbonsäure (ACA) als auch gegenüber 3,4-Dehydro-DL-prolin (DHP) resistent. Das durch Kultivieren von Mikroorganismen dieses neuen Stammes hergestellte Prolin kann ohne Schwierigkeiten nach Standardverfahren aus der Fermentationsbrühe abgetrennt werden.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, einen neuen Mikroorganismus zu schaffen, der zu gesteigerter Prolinproduktion in kommerziellen Mengen fähig ist.

Es ist ein weitere Aufgabe der Erfindung, einen Mikroorganismus zu schaffen, dessen genetische Struktur dahingehend verändert wurde, daß dem Mikroorganismus Resistenz gegenüber mehreren Prolinanalogen verliehen wurde.

Ferner ist es erfindungsgemäß vorgesehen, daß der neue Stamm in kommerziellen Standard-Fermentationsverfahren oder verbesserten Ausführungsformen derselben verwendbar ist.

Die Erfindung betrifft neue Mikroorganismenstämme, deren veränderte genetische Struktur Resistenz der Mikroorganismen gegenüber zwei Strukturanalogen des Prolins, nämlich ACA und DHP auslöst oder zuläßt. Folglich produzieren die Mikroorganismen, wenn sie unter aeroben Bedingungen angezogen werden, überschüssige Mengen von Prolin. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein neuer Stamm von einer Kultur von Brevibacterium ammoniagenes abgeleitet, welche von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC Nr. 13746 erhalten wurde.

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 13746 ist ein bekannter Glutaminsäureproduzent, der sich in einem vorangehenden Screening-Test als Produzent kleiner Prolinmengen (weniger als 1 mg/ml) erwiesen hatte. Es wurde angestrebt, durch Resistenz gegenüber mehreren Strukturanalogen des Prolins einen Mutantenstamm zu erhalten, der signifikant erhöhte Prolinspiegel lieferte. Im Laufe des Selektionsverfahrens wurde der Stamm ATCC 13746 der Einwirkung von ACA ausgesetzt und eine gegenüber ACA resisten- _lQ te Spontanmutante ausgewählt. Diese gegenüber ACA resistente Zwischenmutante wurde der Einwirkung von DHP ausgesetzt und eine Mutante mit der gewünschten Eigenschaft - nämlich mehrfacher Resistenz gegenüber Analogen - gefunden.

Eine Nähragarschrägkultur (im Handel erhältlich von Difco) von ATCC 13746 wurde mit sterilem entionisierten Wasser bespült. Eine Teilmenge der resultierenden Zellsuspension von 0,2 ml wurde auf einer Nähragarplatte (Difco) verteilt, die 10 mg/ml des Prolinanalogen ACA enthielt. Diese Platte wurde 3 Tage lang bei 30⁰C inkubiert. Aufgrund der Anwesenheit von ACA in dem Kulturmedium wurde das Wachstum von prototrophen Zellen des ATCC 13746 unterdrückt und nur ACA-resistente Mikroorganismen waren zum Wachstum fähig. Die größte der resistenten Einzelkolonien, die auf der ACA-Platte gewachsen waren, wurde auf eine frische Nähragarplatte (Difco) ohne ACA übertragen. Diese Platte wurde solange inkubiert, bis die ACA-resistenten Kolonien gewachsen waren, nämlich etwa 3 Tage.

Es zeigte sich, daß einer dieser ACA-resistenten Klone erhöhte Prolinspiegel bildete, wenn er in Prolin-Medium C angezogen wurde, das die folgenden Bestandteile aufwies:

— Q —

Bestandteile Menge

(je Liter entionisiertem Wasser)

Glukose 5 0,0 g

NH₄Cl 5,0 g

Harnstoff 5,0 g

KH₂PO₄ 0,5 g

K₂HPO₄ 0,5 g

MgSO₄ . 7 H₂O 0,5 g

FeSO₄ . 7 H₂O 0,02 g

MnSO₄ . 4 H₃O 0,02 g

ZnSO₄ . 7 H₂O 0,01 g

Biotin 100,0 ,ug
Thiamin-HCl 1,0 mg

Der pH-Wert des Mediums wurde mit Natriumhydroxid auf den Neutralwert von etwa 6,8 eingestellt und das Medium wurde 12 Minuten lang bei 112 C autoklaviert.

Der gegenüber ACA resistente Klon wurde in 50 ml Prolin-Medium C in einem 250 ml Erlenmeyer Kolben mit Schikanen 3 Tage lang bei 30⁰C und 300 UpM angezogen. Die Brühe wurde geerntet, bei 4000 UpM zentrifugiert und durch einen 0,22,um Milliporenfilter filtriert. Der Prolintiter wurde nach dem Technicon-Autoanalyzer- -II-Verfahren unter Verwendung der Isatin-Färbung bestimmt. Das Verfahren wurde durchgeführt, indem man 1 % Isatinfärbemittel in Isopropanol 1 Minute lang bei 80 C mit der Probe erhitzte und anschließend die Absorption bei 590 nm bestimmte. Es zeigte sich, daß der gegenüber ACA resistente Klon 8,5 mg/ml Prolin produzierte.

Diese ACA-resistente Zwischenmutante wurde auf ein Nähragarschragrohrchen (Difco) überimpft und 4 Tage lang bei 30⁰C inkubiert. Die Schrägkultur wurde mit 5,0 ml sterilem entionisierten Wasser bespült. Eine 0,2 ml Teilmenge der resultierenden Zellsuspension wurde auf einer Nahragarplatte (Difco) verteilt, die 2 mg/ml DHP enthielt. Diese Platte wurde 3 Tage lang bei 30⁰C inkubiert.

Eine der auf dieser Platte gewachsenen Kolonien - resistent sowohl gegenüber ACA als auch gegenüber DHP wurde auf eine frische Nahragarplatte (Difco) übertragen, die weder ACA noch DHP enthielt. Dieser Stamm wurde anschließend in Prolin-Medium C_1nS angezogen, das die folgenden Bestandteile aufwies:

Bestandteile

Menge

(je Liter entionisiertem Wasser)

Glukose	H₂O	100,0	g
NH₄Cl	H₂O	5,0	g
Harnstoff	H₂O	5,0	g
KH₂PO₄	H₂O	0,5	g
K₂HPO₄	Bacto-Soyton (Difco)	0,5	g
MgSO₄ . 7	Biotin	0,5	g
FeSO₄ . 7		0,02	g
MnSO₄ . 4	Thiamin-HCl	0,02	g
ZnSO₄ . 7	0,01	g
	0,3	g
	100,0	/^u
	1,0	mg

Der pH-Wert des Mediums wurde mit Natriumhydroxid auf den Neutralwert von etwa 6,8 eingestellt und das Medium wurde 12 Minuten lang bei 112°C autoklaviert.

Einer der gegenüber ACA-und DHP-resistenten Klone wurde 3 Tage lang in 50 ml Prolin-Medium C_1QS in einem 250 ml ErIenmeyerkolben mit Schikanen angezogen. Der Prolintiter wurde wie zuvor beschrieben nach dem Isatin-Farbtest bestimmt. Es zeigte sich, daß der Klon Prolin in einer Konzentration von 19,6 mg/ml produziert hatte.

Eine lyophilisierte Kultur des neu gezüchteten ACA und DHP resistenten Stammes von Brevibacterium ammoniagenes wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 30852 hinterlegt und der Öffentlichkeit ohne Beschränkungen zugänglich gemacht. Die Kultur erhielt die Bezeichnung ATCC Nr. 39101.

Alternativ wurde eine Fermentation durchgeführt, bei der ATCC 39101 zur Herstellung von Prolin unter Verwendung des folgenden Mediums eingesetzt wurde:

	Impfmedium	Menge
Bestandteile		5,0 g
Glukose		5,0 g
NaCl		10,0 g
Hefeextrakt		10,0 g
Pepton

Die Bestandteile wurden in entionisiertem Wasser vermischt und auf 1 Liter aufgefüllt, der pH wurde mit Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt und das Medium 15 Minuten lang bei 112°C autoklaviert.

Produktionsmedium Bestandteile

Harnstoff NH₄Cl
K₂HPO₄

MgSO₄ . 7 H₂O Sojaauszug (Sheffield Co.)

^FeS°4 · ^{7 H}2° MnSO₄ . H₂O ZnSO₄ . 7 H₂O Biotin

Thiamin-HCl

„^ CaCO, 50,0 g

j

Glukose

	g	Menge
5,0	g
5,0	g
1,0	g
0,5	g
1,0	ml²
1,0	ml³
2,0	ml⁴
1,0	ml⁵
1,0	ml⁶
1,0

1. Die Zugabe von Glukose sollte berücksichtigt werden, 20 wenn das Gesamtvolumen an entionisiertem Wasser

bestimmt wird.

2. Stammlösung: 20,0 g/l FeSO₄ . 7 H₃O

3. Stammlösung: 6,1 g/l MnSO₄ . H₃O

4. Stammlösung: 10,0 g/l ZnSO₄ . 7 H₃O 5. Stammlösung: 0,1 g/l Biotin

6. Stammlösung: 1,0 g/l Thiamin-HCl

7. Stammlösung: 70 % Glukose, 15 Minuten lang bei 110⁰C autoklaviert. Vor dem Beimpfen werden 7,0 ml/Kolben zugegeben.

Die ersten 10 Bestandteile wurden in entionisiertem Wasser vermischt und auf 1 Liter aufgefüllt, der pH-Wert mit Schwefelsäure auf 6,8 eingestellt und das CaCO., zugegeben.

Das Medium wurde 15 Minuten lang bei 121 C autoklaviert. 5

Ein 250 ml Kolben mit Schikanen, der 50 ml Impf medium enthielt, wurde mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101 beimpft und bei 31⁰C und 300 UpM 24 Stunden lang inkubiert. Etwa 5,0 ml der in der log-Phase befindlichen Kultur (O.D.g₄₀ = 3,0) wurde beschallt, um Zellklumpen aufzulösen. Die beschallte Zellsuspension wurde mit steriler 0,9 %iger NaCl verdünnt und auf Nähragar (Difco) ausgestrichen, um Einzelkolonien zu erhalten. Die Platten wurden 72 Stunden lang bei 30o_, . , , . ,

_l,- ³C mkubiert.

Eine Einzelkolonie von diesen Platten wurde in einen 250 ml Kolben mit Schikanen überimpft, der 50 ml Impfmedium enthielt, und 16 Stunden lang bei 31⁰C und 300 UpM inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt befand sich die Impfkultur hinsichtlich ihres Wachstums in der frühen log-Phase (O.D._fi4n = 1,7). Die Impfkultür wurde verwendet, um 250 ml Kolben mit Schikanen, die 50 ml Produktionsmedium enthielten, bis zu einer Ausgangs-O.D.₆₄q von 0,05 zu beimpfen. Jedem Kolben wurden 50,ul 25,0 %iger Pluronic 61 (BASF Wyandotte) als Entschäumer zugegeben. Die Produktionskolben wurden bei 31⁰C und 300 UpM inkubiert.

Die HPLC-Analyse einer nach 48 Stunden geernteten Probe der Brühe, zeigte eine Prolxnkonzentratxon von 15,8 g/l.

Die Mikroorganismen dieses Stammes können zur Herstellung von Prolin nach jeglichem herkömmlichen aeroben Kultivierungs- oder Fermentationsverfahren verwendet werden. Die Fermentation wird gewöhnlich bei 20 bis 45°C, vorzugsweise 28 bis 35 C und bei einem pH-Wert von 5 bis 9 durchgeführt. Calciumcarbonat und Ammoniumhydroxid können zum Einstellen des pH-Wertes des Mediums verwendet werden.

Das Kulturmedium kann jegliches Fermentationsmedium sein, das eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Salze und, falls erwünscht, andere weniger wichtige organische Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquelle können fermentierbare Zucker, Proteinhydrolysate und Proteine verwendet werden. Als Stickstoffquelle kommen Harnstoff, Ammoniumsalze organischer Säuren (beispielsweise Ammoniumacetat oder Ammoniumoxalat) und Ammoniumsalze anorganischer Säuren (beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumchlorid) in Betracht. Die Kohlenstoff- und Stickstoff quellen liegen in dem Medium in Mengen von 0,001 bis 20 Gew./Vol% vor. Anorganische Bestandteile (beispielsweise Kaliumphosphat oder Magnesiumphosphat) und/oder Vitamine (beispielsweise Thiamin) können ebenfalls zugegeben werden.

Für die Kultivierung von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101 ist Biotin, ein Vitamin B Komplex, ein erforderlicher Nährstoff. Die Konzentration von Biotin in dem Kulturmedium kann von etwa 50 bis etwa 500 ,ug/1 betragen. Bei Konzentrationen unterhalb dieses Bereiches neigen die Mikroorganismen zur Produktion von Glutaminsäure, die eine unerwünschte Verunreinigung bildet, wenn Prolin als Aminosäure hergestellt werden soll.

Die Zugabe anderer organischer Nährstoffe zu dem Kulturmedium kann erwünscht sein. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen werden als bradytroph betrachtet, d.h. als ein langsam wachsender Mikroorganismus, der bei Anzucht auf komplexen Nährstoffen besser gedeiht als auf einem Minimalmedium. Beispielsweise können organische Nährstoffe (z.B. Maisquellwasser, Peptone, Protexnhydrolysate oder Hefeextrakte) , anorganische Bestandteile (beispielsweise Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat) und/oder Vitamine (beispielsweise Thiamin) zugegeben werden.

Das bevorzugte Kulturmedium für Mikroorganismen dieses Typs sollte organische Nährstoffe einschließen. Einer der bevorzugten organischen Nährstoffe für Kolbenfermentation ist Bacto-Soyton (Difco), ein enzymatisches Hydrolysat von Sojabohnenmehl·, das in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 0,5, vorzugsweise etwa 0,3 g/l· Kulturmedium verwendet wird. Aiternativ können Hefeextrakte, Maisquell·- wasser oder Peptone aus anderen Queren verwendet werden. Ferner ist das Vitamin Thiamin ein bevorzugter Nährstoff.

Die Fermentation wird innerhaib 16 bis 176 Stunden, in Koiben gewöhnten über 72 Stunden, durchgeführt, wobei während dieser Zeit Proiin in der Fermentationsbrühe angereichert wird. Ze^en und andere feste Bestandteiie der Ku^ur können mit herkömmiiehen Verfahren wie Fiitration oder Zentrifugation aus der Brühe entfernt werden.

Bei der Gewinnung und/oder Reinigung des Prolins aus dem Filtrat oder der überstehenden F^ssigkeit können bekannte Verfahren verwendet werden. Beispieisweise kann die fiitrierte Fermentationsbrühe mit einem Ionenaustauscherharz behandeit werden. Das Pro^n kann aus der resultierenden Lösung kristalMsiert werden.
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Claims

UEXKÜLL & ST9.LBSRG PATENTANWÄLTE BESELERSTRASSE 4 D-2000 HAMBURG 52 EUROPEAN PATENT ATTORNEYS DR. J.-D. FRHR. von UEXKÜLL DR. ULRICH GRAF STOLBERG DIPL.-ING. JÜRGEN SUCHANTKE DIPL.-ING. ARNULF HUBER DR. ALLARD von KAMEKE W.R. Grace & Co. 1114 Avenue of the Americas New York, N.Y. 10036 V.St.A. (Prio.: 2. Dez. 1983 US 557 537 - 21077/UGS/IV/wo) November 1984 Neue L-Prolin produzierende Mikroorganismen Patentansprüche

1. Verbesserter Stamm eines L-Prolin produzierenden Mikroorganismus, gekennzeichnet durch Resistenz gegenüber mehreren Prolinanalogen und die Fähigkeit zur Überproduktion von L-Prolin.

2. Verbesserter Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus gegenüber zwei oder mehreren Prolinanalogen ausgewählt aus der Gruppe 3,4-Dehydro-DL-Prolin, Azetidin-2-carbonsäure, Prolinhydroxamat und D-Prolin resistent ist.

3. Verbesserter Stamm nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Stamm von Brevibacterium ammoniagenes und restistent gegenüber 3,4-Dehydro-DL-prolin und L-Azetidin-2-carbonsäure

c ist.

4. Verbesserter Stamm nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101 ist.

5. Verbesserter Stamm nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Nährmedium verwertet, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen in Mengen von etwa 0,001 bis etwa 20,0 Gew./Vol.% enthält.

6. Verbesserter Stamm nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium etwa 50 bis etwa 500/ug/1 Biotin enthält.

7. Verbesserter Stamm nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium mindestens einen komplexen Nährstoff ausgewählt aus der Gruppe Peptone, Proteinhydrolysate, Hefeextrakte und Maisquellwasser enthält.

8. Verfahren zum Gewinnen von Mikroorganismen, die zur

gesteigerten Produktion von L-Prolin fähig sind, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) L-Prolin produzierende Mikroorganismen einem ersten Prolinanalogen aussetzt,

(b) die gegenüber dem ersten Prolinanalogen restistenten Kolonien anzieht, die die Behandlung gemäß

Stufe a überlebt haben,

(c) die gegenüber dem ersten Prolinanalogen resistenten Kolonien einem zweiten Prolinanalogen aussetzt und

(d) die gegenüber dem ersten und zweiten Prolinanalogen resistenten Kolonien anzieht, die die Behandlung gemäß Stufe c überlebt haben.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das erste Prolinanaloge und das zweite Prolinanaloge aus der Gruppe 3,4-Dehydro-DL-prolin, Azetidin-2-carbonsäure, Prolinhydroxamat und D-Prolin auswählt und man als erstes Prolinanaloges und als zweites Prolinanaloges nicht das gleiche Prolinanaloge wählt.

10. Verfahren zur Herstellung von L-Prolin, dadurch gekennzeichnet daß man

(a) einen L-Prolin produzierenden Mikroorganismenstamm auswählt, der resistent gegenüber mehreren Prolinanalogen ist,

(b) den Stamm in einem Kulturmedium kultiviert oder _,. fermentiert, das eine Kohlenstoffquelle und eine

Stickstoffquelle enthält und

(c) L-Prolin aus dem Kulturmedium gewinnt.

__n

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Prolin produzierenden Mikroorganismenstamm einen Stamm von Brevibacterium ammoniagenes verwendet, der resistent gegenüber zwei verschiedenen Prolinanalogen, ausgewählt aus der Gruppe 3,4-Dehydro-DL-prolin, L-Azetidin-2-carbonsäure, Prolinhydroxamat und D-Prolin ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das mindestens einen komplexen Nährstoff ausgewählt aus der Gruppe Peptone, Proteinhydrolysate, Hefeextrakte und Maisquellwasser enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als L-Prolin bildenden Mikroorganismenstamm Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101 verwendet.

14. Verwendung der nach den Ansprüchen 8 bis 12 hergestellten Mikroorganismenstämme zur Herstellung von L-Prolin.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismenstamm Brevibacterium ammoniagenes ATCC 39101 ist.