DE60113323T2

DE60113323T2 - Verfahren für die Herstellung von L-Phenylalanin

Info

Publication number: DE60113323T2
Application number: DE60113323T
Authority: DE
Inventors: Yurgis Antanas Vladovich Iomantas; Elena Georgievna Abalakina
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-03-03
Filing date: 2001-02-13
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2021-02-14
Also published as: US20010044139A1; US6350596B2; BR0100816A; RU2202607C2; EP1134283A1; CN1317568A; DE60113323D1; KR20010086590A; JP2001245658A; EP1134283B1; CN1162538C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, insbesondere ein Bakterium der Gattung Methylophilus mit der Fähigkeit, L-Phenylalanin zu produzieren und ein Verfahren zum Herstellen von L-Phenylalanin unter Verwendung einer Bakteriums der Gattung Methylophilus.
Als Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung eines Mikroorganismus durch Fermentation sind solche, die rekombinante Bakterien der Gattung Escherichia verwenden (offengelegte japanische Patentanmeldungen Nr. 56-1890, 57-170184, 58-103398, 61-92565 und 1-104160 und Internationale Patentanmeldung Nr. WO 87/00202) bekannt. Als Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin oder L-Tyrosin ist eines unter Verwendung einer Mutante der Gattung Corynebacterium (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 61-128897) und solche unter Verwendung rekombinanter Bakterien der Gattung Corynebacterium bekannt (offengelegte japanische Patentanmeldungen Nr. 60-34197, 60-24192, 61-260892, und 61-124375).
US 4,824,786 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Phenylalanin produzierenden Bakteriums, welches einen methylotrophen Organismus, chemische Mutagenese mit N-Nitrosoguanidin und die Selektion auf Resistenz gegen 5-Fluorphenylalanin umfasst.
Die Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung eines Bakteriums der Gattung Methylophilus, das gegen L-Phenylalanin und ein Analogon davon resistent ist, ist jedoch nicht bekannt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Bakterium mit der Fähigkeit zur Herstellung von L-Phenylalanin und ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung des Bakteriums bereitzustellen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass ein Bakterium der Gattung Methylophilus, das gegenüber einem Phenylalaninanalogon resistent ist, eine hohe Fähigkeit zur Produktion von L-Phenylalanin hat.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Bakterium der Gattung Methylophilus bereit, das die Fähigkeit zur Produktion von L-Phenylalanin hat und gegen ein Phenylalaninanalogon und L-Phenylalanin resistent ist (im folgenden auch als "erfindungsgemäßes Bakterium" bezeichnet).
Das erfindungsgemäße Bakterium ist vorzugsweise gegen DL-p-Fluorphenylalanin resistent.
Das erfindungsgemäße Bakterium ist durch Selektieren eines Stammes, der gegen das Phenylalaninanalogon und L-Phenylalanin resistent ist, unter Bakterien der Gattung Methylophilus erhältlich, wobei die Selektion mindestens einmal für jedes Phenylalaninanalogon und L-Phenylalanin in dieser Reihenfolge durchgeführt wird.
Das erfindungsgemäße Bakterium ist stärker bevorzugt gegen DL-p-Fluorphenylalanin und m-Fluorphenylalanin sowie gegen L-Phenylalanin resistent.
Das erfindungsgemäße Bakterium ist stärker bevorzugt durch Selektieren eines Stammes, der gegen DL-p-Fluorphenylalanin, m-Fluorphenylalanin und L-Phenylalanin resistent ist, unter Bakterien der Gattung Methylophilus erhältlich, wobei die Selektion mindestens einmal für DL-p-Fluorphenylalanin, m-Fluorphenylalanin und L-Phenylalanin in beliebiger Reihenfolge durchgeführt wird.
Das erfindungsgemäße Bakterium ist vorzugsweise gegen DL-p-Fluorphenylalanin, m-Fluorphenylalanin und Zimtsäure sowie gegen L-Phenylalanin resistent.
Das erfindungsgemäße Bakterium ist stärker bevorzugt durch Selektieren eines Stammes, der gegen DL-p-Fluorphenylalanin, m-Fluorphenylalanin, Zimtsäure und L-Phenylalanin resistent ist, unter Bakterien der Gattung Methylophilus erhältlich, wobei die Selektion mindestens einmal jeweils für DL-p-Fluorphenylalanin, m-Fluorphenylalanin, Zimtsäure und L-Phenylalanin in beliebiger Reihenfolge durchgeführt wird.
Das erfindungsgemäße Bakterium ist vorzugsweise Methylophilus methylotrophus.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin bereit, welches die folgenden Stufen umfasst:
Kultivieren des erfindungsgemäßen Bakteriums in einem Kulturmedium zur Herstellung und Anhäufung von L-Phenylalanin in einer Kultur, und
Gewinnen von L-Phenylalanin aus der Kultur (im Folgenden auch als "erfindungsgemäßes Verfahren" bezeichnet).
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
<1> Erfindungsgemäßes Bakterium
Das erfindungsgemäße Bakterium ist ein Bakterium der Gattung Methylophilus, das die Fähigkeit zur Produktion von L-Phenylalanin hat und gegen 0,05 M L-Phenylalanin und gegen ein Phenylalaninanalogon resistent ist, wobei das Analogon mindestens eines ist, das unter 2 mg/ml DL-p- Fluorphenylalanin, 0,5 g/l m-Fluorphenylalanin und 60 mg/l Zimtsäure ausgewählt ist.
Das Bakterium der Gattung Methylophilus umfasst Methylophilus methylotrophus.
Die Fähigkeit zur Produktion von L-Phenylalanin bedeutet die Fähigkeit, signifikante Mengen an L-Phenylalanin in einem Medium anzuhäufen, wenn das Bakterium in dem Medium kultiviert wird. Üblicherweise bedeutet dies die Fähigkeit, nicht weniger als 0,5 g/l L-Phenylalanin unter den in den nachstehend beschriebenen Beispielen genannten Bedingungen anzuhäufen.
Beispiele des Phenylalaninanalogons sind DL-p-Fluorophenylalanin, m-Fluorphenylalanin, β-Amino-β-Phenylpropionsäure, o-Fluorphenylalanin, β-2-Thienylalanin, β-3-Thienylalanin, β-2-Furylalanin, β-3-Furylalanin, o-Aminophenylalanin, p-Aminophenylalanin, m-Aminophenylalanin, α-Amino-β-phenylethansulfonat, β-2-Pyrrolalanin, 1-Cyclopenten-1-alanin, 1-Cyclohexen-1-alanin, β-4-Pyridylalanin, β-4-Pyrazolylalanin, p-Nitro-phenylalanin, Cyclohexylalanin, o-Chlorphenylalanin, m-Chlorphenylalanin, p-Chlorphenylalanin, o-Bromphenylalanin, m-Bromphenylalanin, p-Bromphenylalanin, β-4-Thiazolealanin und dergleichen.
Resistent zu sein gegen ein Phenylalaninanalogon bedeutet, dass das Bakterium in Anwesenheit des Phenylalaninanalogons in der Menge, bei der der Wildtypstamm (beispielsweise der Stamm AS-1) nicht wachsen kann, wachsen kann. Die Menge variiert in Abhängigkeit von der Art des Phenylalaninanalogons. Im Fall von DL-p-Fluorphenylalanin ist die Menge üblicherweise 2 g/l unter den in den nachstehend genannten Beispielen erwähnten Bedingungen, und im Fall von m-Fluorphenylalanin ist die Menge üblicherweise 1 g/l unter den in den nachstehenden Beispielen genannten Bedingungen.
Es ist bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Bakterium gegen mindestens zwei Arten des Phenylalaninanalogons resistent ist. Beispielsweise ist es bevorzugt, dass es DL-p-fluorphenylalanin- und m-fluorphenylalaninresistent ist.
Resistent zu sein gegen L-Phenylalanin bedeutet, dass das Bakterium in Anwesenheit von L-Phenylalanin in einer Menge, bei der Wildtypstamm (beispielsweise der Stamm AS-1) nicht wachsen kann, wachssen kann. Die Menge ist üblicherweise 8 g/l unter den in den nachstehenden Beispielen genannten Bedingungen.
Das erfindungsgemäße Bakterium ist vorzugsweise gegen eine höhere Konzentration (beispielsweise 0,1 M) an L-Phenylalanin resistent.
Das erfindungsgemäße Bakterium kann durch aufeinanderfolgendes Übertragen der erforderlichen Resistenzen auf ein Bakterium der Gattung Methylophilus erhalten werden. Die Reihenfolge der Übertragung der Phenylalaninanalogonresistenz und der L-Phenylalaninresistenz ist nicht eingeschränkt, so dass die Übertragung in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden kann.
Das Verfahren zum Erhalten eines Bakteriums der Gattung Methylophilus, das gegenüber dem Phenylalaninanalogon resistent ist, und eines Bakteriums der Gattung Methylophilus, das gegen L-Phenylalanin resistent ist, wird im Folgenden beschrieben.
Das Bakterium der Gattung Methylophilus, das gegen ein Phenylalaninanalogon resistent ist, kann durch Kultivieren von Bakterium der Gattung Methylophilus in einem minimalen Medium, welches das Phenylalaninanalogon bei der wachstumshemmenden Konzentration enthält, und Selektieren eines wachsenden Stammes erhalten werden.
Die Selektion des phenylalaninanalogonresistenten Stammes kann mit einer Art des Phenylalaninanalogons oder mit mehreren Arten der Phenylalaninanaloga durchgeführt werden. Die Selektion des Stammes kann einmal oder mehrere Male für eine Art des Phenylalaninanalogons durchgeführt werden.
Die Menge des Phenylalaninanalogons, die dem Medium zugegeben werden soll, hängt von der Art des Phenylalaninanalogons ab, sie ist jedoch vorzugsweise nicht weniger als 2 g/l im Fall von DL-p-Fluorphenylalanin. Die Bakterien der Gattung Methylophilus können vor der Selektion einer Mutationsbehandlung unterworfen werden. Die Mutation kann durch UV-Bestrahlung oder durch Behandlung mit einem Mutagen, das üblicherweise für die künstliche Mutagenese eingesetzt wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder salpetrige Säure und dergleichen, durchgeführt werden.
Die Bakterien der Gattung Methylophilus, die gegen L-Phenylalanin resistent sind, können durch Kultivieren von Bakterien der Gattung Methylophilus in einem minimalen Medium, das L-Phenylalanin in einer Konzentration enthält, die Wachstumsinhibition verursacht, und Selektieren eines wachsenden Stammes erhalten werden. Die hier genannte Wachstumshemmung bezieht sich auf langsames Wachstum oder anhaltendes Wachstum. Die Selektion des Stammes kann einmal oder mehrmals durchgeführt werden. Die Konzentration von L-Phenylalanin in dem Medium ist nicht besonders eingeschränkt, sie ist jedoch beispielsweise nicht weniger als 0,05 M, vorzugsweise 0.1 M. Die Bakterien der Gattung Methylophilus können vor der Selektion auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben einer Mutationsbehandlung unterworfen werden.
Das Bakterium der Gattung Methylophilus, das gegen L-Phenylalanin resistent ist und wie vorstehend beschrieben erhalten wird, kann in Anwesenheit von L-Phenylalanin in einer Konzentration, bei der der Ausgangsstamm nicht wachsen kann, wachsen.
Das erfindungsgemäße Bakterium ist vorzugsweise gegen Zimtsäure resistent.
Resistent zu sein gegen Zimtsäure bedeutet dass das Bakterium in Anwesenheit von Zimtsäure in einer Menge, bei der Wildtypstamm (beispielsweise der Stamm AS-1) nicht wachsen kann, wachsen kann. Die Menge ist üblicherweise 50 mg/l unter den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Bedingungen.
Die Bakterien der Gattung Methylophilus, die gegen Zimtsäure resistent sind, können auf ähnliche Weise wie die phenylalaninanalogonresistenten Bakterien erhalten werden. Die Reihenfolge der Verleihung der Zimtsäureresistent Phenylalaninanalogonresistenz und L-Phenylalaninresistenz ist nicht eingeschränkt und kann in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden.
L-Phenylalanin ist an mehreren Regulationsstufen des L-Phenylalanin-Biosyntheseweges bekannt. Deshalb kann eine einzelne Mutation, welche L-Phenylalaninresistenz verursacht, für die Verbesserung der L-Phenylalaninproduktivität wirksam sein. Es ist jedoch bevorzugt, dass durch Doppelmutationen oder Mehrfachmutationen mehrere Regulationen ausgeschaltet werden. Ein Bakterium der Gattung Methylophilus, das eine einzelne Mutation hat, kann als Ausgangsstamm für die Züchtung eines L-Phenylalanin produzierenden Stammes eingesetzt werden, selbst wenn seine Produktivität an L-Phenylalanin gering ist.
Das erfindungsgemäße Bakterium kann bezüglich der Aktivität eines oder mehrerer Enzyme des L-Phenylalanin-Biosyntheseweges durch übliche Mutationsbehandlung oder gentechnologische Verfahren verstärkt werden.
Beispielsweise kann die L-Phenylalanin-Biosynthese durch Erhöhen der Fähigkeit zur Produktion von Phosphoenolpyruvat in einem Bakterium der Gattung Methylophilus verstärkt werden (Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 97/08333).
Die L-Phenylalaninproduktivität wird durch Verstärken eines unempfindlich gemachten Chorismat-Mutase-Prephenatdehydratasegens (Offengelgte japanische Patentanmeldungen Nr. 5-236947 und 62-130693) und/oder eines unempfindlich gemachten 3-Deoxy-D-arabinohepturosonsäure-7-phosphatsynthasegens (offengelegte japanische Patentanmeldungen Nr. 5-236947 und 61-124375) verbessert.
<2> Erfindungsgemäßes Verfahren
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, welches das Kultivieren des erfindungsgemäßen Bakteriums in einem Kulturmedium, um L-Phenylalanin in einer Kultur herzustellen und anzuhäufen, und das Gewinnen von L-Phenylalanin aus der Kultur umfasst.
Die Kultivierung des erfindungsgemäßen Bakteriums kann durch das Verfahren durchgeführt werden, das üblicherweise für die Kultivierung von Methanol assimilierenden Mikroorganismen eingesetzt wird.
Das in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Kulturmedium kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium sein, solange das Medium eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralnährstoffe und, falls erforderlich, andere organische Mikronährstoffe enthält.
Wenn Methanol als Hauptkohlenstoffquelle eingesetzt wird, kann L-Phenylalanin kostengünstig hergestellt werden. Methanol wird üblicherweise zu dem Kulturmedium in einer Menge von 0,001 bis 30 Gew.-% gegeben, wenn es als Hauptkohlenstoffquelle eingesetzt wird. Als Stickstoffquelle kann Ammoniumsulfat durch Zugeben zu dem Kulturmedium eingesetzt werden. Zusätzlich dazu kann eine kleine Menge von Mineralnährstoffen, wie Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumphosphat, Eisensulfat und Mangansulfat, eingesetzt werden.
Die Kultivierung wird üblicherweise unter aeroben Bedingungen, wie mit einer Schüttelkultur und einer Belüftungs- und Rührkultur, bei pH 5 bis 9 und einer Temperatur von 20 bis 40°C durchgeführt. Sie ist üblicherweise nach 24 bis 120 Stunden vollständig abgelaufen.
Die Kultur umfasst Zellen und das Kulturmedium und ist vorzugsweise das Kulturmedium.
Die Gewinnung von L-Phenylalanin aus der Kultur kann gemäß einer Kombination von bekannten Verfahren, wie Ionenaustauscherharzverfahren und Fällungsverfahren durchgeführt werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird anhand der Beispiele eingehend beschrieben. Verfahren zur Kultivierung von Methylophilus methylotrophus und für die Analyse von L-Phenylalanin, die in den folgenden Beispielen eingesetzt wurden, sind die folgenden:
<1> Kultivieren in Röhrchen
1. Impfkultur
Der Stamm wurde auf Platten oder Schrägkulturröhrchen mit 121(Fe2)-Mediumagar, der 1% Methanol enthielt, bei 30°C während 48–72 Stunden gezüchtet. Dann wurde der Stamm in 5 ml 121(Fe2)-Medium, das 2% Methanol enthielt, geimpft und als Impfmedium in Tuben mit einer Kapazität von 40 ml eingesetzt. Die Impfkultur wurde auf einem Rotationsschüttler bei 37°C während 18 Stunden inkubiert.
2. Fermentation in Röhrchen
Die Kultivierung des L-Phenylalaninproduzenten wurde bei 37°C in 5 ml 121(Fe2)-Medium, das 2% Methanol und 3% Calciumcarbonat enthielt, in Röhrchen mit einer Kapazität von 40 ml durchgeführt. 24 Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde eine weitere Portion von 2%-igem Methanol zugegeben und die Kultivierung wurde weitere 48 Stunden bei 37°C auf einem Rotationsschüttler fortgesetzt.

Die Zusammensetzung des 121(Fe2)-Mediums, das 2% Methanol und 3% Calciumcarbonat enthielt, war wie folgt (1 Liter):

K₂HPO₄·3H₂O	1,57 g
KH₂PO₄	0,62 g
(NH₄)2SO₄	3 g
NaCl	0,1 g
MgSO₄·7H₂O	0,2 g
CaCl₂	0,025 g
EDTA-Na₂	5 mg
FeSO₄·7H₂O	3 mg
MnSO₄·5H₂O	0,01 mg
ZnSO₄·7H₂O	0,07 mg
Na₂MoO₄·2H₂O	0,01 mg
H₃BO₃	0,01 mg
CoCl₂·6H₂O	0,005 mg
CuSO₄·5H₂O	0.005 mg
Methanol	20 ml (mit Filter sterilisiert)
CaCO₃	30 g
	pH 7.0

Ursprüngliches Volumen des Mediums in dem Fermentationsröhrchen: 5 ml.
Impfverhältnis: 10%
Temperatur: 37°C
Bewegung: 250 Umdrehungen pro Minute auf einem Schüttler.

<2> Analyse des L-Phenylalanins in der Fermentationsbrühe
1. Probenherstellung
Die Proben der Fermentationsbrühe wurden 15 Minuten in einer Modell 5415C-Mikrofuge (Eppendorf) zentrifugiert, um die Zellen und die Zellbruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde für eine Hochleistungsflüssigchromatograpie (HPLC)-Analyse eingesetzt.
2. Chromatographische Bestimmung des L-Phenylalanins
Das Chromatographiesystem bestand aus einer HPLC-Gruppe Modell 30 (Gilson) und einem Modell 2151-Monitor mit variabler Wellenlänge, der bei 245 nm betrieben wurde (LKB). Proben wurden unter Verwendung einer Modell 7410-Spritze mit 1 μl interner Probenschleife (Rhedyne) eingespritzt. Die Säule wurde mit einem im Labor hergestellten wasserummantelten Thermostat bei 45°C thermostatisiert.
Ein Glaspatronensystem mit Glaspatronen mit Innenmaßen von 150 mm × 3,9 mm, gepackt mit 5 μm Separon C18-Sorbent (Tessek), wurde für alle Trennungen eingesetzt. Das Elutionsmittel bestand aus 0,001 M CuSO₄ in Wasser/Acetonitril (80/20 (Vol./Vol.)).
Die Proben der Fermentationsbrühe wurden 5 Minuten bei 13.000 × g zentrifugiert und ohne weiter Behandlung eingespritzt.
Die Daten wurden unter Verwendung einer IBM PC/AT-kompatiblen Datenstation mit einem Modell 960-Interface und einer Nelson PC-Ingetratorsoftware (PE Nelson) verarbeitet. Die Peaks wurden unter Verwendung eines externen Standards berechnet.
Beispiel 1:
Konstruktion von mutierten Stämmen von Methylophilus methylotrophus, die L-Phenylalanin produzieren können
<1> Mutagenese und Selektion von Mutanten, die gegen DL-p-Fluorphenylalanin, einem aromatischen Aminosäureanalogon, resistent sind
Der Stamm Methylophilus methylotrophus AS-1 (NCIB 10515; ATCC 53528) wurde auf seine Empfindlichkeit gegen DL-p-Fluorphenylalanin, einem aromatischen Aminosäureanalogon, untersucht. Die Empfindlichkeit wurde auf einem 121(Fe2)-Agarmedium, das unterschiedliche Konzentrationen an DL-p-Fluorphenylalanin enthielt, untersucht. 10⁸ c.f.u./ml M. methylotrophus wurden platiert und drei Tage bei 30°C gezüchtet. 1 mg/ml DL-p-Fluorphenylalanin inhibierte das Wachstum des Bakterienrasens vollständig. Um analogonresistente Mutanten zu selektieren wurden 10⁸ Bakterien des Stammes M. methylotrophus auf Platten, die 2 mg/ml DL-p-Fluorphenylalanin enthielten, geimpft. Mehrere Kristalle von N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (im folgenden als NG abgekürzt) wurden in die Mitte der Platte gegeben. Nah 4 bis 5 Tagen bei 30°C wurden die Platten analysiert. Die Bakterien zeigten kein Wachstum in der Nähe des NG-Mutagens, jedoch wuchsen analogonresistente mutierte Kolonien in einem Abstand von 3–4 Zentimeter davon. Die großen Kolonien wurden aufgenommen und auf demselben Medium mit dem Analogon DL-p-Fluorphenylalanin gereinigt. Die DL-p-Fluorphenylalanin-resistenten Mutanten von M. methylo trophus (im folgenden als pFp^R abgekürzt) wurden kultiviert, und die Konzentration an L-Phenylalanin in dem Fermentationsmedium wurde wie vorstehend beschrieben gemessen. Die beste Mutante von M. methylotrophus pFp^R, Nr. 272, produzierte 30 mg/L an L-Phenylalanin, etwa 1 g/L Valin und 0,2 g/L L-Leucin, L-Isoleucin und L-Alanin. Die Dünnschichtchromatographie bestätigte die Ergebnisse der HPLC-Analyse.
<2> Mutagenese und Selektion von Mutanten von Methylophilus methylotrophus, die gegen hohe Konzentrationen von L-Phenylalanin in dem Wachstumsmedium resistent sind.
Die gegen DL-p-Fluorphenylalanin resistenten Mutanten von Methylophilus methylotrophus produzierten L-Phenylalanin, sie waren jedoch gegen hohe Konzentration an L-Phenylalanin empfindlich, wenn diese in dem Medium vorhanden waren. 0,1 M L-Phenylalanin hemmte das Wachstum von M. methylotrophus pFp^R Mr. 227 vollständig, wenn es in das agarisierte 121-Medium gegeben wurde.
Um diese Empfindlichkeit auszuschalten und die Produktivität der Stämme zu erhöhen, wurden die Mutanten, die gegen eine höhere Konzentration an L-Phenylalanin im Wachstumsmedium resistent waren, selektiert. Als Ausgangsstamm für die Selektion der L-phenylalanin-resistenten Mutanten (im Folgenden als phe^R abgekürzt) wurde M. methylotrophus Nr. 227 (pFp^R-Mutantenstamm), der eine geringe Menge (30 mg/l) L-Phenylalanin produziert, eingesetzt. Das Selektionsmedium war das 121(Fe2)-Agarmedium mit 1% Methanol und 0,05 M L-Phenylalanin. Die Mutagenese durch NG wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die L-phenylalaninresistenten Mutantenkolonien wurden auf demselben Medium und später auf einem Medium ohne 0,05 M L-Phenylalanin mehrmals gereinigt. Der phe^R-Marker in Mutanten wurde stabil und ging ohne Selektionsdruck nicht verloren.
Die selektierten phe^R-Mutanten von M. methylotrophus pFp^R wurden kultiviert, und die Konzentration von L-Phenylalanin in dem Fermentationsmedium wurde wie vorstehend beschrieben gemessen. Die beste phe^R-Mutante von M. methylotrophus pFp^R, Nr. 227-16, welche die Mutation der Resistenz gegen hohe L-Phenylalaninkonzentrationen trug, produzierte 0,4 g/l L-Phenylalanin. Somit erhöhte die phe^R-Mutation als die zweite Mutation in der M. methylotrophus pFp^R phe^R-Mutante Nr. 227-16 die L-Phenylalaninproduktion um mehr als das 10-fache. Die pFp^R-Mutante (Nr. 22) produzierte 30 mg/l L-Phenylalanin, und die Doppelmutante pFp^R phe^R (Nr. 227-16) produzierte 400 mg/l L-Phenylalanin.
Es wurde gefunden, dass der Methylophilus methylotrophus pFp^R phe^R-Mutantenstamm Nr. 227-16 auch gegen 0,5 g/l Metafluorphenylalanin neben der Resistenz gegen 2 g/l DL-p-Fluorphenylalanin und 0,05 M L-Phenylalanin resistent war. Der Stamm Nr. 227-16 zeigte jedoch nur geringes Wachstum auf 1 g/l Meta-Fluorphenylalanin. Die neuen Mutanten, die gegen 1 g/L Meta-Fluorphenylalanin resistent waren (im Folgenden als mFp^R abgekürzt), wurden aus dem Stamm Nr. 227-16 nach NG-Mutagenese wie vorstehend beschrieben isoliert. Der erhaltene M. methylotrophus pFp^R phe^R pFp^R-Mutantenstamm Nr. 227-16-10 produzierte dieselbe Menge an L-Phenylalanin wie sein Vorläufer (0,4 g/l).
Ein neuer M. methylotrophus pFp^R phe^R mFp^R phe^RR-Mutantenstamm Nr. 227-16-10-11, der gegen höhere Konzentratioen an L-Phenylalanin (0,1 M) (im Folgenden als phe^RR abgekürzt) resistent war, wurde aus dem Stamm Nr. 227-16-10 nach NG-Mutagenese wie vorstehend beschrieben isoliert. Der phe^RR-Mutantenstamm produzierte in Röhrchen 0,5–0,7 g/l L-Phenylalanin, 0,3 g/l L-Valin, 0,2 g/l L-Leucin und weniger als 0,1 g/l L-Isoleucin, L-Alanin und L-Glutaminsäure.
Der neue M. methylotrophus pFp^R-phe^R-mFp^R-phe^RR-cin^R-Mutantenstamm Nr. 227-16-10-11-cin8, der gegen Zimtsäure (50 mg/L), dem chemischen Strukturanalogon von L-Phenylalanin, resistent war (im Folgenden als cin^R abgekürzt), wurde nach NG-Mutagenese wie vorstehend beschrieben aus dem Stamm Nr. 227-16-10-11 isoliert. Die cin^R-Mutante produzierte in Röhrchen 0,8–0,9 g/l L-Phenylalanin und 0,6 g/l L-Valin.
Die Stämme Nr. 227, 227-16, 227-16-10, 227-16-10-11 und 227-16-10-11-cin8 wurden bei der Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) am 10. Februar 2000 unter den Hinterlegungsnummern VKPM B-7909, VKPM B-7910, VKPM B-7911, VKPM B-7912 bzw. VKPM B-7913 hinterlegt (und am 18. Juli 2000 in eine Hinterlegung gemäß den Bestimmungen des Budapester Abkommens umgewandelt).

Claims

Bakterium der Gattung Methylophilus, das L-Phenylalanin produzieren kann und gegen 0,05 M L-Phenylalanin und gegen ein Phenylalaninanalogon resistent ist, wobei das Analogon mindestens eines ist, das unter 2 mg/ml DL-p-Fluorphenylalanin, 0,5 g/l m-Fluorphenylalanin und 50 mg/l Zimtsäure ausgewählt ist.
Bakterium nach Anspruch 1, das gegen 2 mg/ml DL-p-Fluorphenylalanin resistent ist.
Bakterium nach Anspruch 1, das durch Selektieren eines Stammes, der gegen das Phenylalaninanalogon und 0,05 M L-Phenylalanin resistent ist, unter Bakterien der Gattung Methylophilus erhältlich ist, wobei die Selektion für das Phenylalaninanalogon und L-Phenylalanin in beliebiger Reihenfolge jeweils mindestens einmal durchgeführt wird.
Bakterium nach Anspruch 1, das gegen 2 mg/ml DL-p-Fluorphenylalanin und 0,5 g/l m-Fluorphenylalanin resistent ist.
Bakterium nach Anspruch 4, das durch Selektieren eines Stammes, der gegen 2 mg/ml DL-p-Fluorphenylalanin, 0,5 g/l m-Fluorphenylalanin und 0,05 M L-Phenylalanin resistent ist, unter Bakterien der Gattung Methylophilus erhältlich ist, wobei die Selektion für DL-p-Fluorphenylalanin, m-Fluorphenylalanin und L-Phenylalanin in beliebiger Reihenfolge jeweils mindestens einmal durchgeführt wird.
Bakterium nach Anspruch 1, das gegen 2 mg/ml DL-p-Fluorphenylalanin, 0,5 g/l m-Fluorphenylalanin und 50 mg/l Zimtsäure resistent ist.
Bakterium nach Anspruch 6, das durch Selektieren eines Stammes, der gegen 2 mg/ml DL-p-Fluorphenylalanin, 0,5 g/l m-Fluorphenylalanin, 50 mg/l Zimtsäure und 0,05 M L-Phenylalanin resistent ist, unter Bakterien der Gattung Methylophilus erhältlich ist, wobei die Selektion für DL-p-Fluorphenylalanin, m-Fluorphenylalanin, Zimtsäure und L-Phenylalanin in beliebiger Reihenfolge jeweils mindestens einmal durchgeführt wird.
Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das Methylophilus methylotrophus ist.
Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, das die folgenden Stufen umfasst: Kultivieren des Bakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einem Kulturmedium, um L-Phenylalanin in einer Kultur zu produzieren und anzuhäufen, und Gewinnen des L-Phenylalanins aus der Kultur.