WO2019168203A1 - ４－アミノ桂皮酸を製造する方法、並びに、それに用いられるベクター及び宿主細胞 - Google Patents

４－アミノ桂皮酸を製造する方法、並びに、それに用いられるベクター及び宿主細胞 Download PDF

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amino acid
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直樹 高谷
俊介 桝尾
志慧 川▲崎▼
一 皆川
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国立研究開発法人科学技術振興機構
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    • C12Y403/01024—Phenylalanine ammonia-lyase (4.3.1.24)

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for producing 4-aminocinnamic acid useful as a raw material monomer for an aromatic polymer derived from biomass, and a novel vector and host cell used in such a method.
  • Biomass-derived polymers include aliphatic polymers and aromatic polymers, but currently, research and development are mainly on aliphatic polymers such as polylactic acid.
  • Polylactic acid has a problem of low heat resistance and durability, but these problems are being improved by improving the crystallinity.
  • aromatic polymers often show excellent material properties in terms of thermal stability and mechanical strength, and are expected to be used as raw materials for engineering plastics.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 report a method of synthesizing an aromatic polymer having high heat resistance using 4-aminocinnamic acid as a raw material. Accordingly, there is a demand for highly efficient synthesis of 4-aminocinnamic acid from biomass as a monomer for the raw material of such a high heat-resistant polymer.
  • An object of the present invention is to provide a novel method for synthesizing 4-aminocinnamic acid.
  • the inventors of the present invention first converted 4-nitrocinnamic acid into 4-nitrocinnamic acid using 4-nitrophenylalanine, which has a known synthetic route from glucose, and then converted 4-nitrocinnamic acid into 4-aminocinnamic acid. It was conceived that a novel route for synthesizing 4-aminocinnamic acid from glucose could be established by converting to cinnamic acid. Furthermore, it has been found that both the conversion of 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid and the conversion of 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid can be realized using an appropriate enzyme derived from a living organism, The present invention has been completed.
  • the conversion of (2) comprises an amino acid sequence having 80% or more sequence homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, or 15, and 4-nitro
  • the method according to [7], wherein the conversion of (2) is performed using a second host cell that expresses the second enzyme.
  • the method according to [8], wherein the second host cell is a host cell modified to express the second enzyme.
  • a method for producing 4-aminocinnamic acid from glucose comprising: (A) producing phenylalanine from glucose; (B) Nitration of the phenylalanine obtained in (a) above to convert it to 4-nitrophenylalanine, (C) A method comprising producing 4-aminocinnamic acid from 4-nitrophenylalanine obtained in (b) by the method of [1] to [14].
  • [16] A method for producing 4-aminocinnamic acid from phenylalanine, (B) Nitration of phenylalanine to convert to 4-nitrophenylalanine; (C) A method comprising producing 4-aminocinnamic acid from 4-nitrophenylalanine obtained in (b) by the method of [1] to [14].
  • [17] A method for producing 4-nitrocinnamic acid from 4-nitrophenylalanine, comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, or 5 And using a first enzyme having the activity of converting 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid.
  • a method for producing 4-aminocinnamic acid from 4-nitrocinnamic acid which has a sequence homology of 80% or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13 or 15
  • a method comprising using a second enzyme consisting of an amino acid sequence having an activity to convert 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid.
  • An activity comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, or 5 and converting 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid
  • an activity comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, or 5 and converting 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid
  • FIG. 1 is a table showing the deammonase activity of CamPAL, LiePAL, and RgPAL purified after recombinant production in E. coli for phenylalanine (Phe) and 4-nitrophenylalanine (n-Phe).
  • FIG. 2 is a graph showing the conversion activity from 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid by CamPAL, LiePAL, and RgPAL subjected to resting cell reaction after recombinant production in E. coli.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of the conversion reaction from 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid by CamPAL subjected to resting cell reaction after recombinant production in E. coli over time.
  • FIG. 1 is a table showing the deammonase activity of CamPAL, LiePAL, and RgPAL purified after recombinant production in E. coli for phenylalanine (Phe) and 4-nitrophenylalanine (n
  • FIG. 4 is a graph showing the conversion activity from 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid by scFrm2, scHbn1, and cdFLDZ subjected to resting cell reaction after recombinant production in E. coli.
  • FIG. 5 is a table showing the conversion activity from 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid at each bacterial mass and each basic mass.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of the conversion reaction from 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid by the conversion reaction in the reactor after culturing CamPAL-producing E. coli 1.2 L over time.
  • FIG. 5 is a table showing the conversion activity from 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid at each bacterial mass and each basic mass.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of the conversion reaction from 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid by the conversion reaction in the reactor
  • FIG. 7 is a graph showing the results of HPLC analysis of purified 4-nitrocinnamic acid.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of converting 4-nitrocinnamic acid to 4-aminocinnamic acid (4ACA) by adding glucose, fructose and glycerol to the culture solution of CamPAL-producing Escherichia coli.
  • FIG. 9 is a graph showing the conversion activity of 4-nitrophenylalanine to 4-aminocinnamic acid by CamPAL-producing Escherichia coli.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of HPLC analysis of purified 4ACA hydrochloride and 4ACA (standard).
  • nucleic acid includes ribonucleic acid, deoxyribonucleic acid, or any modified nucleic acid.
  • the nucleic acid includes either a single strand or a double strand.
  • the nucleic acid (gene) according to the present invention may be any arbitrary known to those skilled in the art using primers or probes prepared based on public databases known to those skilled in the art or base sequences disclosed in this specification. Can be prepared by the method. For example, it can be easily obtained as cDNA of the gene by using various PCR and other DNA amplification techniques known to those skilled in the art. Alternatively, those skilled in the art can synthesize nucleic acids using existing techniques as appropriate based on the sequence information disclosed in this specification.
  • a nucleic acid encodes a protein or polypeptide.
  • “encode” means that the protein or polypeptide of the present invention is expressed in a state having the activity.
  • the term “encode” includes both encoding the protein of the present invention as a continuous structural sequence (exon) and encoding the protein via an appropriate intervening sequence (intron).
  • the first gist of the present invention relates to a method for producing 4-aminocinnamic acid from 4-nitrophenylalanine (hereinafter abbreviated as “the first method of the present invention” as appropriate).
  • the first method of the present invention comprises at least (1) a step of converting 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid, and (2) a step of converting 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid.
  • a method of synthesizing phenylalanine from glucose by fermentation for example, US Patent Application Publication No. 2001/0044139: Reference A below
  • a method of synthesizing 4-nitrophenylalanine by nitration of phenylalanine for example, Takayama et al., BCSJ, 17 [3]: 109-113: see Document B below
  • the present inventors paid attention to 4-nitrophenylalanine as a starting material, and first converted it into 4-nitrocinnamic acid, and then converted it into 4-aminocinnamic acid, whereby glucose was converted to phenylalanine ⁇ 4- It was conceived that a novel synthesis route for synthesizing 4-aminocinnamic acid via nitrophenylalanine ⁇ 4-nitrocinnamic acid could be established.
  • any of the two steps included in the first method of the present invention various methods such as a biological method and a chemical method can be used.
  • the inventors of the present invention have examined the method for converting 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid, and the enzyme that converts 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid for a wide range of organism-derived enzymes.
  • Phhenylalanine ammonia lyase was searched.
  • the present inventors have found that the enzyme derived from Campallia (Camellia sinensis), the enzyme derived from Camellia (Lithospermum erythrorhizon), LiePAL, and Rhodotorula glutinis JN-1. A certain RgPAL was selected.
  • a reduction reaction of a nitro group by a known chemical method can be used.
  • a conversion enzyme nitrogenreductase
  • the present inventors have used scFrm2 and scHbn1, which are enzymes derived from Saccharomyces cerevisiae, cdFLZ, which is an enzyme derived from Clostridium difficile, and an enzyme derived from Escherichia coli. Certain nfsA and nfsB were selected.
  • the present inventors succeeded in converting 4-nitrophenylalanine into 4-nitrocinnamic acid and then converting 4-nitrocinnamic acid into 4-aminocinnamic acid using host cells expressing these enzymes.
  • the first method of the present invention has been completed.
  • the first method of the present invention is a known method described above, which is a method for synthesizing phenylalanine by fermentation of glucose (see the above-mentioned document A) and a method for synthesizing 4-nitrophenylalanine by nitration of phenylalanine (the above-mentioned document B).
  • 4-aminocinnamic acid can be produced from glucose via glucose via phenylalanine ⁇ 4-nitrophenylalanine ⁇ 4-nitrocinnamic acid.
  • the synthesis of 4-aminocinnamic acid from glucose via the first method of the present invention is compared with the conventional methods (Patent Documents 2 and 3) by the present inventors. It is excellent in terms of reaction rate and reaction efficiency, and can be said to be advantageous.
  • 4-nitrophenylalanine is used as the starting material.
  • the type of 4-nitrophenylalanine is not limited and may be natural or synthesized. Various methods for synthesizing 4-nitrophenylalanine will be described later.
  • Step (1) Conversion of 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid
  • 4-nitrophenylalanine is first converted to 4-nitrocinnamic acid as step (1).
  • the method for performing this step (1) is not limited, and any method such as a biological method or a chemical method can be used.
  • the step (1) can be carried out using an enzyme that converts 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid (nitrophenylalanine ammonia lyase: hereinafter referred to as “first enzyme” as appropriate). preferable.
  • CamPAL, LiePAL, and RgPAL are known enzymes, and their amino acid sequences are also known, but these can use a nitro compound as a substrate and convert 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid. Having conversion activity has not been known so far, and is the first finding found by the present inventors.
  • Examples of the first enzyme include not only CamPAL, LiePAL, and RgPAL, but also analogs thereof that maintain the activity of converting 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid. It is done.
  • the analog of CamPAL, LiePAL, or RgPAL includes, for example, homologs thereof (including orthologs and paralogs), or fragments thereof.
  • the first enzyme has at least 80%, preferably at least 85%, or at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, or 5. It is desirable to have a sequence homology of at least 98%, particularly preferably at least 99%, most preferably 100%.
  • the first enzyme also has at least 80%, preferably at least 85%, or at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, or 5. %, Particularly preferably at least 99%, most preferably 100%.
  • the “homology” of two amino acid sequences is the ratio at which the same or similar amino acid residues appear at each corresponding position when both amino acid sequences are aligned, and the “identity” of the two amino acid sequences. Is the ratio at which identical amino acid residues appear at each corresponding position when both amino acid sequences are aligned.
  • “Homology” and “identity” of two amino acid sequences are, for example, BLAST (Basic Alignment Search Tool) program (Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215 (3): 403-10 or the like.
  • the first enzyme is a polypeptide having an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence obtained by deleting, substituting, or adding one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, or 5.
  • amino acid sequence obtained by deleting, substituting, or adding one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, or 5.
  • “one or several amino acids are deleted, substituted or added in an amino acid sequence” means that the amino acid in the amino acid sequence significantly affects the structure or function of the polypeptide. It means that it is modified without doing.
  • “several” usually has 2 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, and still more preferably 2 to 5 mutations (deletion, substitution or addition). Refers to that.
  • the first enzyme is a polypeptide encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, or 5. It may be a peptide.
  • stringent conditions are conditions that enable selective and detectable specific binding between nucleic acids, and include salt concentration, solvent (for example, an organic solvent such as formamide). , Temperature, and other known conditions. “Stringent conditions” are well known to those skilled in the art, but specifically refer to T. Maniatis et al., MolecularoleCloning: A Laboratory Manual 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory.
  • stringent conditions include about 40-45 ° C., optimally about 42 ° C. in 5 ⁇ SSPE, 0.3% SDS, 200 ⁇ g / mL shear-denatured salmon sperm DNA. And 25% formamide for very low and low stringency, 35% formamide for medium and moderate to high stringency, 50% for high and very high stringency Hybridization is performed in formamide for 12-24 hours according to standard Southern blotting methods. The final carrier material was then placed in 2 ⁇ SSC, 0.2% SDS at 45 ° C. (very low stringency), 50 ° C. (low stringency), 55 ° C. (moderate stringency). Wash three times for 15 minutes each at 15 ° C. (genency), 60 ° C.
  • Hybridization can be performed according to a method known in the art or a method analogous thereto. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • the method for preparing the first enzyme is not limited. You may extract and use the target enzyme from the organism which produces said 1st enzyme.
  • the base sequence of the CamPAL, LiePAL, or RgPAL gene registered in a public institution database known to those skilled in the art, or the base sequence of the CamPAL, LiePAL, or RgPAL gene disclosed in the present specification (SEQ ID NO: 2, respectively) 4 and 6) can be used to prepare various methods known to those skilled in the art, such as chemical synthesis methods and genetic engineering methods.
  • CamPAL LiePAL, or RgPAL
  • a polymerase chain known to those skilled in the art from, for example, Camellia ⁇ sinensis, Murosaki (Lithospermum erythrorhizon), or Rhodotorula glutinis JN-1 genomic libraries.
  • Nucleic acid amplification techniques such as reaction (polymerase chain reaction: PCR) are used to prepare nucleic acids encoding CamPAL, LiePAL, or RgPAL genes, and these are prepared by various methods known to those skilled in the art such as plasmids and viruses. It is possible to prepare CamPAL, LiePAL, or RgPAL by incorporating the gene into the vector and introducing the gene into a suitable host cell by gene recombination.
  • the host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.
  • a prokaryotic cell it may be an eubacteria or archaea.
  • a eukaryotic cell it may be a plant cell, an animal cell, a fungal cell, or a protist cell.
  • CamPAL for the analogs of CamPAL, LiePAL, or RgPAL
  • CamPAL disclosed in the present specification Using a method of contacting a nucleic acid comprising the base sequence of the LiePAL or RgPAL gene (SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 respectively) with a mutagen agent, a method of irradiating ultraviolet rays, a genetic engineering method, etc.
  • a nucleic acid encoding an analog of CamPAL, LiePAL, or RgPAL is prepared by introducing a mutation.
  • site-directed mutagenesis which is one of genetic engineering techniques, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position.
  • Nucleic acids encoding CamPAL, LiePAL, or RgPAL analogs thus obtained are incorporated into various vectors such as plasmids and viruses by methods known to those skilled in the art in the same manner as described above. By introducing and expressing, an analog of CamPAL, LiePAL, or RgPAL can be prepared.
  • the method for carrying out step (1) using the first enzyme is not particularly limited.
  • the first enzyme may be converted into 4-nitrocinnamic acid by acting on 4-nitrophenylalanine under conditions that cause an enzymatic reaction.
  • 4-nitrophenylalanine a composition such as a natural product or a synthetic product containing 4-nitrophenylalanine may be used as it is without purification. From such a composition, various methods known to those skilled in the art can be used. 4-nitrophenylalanine may be purified and used.
  • the first enzyme prepared by the above procedure may be isolated and purified, and the first enzyme can be isolated by the above procedure.
  • Recombinant cells obtained by modifying the host cell so as to express the above (hereinafter referred to as “first cells” where appropriate) may be used as they are.
  • first cells Recombinant cells obtained by modifying the host cell so as to express the above
  • a bacterium is used as a host cell
  • the resting cell is used to coexist with 4-nitrophenylalanine
  • the first enzyme contained in the resting cell is allowed to act on 4-nitrophenylalanine to cause 4-nitrocinnamon.
  • a method of converting to an acid (hereinafter referred to as “resting cell reaction” as appropriate) is preferred. Such resting cell reaction will be described later.
  • a bacterium is used as a host cell expressing the first enzyme, and the culture solution is used to coexist with 4-nitrophenylalanine, and the first enzyme contained in the culture solution is allowed to act on 4-nitrophenylalanine.
  • a method of converting to nitrocinnamic acid can also be employed.
  • Conditions for causing the enzyme reaction of the first enzyme are not limited, but for example, in an aqueous solvent, the pH is not particularly limited, but is usually 7.5 or more, especially 8 The above is preferable, and usually 9.5 or less, more preferably 9 or less. Further, the temperature at which the reaction is carried out is not particularly limited, but it is preferably exemplified that the reaction is usually carried out at 27 ° C. or more, especially 30 ° C. or more, more preferably 32 ° C. or more, and usually 42 ° C. or less, especially 37 ° C. or less.
  • Step (2) Conversion of 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid.
  • step (2) 4-nitro cinnamic acid is converted into 4-amino cinnamic acid.
  • the technique for performing this step (2) is not limited, and any technique such as a biological technique or a chemical technique can be used. Among them, in the present invention, it is preferable to carry out the step (2) using an enzyme that converts 4-nitrocinnamic acid into 4-aminocinnamic acid (nitroreductase: hereinafter referred to as “second enzyme” as appropriate). .
  • Examples of the second enzyme include scFrm2 and scHbn1, which are enzymes derived from Saccharomyces cerevisiae, cdFLDZ, which is an enzyme derived from Clostridium difficile, and an enzyme derived from Escherichia coli. Some nfsA, nfsB, etc. are mentioned.
  • the amino acid sequence of the scFrm2 protein is shown in SEQ ID NO: 7, and an example of the base sequence of the scFrm2 gene encoding it is shown in SEQ ID NO: 8, respectively.
  • scFrm2, scHbn1, cdFLDZ, nfsA and nfsB were obtained by searching the present inventors from known nitroreductases and enoate reductases derived from living organisms, as shown in the Examples below. It is an enzyme. Unexpectedly, these enzymes have an excellent conversion activity from 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid, as shown in the examples below, and can be suitably used in the present invention. .
  • scFrm2, scHbn1, cdFLDZ, nfsA and nfsB are known enzymes as nitroreductase or enoate reductase, and their amino acid sequences are also known. It has not been known so far that it has an acid conversion activity and can also be used as a nitroreductase, and is the first finding found by the present inventors.
  • said second enzyme has at least 80%, preferably at least 85%, or at least 90%, at least 95%, at least 96% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13 or 15. It is desirable to have a sequence homology of at least 97%, at least 98%, particularly preferably at least 99%, most preferably 100%.
  • the second enzyme also has at least 80%, preferably at least 85%, or at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97% with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, or 15. It is desirable to have a sequence identity of at least 98%, particularly preferably at least 99%, most preferably 100%.
  • the “homology” and “identity” of the two amino acid sequences are as described above.
  • the second enzyme has an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, or 15. It may be a polypeptide.
  • amino acid sequence consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, or 15.
  • the second enzyme is encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13, or 15. It may be a polypeptide.
  • the “stringent condition” is as described above.
  • the method for preparing the second enzyme is not limited. You may extract and use the target enzyme from the organism which produces said 2nd enzyme.
  • the base sequence of the gene of the second enzyme registered in the database of public institutions known to those skilled in the art, and the base sequences of the genes of SEQ ID NOs: 8, 10, 12, 14 and 16 disclosed in the present specification Can be prepared using various methods known to those skilled in the art, for example, chemical synthesis methods and genetic engineering methods. The specific method, particularly the genetic engineering method, is as described in detail above.
  • the method for performing the step (2) using the second enzyme is not particularly limited.
  • the second enzyme may be converted into 4-aminocinnamic acid by acting on the 4-nitrocinnamic acid obtained in step (1) under conditions that cause an enzymatic reaction.
  • the 4-nitrocinnamic acid obtained in the step (1) may be used as it is without purifying the composition with the reaction product of the step (1) containing 4-nitro cinnamic acid.
  • 4-Nitrocinnamic acid may be purified from the reaction product by various techniques known to those skilled in the art.
  • the second enzyme As an example of a technique for causing the second enzyme to act on 4-nitrocinnamic acid, the second enzyme (scFrm2, scHbn1, cdFLDZ, nfsA or nfsB or an analog thereof) prepared by the above procedure is isolated and purified.
  • a genetically modified cell obtained by modifying the host microorganism so as to express the second enzyme by the above-described procedure (hereinafter referred to as “second cell” as appropriate) is used as it is. Also good.
  • a bacterium is used as a host, and the resting cell is used to coexist with 4-nitrocinnamic acid, and the second enzyme contained in the resting cell is allowed to act on 4-nitrocinnamic acid to produce 4-amino
  • resting cell reaction Such resting cell reaction will be described later.
  • bacteria are used as host cells, and the culture solution is used to coexist with 4-nitrocinnamic acid, and the first enzyme contained in the culture solution is allowed to act on 4-nitrocinnamic acid to produce 4-amino cinnamic acid.
  • a method of conversion is also preferable.
  • Escherichia coli is preferable as the bacterium.
  • the conditions that cause the enzymatic reaction of the second enzyme are not limited, but examples include the following. That is, the pH is not particularly limited as long as it is in an aqueous solvent, but it is usually 6.5 or higher, preferably 7.0 or higher, and usually 8.5 or lower, more preferably 8.0 or lower. Further, the temperature at which the reaction is carried out is not particularly limited, but it is preferably exemplified that the reaction is usually carried out at 27 ° C. or more, especially 30 ° C. or more, more preferably 32 ° C. or more, and usually 42 ° C. or less, especially 37 ° C. or less.
  • Resting cell reaction In the first method of the present invention, when the step (1) is performed using the first enzyme and / or the step (2) is performed using the second enzyme. In addition, it is preferable to use a reaction using a resting bacterial cell (resting cell reaction) as the first and / or second cell expressing the first and / or second enzyme (the first cell reaction). Bacteria expressing one enzyme are hereinafter referred to as “first bacteria”, and bacteria expressing the second enzyme are hereinafter referred to as “second bacteria”).
  • the “resting microbial cell” of a bacterium means a microbial cell not accompanied by such bacterial growth.
  • Examples of resting cells include cultured cells obtained by culturing bacteria, powder cells obtained by pulverizing such cultured cells by freeze drying or spray drying, and immobilizing such cultured cells on a carrier. And the immobilized microbial cells. Two or more of these may be used in combination.
  • a culture solution obtained by culturing bacteria is separated into a culture supernatant and cells by centrifugation, and the obtained cells are washed with physiological saline to obtain a desired cell suspension.
  • a resting cell suspension suspended in sterilized purified water so as to have a degree of absorbance (for example, an absorbance at 600 nm of 40) can be used.
  • a degree of absorbance for example, an absorbance at 600 nm of 40
  • powdered cells obtained by pulverizing such resting cell suspensions by freeze drying or spray drying and immobilized cells obtained by immobilizing cultured cells in such cultured cell suspensions on a carrier. Can be used.
  • the conditions that cause the enzymatic reaction of the first or second enzyme are not limited, but for example, the pH is usually 6.5 or more, especially 7 or more, usually 9.5 or less, It is preferable to carry out the reaction in an aqueous solvent of 9 or less, usually at 27 ° C. or higher, especially 30 ° C. or higher, more preferably 32 ° C. or higher, and usually 42 ° C. or lower, especially 37 ° C. or lower.
  • a chemical method can also be used as a method for converting 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid in step (2).
  • the chemical method is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the nitro group of 4-nitrocinnamic acid may be reduced using a chemical reaction for converting a nitro group to an amino group.
  • the reduction method of the nitro group is not particularly limited, but known methods such as the Bechamp method (for example, A. J. nn Ann. Chim. Phys. 1854, 42, 186.) and the heterogeneous catalytic reduction method are used.
  • Bechamp method for example, A. J. nn Ann. Chim. Phys. 1854, 42, 186.
  • the heterogeneous catalytic reduction method are used.
  • the 4-nitrocinnamic acid the 4-nitro cinnamic acid obtained in the above step (1) may be used as it is, but it may be used after being appropriately purified
  • the step (1) and the step (2) can be appropriately combined.
  • the combination is not limited.
  • the enzyme reaction using the first enzyme is performed in the step (1), and the enzyme reaction using the second enzyme in the step (2).
  • the above chemical method is performed.
  • the enzyme reaction is performed in the presence of the first bacterium in the step (1), the enzyme reaction is performed in the presence of the second bacterium in the step (2) or by a chemical method. It is preferable. Among them, if the enzyme reaction is performed in the presence of the second bacterium, both enzyme reactions can be performed consistently, which is more preferable in terms of efficiency. In this case, it is more preferable from the viewpoint of cost reduction to use Escherichia coli as the second bacterium.
  • the resting cell of the first bacterium is performed in the step (1)
  • the resting cell reaction of the second bacterium is performed in the step (2) or a chemical method is performed.
  • the chemical method can be used to convert 4-nitrocinnamic acid into 4-aminocinnamic acid, production costs (such as raw material costs, capital investment costs, and labor costs), and CO 2 reduction during production. This is more preferable.
  • the mode in which the step (2) is performed after the step (1) is performed has been described.
  • the step (1) and the step (2) can be performed at the same time.
  • the first and second enzymes are allowed to act on 4-nitrophenylalanine under conditions that cause an enzymatic reaction, and conversion of 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid by the first enzyme; Conversion from 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid by the second enzyme may be carried out in parallel.
  • the first and second enzymes isolated and purified may be used in combination, and the first and second cells expressing the first and second enzymes may be used in combination.
  • a single genetically modified cell that expresses both the first and second enzymes may be used (hereinafter referred to as the “third cell”).
  • a third cell that expresses both the first and second enzymes contains a gene encoding the first and second enzymes, or first and second vectors carrying these genes, respectively, in a single host. It can be obtained by introducing into a cell and modifying the host cell to express both the first and second enzymes.
  • the second gist of the present invention relates to a method for producing 4-aminocinnamic acid from glucose (hereinafter abbreviated as “the second method of the present invention” as appropriate).
  • the second method of the present invention includes at least (a) a step of producing phenylalanine from glucose, (b) a step of nitration of the phenylalanine obtained in the above (a) to convert it into 4-nitrophenylalanine, and (c ) Comprising the step of producing 4-aminocinnamic acid from the 4-nitrophenylalanine obtained in (b) by the first method of the present invention.
  • step (b) As a method for synthesizing 4-nitrophenylalanine from phenylalanine in step (b), for example, the method described in the above-mentioned document B can be used.
  • the aforementioned first method of the present invention can be used.
  • the third gist of the present invention relates to a method for producing 4-aminocinnamic acid from phenylalanine (hereinafter abbreviated as “the third method of the present invention” as appropriate).
  • the third method of the present invention includes at least (b) a step of nitration of phenylalanine to convert it to 4-nitrophenylalanine, and (c) 4 obtained in (b) above by the first method of the present invention. Including the step of producing 4-aminocinnamic acid from nitrophenylalanine.
  • step (b) The method for synthesizing 4-nitrophenylalanine from phenylalanine in step (b) is as described above for the second method of the present invention.
  • the aforementioned first method of the present invention can be used.
  • the fourth gist of the present invention relates to a method for producing 4-nitrocinnamic acid from phenylalanine (hereinafter abbreviated as “the fourth method of the present invention” as appropriate).
  • the fourth method of the present invention includes the step of converting phenylalanine to 4-nitrocinnamic acid using at least the first enzyme described above. The details of such a process are as described in detail above as step (1) of the first method of the present invention.
  • the fifth gist of the present invention relates to a method for producing 4-aminocinnamic acid from 4-nitrocinnamic acid (hereinafter abbreviated as “fifth method of the present invention” as appropriate).
  • the fifth method of the present invention includes the step of converting 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid using at least the second enzyme described above. The details of such steps are as described in detail above as step (2) of the first method of the present invention.
  • the sixth gist of the present invention is a vector carrying a gene encoding the first and / or second enzyme described above (hereinafter, a vector carrying a gene encoding the first enzyme is referred to as “first vector”).
  • the vector carrying the gene encoding the second enzyme is hereinafter referred to as “second vector”, and the vector carrying both the gene encoding the first enzyme and the gene encoding the second enzyme.
  • third vector the vector carrying both the gene encoding the first enzyme and the gene encoding the second enzyme.
  • the first to third vectors carry the genes encoding the first and / or second enzymes described above, and can introduce these genes into a host cell so that they can be expressed. If there is, the kind is not limited. For example, even a vector that is integrated into the host cell genome or a vector that is incorporated into the cytoplasm of the host cell, coexists independently of the host cell genome, and replicates autonomously according to host cell division. Good. Further, it may be a linear vector or a circular vector, may be a single-stranded vector or a double-stranded vector, and may be a DNA vector or an RNA vector.
  • it may be a plasmid vector, a cosmid vector, a fosmid vector, a virus vector, an artificial chromosome vector, a bacterial vector such as Agrobacterium, or a binary vector based on a combination of these.
  • the types, configurations, construction methods, and the like of such vectors are well known to those skilled in the art, and may be appropriately selected according to conditions such as genes and host microbial cells.
  • the first to third vectors preferably further include a regulatory sequence that regulates the expression of the gene in a host cell, in addition to the gene encoding the first and / or second enzyme.
  • regulatory sequences include promoters, terminators, enhancers, poly A addition signal, 5'-UTR (untranslated region), marker or selectable marker genes, multiple cloning sites, replication origins, and the like.
  • these regulatory sequences are operably linked to the genes encoding the first and / or second enzymes described above to make the genes autonomous in the host cell. It is preferably constructed as an expression cassette that can be expressed in The types, configurations, construction methods, and the like of such regulatory sequences are well known to those skilled in the art, and may be appropriately selected according to conditions such as genes and host cells.
  • the seventh aspect of the present invention is a cell obtained by modifying a host cell so as to express the aforementioned first and / or second enzyme (as described above, a cell expressing the first enzyme A cell that expresses the second enzyme is called a "second cell”, and a cell that expresses both the first and second enzymes is called a "third cell”). .
  • the first to third cells expressing the first and / or second enzyme can be obtained.
  • the genes encoding the first and / or second enzymes described above may be used as they are, or the first to third vectors carrying these genes may be used.
  • Methods for gene transfer include infection of host cells with vectors, physical methods such as electroporation, particle gun (bombardment), vacuum infiltration, and genome editing such as CRISPR / Cas9. The law etc. can be used.
  • the first to third cells thus obtained may be ones that transiently express the first and / or second enzymes, or may be ones that are constantly expressed.
  • these genes may be expressed at all stages of development, or may be expressed only at specific stages.
  • these genes may be expressed in all tissues / organs, or may be expressed only in specific tissues / organs.
  • Such gene expression timing / site control can be performed, for example, by appropriately selecting regulatory sequences.
  • Escherichia coli strain BL21 (DE3) [Novagen, genotype F-, ompT, hsdSB (rB-mB-), gal ( ⁇ cI857, ind1, Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm (DE3)] was used.
  • an LB medium (pH 7.0) having the following composition or a medium supplemented with other components was sterilized at 121 ° C. for 15 minutes using an autoclave.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Example 1 [I. Conversion of 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid] 1. Construction of plasmid and introduction into E. coli (1) Construction of pET28a-CamPAL and introduction into E. coli CamPAL, an enzyme derived from Camellia sinensis, was artificially synthesized by a known polynucleotide synthesis method and subsequently restricted with restriction enzymes NdeI and EcoRI. A DNA ligation kit Ligation High Ver.
  • the number of rotations during these cultures was 120 rpm.
  • the absorbance at a wavelength of 380 nm derived from the production of 4-nitrocinnamic acid was measured for 10 minutes and quantified.
  • FIG. 1 shows the deammonase specific activity, K m , K cat , and K m of CamPAL, LiePAL, and RgPAL purified after recombinant production in E. coli for phenylalanine (Phe) and 4-nitrophenylalanine (n-Phe). It is a table
  • the obtained resting cells were suspended in a reaction buffer and reacted at 28 ° C. while shaking at 300 rpm. Every 24 hours, 20 mM 4-nitrophenylalanine was added to the medium and allowed to react continuously. Periodically, the reaction supernatant was collected, and 4-nitrophenylalanine and 4-nitrocinnamic acid were quantified.
  • the supernatant was transferred to a centrifuge tube, collected by centrifugation, and the reaction product was quantified using high performance liquid chromatography (HPLC). Moreover, the same experiment was conducted using host E. coli as a control.
  • FIG. 2 is a graph showing the amount of 4-nitrocinnamic acid in the reaction supernatant 24 hours after the resting cell reaction of CamPAL, LiePAL, and RgPAL-producing E. coli strains. Even when any resting cells of CamPAL, LiePAL, and RgPAL-producing E. coli strains were used, the amount of 4-nitrocinnamic acid in the reaction supernatant was remarkably increased compared to that of the control E. coli, and CamPAL, LiePAL, It can be seen that the conversion of 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid by RgPAL and RgPAL proceeded.
  • FIG. 3 is a graph showing temporal changes in the amount of 4-nitrophenylalanine and the amount of 4-nitrocinnamic acid in the reaction supernatant of the resting cell reaction of the CamPAL-producing Escherichia coli strain.
  • the amount of 4-nitrophenylalanine in the reaction supernatant increases with the addition every 24 hours, but thereafter gradually decreases until the next addition, and 4-nitrocinnamic acid in the reaction supernatant continuously increases. I understand that. From this, it can be seen that the conversion from 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid by CamPAL continued to proceed.
  • Yonkitto Ligation using High Ver.2 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was ligated to prepare a pRSFDuet-1-scFrm2.
  • the obtained pRSFDuet-1-scFrm2 was introduced into E. coli strain BL21 (DE3) by the heat shock transformation method.
  • the resulting scFrm2-producing Escherichia coli strain was cultured to express scFrm2.
  • reaction buffer 100 mM potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ), 1 mM magnesium sulfate (MgSO 4 ), 0.5 mM thiamine chloride, pH 7.0.
  • the obtained resting cells were suspended in a reaction buffer containing 2.5 mM 4-nitrocinnamic acid and reacted at 30 ° C. for 12 hours while shaking at 300 rpm. After the reaction, the reaction supernatant was collected, and 4-aminocinnamic acid was quantified. The supernatant was transferred to a centrifuge tube, collected by centrifugation, and the reaction product was quantified using the HPLC. Moreover, the same experiment was conducted using host E. coli as a control.
  • FIG. 4 shows a graph showing the conversion activity from 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid by scFrm2, scHbn1, and cdFLDZ subjected to resting cell reaction after recombinant production in E. coli.
  • the amount of 4-aminocinnamic acid in the culture supernatant was markedly increased compared to the control E.
  • Example 2 [III. Conversion of 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid] 1. Evaluation of conversion efficiency based on difference in amount and base mass of CamPAL cells The CamPAL-producing Escherichia coli strain described in Example 1 was stirred using a 5 mL LB medium containing 40 mg / L kanamycin sulfate, stirred at 300 rpm, and 28 ° C. Was pre-cultured for 16 hours under the above conditions. 1 mL of this preculture solution was inoculated after adding 80 mg / L kanamycin sulfate to 100 mL TB medium having the following composition, cultured at 30 ° C.
  • reaction buffer 100 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5
  • reaction solution After 24 hours of reaction was collected, and 4-nitrophenylalanine and 4-nitrocinnamic acid were quantified.
  • the supernatant of the obtained (bacterial cell) reaction solution was transferred to a centrifuge tube, collected by centrifugation, and the reaction product was quantified using the HPLC.
  • FIG. 5 shows the result of suspending the amount and base mass of each cell in a reaction buffer and reacting for 24 hours.
  • the results show that the conversion efficiency from 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid is as high as 60% or more when the bacterial mass is 20 g / L and 30 g / L and the base mass is 21 g / L. It was.
  • the above-described CamPAL-producing Escherichia coli strain was pre-cultured at 28 ° C. for 16 hours while stirring at 300 rpm using 15 mL of LB medium with 40 mg / L kanamycin sulfate added. 12 mL of this preculture was inoculated into a 2 L jar fermenter containing 1.2 L TB medium supplemented with 80 mg / L kanamycin sulfate, and the conditions were an air flow rate of 3.5 L / min, a stirring speed of 500 rpm, and 30 ° C. Cultured for 4 hours. Subsequently, 0.1 mM IPTG was added to the culture solution, and further cultured for 20 hours. O. The amount of bacterial cells was calculated from the value of D600 and found to be 30 g / L.
  • FIG. 6 is a graph showing the analysis result of the reaction solution after 24 hours of reaction. This result showed that 21 g / L of 4-nitrophenylalanine was converted to 18 g / L of 4-nitrocinnamic acid with high conversion efficiency. The same reaction was carried out for 24 hours with the aeration rate changed to 0.04 L / min. As a result, conversion from 21 g / L 4-nitrophenylalanine to 12 g / L 4-nitrocinnamic acid was achieved with high conversion efficiency. It was shown that
  • 4-Nitrocinnamic acid was purified from a 1.2 L reaction solution of CamPAL-producing Escherichia coli. After reacting for 24 hours, the cells were removed by centrifugation, and the precipitate was obtained by adjusting the pH to 5 by adding 12N HCl to the supernatant of the reaction solution. The precipitate was collected by filtration, washed with acetone and dried. The solid product recovered after drying was subjected to HPLC analysis under the above conditions.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of HPLC analysis of the obtained product. This result showed that the product was 4-nitrocinnamic acid, and a conversion reaction from 4-nitrophenylalanine to 4-nitrocinnamic acid occurred.
  • the obtained 4-nitrocinnamic acid was found to have an extremely high purity and high yield of 97% and a yield of 93%. In particular, the purity of the obtained 4-nitrocinnamic acid is sufficient to be converted to 4-amino cinnamic acid by a chemical reduction technique.
  • Example 3 [IV. Conversion of 4-nitrophenylalanine to 4-aminocinnamic acid] 1. Search for a carbon source suitable for the conversion of 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid It is known that E. coli has nitroreductase (nfsA and nfsB). Therefore, a reduction reaction from 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid was performed using Escherichia coli.
  • the CamPAL-producing E. coli strain described in Example 1 was pre-cultured for 16 hours by the same method as in Example 2. 1 mL of this preculture was inoculated into 100 mL of TB medium supplemented with 80 mg / L kanamycin sulfate, cultured at 120 rpm with stirring at 30 ° C. for 4 hours, and then added with 0.1 mM IPTG. The culture was further continued for 16 hours. After adding 2 g / L 4-nitrocinnamic acid to the obtained culture broth and adjusting to pH 8 using 2N NaOH, glucose, fructose and glycerol were added as carbon sources to a final concentration of 10%. The cells were cultured under the conditions of 300 rpm stirring and 37 ° C., and reacted for 24 hours.
  • reaction solution during the reaction was collected, and 4-aminocinnamic acid was quantified. That is, the reaction solution was transferred to a centrifuge tube, the supernatant was collected by centrifugation, and the reaction product was quantified using the HPLC.
  • 4-Aminocinnamic acid was purified from 0.5 L of the reaction solution. Bacteria were removed from the reaction solution reacted for 24 hours by centrifugation, and the resulting supernatant was adjusted to pH 3 by adding 12N HCl, and a strongly acidic cation exchange resin (Mitsubishi Chemical Corporation) was added to 600 mL of the reaction solution supernatant. 700 g of Diaion PK212LH) was added and stirred for 1 hour. The resin was recovered, washed with distilled water twice the amount of resin, and further washed with ethanol twice the amount of resin. 4-aminocinnamic acid was eluted by adding 7.5% ammonia water in an amount 1.5 times the amount of resin.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of HPLC analysis of the obtained product and 4-aminocinnamic acid (standard product). According to this result, it was shown that the product was 4-aminocinnamic acid, and a conversion reaction from 4-nitrophenylalanine to 4-aminocinnamic acid using nitroreductase (reduction reaction) of Escherichia coli occurred. . The purity of the resulting 4-aminocinnamic acid was found to be extremely high at 98%. The recovery rate of 4-aminocinnamic acid was 60%.
  • Example 4 [Conversion of 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid] 1. Construction of plasmid and introduction into E. coli (1) Construction of pCDF Duet-1-nfsA and introduction into Escherichia coli nfsA (an amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 13 and an example of a base sequence is shown in SEQ ID NO: 14, respectively) derived from Escherichia coli.
  • 2N NaOH is added to the obtained culture solution containing the bacterial cells to adjust the pH to 8.0, and 2 g / L of 4-nitrocinnamic acid and a final concentration of 2% glycerol are suspended in this culture solution and shaken at 120 rpm.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. for 18 hours. After the reaction, the reaction solution supernatant was collected, and 4-aminocinnamic acid was quantified. The supernatant was transferred to a centrifuge tube, collected by centrifugation, and the reaction product was quantified using the HPLC. Moreover, the same experiment was conducted using host E. coli as a control.
  • the nfsA-producing E. coli strain was converted to 0.26 g / L 4-aminocinnamic acid
  • the nfsB-producing E. coli strain was converted to 0.76 g / L 4-aminocinnamic acid
  • the control E. coli strain was 0. Conversion to 32 g / L 4-aminocinnamic acid. It can be seen that the conversion from 4-nitrocinnamic acid to 4-amino cinnamic acid by nfsA and nfsB proceeded.
  • the present invention can be widely used in fields where synthesis of 4-aminocinnamic acid from glucose such as biomass is required, and has high industrial utility.

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Abstract

４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する新規な方法を提供する。本方法は、（１）４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に転換し、（２）４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に転換することを含む。

Description

４－アミノ桂皮酸を製造する方法、並びに、それに用いられるベクター及び宿主細胞
　本発明は、バイオマス由来の芳香族ポリマーの原料モノマーとして有用な４－アミノ桂皮酸を製造するための新規な方法、並びに、斯かる方法に用いられる新規なベクター及び宿主細胞に関する。
　石油資源の枯渇に対する懸念や二酸化炭素排出問題により、再生可能な資源であるバイオマスを利用して燃料・化成品等を生産するシステムの重要性が高まっている。バイオマス由来のポリマーとしては、脂肪族系ポリマーと芳香族ポリマーとが挙げられるが、現在のところ研究・開発が進んでいるのは、主にポリ乳酸を始めとする脂肪族系ポリマーである。ポリ乳酸は耐熱性・耐久性が低いという課題があったが、結晶化度の向上等によりこれらの課題は改善されつつある。一方、芳香族ポリマーは熱安定性や力学強度等の点で優れた物質特性を示すことが多く、エンジニアリングプラスチックの原料等としての利用が期待される。
　バイオマス由来の芳香族ポリマーの原料モノマーとして特に注目されるのは、４－アミノ桂皮酸である。例えば特許文献１及び非特許文献１には、４－アミノ桂皮酸を原料として高耐熱性の優れた芳香族ポリマーを合成する方法が報告されている。よって、斯かる高耐熱ポリマーの原料のモノマーとして、バイオマスから４－アミノ桂皮酸を高効率で合成することが求められている。
　本発明者等は、バイオマスのグルコースから４－アミノ桂皮酸を合成する方法として、微生物由来の酵素を用い、まずグルコースからコリスミ酸及び４－アミノフェニルピルビン酸を経て４－アミノフェニルアラニンを合成し（特許文献２）、次いでこの４－アミノフェニルアラニンを４－アミノ桂皮酸に変換する（特許文献３）という経路を開発している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
国際公開第２０１３／０７３５１９号 国際公開第２０１５／１４１７９１号 国際公開第２０１５／１１９２５１号
Suvannasara et al., Macromolecules, (2014), 47[5]1586-1593
　本発明者等による前述の４－アミノ桂皮酸の合成法は、優れた方法ではあるものの、反応速度や反応効率等の点でまだ改善の余地があった。
　本発明の目的は、４－アミノ桂皮酸を合成する新規な方法の提供にある。
　本発明者等は鋭意検討の結果、グルコースからの合成経路が知られている４－ニトロフェニルアラニンを用いて、これをまず４－ニトロ桂皮酸に変換し、次いで４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換することにより、グルコースから４－アミノ桂皮酸を合成する新規な経路を確立できることに想到した。更に、４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換、及び、４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換の双方を、生物由来の適切な酵素を用いて実現できることを見出し、本発明を完成させた。
　即ち、本発明の要旨は以下に存する。
［１］４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
（１）４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換し、
（２）４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する
ことを含む方法。
［２］前記（１）の変換が、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を用いて行われる、［１］の方法。
［３］前記（１）の変換が、前記第１の酵素を発現するよう改変された第１の宿主細胞を用いて行われる、［２］の方法。
［４］前記第１の宿主細胞が微生物である、［３］の方法。
［５］前記微生物が細菌である、［４］の方法。
［６］前記（１）の変換が、前記第１の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、［５］の方法。
［７］前記（２）の変換が、配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を用いて行われる、［１］～［６］の方法。
［８］前記（２）の変換が、前記第２の酵素を発現する第２の宿主細胞を用いて行われる、［７］の方法。
［９］前記第２の宿主細胞が、前記第２の酵素を発現するよう改変された宿主細胞である、［８］に記載の方法。
［１０］前記第２の宿主細胞が微生物である、［８］又は［９］の方法。
［１１］前記微生物が細菌である、［１０］の方法。
［１２］前記（２）の変換が、前記第２の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、［１１］の方法。
［１３］前記休止菌体が培養菌体、粉末菌体、及び固定化菌体からなる群から選択される、［６］又は［１２］の方法。
［１４］前記（２）の変換がｐＨ８～９で行われる、［７］～［１３］の方法。
［１５］グルコースから４－アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
（ａ）グルコースからフェニルアラニンを産生し、
（ｂ）前記（ａ）で得られたフェニルアラニンをニトロ化して４－ニトロフェニルアラニンに変換し、
（ｃ）［１］～［１４］の方法により、前記（ｂ）で得られた４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する
ことを含む方法。
［１６］フェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
（ｂ）フェニルアラニンをニトロ化して４－ニトロフェニルアラニンに変換し、
（ｃ）［１］～［１４］の方法により、前記（ｂ）で得られた４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する
ことを含む方法。
［１７］４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を用いることを含む方法。
［１８］４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を用いることを含む方法。
［１９］配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
［２０］配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
［２１］配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
［２２］配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
　本発明によれば、グルコースから４－アミノ桂皮酸を合成する新規な方法が提供される。
図１は、大腸菌での組換産生後に精製したＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）及び４－ニトロフェニルアラニン（ｎ－Ｐｈｅ）に対する脱アンモニア酵素活性を示す表である。 図２は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬによる４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。 図３は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したＣａｍＰＡＬによる４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換反応の結果を経時的に示すグラフである。 図４は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺによる４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。 図５は、各菌体量及び各基質量における４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換活性を示す表である。 図６は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌を１．２Ｌ培養後に反応器内での変換反応による４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換反応の結果を経時的に示したグラフである。 図７は、精製した４－ニトロ桂皮酸のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。 図８は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌の培養液にグルコース、フルクトース及びグルセロールを添加して４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸（４ＡＣＡ）への変換を行った際の結果を示すグラフである。 図９は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌による４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。 図１０は、精製した４ＡＣＡ塩酸塩と４ＡＣＡ（標品）のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。
　以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
　なお、本明細書において「核酸」には、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又は何れの核酸の修飾体も含まれる。また、核酸には、一本鎖又は二本鎖の何れも含まれる。また、本発明に係る核酸（遺伝子）は、当業者に公知の公的機関のデータベース又は本明細書に開示する塩基配列に基づき作製したプライマー又はプローブ等を用いて、当業者に公知の任意の方法で調製することができる。例えば、各種のＰＣＲその他の当業者に公知のＤＮＡ増幅技術を用いることにより、該遺伝子のｃＤＮＡとして容易に得ることができる。あるいは、当業者であれば、本明細書中に開示する配列情報に基づいて、適宜既存技術を用いて、核酸を合成することができる。核酸（遺伝子）は、タンパク質又はポリペプチドをコードするものである。ここで、「コードする」とは、本発明に係るタンパク質又はポリペプチドをその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、本発明に係るタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすることと、該タンパク質を適当な介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者を含む。
［Ｉ．４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する方法］
１．概要
　本発明の第一の要旨は、４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する方法（以下適宜「本発明の第一の方法」と略称する。）に関する。本発明の第一の方法は、少なくとも（１）４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する工程、及び（２）４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する工程を含む。
　グルコースから発酵によりフェニルアラニンを合成する方法（例えば米国特許出願公開第２００１／００４４１３９号：以下文献Ａ、参照）、及び、フェニルアラニンをニトロ化して４－ニトロフェニルアラニンを合成する方法（例えばTakayama et al., BCSJ, 17[3]:109-113：以下文献Ｂ、参照）は、何れも公知である。
　そこで本発明者等は、出発原料として４－ニトロフェニルアラニンに着目し、まずこれを４－ニトロ桂皮酸に変換し、次いでこれを４－アミノ桂皮酸に変換することで、グルコースからフェニルアラニン→４－ニトロフェニルアラニン→４－ニトロ桂皮酸を介して４－アミノ桂皮酸を合成する新規な合成経路を確立できることに想到した。
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　本発明の第一の方法に含まれる２つの工程は、いずれも生物的手法、化学的手法等の各種の方法を用いることができる。
　また、本発明者等は、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する方法の検討に際し、生物由来の広範な酵素を対象として、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する酵素（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）を探索した。探索の結果、本発明者等は、チャノキ（Camellia sinensis）由来の酵素であるＣａｍＰＡＬ、ムラサキ（Lithospermum erythrorhizon）由来の酵素であるＬｉｅＰＡＬ、及び、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）ＪＮ－１由来の酵素であるＲｇＰＡＬを選抜した。
　また、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する方法としては、公知の化学的方法によるニトロ基の還元反応を用いることができるが、本発明者等は更に、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する変換酵素（ニトロレダクターゼ）を探索した。探索の結果、本発明者等は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の酵素であるｓｃＦｒｍ２及びｓｃＨｂｎ１、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）由来の酵素であるｃｄＦＬＤＺ、並びに大腸菌（Escherichia coli）由来の酵素であるｎｆｓＡ及びｎｆｓＢを選抜した。
　更に本発明者等は、これらの酵素を発現する宿主細胞を用いて、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に、次いで４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換することに成功し、本発明の第一の方法を完成させた。
　本発明の第一の方法を、前述した公知の方法である、グルコースの発酵によるフェニルアラニンの合成方法（前記文献Ａ参照）、及び、フェニルアラニンのニトロ化による４－ニトロフェニルアラニンの合成方法（前記文献Ｂ参照）と組み合わせれば、グルコースからフェニルアラニン→４－ニトロフェニルアラニン→４－ニトロ桂皮酸を介する新規な合成経路により、４－アミノ桂皮酸を製造することが可能となる。しかも、後述の実施例に示すように、本発明の第一の方法を介するグルコースからの４－アミノ桂皮酸の合成は、本発明者等による従来法（特許文献２及び３）と比較して、反応速度や反応効率等の面で優れており、有利であると言える。
　以下、本発明の第一の方法について、詳細に説明する。
２．出発物質：４－ニトロフェニルアラニン
　本発明の第一の方法では、出発原料として４－ニトロフェニルアラニンを用いる。４－ニトロフェニルアラニンの種類は制限されず、天然のものでも合成されたものでもよい。４－ニトロフェニルアラニンを合成する種々の手法については後述する。
３．工程（１）：４－ニトロフェニルアラニンの４－ニトロ桂皮酸への変換
　本発明の第一の方法では、まず工程（１）として、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸へと変換する。本工程（１）を実施する手法は制限されず、例えば生物的手法や化学的手法等、任意の手法を用いることができる。中でも、本発明では４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸へと変換する酵素（ニトロフェニルアラニンアンモニアリアーゼ：以下適宜「第一の酵素」という。）を用いて、工程（１）を実施することが好ましい。
　前記第一の酵素の例としては、チャノキ（Camellia sinensis）由来の酵素であるＣａｍＰＡＬ、ムラサキ（Lithospermum erythrorhizon）由来の酵素であるＬｉｅＰＡＬ、及び、酵母ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）ＪＮ－１由来の酵素であるＲｇＰＡＬが挙げられる。ＣａｍＰＡＬタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に、これをコードするＣａｍＰＡＬ遺伝子の塩基配列の例（大腸菌での発現用にコドンを補正したもの）を配列番号２にそれぞれ示す。また、ＬｉｅＰＡＬタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に、これをコードするＬｉｅＰＡＬ遺伝子の塩基配列の例（大腸菌での発現用にコドンを補正したもの）を配列番号４にそれぞれ示す。また、ＲｇＰＡＬタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に、これをコードするＲｇＰＡＬ遺伝子の塩基配列の例（大腸菌での発現用にコドンを補正したもの）を配列番号６にそれぞれ示す。
　ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬは、後述の実施例に示すように、生物由来の既知のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（phenylalanine ammonia lyase：ＰＡＬ）の中から、本発明者等が探索して得られた酵素である。ＰＡＬはフェニルアラニンを基質とし、これを脱アンモニアして桂皮酸を産生する酵素である。ＰＡＬによるフェニルアラニンの脱アンモニアにより桂皮酸を産生する反応と、ここで目的とする４－ニトロフェニルアラニンの脱アンモニアにより４－ニトロ桂皮酸を産生する反応とは、類似するものの、後者では基質のベンゼン環の４位にあるニトロ基が存在する点で異なる。予想外にも、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬは、後述の実施例に示すように、優れた４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換活性を有し、本発明において好適に使用することができる。
　なお、前述のようにＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬは公知の酵素であり、そのアミノ酸配列も公知であるが、これらがニトロ化合物を基質として利用でき、４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換活性を有とすることは、これまで知られておらず、本発明者等が初めて見出した知見である。
　前記第一の酵素の例としては、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬのみならず、それらの類似体であって、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸へと変換する活性を維持するポリペプチドも挙げられる。ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬの類似体としては、例えばそのホモログ（オルソログ及びパラログを含む）、又はそのフラグメントが挙げられる。
　具体的に、第一の酵素は、配列番号１、３、又は５のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列相同性を有することが望ましい。また、第一の酵素は、配列番号１、３、又は５のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが望ましい。
　ここで、２つのアミノ酸配列の「相同性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一又は類似のアミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。
　また、前記第一の酵素は、配列番号１、３、又は５のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。なお、本明細書において「アミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、当該アミノ酸配列中のアミノ酸が、そのポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく改変していることを指す。また、「数個」とは、通常２～５０個、好ましくは２～２０個、より好ましくは２～１０個、更に好ましくは２～５個の変異（欠失、置換又は付加）が存在することを指す。
　また、前記第一の酵素は、配列番号１、３、又は５のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチドであってもよい。なお、本明細書において「ストリンジェントな（stringent）条件」とは、核酸同士の選択的且つ検出可能な特異的結合を可能とする条件であり、塩濃度、溶媒（例えばホルムアミド等の有機溶媒）、温度、その他の公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。なお、「ストリンジェントな条件」は当業者には周知であるが、具体的にはT.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989）Cold Spring Harbor Laboratory等を参照のこと。具体的な「ストリンジェントな条件」の例としては、約４０～４５℃、最適には約４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍＬの剪断変性サケ精子ＤＮＡ中で、且つ、極めて低度及び低度のストリンジェンシーの場合は２５％のホルムアミド、培地及び中度～高度のストリンジェンシーの場合は３５％のホルムアミド、高度及び極めて高度のストリンジェンシーの場合は５０％のホルムアミド中で、標準的なサザンブロッティング法に従って１２～２４時間のハイブリダイゼーションを行う。その後、最終的には担体材料を２×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中で、４５℃（極めて低度のストリンジェンシー）、５０℃（低度のストリンジェンシー）、５５℃（中度のストリンジェンシー）、６０℃（中度～高度のストリンジェンシー）、６５℃（高度のストリンジェンシー）、又は７０℃（極めて高度のストリンジェンシー）で、１５分間ずつ三回洗浄する。なお、ハイブリダイゼーションは、当業界で公知の方法やそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
　前記第一の酵素を調製する方法は制限されない。前記の第一の酵素を産出する生物から目的の酵素を抽出して用いてもよい。また、当業者に公知の公的機関のデータベースに登録されたＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬ遺伝子の塩基配列や、本明細書に開示するＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬ遺伝子の塩基配列（それぞれ配列番号２、４、及び６）を用いて、当業者に公知の各種の手法、例えば化学合成法や遺伝子工学的手法を用いて調製することができる。
　具体的に、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬについては、例えばチャノキ（Camellia sinensis）、ムラサキ（Lithospermum erythrorhizon）、又はロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）ＪＮ－１のゲノムライブラリーから、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）等の核酸増幅技術を用いることにより、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬ遺伝子をコードする核酸を調製した上で、これらを当業者に公知の手法でプラスミドやウイルス等の各種のベクターに組み込み、適切な宿主細胞に遺伝子組換えにより導入して発現させることにより、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬを調製することが可能である。なお、宿主細胞としては、原核細胞でも真核細胞でもよく、原核細胞の場合は真正細菌でも古細菌でもよく、真核細胞の場合は植物細胞でも動物細胞でも真菌細胞でも原生生物細胞でもよい。
　また、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬの類似体については、例えば、当業者に公知の公的機関のデータベースに登録されたＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬ遺伝子の塩基配列や、本明細書に開示するＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬ遺伝子の塩基配列（それぞれ配列番号２、４、及び６）からなる核酸に対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて変異を導入することにより、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬの類似体をコードする核酸を調製する。中でも、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は、特定の位置に特定の変異を導入できることから有用である。こうして得られたＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬの類似体をコードする核酸を、前述と同様に当業者に公知の手法でプラスミドやウイルス等の各種のベクターに組み込み、適切な宿主細胞に遺伝子組換えにより導入して発現させることにより、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、又はＲｇＰＡＬの類似体を調製することが可能である。
　なお、遺伝子工学的な手法については、例えばSambrook,J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等の記載を参照することができる。
　前記第一の酵素を用いて工程（１）を実施する手法は特に制限されない。第一の酵素を、酵素反応を生じさせるような条件下で、４－ニトロフェニルアラニンに作用させ、４－ニトロ桂皮酸へと変換させればよい。なお、４－ニトロフェニルアラニンとしては、４－ニトロフェニルアラニンを含む天然生成物や合成生成物等の組成物を精製せずそのまま用いてもよいが、斯かる組成物から当業者に公知の各種の手法で４－ニトロフェニルアラニンを精製して用いてもよい。
　前記第一の酵素を４－ニトロフェニルアラニンに作用させる手法の例としては、上記手順により調製された第一の酵素を単離・精製して用いてもよいが、前述の手順により第一の酵素を発現するように宿主細胞を改変して得られた遺伝子組換細胞（以下適宜「第一の細胞」という。）をそのまま用いてもよい。後者の場合、特に宿主細胞として細菌を用い、その休止菌体を用いて４－ニトロフェニルアラニンと共存させ、休止菌体に含まれる第一の酵素を４－ニトロフェニルアラニンに作用させて４－ニトロ桂皮酸へと変換させる手法（以下適宜「休止菌体反応」という。）が好ましい。斯かる休止菌体反応については後述する。
　また、第一の酵素を発現する宿主細胞として細菌を用い、その培養液を用いて４－ニトロフェニルアラニンと共存させ、培養液に含まれる第一の酵素を４－ニトロフェニルアラニンに作用させて４－ニトロ桂皮酸へと変換させる手法を取ることもできる。
　前記第一の酵素の酵素反応を生じさせるような条件とは、制限されるものではないが、例えば水性溶媒中であれば、そのｐＨは特に制限はされないが、通常７．５以上、中でも８以上が好ましく、また、通常９．５以下、更には９以下が好ましい。また、反応を行う温度は特に制限はされないが、通常２７℃以上、中でも３０℃以上、更には３２℃以上、また、通常４２℃以下、中でも３７℃以下で反応を行うことが好ましく例示できる。
４．工程（２）：４－ニトロ桂皮酸の４－アミノ桂皮酸への変換
　本発明の第一の方法では、次に工程（２）として、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸へと変換する。本工程（２）を実施する手法も制限されず、例えば生物的手法や化学的手法等、任意の手法を用いることができる。中でも、本発明では４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸へと変換する酵素（ニトロレダクターゼ：以下適宜「第二の酵素」という。）を用いて、工程（２）を実施することが好ましい。
　前記第二の酵素の例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の酵素であるｓｃＦｒｍ２及びｓｃＨｂｎ１、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）由来の酵素であるｃｄＦＬＤＺ、並びに大腸菌（Escherichia coli）由来の酵素であるｎｆｓＡ及びｎｆｓＢ等が挙げられる。ｓｃＦｒｍ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に、これをコードするｓｃＦｒｍ２遺伝子の塩基配列の例を配列番号８にそれぞれ示す。また、ｓｃＨｂｎ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号９に、これをコードするｓｃＨｂｎ１遺伝子の塩基配列の例を配列番号１０にそれぞれ示す。また、ｃｄＦＬＤＺタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１に、これをコードするｃｄＦＬＤＺ遺伝子の塩基配列の例を配列番号１２にそれぞれ示す。また、ｎｆｓＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１３に、これをコードするｎｆｓＡ遺伝子の塩基配列の例を配列番号１４にそれぞれ示す。また、ｎｆｓＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１５に、これをコードするｎｆｓＢ遺伝子の塩基配列の例を配列番号１６にそれぞれ示す。
　ｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、ｃｄＦＬＤＺ、ｎｆｓＡ及びｎｆｓＢは、後述の実施例に示すように、生物由来の既知のニトロレダクターゼ及びエン酸レダクターゼ（enoate reductase）の中から、本発明者等が探索して得られた酵素である。これらの酵素は、予想外にも、後述の実施例に示すように、４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への優れた変換活性を有し、本発明において好適に使用することができる。
　なお、前述のようにｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、ｃｄＦＬＤＺ、ｎｆｓＡ及びｎｆｓＢはニトロレダクターゼ又はエン酸レダクターゼとして公知の酵素であり、そのアミノ酸配列も公知であるが、これらが４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換活性を有し、ニトロレダクターゼとしても使用できることはこれまで知られておらず、本発明者等が初めて見出した知見である。
　前記第二の酵素の例としては、これらの酵素自体のみならず、それらの酵素の類似体であって、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸へと変換する活性を維持するポリペプチドも挙げられる。前記の類似体としては、例えばそのホモログ（オルソログ及びパラログを含む）、又はそのフラグメントが挙げられる。
　具体的に、前記第二の酵素は、配列番号７、９、１１、１３又は１５のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列相同性を有することが望ましい。また、第二の酵素は、配列番号７、９、１１、１３又は１５のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、特に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有することが望ましい。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」については、先に説明したとおりである。
　また、前記第二の酵素は、配列番号７、９、１１、１３又は１５のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されてなるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。なお、本明細書において「アミノ酸配列において１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、先に説明したとおりである。
　また、前記第二の酵素は、配列番号７、９、１１、１３又は１５のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチドであってもよい。なお、本明細書において「ストリンジェントな（stringent）条件」とは、先に説明したとおりである。
　前記第二の酵素を調製する方法は制限されない。前記の第二の酵素を産出する生物から目的の酵素を抽出して用いてもよい。しかし、当業者に公知の公的機関のデータベースに登録された前記第二の酵素の遺伝子の塩基配列や、本明細書に開示する配列番号８、１０、１２、１４及び１６の遺伝子の塩基配列を用いて、当業者に公知の各種の手法、例えば化学合成法や遺伝子工学的手法を用いて調製することができる。その具体的な手法、特に遺伝子工学的な手法については、先に詳述したとおりである。
　前記第二の酵素を用いて工程（２）を実施する手法は特に制限されない。第二の酵素を、酵素反応を生じさせるような条件下で、工程（１）で得られた４－ニトロ桂皮酸に作用させ、４－アミノ桂皮酸へと変換させればよい。なお、工程（１）で得られた４－ニトロ桂皮酸としては、４－ニトロ桂皮酸を含む工程（１）の反応生成物との組成物を精製せずそのまま用いてもよいが、斯かる反応生成物から当業者に公知の各種の手法で４－ニトロ桂皮酸を精製して用いてもよい。
　前記第二の酵素を４－ニトロ桂皮酸に作用させる手法の例としては、上記手順により調製された第二の酵素（ｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、ｃｄＦＬＤＺ、ｎｆｓＡ若しくはｎｆｓＢ又はその類似体）を単離・精製して用いてもよいが、前述の手順により第二の酵素を発現するように宿主微生物を改変して得られた遺伝子組換細胞（以下適宜「第二の細胞」という。）をそのまま用いてもよい。後者の場合、特に宿主として細菌を用い、その休止菌体を用いて４－ニトロ桂皮酸と共存させ、休止菌体に含まれる第二の酵素を４－ニトロ桂皮酸に作用させて４－アミノ桂皮酸へと変換させる手法（休止菌体反応）が好ましい。斯かる休止菌体反応については後述する。また、宿主細胞として細菌を用い、その培養液を用いて４－ニトロ桂皮酸と共存させ、培養液に含まれる第一の酵素を４－ニトロ桂皮酸に作用させて４－アミノ桂皮酸へと変換させる手法も好ましい。この場合、前記の細菌としては大腸菌が好ましい。
　なお、前記第二の酵素の酵素反応を生じさせるような条件とは、制限されるものではないが、例としては以下が挙げられる。即ち、水性溶媒中であれば、そのｐＨは特に制限はされないが、通常６．５以上、中でも７．０以上が好ましく、また、通常８．５以下、更には８．０以下が好ましい。また、反応を行う温度は特に制限はされないが、通常２７℃以上、中でも３０℃以上、更には３２℃以上、また、通常４２℃以下、中でも３７℃以下で反応を行うことが好ましく例示できる。
５．休止菌体反応
　本発明の第一の方法では、前記第一の酵素を用いて工程（１）を実施する際、及び／又は、前記第二の酵素を用いて工程（２）を実施する際に、前記の第一及び／又は第二の酵素を発現する第一及び／又は第二の細胞として細菌の休止菌体を用いた反応（休止菌体反応）を用いることが好ましい（なお、第一の酵素を発現する細菌を以下「第一の細菌」といい、第二の酵素を発現する細菌を以下「第二の細菌」という）。
　ここで、細菌の「休止菌体」とは、斯かる細菌の増殖を伴わない菌体を意味する。休止菌体の例としては、細菌を培養して得られた培養菌体や、斯かる培養菌体を凍結乾燥やスプレードライによって粉末にした粉末菌体、斯かる培養菌体を担体に固定化した固定化菌体等が挙げられる。これらの二種以上を組み合わせて使用してもよい。休止菌体の具体例としては、細菌を培養して得られる培養液を遠心分離によって培養上清と菌体とに分け、得られた菌体を生理食塩水で洗浄し、所望の菌体濁度（例えば６００ｎｍでの吸光度が４０）となるように滅菌精製水に懸濁した休止菌体懸濁液を用いることができる。また、斯かる休止菌体懸濁液を凍結乾燥やスプレードライによって粉末にした粉末菌体や、斯かる培養菌体懸濁液中の培養菌体を担体に固定化した固定化菌体等も用いることができる。
　斯かる第一又は第二の細菌の休止菌体を、対応する基質（第一の細菌の場合は４－ニトロフェニルアラニン、第二の細菌の場合は４－ニトロ桂皮酸）又はこれを含む組成物（例えば天然生成物、反応生成物等）と、第一又は第二の酵素の酵素反応を生じさせるような条件下で共存させることにより、第一又は第二の細菌の休止菌体に含まれる第一又は第二の酵素を対応する基質に作用させる。第一又は第二の酵素の酵素反応を生じさせるような条件とは、制限されるものではないが、例えばｐＨが通常６．５以上、中でも７以上、また、通常９．５以下、更には９以下の水性溶媒中、通常２７℃以上、中でも３０℃以上、更には３２℃以上、また、通常４２℃以下、中でも３７℃以下の温度で反応を行うことが好ましく例示できる。
　なお、本発明の第一の方法では、工程（２）において４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸へと変換する手法として、化学的手法を用いることもできる。化学的手法としては、特に限定されることはなく、既知の方法を用いることができる。具体例としては、ニトロ基をアミノ基に変換する化学反応を用いて、４－ニトロ桂皮酸のニトロ基を還元すればよい。ニトロ基の還元方法としては、特に限定はされないが、例えばＢｅｃｈａｍｐ法（例えばA. J. Ann. Chim. Phys. 1854, 42, 186.）や、不均一系接触還元法等の公知の方法を用いることができる。なお、４－ニトロ桂皮酸としては、前記工程（１）で得られた４－ニトロ桂皮酸をそのまま用いてもよいが、公知の方法で適宜精製してから用いてもよい。
６．その他
　以上の手順により、（１）４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する工程、及び（２）４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する工程を実施することにより、４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造することができる。なお、工程（２）の終了後、当業者に公知の各種の手法で反応生成物から４－アミノ桂皮酸を単離・精製してもよい。
　なお、以上の説明はあくまでも本発明の第一の方法の実施の一態様に過ぎない。当業者であれば容易に理解するように、上述の態様に適宜変更を加えて、本発明の第一の方法を実施することが可能である。
　例えば、本発明の第一の方法では、前記工程（１）と前記工程（２）を適宜組み合わせて実施することができる。その組合せは限定されるものではないが、通常は、前記工程（１）において前記第一の酵素を用いた酵素反応を実施し、前記工程（２）において前記第二の酵素を用いた酵素反応又は前記の化学的手法を実施する。このうち前記工程（１）では、前記第一の細菌の共存下で酵素反応を行う方法、又は、第一の細菌の休止菌体反応を行うことが好ましい。
　なお、前記工程（１）で第一の細菌の共存下で酵素反応を行う場合は、前記工程（２）では前記第二の細菌の共存下で酵素反応を行うか、又は化学的手法で行うことが好ましい。中でも、前記第二の細菌の共存下で酵素反応を行えば、一貫で双方の酵素反応を行うことができ、効率面でより好ましい。また、この場合には第二の細菌として大腸菌を用いることが、コスト低減の観点で更に好ましい。
　一方、前記工程（１）で第一の細菌の休止菌体を行う場合には、前記工程（２）では前記第二の細菌の休止菌体反応を行うか、又は化学的手法を行うことが好ましい。中でも、化学的手法で行うことが、４－ニトロ桂皮酸の４－アミノ桂皮酸への変換効率、生産コスト（原材料費、設備投資費、及び人件費等）、及び生産時のＣＯ２削減等の点でより好ましい。
　また、以上の説明では工程（１）の実施後に工程（２）を実施する態様を説明したが、工程（１）と工程（２）とを同時に実施することも可能である。この場合、第一及び第二の酵素を、酵素反応を生じさせるような条件下で４－ニトロフェニルアラニンに作用させ、第一の酵素による４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換と、第二の酵素による４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換とを並行して実施すればよい。この場合、単離・精製した第一及び第二の酵素を併用してもよく、第一及び第二の酵素をそれぞれ発現する第一及び第二の細胞を併用してもよく、更には、第一及び第二の酵素を共に発現する単一の遺伝子組換細胞を用いてもよい（これを以下「第三の細胞」という）。第一及び第二の酵素を共に発現する第三の細胞は、第一及び第二の酵素をコードする遺伝子、或いはこれらの遺伝子をそれぞれ担持する第一及び第二のベクターを、単一の宿主細胞に導入し、第一及び第二の酵素を共に発現するように宿主細胞を改変して得ることができる。
［II．グルコースから４－アミノ桂皮酸を製造する方法］
　本発明の第二の要旨は、グルコースから４－アミノ桂皮酸を製造する方法（以下適宜「本発明の第二の方法」と略称する。）に関する。本発明の第二の方法は、少なくとも（ａ）グルコースからフェニルアラニンを産生する工程、（ｂ）前記（ａ）で得られたフェニルアラニンをニトロ化して４－ニトロフェニルアラニンに変換する工程、及び、（ｃ）本発明の第一の方法により、前記（ｂ）で得られた４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する工程を含む。
　工程（ａ）における、グルコースからフェニルアラニンを合成する方法としては、例えば前記の文献Ａに記載の方法を用いることができる。
　工程（ｂ）における、フェニルアラニンから４－ニトロフェニルアラニンを合成する方法としては、例えば前記の文献Ｂに記載の方法を用いることができる。
　工程（ｃ）における、４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を合成する方法としては、前述した本発明の第一の方法を用いることができる。
［III．フェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する方法］
　本発明の第三の要旨は、フェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する方法（以下適宜「本発明の第三の方法」と略称する。）に関する。本発明の第三の方法は、少なくとも（ｂ）フェニルアラニンをニトロ化して４－ニトロフェニルアラニンに変換する工程、及び、（ｃ）本発明の第一の方法により、前記（ｂ）で得られた４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する工程を含む。
　工程（ｂ）における、フェニルアラニンから４－ニトロフェニルアラニンを合成する方法については、本発明の第二の方法について前述したとおりである。
　工程（ｃ）における、４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を合成する方法としては、前述した本発明の第一の方法を用いることができる。
［IV．４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸を製造する方法］
　本発明の第四の要旨は、フェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸を製造する方法（以下適宜「本発明の第四の方法」と略称する。）に関する。本発明の第四の方法は、少なくとも前述の第一の酵素を用いて、フェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する工程を含む。斯かる工程の詳細については、本発明の第一の方法の工程（１）として先に詳述したとおりである。
［Ｖ．４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸を製造する方法］
　本発明の第五の要旨は、４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸を製造する方法（以下適宜「本発明の第五の方法」と略称する。）に関する。本発明の第五の方法は、少なくとも前述の第二の酵素を用いて、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する工程を含む。斯かる工程の詳細については、本発明の第一の方法の工程（２）として先に詳述したとおりである。
［VI．ベクター］
　本発明の第六の要旨は、前述の第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子を担持するベクター（なお、第一の酵素をコードする遺伝子を担持するベクターを以下「第一のベクター」といい、第二の酵素をコードする遺伝子を担持するベクターを以下「第二のベクター」といい、第一の酵素をコードする遺伝子及び第二の酵素をコードする遺伝子を共に担持するベクターを以下「第三のベクター」という。）に関する。
　第一～第三のベクターは、前述の第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子を担持すると共に、これらの遺伝子を宿主細胞内に導入し、発現可能な状態とすることが可能であれば、その種類は限定されない。例えば、宿主細胞のゲノム内に組み込まれるベクターでも、宿主細胞の細胞質内に取り込まれつつ、宿主細胞のゲノムとは独立に共存し、宿主細胞の細胞分裂に従って自律的に複製するベクターであってもよい。また、線状ベクターでも環状ベクターでもよく、一本鎖ベクターでも二本鎖ベクターでもよく、ＤＮＡベクターでもＲＮＡベクターでもよい。更には、プラスミドベクターでも、コスミドベクターでも、フォスミドベクターでも、ウイルスベクターでも、人工染色体ベクターでも、アグロバクテリウム等の細菌ベクターでも、更にはこれら複数の組合せによるバイナリーベクターでもよい。斯かるベクターの種類や構成、構築法等は当業者には周知であり、遺伝子や宿主微生物細胞等の条件に応じて適宜選択すればよい。
　第一～第三のベクターは、前述の第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子に加えて、宿主細胞中で前記遺伝子の発現を調節する調節配列を更に含むことが好ましい。斯かる調節配列としては、プロモータ、ターミネータ、エンハンサ、ポリＡ付加シグナル、５’－ＵＴＲ（非翻訳領域）、標識又は選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等が挙げられる。第一～第三のベクターにおいては、これらの調節配列が、前述の第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子と作動可能に連結されることにより、宿主細胞中で前記遺伝子を自律的に発現することが可能な発現カセットとして構築されることが好ましい。斯かる調節配列の種類や構成、構築法等は当業者には周知であり、遺伝子や宿主細胞等の条件に応じて適宜選択すればよい。
［VII．細胞］
　本発明の第七の要旨は、前述の第一及び／又は第二の酵素を発現するよう宿主細胞を改変して得られる細胞（なお、前述のように、第一の酵素を発現する細胞を「第一の細胞」といい、第二の酵素を発現する細胞を「第二の細胞」といい、第一及び第二の酵素を共に発現する細胞を「第三の細胞」という。）に関する。
　第一～第三の細胞の元となる宿主細胞の種類は制限されず、原核細胞でも真核細胞でもよく、原核細胞の場合は真正細菌でも古細菌でもよく、真核細胞の場合は植物細胞でも動物細胞でも真菌細胞でも原生生物細胞でもよい。但し、前述の休止菌体反応を行う場合には、宿主細胞としては細菌を用いることが好ましい。
　これらの宿主細胞に第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子を導入することにより、第一及び／又は第二の酵素を発現する第一～第三の細胞を得ることができる。導入する遺伝子としては、前述の第一及び／又は第二の酵素をコードする遺伝子をそのまま用いてもよく、或いはこれらの遺伝子を担持する前記の第一～第三のベクターを用いてもよい。遺伝子導入の手法としては、宿主細胞にベクターを感染させる方法や、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（ボンバードメント）法、バキュームインフィルトレーション法等の物理的手法、更にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集法等を用いることができる。
　こうして得られた第一～第三の細胞は、第一及び／又は第二の酵素を一過的に発現するものであってもよく、恒常的に発現するものであってもよい。また、多細胞真核生物の細胞の場合は、これらの遺伝子を発生の全ての段階で発現するものであってもよく、特定の段階のみで発現するものであってもよい。更には、これらの遺伝子を全ての組織・器官で発現するものであってもよく、特定の組織・器官のみで発現するものであってもよい。こうした遺伝子発現時期・部位の制御は、例えば調節配列を適切に選択することにより行うことができる。
　なお、本発明における第一～第三の細胞には、第一及び／又は第二の酵素を発現するよう改変された第一世代の細胞のみならず、斯かる細胞が分裂して得られた次代以降の細胞や、更には斯かる細胞を含む当初個体の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫（クローンを含む）の細胞も含まれることとする。また、植物細胞の場合には、当初植物体の繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）から作出される子孫（クローンを含む）の細胞も含まれることとする。
　以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
　なお、以下の実験では特に別記無き限り、大腸菌（Escherichia coli）株としてＢＬ２１（ＤＥ３）［Novagen, 遺伝子型F-, ompT, hsdSB (rB-mB-), gal (λcI857, ind1, Sam7, nin5, lacUV5-T7gene1), dcm (DE3)］を使用した。また、大腸菌の培養には以下の組成のＬＢ培地（ｐＨ７．０）、又はこれに別記の成分を添加した培地を、オートクレーブを用いて１２１℃、１５分間滅菌してから用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　なお、以下の各実施例で使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の測定条件吸光光度計による酵素活性の評価条件を以下に記す。
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定条件］
　装置：　　　Hewlett Packerd社製　1200 infinity series
　カラム：　　Millipore-Merck社製　Purospher STAR RP-18 endcapped カラム
　検出波長：　２８０ｎｍ
　溶離液Ａ：　２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）
　溶離液Ｂ：　１００％メタノール
　プログラム：　０分（Ａ：Ｂ＝９８％：２％）
　　　　　　　　７分（Ａ：Ｂ＝９８％：２％）
　　　　　　　１２分（Ａ：Ｂ＝５０％：５０％）
　　　　　　　１７分（Ａ：Ｂ＝５０％：５０％）
　　　　　　　１９分（Ａ：Ｂ＝９８％：２％）
　　　　　　　２３分（Ａ：Ｂ＝９８％：２％）
［吸光光度計による酵素活性の評価条件］
　装置　　：BECKMAN COULTER社製DU800 UV/Vis Spectrophotometer
　酵素量　：２ｍｇ／ｍＬ
　緩衝溶液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．６）
　基質濃度：０．３ｍＭ～９．６ｍＭ
　容量　　：２００μＬ
　測定波長：４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸 ３８０ｎｍ
　フェニルアラニンから桂皮酸 ３０５ｎｍ
　測定時間：１０分
　測定温度：２５℃
〔実施例１〕
［Ｉ．４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換］
１．プラスミドの構築及び大腸菌への導入
（１）ｐＥＴ２８ａ－ＣａｍＰＡＬの構築及び大腸菌への導入
　チャノキ（Camellia sinensis）由来の酵素であるＣａｍＰＡＬを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成し、引き続き制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにより制限処理した。この制限処理したＣａｍＰＡＬを、制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩにより制限処理したプラスミドｐＥＴ２８ａ（Novagen社製）（以下、制限処理ｐＥＴ２８ａという）に対して、ＤＮＡライゲーションキットLigation High Ver.2（東洋紡社製）を用いて連結し、ｐＥＴ２８ａ－ＣａｍＰＡＬを作製した。得られたｐＥＴ２８ａ－ＣａｍＰＡＬを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株を培養してＣａｍＰＡＬを発現させた。
（２）ｐＥＴ２８ａ－ＬｉｅＰＡＬの構築及び大腸菌への導入
　ムラサキ（Lithospermum erythrorhizon）由来の酵素であるＬｉｅＰＡＬを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成した。得られたＬｉｅＰＡＬを、前記ＣａｍＰＡＬの制限処理に用いたものと同じ制限酵素を用いて制限処理した。以下、制限処理したＬｉｅＰＡＬを用いた以外は、前記のｐＥＴ２８ａ－ＣａｍＰＡＬの作製手順と同様の方法で前記制限処理ｐＥＴ２８ａと連結し、ｐＥＴ２８ａ－ＬｉｅＰＡＬを作製した。以下、上記同様の方法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたＬｉｅＰＡＬ産生大腸菌株を培養してＬｉｅＰＡＬを発現させた。
（３）ｐＥＴ２８ａ－ＲｇＰＡＬの構築及び大腸菌への導入
　ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）ＪＮ－１由来の酵素であるＲｇＰＡＬを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成した。得られたＲｇＰＡＬを、前記ＣａｍＰＡＬの制限処理に用いたものと同じ制限酵素により制限処理した。以下、制限処理したＲｇＰＡＬを用いた以外は、前記のｐＥＴ２８ａ－ＣａｍＰＡＬの作製手順と同様の方法で、前記制限処理ｐＥＴ２８ａと連結し、ｐＥＴ２８ａ－ＲｇＰＡＬを作製した。得られたｐＥＴ２８ａ－ＲｇＰＡＬを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたＲｇＰＡＬ産生大腸菌株を培養してＲｇＰＡＬを発現させた。
２．精製ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬの酵素活性の評価
　前記のＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬ産生大腸菌株をそれぞれ、３０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、２８℃で１６時間培養した（以下、前培養ということがある）。その後、これを同培地２００ｍＬに植菌し、Ｏ．Ｄ６００が０．６になるまで培養後、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside：ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、さらに３０℃において２０時間培養した。これらの培養の際の回転数は１２０ｒｐｍとした。培養した菌体を集菌し、０．５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝７．５）に懸濁し、超音波破砕を行なった。引き続き遠心分離の後に、その上清をＨｉｓ－Ｔｒａｐカラムを用いて精製し、得られた酵素を活性測定に用いた。
　酵素活性は、吸光光度計を用いて反応生成物の吸収波長の吸光度を１０分間測定することによって測定し定量した。具体的に、フェニルアラニンに対する脱アンモニア酵素活性については、０．３から９．６ｍＭのフェニルアラニンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．６）に前記の各酵素を２ｍｇ／ｍＬ加えて反応させ、桂皮酸の生成に由来する３０５ｎｍの波長の吸光度の変化を１０分間測定した。４－ニトロフェニルアラニンに対する脱アンモニア酵素活性については、０．３から９．６ｍＭの４－ニトロフェニルアラニンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．６）に前記の各酵素を２ｍｇ／ｍL加えて反応させ、４－ニトロ桂皮酸の生成に由来する３８０ｎｍの波長の吸光度を１０分間測定して定量した。
　図１は、大腸菌での組換産生後に精製したＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）及び４－ニトロフェニルアラニン（ｎ－Ｐｈｅ）に対する脱アンモニア酵素比活性、Ｋｍ、Ｋｃａｔ、及びＫｍ／Ｋｃａｔを示す表である。ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬの何れも、４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換活性を有することが分かる。
３．ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬの休止菌体反応による酵素活性の評価
　前記のＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬ産生大腸菌株をそれぞれ、４０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を含む３ｍＬのＬＢ培地を用い、３００ｒｐｍの撹拌、２８℃の条件において１６時間前培養した。この前培養液１ｍＬを４０ｍｇ／Ｌのカナマイシン硫酸塩を含む１００ｍＬのＬＢ培地に植菌し、１２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４時間培養した後、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に２０時間培養した。得られた菌体を反応バッファー（１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．５）で２回洗浄した。
　得られた休止菌体を、反応バッファーに懸濁し、３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で反応させた。２４時間毎に培地に２０ｍＭの４－ニトロフェニルアラニンを追加し、連続して反応させた。定期的に反応上清を採取し、４－ニトロフェニルアラニン及び４－ニトロ桂皮酸の定量を行った。
　上清を遠心管に写し、遠心分離によって回収し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応生成物を定量した。
　また、対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。
　図２は、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬ産生大腸菌株の休止菌体反応による２４時間後の反応上清中の４－ニトロ桂皮酸量を示すグラフである。ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬ産生大腸菌株の何れの休止菌体を用いた場合でも、対照の大腸菌と比べて反応上清中の４－ニトロ桂皮酸量が顕著に上昇しており、ＣａｍＰＡＬ、ＬｉｅＰＡＬ、及びＲｇＰＡＬによる４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換が進行したことが分かる。
　図３は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株の休止菌体反応による反応上清中の４－ニトロフェニルアラニン量及び４－ニトロ桂皮酸量の経時変化を示すグラフである。反応上清中の４－ニトロフェニルアラニン量は２４時間毎に添加に伴い増加するものの、その後は次回添加まで徐々に減少すると共に、反応上清中の４－ニトロ桂皮酸は継続的に増加していることが分かる。ここから、ＣａｍＰＡＬによる４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換が継続的に進行したことが分かる。
［II．４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換］
１．プラスミドの構築及び大腸菌への導入
（１）ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１－ｓｃＦｒｍ２の構築及び大腸菌への導入
　サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の酵素であるｓｃＦｒｍ２（アミノ酸配列を配列番号７、塩基配列の例を配列番号８にそれぞれ示す。）を、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のゲノムライブラリーから、プライマー５’－ＡＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣ－３’（配列番号１７）及び５’－ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＴＡＡＡＣＧＴＴＧＡＴＴＡＣＧ－３’（配列番号１８）を用いてＰＣＲにより増幅した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIにより制限処理し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIにより制限処理したプラスミドｐＲＳＦＤｕｅｔ－１（Novagen）に対して、ＤＮＡライゲーションキットLigation High Ver.2（東洋紡社製）を用いて連結し、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１－ｓｃＦｒｍ２を作製した。得られたｐＲＳＦＤｕｅｔ－１－ｓｃＦｒｍ２を、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたｓｃＦｒｍ２産生大腸菌株を培養してｓｃＦｒｍ２を発現させた。
（２）ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１－ｓｃＨｂｎ１の構築及び大腸菌への導入
　サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来の酵素であるｓｃＨｂｎ１（アミノ酸配列を配列番号９、塩基配列の例を配列番号１０にそれぞれ示す。）を、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のゲノムライブラリーから、プライマー５’－ＡＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＡＡＣ－３’（配列番号１９）及び５’－ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＡＡＧＡＴＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧ－３’（配列番号２０）を用いてＰＣＲにより増幅した後、前記ｓｃＦｒｍ２の制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１－ｓｃＨｂｎ１を作製した。得られたｐＲＳＦＤｕｅｔ－１－ｓｃＨｂｎ１を、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたｓｃＨｂｎ１産生大腸菌株を培養してｓｃＨｂｎ１を発現させた。
（３）ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１－ｃｄＦＬＤＺの構築及び大腸菌への導入
　クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）由来の酵素であるｃｄＦＬＤＺ（アミノ酸配列を配列番号１１、塩基配列の例を配列番号１２にそれぞれ示す。）を、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）のゲノムライブラリーから、プライマー５’－ＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＡＡＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＡＴＧ－３’（配列番号２１）及び５’－ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＡＴＧＣＴＡＣ－３’（配列番号２２）を用いてＰＣＲにより増幅した後、前記ｓｃＦｒｍ２の制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１－ｃｄＦＬＤＺを作製した。得られたｐＲＳＦＤｕｅｔ－１－ｃｄＦＬＤＺを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたｃｄＦＬＤＺ産生大腸菌株を培養してｃｄＦＬＤＺを発現させた。
２．ｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺの休止菌体反応による酵素活性の評価
　前記のｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺ産生大腸菌株をそれぞれ、３０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を含む３ｍＬのＬＢ培地を用い、３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で１６時間前培養した。この前培養液１ｍＬを３０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を含む１００ｍＬのＬＢ培地に植菌し、１２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に２０℃で１２時間培養した。得られた菌体を反応バッファー（１００ｍＭリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１ｍＭ硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、０．５ｍＭ塩化チアミン、ｐＨ７．０）で２回洗浄した。
　得られた休止菌体を、２．５ｍＭの４－ニトロ桂皮酸を含む反応バッファーに懸濁し、３００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で１２時間反応させた。反応後、反応上清を採取し、４－アミノ桂皮酸の定量を行った。上清を遠心管に写し、遠心分離によって回収し、前記ＨＰＬＣを用いて反応生成物を定量した。
　また、対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。
　図４は、大腸菌での組換産生後に休止菌体反応に供したｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺによる４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフを図４に示す。ｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺ産生大腸菌株の何れの休止菌体を用いた場合でも、対照の大腸菌と比べて培地上清中の４－アミノ桂皮酸量が顕著に上昇しており、ｓｃＦｒｍ２、ｓｃＨｂｎ１、及びｃｄＦＬＤＺによる４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換が進行したことが分かる。また、対照の大腸菌は４－アミノ桂皮酸を生産していた。この結果より、大腸菌は４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への還元反応を生じさせる能力を有していることが証明された。
〔実施例２〕
［III．４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換］
１．ＣａｍＰＡＬの菌体量と基質量の違いによる変換効率の評価
　実施例１に記載のＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株を、４０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を含む５ｍＬのＬＢ培地を用い、攪拌速度３００ｒｐｍの撹拌、２８℃の条件において１６時間前培養した。この前培養液１ｍＬを、以下の組成を有する１００ｍＬのＴＢ培地に、８０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を加えた後に植菌し、１２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に２０時間培養した。遠心分離によって培養液から菌体を回収した後、－８０℃で保存した。得られた凍結菌体を１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ及び３０ｇ／Ｌに計量した。さらに、基質である４－ニトロフェニルアラニンを４．２ｇ／Ｌ、２１ｇ／Ｌ、４２ｇ／Ｌを計量した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　それぞれの菌体と基質を反応バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．５）に懸濁し、３００ｒｐｍの撹拌、３７℃の条件において休止菌体反応させた。２４時間反応後の反応液を採取し、４－ニトロフェニルアラニン及び４－ニトロ桂皮酸の定量を行った。それぞれの反応生成物の定量は、得られた（菌体）反応液の上清を遠心管に移し、遠心分離によって回収し、前記ＨＰＬＣを用いて反応生成物を定量した。
　図５は、それぞれの菌体量と基質量を反応バッファーに懸濁し、２４時間反応させた結果を示した。この結果から、菌体量２０ｇ／Ｌ及び３０ｇ／Ｌ、且つ、基質量２１ｇ／Ｌの場合に、収率が６０％以上と高い４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換効率を示した。
２．４－ニトロフェニルアラニンの４－ニトロ桂皮酸への変換反応
　２Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製：ＢＮＲ－Ｃ－２ＬＳ）を反応器とし、実施例１に記載のＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株（菌体量２０ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌ）を用いて、基質である４－ニトロフェニルアラニン（基質量２１ｇ／Ｌ）を４－ニトロ桂皮酸へと変換する反応を行った。
　具体的には、前記ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株を、１５ｍＬのＬＢ培地に４０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を添加して用い、３００ｒｐｍで撹拌しながら、２８℃で１６時間前培養した。この前培養液１２ｍＬを、８０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を加えた１.２ＬのＴＢ培地を含む２Ｌジャーファーメンターに植菌し、通気量３．５Ｌ／分、撹拌速度５００ｒｐｍ、３０℃の条件において４時間培養した。引き続き、この培養液に０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に２０時間培養した。培養液のＯ．Ｄ６００の値から菌体量を計算したところ、３０ｇ／Ｌであった。
　培養終了後、培養液に基質である２１ｇ／Ｌの４－ニトロフェニルアラニンを添加した後、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ８．５に調整した。通気をすることなくこの培養液を５００ｒｐｍの撹拌、３７℃の条件において２４時間反応させた。反応中の反応液を採取し、以下の方法で４－ニトロフェニルアラニン及び４－ニトロ桂皮酸を定量した。即ち、反応液を遠心管に移し、遠心分離によって上清を回収し、前記条件のＨＰＬＣを用いて反応生成物を定量した。
　図６は、２４時間反応させた後の反応液の分析結果を示すグラフである。この結果から、２１ｇ／Ｌの４－ニトロフェニルアラニンから１８ｇ／Ｌの４－ニトロ桂皮酸へと、高い変換効率で変換されたことが示された。また、通気量を０．０４Ｌ／分に変更して同様の反応を２４時間行った結果、２１ｇ／Ｌの４－ニトロフェニルアラニンから１２ｇ／Ｌの４－ニトロ桂皮酸へと、高い変換効率で変換されたことが示された。
　ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌の１．２Ｌ反応液から４－ニトロ桂皮酸の精製を行った。２４時間反応させた後、遠心分離によって菌体を除き、反応液上清に１２Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨ５に調整することで析出物を得た。析出物を濾過にて回収後、アセトンで洗浄して乾燥させた。乾燥後に回収した固体生成物を、前記条件のＨＰＬＣ分析に供した。
　図７は、得られた生成物のＨＰＬＣ分析結果を示すグラフである。この結果によれば、生成物は４－ニトロ桂皮酸であり、４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸への変換反応が生じたことが示された。また、得られた４－ニトロ桂皮酸の純度は９７％、収率は９３％と、極めて高純度且つ高収率であることが分かった。特に、得られた４－ニトロ桂皮酸の純度は、化学的な還元の手法によって４－アミノ桂皮酸に変換するのに十分な純度である。
〔実施例３〕
［IV．４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸への変換反応］
１．４－ニトロ桂皮酸の４－アミノ桂皮酸への変換に適した炭素源の探索
　大腸菌はニトロレダクターゼ（ｎｆｓＡ及びｎｆｓＢ）を有していることが知られている。そこで、大腸菌を用いて４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への還元反応を行った。
　まず、実施例１に記載のＣａｍＰＡＬ産生大腸菌株を、実施例２と同様の方法によって１６時間前培養した。この前培養液１ｍＬを、８０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を加えた１００ｍＬのＴＢ培地に植菌し、１２０ｒｐｍの攪拌、３０℃の条件において４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に１６時間培養した。得られた培養液に２ｇ／Ｌの４－ニトロ桂皮酸を添加し、２Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ８に調整後、炭素源としてグルコース、フルクトース及びグリセロールを終濃度１０％となるように添加して、３００ｒｐｍの撹拌、３７℃の条件において培養し、２４時間反応させた。
　反応中の反応液を採取し、４－アミノ桂皮酸の定量を行った。即ち、反応液を遠心管に移し、遠心分離によって上清を回収し、前記ＨＰＬＣを用いて反応生成物を定量した。
　図８は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌の培養液にグルコース、フルクトース及びグルセロールを終濃度１０％添加した際の４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換反応を示すグラフである。この結果より、グルセロールを添加した場合に最も多くの４－アミノ桂皮酸が得られることが示された。また、この４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換反応の際に添加する炭素源としては、グリセロールが適していることが分かった。
２．４－ニトロフェニルアラニンの４－アミノ桂皮酸の変換
　１Ｌジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製：ＢＭＪ－０１）を用いて、上記のグリセロールを添加した条件下で、４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸への変換を行った。実施例２の前培養液５ｍＬを、８０ｍｇ／Ｌカナマイシン硫酸塩を加えた０．５ＬのＴＢ培地を含む１Ｌジャーファーメンターに植菌し、通気量を０．７Ｌ／分、６４５ｒｐｍの撹拌、３０℃の条件において４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に２０時間培養した。
　培養終了後、培養液に７ｇ／Ｌの４－ニトロフェニルアラニン及び終濃度１０％のグリセロールを添加した後、２Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ８．５に調整した。０．０２Ｌ／分の通気量、６４５ｒｐｍの撹拌及び３７℃の条件において３６時間反応させた。ｐＨは８．０より低くなった場合は、２Ｎ ＮａＯＨを添加した。反応中の反応液を採取し、４－ニトロフェニルアラニン、４－ニトロ桂皮酸及び４－アミノ桂皮酸の定量を行った。
　図９は、ＣａｍＰＡＬ産生大腸菌による４－ニトロフェニルアラニンの４－アミノ桂皮酸への変換活性を示すグラフである。この結果より、７ｇ／Ｌの４－ニトロフェニルアラニンを原料として４．７ｇ／Ｌの４－アミノ桂皮酸を生産できることが示された。
　０．５Ｌの反応液から４－アミノ桂皮酸の精製を行った。２４時間反応させた反応液から、遠心分離によって菌体を除き、得られた上清に１２Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨ３に調整し、６００ｍＬの反応液上清に強酸性陽イオン交換樹脂（三菱ケミカル社製：ダイヤイオンＰＫ２１２ＬＨ）を７００ｇ添加して、１時間撹拌した。樹脂を回収して、樹脂量の２倍量の蒸留水で洗浄し、さらに樹脂量の２倍量のエタノールで洗浄した。樹脂量の１．５倍量の７．５％アンモニア水を加えて４－アミノ桂皮酸を溶出させた。さらに、０．５倍量の７．５％アンモニア水を加えて樹脂をリンス後、４－アミノ桂皮酸を含む溶出液を得た。溶出液をエバポレータ―で濃縮後、１２Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ３に調整した。その後、等量の酢酸エチルを添加して１時間撹拌させ、遠心分離によって酢酸エチル層を回収した。エバポレータ―を用いて酢酸エチルを除去し、４－アミノ桂皮酸の粗精製物を回収した。
　４－アミノ桂皮酸の粗精製物をアセトンに溶解後、濾過で不溶解物質を除き、１２Ｎ ＨＣｌを加えて４－アミノ桂皮酸の塩酸塩を析出させた。これを濾過にて回収後、アセトンを用いて洗浄・乾燥させて固体乾燥物を得た。乾燥後に回収した固体生成物を、前記条件のＨＰＬＣ分析に供した。
　図１０は、得られた生成物及び４－アミノ桂皮酸（標品）のＨＰＬＣ分析の結果を示すグラフである。この結果によれば、生成物は４－アミノ桂皮酸であり、大腸菌のニトロレダクターゼ（還元反応）を利用した４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸への変換反応が生じたことが示された。また、得られた４－アミノ桂皮酸の純度は９８％と、極めて高純度であることが分かった。４－アミノ桂皮酸の回収率は６０％であった。
〔実施例４〕
［４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換］
１．プラスミドの構築及び大腸菌への導入
（１）ｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ－１－ｎｆｓＡの構築及び大腸菌への導入
　大腸菌（Escherichia coli）由来の酵素であるｎｆｓＡ（アミノ酸配列を配列番号１３、塩基配列の例を配列番号１４にそれぞれ示す。）を、大腸菌（Escherichia coli）のゲノムライブラリーから、プライマー５’－ＣＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＧＣＣＡＡＣＣＡＴＴＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＧ－３’（配列番号２３）及び５’－ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＧＣＧＴＣＧＣＣＣＡＡＣＣＣＴＧ－３’（配列番号２４）を用いてＰＣＲにより増幅した後、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより制限処理し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより制限処理したプラスミドｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ－１（Novagen）に対して、ＤＮＡライゲーションキットLigation High Ver.2（東洋紡社製）を用いて連結し、ｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ－１－ｎｆｓＡを作製した。得られたｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ－１－ｎｆｓＡを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたｎｆｓＡ産生大腸菌株を培養してｎｆｓＡを発現させた。
（２）ｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ－１－ｎｆｓＢの構築及び大腸菌への導入
　大腸菌（Escherichia coli）由来の酵素であるｎｆｓＢ（アミノ酸配列を配列番号１５、塩基配列の例を配列番号１６にそれぞれ示す。）を、大腸菌（Escherichia coli）のゲノムライブラリーから、プライマー５’－ＣＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＣＧＣＣ－３’（配列番号２５）及び５’－ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＴＴＣＧＧＴＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧ－３’（配列番号２６）を用いてＰＣＲにより増幅した後、前記ｎｆｓＡの制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、ｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ－１－ｎｆｓＡを作製した。得られたｐＣＤＦ Ｄｕｅｔ－１－ｎｆｓＢを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。得られたｎｆｓＢ産生大腸菌株を培養してｎｆｓＢを発現させた。
２．ｎｆｓＡ、及びｎｆｓＢの休止菌体反応による酵素活性の評価
　前記のｎｆｓＡ及びｎｆｓＢ産生大腸菌株をそれぞれ、４０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン硫酸塩を含む５ｍＬのＬＢ培地を用い、３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で１６時間前培養した。この前培養液１ｍＬを、８０ｍｇ／Ｌストレプトマイシン硫酸塩を含む１００ｍＬのＴＢ培地に植菌し、１２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で４時間培養した後、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、更に３０℃で１８時間培養した。
　得られた菌体を含む培養液に２Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨ８．０に調整し、この培養液に２ｇ／Ｌの４－ニトロ桂皮酸及び終濃度２％のグリセロールを懸濁し、１２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１８時間反応させた。反応後、反応液上清を採取し、４－アミノ桂皮酸の定量を行った。上清を遠心管に写し、遠心分離によって回収し、前記ＨＰＬＣを用いて反応生成物を定量した。
　また、対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。
　結果より、ｎｆｓＡ産生大腸菌株は０．２６ｇ／Ｌの４－アミノ桂皮酸に変換し、ｎｆｓＢ産生大腸菌株は０．７６ｇ／Ｌの４－アミノ桂皮酸に変換し、対照の大腸菌株は０．３２ｇ／Ｌの４－アミノ桂皮酸に変換した。ｎｆｓＡ及びｎｆｓＢによる４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸への変換が進行したことが分かる。
　本発明は、バイオマス等のグルコースからの４－アミノ桂皮酸の合成が求められる分野において広く利用でき、産業上の有用性は高い。

Claims (22)

  1. 　４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
    （１）４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換し、
    （２）４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する
    ことを含む方法。
  2. 　前記（１）の変換が、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記（１）の変換が、前記第１の酵素を発現するよう改変された第１の宿主細胞を用いて行われる、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記第１の宿主細胞が微生物である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記微生物が細菌である、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記（１）の変換が、前記第１の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記（２）の変換が、配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を用いて行われる、請求項１～６の何れか一項に記載の方法。
  8. 　前記（２）の変換が、前記第２の酵素を発現する第２の宿主細胞を用いて行われる、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記第２の宿主細胞が、前記第２の酵素を発現するよう改変された宿主細胞である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記第２の宿主細胞が微生物である、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　前記微生物が細菌である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記（２）の変換が、前記第２の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記休止菌体が培養菌体、粉末菌体、及び固定化菌体からなる群から選択される、請求項６又は１２に記載の方法。
  14. 　前記（２）の変換がｐＨ８～９で行われる、請求項７～１３の何れか一項に記載の方法。
  15. 　グルコースから４－アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
    （ａ）グルコースからフェニルアラニンを産生し、
    （ｂ）前記（ａ）で得られたフェニルアラニンをニトロ化して４－ニトロフェニルアラニンに変換し、
    （ｃ）請求項１～１４の何れか一項に記載の方法により、前記（ｂ）で得られた４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する
    ことを含む方法。
  16. 　フェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
    （ｂ）フェニルアラニンをニトロ化して４－ニトロフェニルアラニンに変換し、
    （ｃ）請求項１～１４の何れか一項に記載の方法により、前記（ｂ）で得られた４－ニトロフェニルアラニンから４－アミノ桂皮酸を製造する
    ことを含む方法。
  17. 　４－ニトロフェニルアラニンから４－ニトロ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を用いることを含む方法。
  18. 　４－ニトロ桂皮酸から４－アミノ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を用いることを含む方法。
  19. 　配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
  20. 　配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
  21. 　配列番号１、３、又は５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロフェニルアラニンを４－ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第１の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
  22. 　配列番号７、９、１１、１３又は１５で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、４－ニトロ桂皮酸を４－アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第２の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
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