CN111801420B - 制造4-氨基肉桂酸的方法、以及用于其的载体及宿主细胞 - Google Patents

制造4-氨基肉桂酸的方法、以及用于其的载体及宿主细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN111801420B
CN111801420B CN201980016395.5A CN201980016395A CN111801420B CN 111801420 B CN111801420 B CN 111801420B CN 201980016395 A CN201980016395 A CN 201980016395A CN 111801420 B CN111801420 B CN 111801420B
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
acid
nitrophenylalanine
reaction
nitrocinnamic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980016395.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111801420A (zh
Inventor
高谷直树
桝尾俊介
川崎志慧
皆川一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Research And Development Corp Science And Technology Revitalization Organization
Original Assignee
National Research And Development Corp Science And Technology Revitalization Organization
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Research And Development Corp Science And Technology Revitalization Organization filed Critical National Research And Development Corp Science And Technology Revitalization Organization
Publication of CN111801420A publication Critical patent/CN111801420A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111801420B publication Critical patent/CN111801420B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/008—Preparation of nitrogen-containing organic compounds containing a N-O bond, e.g. nitro (-NO2), nitroso (-NO)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01024—Phenylalanine ammonia-lyase (4.3.1.24)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供从4‑硝基苯丙氨酸制造4‑氨基肉桂酸的新方法。本方法包括：(1)将4‑硝基苯丙氨酸转化为4‑硝基肉桂酸；(2)将4‑硝基肉桂酸转化为4‑氨基肉桂酸。

Description

制造4-氨基肉桂酸的方法、以及用于其的载体及宿主细胞
技术领域
本发明涉及用于制造作为生物质来源的芳香族聚合物的原料单体有用的4-氨基肉桂酸的新方法、以及用于该方法的新型载体及宿主细胞。
背景技术
由于对石油资源枯竭的担忧、二氧化碳排放问题，利用作为可再生资源的生物质来生产燃料、化学品等的系统的重要性升高。作为生物质来源的聚合物，可举出脂肪族系聚合物和芳香族聚合物，而目前正在进行研究、开发的主要是以聚乳酸为代表的脂肪族系聚合物。聚乳酸存在耐热性、耐久性低的课题，但这些课题通过提高结晶度等而逐渐得到改善。另一方面，芳香族聚合物大多在热稳定性、力学强度等方面显示优异的物质特性，可期待用作工程塑料的原料等。
作为生物质来源的芳香族聚合物的原料单体，4-氨基肉桂酸尤其受到瞩目。例如专利文献1及非专利文献1中报道了以4-氨基肉桂酸作为原料来合成高耐热性的优异的芳香族聚合物的方法。因此，要求从生物质高效率地合成4-氨基肉桂酸来作为该高耐热聚合物的原料的单体。
作为从生物质的葡萄糖合成4-氨基肉桂酸的方法，本申请发明人开发了下述路径：使用微生物来源的酶，首先从葡萄糖经由分支酸及4-氨基苯基丙酮酸合成4-氨基苯丙氨酸(专利文献2)，接着将该4-氨基苯丙氨酸转化为4-氨基肉桂酸(专利文献3)。
[化学式1]
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2013/073519号
专利文献2：国际公开第2015/141791号
专利文献3：国际公开第2015/119251号
非专利文献
非专利文献1：Suvannasara等人，Macromolecules,(2014),47[5]1586-1593
发明内容
发明所要解决的课题
本申请发明人提出的上述4-氨基肉桂酸的合成方法虽然是优异的方法，但在反应速度、反应效率等方面还存在改善的余地。
本发明的目的在于提供合成4-氨基肉桂酸的新方法。
用于解决课题的手段
本申请发明人进行了深入研究，结果想到能够确立下述新路径：使用4-硝基苯丙氨酸(其从葡萄糖合成的路径是已知的)，将其首先转化为4-硝基肉桂酸，接着将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸，由此从葡萄糖合成4-氨基肉桂酸。进而发现，从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化、以及从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化这两者能够使用生物来源的合适的酶来实现，从而完成了本发明。
即，本发明的主旨如下所示。
[1]从4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸的方法，所述方法包括：
(1)将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸；
(2)将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸。
[2][1]的方法，其中，前述(1)的转化使用第一酶来进行，所述第一酶包含与由序列号1、3或5表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且，具有将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸的活性。
[3][2]的方法，其中，前述(1)的转化使用第一宿主细胞来进行，所述第一宿主细胞被修饰为能表达前述第一酶。
[4][3]的方法，其中，前述第一宿主细胞为微生物。
[5][4]的方法，其中，前述微生物为细菌。
[6][5]的方法，其中，前述(1)的转化利用休止菌体反应来进行，所述休止菌体反应中，使用了作为前述第一宿主细胞的细菌的休止菌体。
[7][1]～[6]的方法，其中，前述(2)的转化使用第二酶来进行，所述第二酶包含与由序列号7、9、11、13或15表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且，具有将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸的活性。
[8][7]的方法，其中，前述(2)的转化使用表达前述第二酶的第二宿主细胞来进行。
[9]如[8]所述的方法，其中，前述第二宿主细胞被修饰为能表达前述第二酶。
[10][8]或[9]的方法，其中，前述第二宿主细胞为微生物。
[11][10]的方法，其中，前述微生物为细菌。
[12][11]的方法，其中，前述(2)的转化利用休止菌体反应来进行，所述休止菌体反应中，使用了作为前述第二宿主细胞的细菌的休止菌体。
[13][6]或[12]的方法，其中，前述休止菌体选自由培养菌体、粉末菌体、及固定化菌体组成的组。
[14][7]～[13]的方法，其中，于pH8～9进行前述(2)的转化。
[15]从葡萄糖制造4-氨基肉桂酸的方法，所述方法包括：
(a)从葡萄糖产生苯丙氨酸；
(b)将前述(a)中得到的苯丙氨酸进行硝基化而转化为4-硝基苯丙氨酸；
(c)利用[1]～[14]的方法，从前述(b)中得到的4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸。
[16]从苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸的方法，所述方法包括：
(b)将苯丙氨酸进行硝基化而转化为4-硝基苯丙氨酸；
(c)利用[1]～[14]的方法，从前述(b)中得到的4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸。
[17]从4-硝基苯丙氨酸制造4-硝基肉桂酸的方法，所述方法包括使用第一酶，所述第一酶包含与由序列号1、3或5表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且，具有将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸的活性。
[18]从4-硝基肉桂酸制造4-氨基肉桂酸的方法，所述方法包括使用第二酶，所述第二酶包含与由序列号7、9、11、13或15表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且，具有将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸的活性。
[19]载体，其载有编码第一酶的核酸，所述第一酶包含与由序列号1、3或5表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且，所述第一酶具有将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸的活性。
[20]载体，其载有编码第二酶的核酸，所述第二酶包含与由序列号7、9、11、13或15表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且，所述第二酶具有将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸的活性。
[21]宿主细胞，其被修饰为能表达第一酶，所述第一酶包含与由序列号1、3或5表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且，所述第一酶具有将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸的活性。
[22]宿主细胞，其被修饰为能表达第二酶，所述第二酶包含与由序列号7、9、11、13或15表示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列，并且，所述第二酶具有将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸的活性。
发明效果
根据本发明，提供了从葡萄糖合成4-氨基肉桂酸的新方法。
附图说明
[图1]图1为示出在大肠杆菌中重组产生后纯化得到的CamPAL、LiePAL、及RgPAL的针对苯丙氨酸(Phe)及4-硝基苯丙氨酸(n-Phe)的脱氨酶活性的表。
[图2]图2为示出基于在大肠杆菌中重组产生后供于休止菌体反应的CamPAL、LiePAL、及RgPAL的从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化活性的图。
[图3]图3为经时性示出基于在大肠杆菌中重组产生后供于休止菌体反应的CamPAL的从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化反应的结果的图。
[图4]图4为示出基于在大肠杆菌中重组产生后供于休止菌体反应的scFrm2、scHbn1、及cdFLDZ的从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化活性的图。
[图5]图5为示出各菌体量及各底物量时的从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化活性的表。
[图6]图6为经时性示出基于将产生CamPAL的大肠杆菌进行1.2L培养后于反应器内的转化反应的、从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化反应的结果的图。
[图7]图7为示出纯化得到的4-硝基肉桂酸的HPLC分析的结果的图。
[图8]图8为示出向产生CamPAL的大肠杆菌的培养液中添加葡萄糖、果糖及甘油来进行从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸(4ACA)的转化时的结果的图。
[图9]图9为示出基于产生CamPAL的大肠杆菌的从4-硝基苯丙氨酸向4-氨基肉桂酸的转化活性的图。
[图10]图10为示出纯化得到的4ACA盐酸盐和4ACA(标准品)的HPLC分析的结果的图。
具体实施方式
以下，通过具体实施方式更详细地说明本发明。但本发明不限于以下实施方式，可以在不脱离本发明的主旨的范围内以任意的方式实施。
需要说明的是，本说明书中“核酸”也包括核糖核酸、脱氧核糖核酸、或任何核酸的修饰物。另外，核酸也包括单链或双链中的任何。另外，本发明涉及的核酸(基因)可以使用基于在本领域技术人员已知的公共机构的数据库或本说明书中公开的碱基序列而制造的引物或探针等，通过本领域技术人员已知的任意的方法制备。例如，通过使用各种PCR、及其他本领域技术人员已知的DNA扩增技术，可以容易地得到该基因的cDNA。或者，本领域技术人员可以基于本说明书中公开的序列信息，适当使用现有技术来合成核酸。核酸(基因)是编码蛋白质或多肽的物质。此处，所谓“编码”，是指使本发明涉及的蛋白质或多肽以具有其活性的状态表达。另外，“编码”包括以连续的结构序列(外显子)的形式编码本发明涉及的蛋白质、和隔着适当的间插序列(内含子)编码该蛋白质这两者。
[I.从4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸的方法]
1.概要
本发明的第一主旨涉及从4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸的方法(以下，适当简称为“本发明的第一方法”)。本发明的第一方法至少包括：(1)将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸的工序；及(2)将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸的工序。
利用发酵从葡萄糖合成苯丙氨酸的方法(参见例如美国专利申请公开第2001/0044139号，以下称为文献A)、及将苯丙氨酸进行硝基化来合成4-硝基苯丙氨酸的方法(参见例如Takayama等人，BCSJ,17[3]:109-113，以下称为文献B)均是已知的。
因此，本申请发明人想到能够确立下述新合成路径：作为起始原料，着眼于4-硝基苯丙氨酸，首先将其转化为4-硝基肉桂酸，接着转化为4-氨基肉桂酸，由此从葡萄糖经由苯丙氨酸→4-硝基苯丙氨酸→4-硝基肉桂酸来合成4-氨基肉桂酸。
[化学式2]
本发明的第一方法所包括的2个工序均可以使用生物方法、化学方法等各种方法。
另外，本申请发明人在研究将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸的方法时，以生物来源的广泛的酶作为对象，研究了将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸的酶(苯丙氨酸解氨酶)。研究的结果是，本申请发明人筛选出了来源于茶树(Camellia sinensis)的酶CamPAL、来源于紫草(Lithospermum erythrorhizon)的酶LiePAL、及来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)JN-1的酶RgPAL。
另外，虽然作为将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸的方法，可以使用基于已知化学方法的硝基的还原反应，但本申请发明人还研究了将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸的转化酶(硝基还原酶)。研究的结果是，本申请发明人筛选出了来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酶scFrm2及scHbn1、来源于艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)的酶cdFLDZ、以及来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酶nfsA及nfsB。
进而，本申请发明人使用表达上述酶的宿主细胞，成功将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸，接着将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸，从而完成了本发明的第一方法。
若将本发明的第一方法与作为上述已知方法的基于葡萄糖的发酵来合成苯丙氨酸的方法(参见上述文献A)、及基于苯丙氨酸的硝基化来合成4-硝基苯丙氨酸的方法(参见上述文献B)组合，即可利用从葡萄糖经由苯丙氨酸→4-硝基苯丙氨酸→4-硝基肉桂酸的新合成路径来制造4-氨基肉桂酸。并且，如后述的实施例所示，就经由本发明的第一方法的、自葡萄糖的4-氨基肉桂酸合成而言，与本申请发明人提出的以往方法(专利文献2及3)相比，在反应速度、反应效率等方面优异，可以说是有利的。
以下，对本发明的第一方法进行详细说明。
2.起始物质：4-硝基苯丙氨酸
本发明的第一方法中，使用4-硝基苯丙氨酸作为起始原料。4-硝基苯丙氨酸的种类没有限定，可以是天然的，也可以是合成的。关于合成4-硝基苯丙氨酸的各种方法见后述。
3.工序(1)：4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化
本发明的第一方法中，首先，作为工序(1)，将4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸转化。实施本工序(1)的方法没有限定，可以使用例如生物方法、化学方法等任意的方法。其中，本发明中优选使用将4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸转化的酶(硝基苯丙氨酸解氨酶：以下适当称为“第一酶”)实施工序(1)。
作为上述第一酶的例子，可举出来源于茶树(Camellia sinensis)的酶CamPAL、来源于紫草(Lithospermum erythrorhizon)的酶LiePAL、及来源于粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)JN-1的酶RgPAL。分别地，将CamPAL蛋白质的氨基酸序列示于序列号1，将编码其的CamPAL基因的碱基序列的例子(为了用于在大肠杆菌中表达而对密码子进行了修改)示于序列号2。另外，分别地，将LiePAL蛋白质的氨基酸序列示于序列号3，将编码其的LiePAL基因的碱基序列的例子(为了用于在大肠杆菌中表达而对密码子进行了修改)示于序列号4。另外，分别地，将RgPAL蛋白质的氨基酸序列示于序列号5，将编码其的RgPAL基因的碱基序列的例子(为了用于在大肠杆菌中表达而对密码子进行了修改)示于序列号6。
如后述的实施例所示，CamPAL、LiePAL、及RgPAL是本申请发明人从生物来源的已知的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase：PAL)中研究得到的酶。PAL是以苯丙氨酸作为底物、将其脱氨而产生肉桂酸的酶。虽然利用PAL将苯丙氨酸脱氨来产生肉桂酸的反应、与作为本发明的目的基于4-硝基苯丙氨酸的脱氨来产生4-硝基肉桂酸的反应相似，但区别在于后者中在底物的苯环的4位存在硝基。出乎意料地，如后述的实施例所示，CamPAL、LiePAL、及RgPAL具有优异的从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化活性，可优选用于本发明中。
需要说明的是，如前文所述，CamPAL、LiePAL、及RgPAL是已知的酶，其氨基酸序列也是已知的，但迄今为止并不清楚它们能将利用硝基化合物作为底物、且具有从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化活性，这是由本申请发明人首次发现的见解。
作为上述第一酶的例子，除了CamPAL、LiePAL、及RgPAL以外，还可举出作为它们的类似物的、维持使4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸转化的活性的多肽。作为CamPAL、LiePAL、或RgPAL的类似物，可举出例如其同源物(包括直系同源物及旁系同源物)、或其片段。
具体而言，期望第一酶与序列号1、3、或5的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、或至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、特别优选至少99％、最优选100％的序列同源性。另外，期望第一酶与序列号1、3、或5的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、或至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、特别优选至少99％、最优选100％的序列同一性。
此处，2条氨基酸序列的“同源性”是指将两条氨基酸序列比对时在各对应的位置出现相同或类似的氨基酸残基的比率，2条氨基酸序列的“同一性”是指将两条氨基酸序列比对时在各对应的位置出现相同的氨基酸残基的比率。需要说明的是，2个氨基酸序列的“同源性”及“同一性”可以使用例如BLAST(基本局部比对搜索工具，Basic LocalAlignment Search Tool)程序(Altschul等人，J.Mol.Biol.,(1990),215(3):403-10)等求出。
另外，上述第一酶可以是具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在序列号1、3、或5的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列。需要说明的是，本说明书中，“在氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸”是指该氨基酸序列中的氨基酸在不显著影响其多肽的结构或功能的情况下进行了修饰。另外，“数个”指存在通常为2～50个、优选2～20个、更优选2～10个、进一步优选2～5个突变(缺失、取代或添加)。
另外，上述第一酶可以是由下述核酸编码的多肽，所述核酸与包含与编码序列号1、3、或5的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的核酸在严格条件下杂交。需要说明的是，本说明书中，所谓“严格(stringent)条件”，是指能实现核酸之间的选择性的且能够检测的特异性结合的条件，可通过盐浓度、溶剂(例如甲酰胺等有机溶剂)、温度、其他已知的条件的适当的组合来定义。需要说明的是，“严格条件”对于本领域技术人员而言是周知的，具体可参见Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989)Cold SpringHarbor Laboratory(T.Maniatis等人编)等。作为具体的“严格条件”的例子，于约40～45℃、最优约42℃，在5×SSPE、0.3％的SDS、200μg/mL的剪切变性鲑鱼精DNA中，并且，极低严格度及低严格度的情况下在25％的甲酰胺中、培养基及中严格度～高严格度的情况下在35％的甲酰胺中、高严格度及极高严格度的情况下在50％的甲酰胺中，按照标准的Southern印迹法进行12～24小时杂交。然后，最终将担载体材料在2×SSC、0.2％的SDS中，于45℃(极低严格度)、50℃(低严格度)、55℃(中严格度)、60℃(中严格度～高严格度)、65℃(高严格度)、或70℃(极高严格度)洗涤三次，每次15分钟。需要说明的是，杂交可以按照本领域中已知的方法或以其为基准的方法实施。另外，使用市售的文库的情况下，可按照所附的使用说明书中记载的方法实施。
制备上述第一酶的方法没有限定。可以从生产上述的第一酶的生物中提取作为目标的酶进行使用。另外，可以使用在本领域技术人员已知的公共机构的数据库中注册的CamPAL、LiePAL、或RgPAL基因的碱基序列、本说明书中公开的CamPAL、LiePAL、或RgPAL基因的碱基序列(分别为序列号2、4、及6)，使用本领域技术人员已知的各种方法、例如化学合成方法、基因工程方法来制备。
具体而言，关于CamPAL、LiePAL、或RgPAL，例如，可以从茶树(Camelliasinensis)、紫草(Lithospermum erythrorhizon)、或粘红酵母(Rhodotorula glutinis)JN-1的基因组文库中，通过使用本领域技术人员已知的聚合酶链式反应(polymerasechain reaction：PCR)等核酸扩增技术，制备编码CamPAL、LiePAL、或RgPAL基因的核酸，进而使用本领域技术人员已知的方法将其整合至质粒、病毒等各种载体，通过基因重组导入合适的宿主细胞来使其表达，由此制备CamPAL、LiePAL、或RgPAL。需要说明的是，作为宿主细胞，可以是原核细胞，也可以是真核细胞，原核细胞的情况下，可以是真细菌也可以是古细菌，真核细胞的情况下，可以是植物细胞，可以是动物细胞，可以是真菌细胞，也可以是原生生物细胞。
另外，关于CamPAL、LiePAL、或RgPAL的类似物，例如，可以使用下述方法导入突变，从而制备编码CamPAL、LiePAL、或RgPAL的类似物的核酸，所述方法为：针对包含注册于本领域技术人员已知的公共机构的数据库中的CamPAL、LiePAL、或RgPAL基因的碱基序列、本说明书中公开的CamPAL、LiePAL、或RgPAL基因的碱基序列(分别为序列号2、4、及6)的核酸，使其与作为突变原的药剂接触作用的方法；照射紫外线的方法；基因工程的方法；等等。其中，作为基因工程方法之一的定点诱变法能够向特定的位置导入特定的突变，因此是有用的。通过将如此得到的编码CamPAL、LiePAL、或RgPAL的类似物的核酸与上述同样地使用本领域技术人员已知的方法整合至质粒、病毒等各种载体，利用基因重组导入合适的宿主细胞来使其表达，从而能够制备CamPAL、LiePAL、或RgPAL的类似物。
需要说明的是，关于基因工程方法，可参见例如Sambrook,J.等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1989等的记载。
使用上述第一酶实施工序(1)的方法没有特别限定。在使酶反应发生的条件下，使第一酶作用于4-硝基苯丙氨酸而向4-硝基肉桂酸转化即可。需要说明的是，作为4-硝基苯丙氨酸，可以不经纯化而直接使用含有4-硝基苯丙氨酸的天然产物、合成产物等组合物，也可以由该组合物使用本领域技术人员已知的各种方法将4-硝基苯丙氨酸纯化而进行使用。
作为使上述第一酶作用于4-硝基苯丙氨酸的方法的例子，可以将通过上述步骤制备的第一酶分离、纯化而进行使用，也可以直接使用以通过上述步骤表达第一酶的方式对宿主细胞进行修饰而得到的基因重组细胞(以下，适当称为“第一细胞”)。后者的情况下，尤其优选下述方法：使用细菌作为宿主细胞，使用该细菌的休止菌体使其与4-硝基苯丙氨酸共存，使休止菌体中含有的第一酶作用于4-硝基苯丙氨酸而向4-硝基肉桂酸转化(以下，适当称为“休止菌体反应”)。关于该休止菌体反应见后述。
另外，也可以采用下述方法：使用细菌作为表达第一酶的宿主细胞，使用该细菌的培养液使其与4-硝基苯丙氨酸共存，使培养液中含有的第一酶作用于4-硝基苯丙氨酸而向4-硝基肉桂酸转化。
所谓使上述第一酶的酶反应发生的条件没有限定，例如在水性溶剂中时，其pH没有特别限定，通常为7.5以上，其中优选为8以上，另外，通常为9.5以下，进一步优选为9以下。另外，进行反应的温度没有特别限定，可优选示例于下述温度进行反应：通常为27℃以上、其中优选30℃以上、进一步优选32℃以上，另外，通常为42℃以下、其中优选37℃以下。
4.工序(2)：4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化
本发明的第一方法中，接下来，作为工序(2)，使4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸转化。实施本工序(2)的方法也没有限定，可以使用例如生物方法、化学方法等任意的方法。其中，本发明中，优选使用使4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸转化的酶(硝基还原酶：以下适当称为“第二酶”)实施工序(2)。
作为上述第二酶的例子，可举出来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酶scFrm2及scHbn1、来源于艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)的酶cdFLDZ、以及来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酶nfsA及nfsB等。分别地，将scFrm2蛋白质的氨基酸序列示于序列号7，将编码其的scFrm2基因的碱基序列的例子示于序列号8。另外，分别地，将scHbn1蛋白质的氨基酸序列示于序列号9，将编码其的scHbn1基因的碱基序列的例子示于序列号10。另外，分别地，将cdFLDZ蛋白质的氨基酸序列示于序列号11，将编码其的cdFLDZ基因的碱基序列的例子示于序列号12。另外，分别地，将nfsA蛋白质的氨基酸序列示于序列号13，将编码其的nfsA基因的碱基序列的例子示于序列号14。另外，分别地，将nfsB蛋白质的氨基酸序列示于序列号15，将编码其的nfsB基因的碱基序列的例子示于序列号16。
如后述的实施例所示，scFrm2、scHbn1、cdFLDZ、nfsA及nfsB是本申请发明人从生物来源的已知的硝基还原酶及烯酸还原酶(enoate reductase)中研究而得到的酶。出乎意料地，这些酶如后述的实施例所示，具有从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的优异的转化活性、可优选用于本发明中。
需要说明的是，如前文所述，scFrm2、scHbn1、cdFLDZ、nfsA及nfsB是作为硝基还原酶或烯酸还原酶而已知的酶，其氨基酸序列也是已知的，但迄今为止并不清楚它们具有从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化活性、且可用作硝基还原酶，这是本申请发明人首次发现的见解。
作为上述第二酶的例子，除了上述酶自身以外，还可举出作为上述酶的类似物的、维持使4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸转化的活性的多肽。作为上述类似物，可举出例如其同源物(包括直系同源物及旁系同源物)、或其片段。
具体而言，期望上述第二酶与序列号7、9、11、13或15的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、或至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、特别优选至少99％、最优选100％的序列同源性。另外，期望第二酶与序列号7、9、11、13或15的氨基酸序列具有至少80％、优选至少85％、或至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、特别优选至少99％、最优选100％的序列同一性。需要说明的是，关于2个氨基酸序列的“同源性”及“同一性”，与前文的说明相同。
另外，上述第二酶可以是具有下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含在序列号7、9、11、13或15的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸而成的氨基酸序列。需要说明的是，本说明书中，“在氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或数个氨基酸”的含义与前文的说明相同。
另外，上述第二酶可以是由下述核酸编码的多肽，所述核酸与包含与编码序列号7、9、11、13或15的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列的核酸在严格条件下杂交。需要说明的是，本说明书中“严格(stringent)条件”的含义与前文的说明相同。
制备上述第二酶的方法没有限定。可以从生产上述的第二酶的生物中提取作为目标的酶而进行使用。但是，也可以使用在本领域技术人员已知的公共机构的数据库中注册的上述第二酶的基因的碱基序列、本说明书中公开的序列号8、10、12、14及16的基因的碱基序列，使用本领域技术人员已知的各种方法、例如化学合成方法、基因工程方法来制备。关于其具体的方法、尤其是基因工程方法，与前文中详细说明的相同。
使用上述第二酶实施工序(2)的方法没有特别限定。在使酶反应发生的条件下，使第二酶作用于工序(1)中得到的4-硝基肉桂酸而向4-氨基肉桂酸转化即可。需要说明的是，作为工序(1)中得到的4-硝基肉桂酸，可以不经纯化而直接使用与含有4-硝基肉桂酸的工序(1)的反应产物的组合物，也可以由该反应产物使用本领域技术人员已知的各种方法将4-硝基肉桂酸进行纯化而使用。
作为使上述第二酶作用于4-硝基肉桂酸的方法的例子，可以将通过上述步骤制备的第二酶(scFrm2、scHbn1、cdFLDZ、nfsA或nfsB或者其类似物)分离、纯化而进行使用，也可以直接使用以通过上述的步骤表达第二酶的方式对宿主微生物进行修饰而得到的基因重组细胞(以下，适当称为“第二细胞”)。后者的情况下，尤其优选下述方法：使用细菌作为宿主细胞，使用该细菌的休止菌体使其与4-硝基肉桂酸共存，使休止菌体中含有的第二酶作用于4-硝基肉桂酸而向4-氨基肉桂酸转化(休止菌体反应)。关于该休止菌体反应见后述。另外，也优选下述方法：使用细菌作为宿主细胞，使用该细菌的培养液使其与4-硝基肉桂酸共存，使培养液中含有的第一酶作用于4-硝基肉桂酸而向4-氨基肉桂酸转化。这种情况下，作为上述的细菌，优选大肠杆菌。
需要说明的是，所谓使上述第二酶的酶反应发生的条件没有限定，作为例子可举出以下条件。即，在水性溶剂中时，其pH没有特别限定，通常为6.5以上、其中优选为7.0以上，另外，通常为8.5以下，进一步优选为8.0以下。另外，进行反应的温度没有特别限定，可优选示例于下述温度进行反应：通常为27℃以上、其中优选30℃以上、进一步优选32℃以上，另外，通常为42℃以下、其中优选37℃以下。
5.休止菌体反应
本发明的第一方法中，使用上述第一酶实施工序(1)时、及/或使用上述第二酶实施工序(2)时，利用如下反应是优选的，所述反应使用表达上述的第一酶及/或第二酶的第一细胞及/或第二细胞作为细菌的休止菌体(休止菌体反应)(需要说明的是，以下，将表达第一酶的细菌称为“第一细菌”，将表达第二酶的细菌称为“第二细菌”)。
此处，细菌的“休止菌体”是指该细菌的未伴有增殖的菌体。作为休止菌体的例子，可举出：培养细菌得到的培养菌体；将该培养菌体通过冷冻干燥、喷雾干燥制成粉末而得到的粉末菌体；将该培养菌体固定于担载体而得到的固定化菌体；等等。也可以将上述中的两种以上组合使用。作为休止菌体的具体例子，可以使用如下制备的休止菌体悬浮液：将对细菌进行培养而得到的培养液通过离心分离分成培养上清液和菌体，将得到的菌体用生理盐水洗涤，以成为所期望的菌体浊度(例如，600nm处的吸光度为40)的方式悬浮于灭菌纯化水中。另外，也可以使用将该休止菌体悬浮液通过冷冻干燥、喷雾干燥制成粉末而得到的粉末菌体、将该培养菌体悬浮液中的培养菌体固定于担载体而得到的固定化菌体等。
通过使该第一细菌或第二细菌的休止菌体与对应的底物(第一细菌的情况下为4-硝基苯丙氨酸，第二细菌的情况下为4-硝基肉桂酸)或含有所述底物的组合物(例如天然产物、反应产物等)在使第一酶或第二酶的酶反应发生的条件下共存，从而使第一细菌或第二细菌的休止菌体中含有的第一酶或第二酶作用于对应的底物。使第一酶或第二酶的酶反应发生的条件没有限定，可优选示例例如在pH通常为6.5以上、其中优选7以上，并且通常为9.5以下、进一步优选为9以下的水性溶剂中，于通常27℃以上、其中优选30℃以上、进一步优选32℃以上，并且通常为42℃以下、其中优选37℃以下进行反应。
需要说明的是，本发明的第一方法中，作为在工序(2)中使4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸转化的方法，也可以使用化学方法。作为化学方法，没有特别限定，可以使用已知的方法。作为具体例子，使用将硝基转化为氨基的化学反应来将4-硝基肉桂酸的硝基还原即可。作为硝基的还原方法，没有特别限定，可以使用例如Bechamp法(例如，A.J.Ann.Chim.Phys.1854,42,186.)、非均相接触还原法等已知的方法。需要说明的是，作为4-硝基肉桂酸，可以直接使用上述工序(1)中得到的4-硝基肉桂酸，也可以将其通过已知的方法适当纯化后使用。
6.其他
通过以上的步骤，实施(1)将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸的工序、及(2)将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸的工序，从而能够从4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸。需要说明的是，工序(2)结束后，可以使用本领域技术人员已知的各种方法从反应产物中将4-氨基肉桂酸分离·纯化。
需要说明的是，以上的说明仅是本发明的第一方法的实施方式之一。本领域技术人员可容易地理解，可以对上述方式施以适当变更来实施本发明的第一方法。
例如，本发明的第一方法中，可以将上述工序(1)与上述工序(2)适当组合而实施。其组合没有限定，通常，在上述工序(1)中实施使用了上述第一酶的酶反应，在上述工序(2)中实施使用了上述第二酶的酶反应或上述的化学方法。其中，上述工序(1)中，优选在上述第一细菌共存的条件下进行酶反应的方法、或进行第一细菌的休止菌体反应的方法。
需要说明的是，上述工序(1)中在第一细菌共存的条件下进行酶反应的情况下，优选上述工序(2)中在上述第二细菌共存的条件下进行酶反应，或通过化学方法实施。其中，若在上述第二细菌共存的条件下进行酶反应，则能够连贯地进行两者的酶反应，在效率方面是更优选的。另外，在该情况下，从减少成本的观点考虑，进一步优选使用大肠杆菌作为第二细菌。
另一方面，上述工序(1)中进行第一细菌的休止菌体时，优选上述工序(2)中进行上述第二细菌的休止菌体反应、或实施化学方法。其中，通过化学方法实施在4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化效率、生产成本(原材料费用、设备投资费用、及人工费用等)、及减少生产时的CO2等方面是更优选的。
另外，以上的说明中对在实施工序(1)后实施工序(2)的方式进行了说明，但也可以同时实施工序(1)和工序(2)。这种情况下，使第一酶及第二酶在使酶反应发生的条件下作用于4-硝基苯丙氨酸，并行地实施基于第一酶的从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化、和基于第二酶的从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化即可。这种情况下，可以合用分离、纯化得到的第一酶及第二酶，可以合用分别表达第一酶及第二酶的第一细胞及第二细胞，还可以使用共表达第一酶及第二酶的单一的基因重组细胞(以下，将其称为“第三细胞”)。就共表达第一酶及第二酶的第三细胞而言，可以如下得到：将编码第一酶及第二酶的基因、或者分别担载上述基因的第一载体及第二载体导入单一的宿主细胞，以共表达第一酶及第二酶的方式对宿主细胞进行修饰。
[II.从葡萄糖制造4-氨基肉桂酸的方法]
本发明的第二主旨涉及从葡萄糖制造4-氨基肉桂酸的方法(以下，适当简称为“本发明的第二方法”)。本发明的第二方法至少包括：(a)从葡萄糖产生苯丙氨酸的工序、(b)将上述(a)中得到的苯丙氨酸进行硝基化而转化为4-硝基苯丙氨酸的工序、及(c)利用本发明的第一方法，从上述(b)中得到的4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸的工序。
作为工序(a)中的从葡萄糖合成苯丙氨酸的方法，可以使用例如上述的文献A中记载的方法。
作为工序(b)中的从苯丙氨酸合成4-硝基苯丙氨酸的方法，可以使用例如上述的文献B中记载的方法。
作为工序(c)中的从4-硝基苯丙氨酸合成4-氨基肉桂酸的方法，可以使用上述的本发明的第一方法。
[III.从苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸的方法]
本发明的第三主旨涉及从苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸的方法(以下，适当简称为“本发明的第三方法”)。本发明的第三方法至少包括：(b)将苯丙氨酸进行硝基化而转化为4-硝基苯丙氨酸的工序、及(c)利用本发明的第一方法，从上述(b)中得到的4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸的工序。
关于工序(b)中的从苯丙氨酸合成4-硝基苯丙氨酸的方法，与前文中关于本发明的第二方法的记载相同。
作为工序(c)中的从4-硝基苯丙氨酸合成4-氨基肉桂酸的方法，可以使用上述的本发明的第一方法。
[IV.从4-硝基苯丙氨酸制造4-硝基肉桂酸的方法]
本发明的第四主旨涉及从苯丙氨酸制造4-硝基肉桂酸的方法(以下，适当简称为“本发明的第四方法”)。本发明的第四方法至少包括使用上述的第一酶将苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸的工序。关于该工序的详细信息，与前文中作为本发明的第一方法的工序(1)所详细说明的相同。
[V.从4-硝基肉桂酸制造4-氨基肉桂酸的方法]
本发明的第五主旨涉及从4-硝基肉桂酸制造4-氨基肉桂酸的方法(以下，适当简称为“本发明的第五方法”)。本发明的第五方法至少包括使用上述的第二酶将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸的工序。关于该工序的详细信息，与前文中作为本发明的第一方法的工序(2)所详细说明的相同。
[VI.载体]
本发明的第六主旨涉及对编码上述的第一酶及/或第二酶的基因进行担载的载体(需要说明的是，以下，将担载编码第一酶的基因的载体称为“第一载体”，将担载编码第二酶的基因的载体称为“第二载体”，将同时担载编码第一酶的基因及编码第二酶的基因的载体称为“第三载体”)。
就第一～第三载体而言，只要能对编码上述的第一酶及/或第二酶的基因进行担载、并且能将这些基因导入宿主细胞内、使其成为可表达的状态即可，其种类没有限定。例如，可以是被整合至宿主细胞的基因组内的载体，也可以是被摄入宿主细胞的细胞质内、同时与宿主细胞的基因组独立地共存、随着宿主细胞的细胞分裂自主复制的载体。另外，可以是线状载体也可以是环状载体，可以是单链载体也可以是双链载体，可以是DNA载体也可以是RNA载体。并且，可以是质粒载体，可以是粘粒载体，可以是福斯质粒载体，可以是病毒载体，可以是人工染色体载体，可以是农杆菌等细菌载体，还可以是基于上述多种组合的二元载体。该载体的种类、构成、构建方法等对于本领域技术人员而言是周知的，根据基因、宿主微生物细胞等条件适当选择即可。
就第一～第三载体而言，优选除了含有编码上述的第一酶及/或第二酶的基因以外，还含有在宿主细胞中调节上述基因的表达的调控序列。作为该调控序列，可举出启动子、终止子、增强子、多聚A附加信号、5’-UTR(非翻译区)、标签或筛选标记基因、多克隆位点、复制起点等。优选的是，在第一～第三载体中，上述调控序列与编码上述的第一酶及/或第二酶的基因可操作地连接，由此构建能在宿主细胞中自主表达上述基因的表达盒。该调控序列的种类、构成、构建方法等对于本领域技术人员而言是周知的，根据基因、宿主细胞等条件适当选择即可。
[VII.细胞]
本发明的第七主旨涉及以表达上述的第一酶及/或第二酶的方式对宿主细胞进行修饰而得到的细胞(需要说明的是，如前文所述，将表达第一酶的细胞称为“第一细胞”，将表达第二酶的细胞称为“第二细胞”，将共表达第一酶及第二酶的细胞称为“第三细胞”)。
作为第一～第三细胞的来源的宿主细胞的种类没有限定，可以是原核细胞，也可以是真核细胞，原核细胞的情况下，可以是真细菌也可以是古细菌，真核细胞的情况下，可以是植物细胞，可以是动物细胞，可以是真菌细胞，也可以是原生生物细胞。其中，进行上述的休止菌体反应时，优选使用细菌作为宿主细胞。
通过向上述的宿主细胞中导入编码第一酶及/或第二酶的基因，可以得到表达第一酶及/或第二酶的第一～第三细胞。作为导入的基因，可以直接使用编码上述的第一酶及/或第二酶的基因，或者也可以使用担载这些基因的上述的第一～第三载体。作为导入基因的方法，可以使用使载体感染宿主细胞的方法、电穿孔法、粒子枪(轰击)法、真空渗透法等物理方法、以及CRISPR/Cas9等基因组编辑方法等。
如此得到的第一～第三细胞可以是一过性表达第一酶及/或第二酶的细胞，也可以是进行稳定表达的细胞。另外，多细胞真核生物的细胞的情况下，其可以在发育的所有阶段均表达这些基因，也可以仅在特定的阶段表达。此外，可以在全部组织、器官中表达这些基因，也可以仅在特定的组织、器官中表达。这样的基因表达时期、部位的控制可以通过例如适当选择调控序列来进行。
需要说明的是，本发明中的第一～第三细胞不仅包括以表达第一酶及/或第二酶的方式进行了修饰的第一代细胞，也包括该细胞分裂而得到的第二代及之后的细胞，还包括通过包含该细胞的初始个体的有性生殖或无性生殖而得到的后代(包括克隆)的细胞。另外，植物细胞的情况下，也包括从初始植物体的繁殖材料(例如，种子、果实、扦插、块茎、块根、株、愈伤组织、原生质体等)制备的后代(包括克隆)的细胞。
实施例
以下，举出实施例来更详细地说明本发明。但本发明不限于以下的实施例，可以在不脱离本发明的主旨的范围内以任意的方式实施。
需要说明的是，以下的实验中只要没有特别说明，则作为大肠杆菌(Escherichiacoli)株，使用BL21(DE3)[Novagen,基因型F-,ompT,hsdSB(rB-mB-),gal(λcI857,ind1,Sam7,nin5,lacUV5-T7gene1),dcm(DE3)]。另外，大肠杆菌的培养中，将以下的组成的LB培养基(pH7.0)、或向其中添加其他成分而成的培养基用高压釜于121℃灭菌15分钟后使用。
[表1]
LB培养基(pH7.0)
胰蛋白酶 10g/L
酵母提取物 5g/L
氯化钠 10g/L
需要说明的是，以下的各实施例中使用的高效液相色谱法(HPLC)的测定条件、利用吸光光度计评价酶活性的条件记载如下。
[高效液相色谱法(HPLC)测定条件]
装置：Hewlett Packerd公司制1200infinity series
色谱柱：Millipore-Merck公司制Purospher STAR RP-18封端色谱柱
检测波长：280nm
洗脱液A：20mM磷酸钾(pH7.0)
洗脱液B：100％甲醇
程序：0分钟(A:B＝98％:2％)
7分钟(A:B＝98％:2％)
12分钟(A:B＝50％:50％)
17分钟(A:B＝50％:50％)
19分钟(A:B＝98％:2％)
23分钟(A:B＝98％:2％)
[利用吸光光度计评价酶活性的条件]
装置：BECKMAN COULTER公司制DU800紫外可见分光光度计
酶量：2mg/mL
缓冲溶液：50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.6)
底物浓度：0.3mM～9.6mM
容量：200μL
测定波长：4-硝基苯丙氨酸→4-硝基肉桂酸380nm
苯丙氨酸→肉桂酸305nm
测定时间：10分钟
测定温度：25℃
〔实施例1〕
[I.从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化]
1.质粒的构建及向大肠杆菌的导入
(1)pET28a-CamPAL的构建及向大肠杆菌的导入利用已知的多核苷酸合成方法而人工合成来源于茶树(Camellia sinensis)的酶CamPAL，接着利用限制性内切酶NdeI及EcoRI进行酶切处理。将该经酶切处理后的CamPAL与利用限制性内切酶NdeI及EcoRI进行酶切处理后的质粒pET28a(Novagen公司制)(以下，称为酶切处理pET28a)使用DNA连接试剂盒Ligation High Ver.2(东洋纺公司制)连接，制作pET28a-CamPAL。将得到的pET28a-CamPAL利用热激转化法导入至大肠杆菌菌株BL21(DE3)。对得到的产生CamPAL的大肠杆菌菌株进行培养，使CamPAL表达。
(2)pET28a-LiePAL的构建及向大肠杆菌的导入
利用已知的多核苷酸合成方法人工合成来源于紫草(Lithospermumerythrorhizon)的酶LiePAL。将得到的LiePAL利用与上述CamPAL的酶切处理中所使用的相同的限制性内切酶进行酶切处理。以下，除了使用经酶切处理后的LiePAL以外，利用与上述的pET28a-CamPAL的制作步骤同样的方法与上述酶切处理pET28a连接，由此制造pET28a-LiePAL。以下，利用与上述同样的方法，导入至大肠杆菌菌株BL21(DE3)。将得到的产生LiePAL的大肠杆菌菌株进行培养，使LiePAL表达。
(3)pET28a-RgPAL的构建及向大肠杆菌的导入
利用已知的多核苷酸合成方法人工合成来源于粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)JN-1的酶RgPAL。将得到的RgPAL利用与上述CamPAL的酶切处理中所使用的相同的限制性内切酶进行酶切处理。以下，除了使用经酶切处理后的RgPAL以外，利用与上述的pET28a-CamPAL的制作步骤同样的方法与上述酶切处理pET28a连接，由此制造pET28a-RgPAL。将得到的pET28a-RgPAL利用热激转化法导入至大肠杆菌菌株BL21(DE3)。将得到的产生RgPAL的大肠杆菌菌株进行培养，使RgPAL表达。
2.纯化CamPAL、LiePAL、及RgPAL的酶活性的评价
将上述的产生CamPAL、LiePAL、及RgPAL的大肠杆菌菌株分别接种于含有30mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基5mL，于28℃培养16小时(以下，有时称为前培养)。然后，将其接种于该培养基200mL，培养至O.D600成为0.6，然后添加异丙基-β-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside：IPTG)使其最终浓度为0.5mM，进一步于30℃培养20小时。上述培养时的转数设为120rpm。收集培养后的菌体，悬浮于含有0.5M NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5)中，实施超声波破碎。接着进行离心分离，然后将其上清液使用His-Trap柱纯化，将得到的酶用于活性测定。
酶活性通过使用吸光光度计针对反应产物的吸收波长的吸光度测定10分钟来测定、定量。具体而言，关于针对苯丙氨酸的脱氨酶活性，向含有0.3至9.6mM的苯丙氨酸的50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.6)中添加2mg/mL上述的各酶使其反应，针对由肉桂酸生成而引起的305nm波长处的吸光度的变化进行10分钟测定。关于针对4-硝基苯丙氨酸的脱氨酶活性，向含有0.3至9.6mM的4-硝基苯丙氨酸的50mM Tris-HCl缓冲液(pH＝8.6)中添加2mg/mL上述的各酶使其反应，针对由4-硝基肉桂酸生成而引起的380nm波长处的吸光度进行10分钟测定并进行定量。
图1为示出在大肠杆菌中重组产生后纯化得到的CamPAL、LiePAL、及RgPAL的针对苯丙氨酸(Phe)及4-硝基苯丙氨酸(n-Phe)的脱氨酶比活性、Km、Kcat、及Km/Kcat的表。可见，CamPAL、LiePAL、及RgPAL均具有从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化活性。
3. 基于CamPAL、LiePAL、及RgPAL的休止菌体反应的酶活性的评价
将上述的产生CamPAL、LiePAL、及RgPAL的大肠杆菌菌株分别使用含有40mg/L硫酸卡那霉素的3mL的LB培养基在300rpm的搅拌、28℃的条件下前培养16小时。将该前培养液1mL接种于含有40mg/L硫酸卡那霉素的100mL的LB培养基，一边以120rpm振荡一边于30℃培养4小时，然后添加0.5mM的IPTG，进一步培养20小时。将得到的菌体利用反应缓冲液(100mMTris-HCl缓冲液，pH8.5)洗涤2次。
将得到的休止菌体悬浮于反应缓冲液，一边以300rpm振荡一边于28℃使其反应。每24小时向培养基中补加20mM的4-硝基苯丙氨酸，连续地使其反应。定期地采集反应上清液，对4-硝基苯丙氨酸及4-硝基肉桂酸进行定量。
将上清液移至离心管，通过离心分离进行回收，使用高效液相色谱法(HPLC)进行反应产物的定量。
另外，使用宿主大肠杆菌作为对照，实施了同样的实验。
图2为示出来自产生CamPAL、LiePAL、及RgPAL的大肠杆菌菌株的休止菌体反应的24小时后的反应上清液中的4-硝基肉桂酸量的图。在使用了产生CamPAL、LiePAL、及RgPAL的大肠杆菌菌株中任意休止菌体的情况下，与作为对照的大肠杆菌相比，反应上清液中的4-硝基肉桂酸量均显著上升，可知，进行了基于CamPAL、LiePAL、及RgPAL的从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化。
图3为示出来自产生CamPAL的大肠杆菌菌株的休止菌体反应的反应上清液中的4-硝基苯丙氨酸量及4-硝基肉桂酸量的经时变化的图。可知，反应上清液中的4-硝基苯丙氨酸量伴随每24小时的添加而增加，之后在直到下次添加之前缓缓减少，反应上清液中的4-硝基肉桂酸持续地增加。由此可知，持续地进行了基于CamPAL的从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化。
[II.从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化]
1.质粒的构建及向大肠杆菌的导入
(1)pRSFDuet-1-scFrm2的构建及向大肠杆菌的导入将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酶scFrm2(分别地，将氨基酸序列示于序列号7，将碱基序列的例子示于序列号8)从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的基因组文库中使用引物5’-AACGGATCCGATGTCCCCAACTGGAAAC-3’(序列号17)及5’-GCCAAGCTTCAGTGATAAACGTTGATTACG-3’(序列号18)利用PCR扩增，然后，利用限制性内切酶BamHI及HindIII进行酶切处理，并与同样利用限制性内切酶BamHI及HindIII进行酶切处理后的质粒pRSFDuet-1(Novagen)使用DNA连接试剂盒Ligation High Ver.2(东洋纺公司制)连接，制作pRSFDuet-1-scFrm2。将得到的pRSFDuet-1-scFrm2利用热激转化法导入至大肠杆菌菌株BL21(DE3)。将得到的产生scFrm2的大肠杆菌菌株进行培养，使scFrm2表达。
(2)pRSFDuet-1-scHbn1的构建及向大肠杆菌的导入
将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酶scHbn1(分别地，将氨基酸序列示于序列号9，将碱基序列的例子示于序列号10)从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的基因组文库中使用引物5’-AACGGATCCGATGTCTGCTGTTGCAAC-3’(序列号19)及5’-GCCAAGCTTAATTGAAGATTTCAACATCG-3’(序列号20)利用PCR扩增后，实施与上述scFrm2的限制性内切酶处理相同的限制性内切酶处理及与质粒的连接，制作pRSFDuet-1-scHbn1。将得到的pRSFDuet-1-scHbn1利用热激转化法导入至大肠杆菌菌株BL21(DE3)。对得到的产生scHbn1的大肠杆菌菌株进行培养，使scHbn1表达。
(3)pRSFDuet-1-cdFLDZ的构建及向大肠杆菌的导入将来源于艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)的酶cdFLDZ(分别地，将氨基酸序列示于序列号11，将碱基序列的例子示于序列号12)从艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)的基因组文库中使用引物5’-CCGGGATCCAATGAAGATTAGTTCTATG-3’(序列号21)及5’-CCGGAATTCTTATATATTTAATGCTAC-3’(序列号22)利用PCR扩增后，实施与上述scFrm2的限制性内切酶处理相同的限制性内切酶处理及与质粒的连接，制作pRSFDuet-1-cdFLDZ。将得到的pRSFDuet-1-cdFLDZ利用热激转化法导入至大肠杆菌菌株BL21(DE3)。对得到的产生cdFLDZ的大肠杆菌菌株进行培养，使cdFLDZ表达。
2.基于scFrm2、scHbn1、及cdFLDZ的休止菌体反应的酶活性的评价
将上述的产生scFrm2、scHbn1、及cdFLDZ的大肠杆菌菌株分别使用含有30mg/L硫酸卡那霉素的3mL的LB培养基，一边以300rpm振荡一边于28℃进行16小时前培养。将该前培养液1mL接种于含有30mg/L硫酸卡那霉素的100mL的LB培养基，一边以120rpm振荡一边于30℃培养4小时，然后添加0.1mM的IPTG，进一步于20℃培养12小时。将得到的菌体利用反应缓冲液(100mM磷酸二氢钾(KH2PO4)、1mM硫酸镁(MgSO4)、0.5mM氯化硫胺素，pH7.0)洗涤2次。
将得到的休止菌体悬浮于含有2.5mM的4-硝基肉桂酸的反应缓冲液中，一边以300rpm振荡一边于30℃使其反应12小时。反应后，采集反应上清液，进行4-氨基肉桂酸的定量。将上清液移至离心管，通过离心分离进行回收，使用上述HPLC进行反应产物的定量。
另外，使用宿主大肠杆菌作为对照，实施了同样的实验。
图4为示出在大肠杆菌中重组产生后供于休止菌体反应的scFrm2、scHbn1、及cdFLDZ的从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化活性的图。在使用了产生scFrm2、scHbn1、及cdFLDZ的大肠杆菌菌株中任意株的休止菌体的情况下，与作为对照的大肠杆菌相比，培养基上清液中的4-氨基肉桂酸量均显著上升，可知，进行了基于scFrm2、scHbn1、及cdFLDZ的从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化。另外，作为对照的大肠杆菌生产了4-氨基肉桂酸。该结果证明了大肠杆菌具有使从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的还原反应发生的能力。
〔实施例2〕
[III.从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化]
1.基于CamPAL的菌体量和底物量的不同的转化效率的评价
将实施例1中记载的产生CamPAL的大肠杆菌菌株使用含有40mg/L硫酸卡那霉素的5mL的LB培养基，在搅拌速度为300rpm的搅拌、28℃的条件下前培养16小时。向具有以下组成的100mL的TB培养基中添加80mg/L硫酸卡那霉素，然后接种该前培养液1mL，一边以120rpm振荡一边于30℃培养4小时，然后添加0.1mM的IPTG，进一步培养20小时。通过离心分离从培养液中回收菌体后，于-80℃保存。将得到的冷冻菌体计量为10g/L、20g/L及30g/L。并且，将作为底物的4-硝基苯丙氨酸计量为4.2g/L、21g/L、42g/L。
[表2]
TB培养基(pH7.0)
胰蛋白胨 12g/L
酵母提取物 24g/L
KH2PO4 2.31g/L
K2HPO4 12.54g/L
甘油 8mL
将各菌体和底物悬浮于反应缓冲液(100mM Tris-HCl缓冲液、pH8.5)中，在300rpm的搅拌、37℃的条件下使其进行休止菌体反应。采集反应24小时后的反应液，进行4-硝基苯丙氨酸及4-硝基肉桂酸的定量。关于各反应产物的定量，将得到的(菌体)反应液的上清液移至离心管，通过离心分离进行回收，使用上述HPLC进行反应产物的定量。
图5示出了将各菌体量和底物量悬浮于反应缓冲液中、使其反应24小时的结果。根据该结果，菌体量为20g/L及30g/L、且底物量为21g/L时，显示出收率高达60％以上的、从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化效率。
2.4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化反应
将2L发酵罐(B.E.MARUBISHI CO.,LTD.制：BNR-C-2LS)作为反应器，使用实施例1中记载的产生CamPAL的大肠杆菌菌株(菌体量为20g/L～30g/L)，进行了将作为底物的4-硝基苯丙氨酸(底物量为21g/L)向4-硝基肉桂酸转化的反应。
具体而言，将上述产生CamPAL的大肠杆菌菌株使用添加有40mg/L硫酸卡那霉素的15mL的LB培养基一边以300rpm搅拌，一边于28℃前培养16小时。将该前培养液12mL接种于2L发酵罐(其包含添加有80mg/L硫酸卡那霉素的1.2L的TB培养基)，在通气量为3.5L/分钟、搅拌速度为500rpm、30℃的条件下培养4小时。接着，向该培养液中添加0.1mM的IPTG，进一步培养20小时。由培养液的O.D600的值计算菌体量，结果为30g/L。
培养结束后，向培养液中添加作为底物的21g/L的4-硝基苯丙氨酸，然后，使用2NNaOH水溶液调节为pH8.5。以不进行通气的方式使该培养液在500rpm的搅拌、37℃的条件下反应24小时。采集反应中的反应液，通过以下的方法进行4-硝基苯丙氨酸及4-硝基肉桂酸的定量。即，将反应液移至离心管，通过离心分离而回收上清液，使用上述条件的HPLC对反应产物进行定量。
图6为示出反应24小时后的反应液的分析结果的图。该结果显示出，以高转化效率从21g/L的4-硝基苯丙氨酸转化为18g/L的4-硝基肉桂酸。另外，将通气量变更为0.04L/分钟，进行24小时同样的反应，结果显示出，以高转化效率从21g/L的4-硝基苯丙氨酸转化为12g/L的4-硝基肉桂酸。
从产生CamPAL的大肠杆菌的1.2L反应液进行4-硝基肉桂酸的纯化。反应24小时后，通过离心分离而除去菌体，向反应液上清液中添加12N HCl从而调节为pH5，由此得到析出物。通过过滤而回收析出物后，用丙酮洗涤并使其干燥。将在干燥后回收的固体产物供于上述条件的HPLC分析。
图7为示出得到的产物的HPLC分析结果的图。由该结果显示，产物为4-硝基肉桂酸，发生了从4-硝基苯丙氨酸向4-硝基肉桂酸的转化反应。另外，可知得到的4-硝基肉桂酸的纯度为97％，收率为93％，纯度极高且为高收率。尤其是，得到的4-硝基肉桂酸的纯度是对于通过化学还原的方法转化为4-氨基肉桂酸而言充分的纯度。
〔实施例3〕
[IV.从4-硝基苯丙氨酸向4-氨基肉桂酸的转化反应]
1.适于4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化的碳源的研究
大肠杆菌具有硝基还原酶(nfsA及nfsB)是已知的。因此，使用大肠杆菌进行了从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的还原反应。
首先，将实施例1中记载的产生CamPAL的大肠杆菌菌株通过与实施例2同样的方法前培养16小时。将该前培养液1mL接种于添加有80mg/L硫酸卡那霉素的100mL的TB培养基，在120rpm的搅拌、30℃的条件下培养4小时，然后添加0.1mM的IPTG，进一步培养16小时。向得到的培养液中添加2g/L的4-硝基肉桂酸，使用2N NaOH调节为pH8后，作为碳源以最终浓度成为10％的方式添加葡萄糖、果糖及甘油，在300rpm的搅拌、37℃的条件下培养，使其反应24小时。
采集反应中的反应液，进行4-氨基肉桂酸的定量。即，将反应液移至离心管，通过离心分离而回收上清液，使用上述HPLC对反应产物进行定量。
图8为示出向产生CamPAL的大肠杆菌的培养液中以最终浓度10％添加葡萄糖、果糖及甘油时的从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化反应的图。该结果显示，添加甘油时，能得到最多的4-氨基肉桂酸。另外，可知甘油适合作为在该从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化反应时添加的碳源。
2.4-硝基苯丙氨酸的4-氨基肉桂酸转化
使用1L发酵罐(Biott公司制：BMJ-01)，在上述的添加甘油的条件下，进行了从4-硝基苯丙氨酸向4-氨基肉桂酸的转化。将实施例2的前培养液5mL接种于1L发酵罐(其包含添加有80mg/L硫酸卡那霉素的0.5L的TB培养基)，将通气量设为0.7L/分钟，在645rpm的搅拌、30℃的条件下培养4小时后，添加0.1mM的IPTG，进一步培养20小时。
培养结束后，向培养液中添加7g/L的4-硝基苯丙氨酸及最终浓度为10％的甘油，然后使用2N NaOH调节为pH8.5。在0.02L/分钟的通气量、645rpm的搅拌及37℃的条件下使其反应36小时。pH低于8.0的情况下，添加2N NaOH。采集反应中的反应液，进行4-硝基苯丙氨酸、4-硝基肉桂酸及4-氨基肉桂酸的定量。
图9为示出基于产生CamPAL的大肠杆菌的4-硝基苯丙氨酸向4-氨基肉桂酸的转化活性的图。该结果显示，将7g/L的4-硝基苯丙氨酸作为原料可生产4.7g/L的4-氨基肉桂酸。
从0.5L的反应液中进行4-氨基肉桂酸的纯化。从反应24小时的反应液中通过离心分离而除去菌体，向得到的上清液中添加12N HCl调节为pH3，向600mL的反应液上清液中添加700g强酸性阳离子交换树脂(三菱化学公司制：DIAION PK212LH)，搅拌1小时。将树脂回收，用树脂量的2倍量的蒸馏水洗涤，进一步用树脂量的2倍量的乙醇洗涤。添加树脂量的1.5倍量的7.5％氨水，使4-氨基肉桂酸洗脱。进一步添加0.5倍量的7.5％氨水对树脂进行漂洗后，得到含有4-氨基肉桂酸的洗脱液。将洗脱液用蒸发器浓缩后，使用12N HCl调节为pH3。然后，添加等量的乙酸乙酯搅拌1小时，通过离心分离而回收乙酸乙酯层。使用蒸发器除去乙酸乙酯，回收4-氨基肉桂酸的粗纯化物。
将4-氨基肉桂酸的粗纯化物溶解于丙酮后，通过过滤而除去不溶解物质，添加12NHCl，使4-氨基肉桂酸的盐酸盐析出。将其通过过滤而回收后，使用丙酮洗涤、干燥而得到固体干燥物。将在干燥后回收的固体产物供于上述条件的HPLC分析。
图10为示出得到的产物及4-氨基肉桂酸(标准品)的HPLC分析的结果的图。由该结果显示，产物为4-氨基肉桂酸，发生了利用了大肠杆菌的硝基还原酶(还原反应)的、从4-硝基苯丙氨酸向4-氨基肉桂酸的转化反应。另外，得到的4-氨基肉桂酸的纯度为98％，纯度极高。4-氨基肉桂酸的回收率为60％。
〔实施例4〕
[从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化]
1.质粒的构建及向大肠杆菌的导入
(1)pCDF Duet-1-nfsA的构建及向大肠杆菌的导入
将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酶nfsA(分别地，将氨基酸序列示于序列号13，将碱基序列的例子示于序列号14)从大肠杆菌(Escherichia coli)的基因组文库中使用引物5’-CAGACCATGGGCACGCCAACCATTGAACTTATTTGTG-3’(序列号23)及5’-GAGGATCCTTAGCGCGTCGCCCAACCCTG-3’(序列号24)利用PCR扩增后，利用限制性内切酶NcoI及BamHI进行酶切处理，与同样利用限制性内切酶NcoI及BamHI进行酶切处理后的质粒pCDFDuet-1(Novagen)使用DNA连接试剂盒Ligation High Ver.2(东洋纺公司制)连接，制作pCDF Duet-1-nfsA。将得到的pCDF Duet-1-nfsA利用热激转化法导入至大肠杆菌菌株BL21(DE3)。对得到的产生nfsA的大肠杆菌菌株进行培养，使nfsA表达。
(2)pCDF Duet-1-nfsB的构建及向大肠杆菌的导入
将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酶nfsB(分别地，将氨基酸序列示于序列号15，将碱基序列的例子示于序列号16)从大肠杆菌(Escherichia coli)的基因组文库中使用引物5’-CAGACCATGGGCGATATCATTTCTGTCGCC-3’(序列号25)及5’-GAGGATCCTTACACTTCGGTTAAGGTGATG-3’(序列号26)利用PCR扩增后，实施与上述nfsA的限制性内切酶处理相同的限制性内切酶处理及与质粒的连接，制作pCDF Duet-1-nfsA。将得到的pCDF Duet-1-nfsB利用热激转化法导入至大肠杆菌菌株BL21(DE3)。对得到的产生nfsB的大肠杆菌菌株进行培养，使nfsB表达。
2.基于nfsA、及nfsB的休止菌体反应的酶活性的评价
将上述的产生nfsA及nfsB的大肠杆菌菌株分别使用含有40mg/L的硫酸链霉素的5mL的LB培养基，一边以300rpm振荡一边于28℃前培养16小时。将该前培养液1mL接种于含有80mg/L硫酸链霉素的100mL的TB培养基，一边以120rpm振荡一边于30℃培养4小时，然后添加0.1mM的IPTG，进一步于30℃培养18小时。
向得到的含有菌体的培养液中添加2N NaOH而调节为pH8.0，向该培养液中悬浮2g/L的4-硝基肉桂酸及最终浓度为2％的甘油，一边以120rpm振荡一边于37℃使其反应18小时。反应后，采集反应液上清液，进行4-氨基肉桂酸的定量。将上清液移至离心管，通过离心分离而回收，使用上述HPLC对反应产物进行定量。
另外，使用宿主大肠杆菌作为对照，实施了同样的实验。
根据结果，产生nfsA的大肠杆菌菌株转化出0.26g/L的4-氨基肉桂酸，产生nfsB的大肠杆菌菌株转化出0.76g/L的4-氨基肉桂酸，作为对照的大肠杆菌菌株转化出0.32g/L的4-氨基肉桂酸。可知，进行了基于nfsA及nfsB的从4-硝基肉桂酸向4-氨基肉桂酸的转化。
产业上的可利用性
本发明可广泛用于要求从生物质等的葡萄糖合成4-氨基肉桂酸的领域，在产业上极其有用。

Claims (14)

1.从4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸的方法，所述方法包括：
(1)将4-硝基苯丙氨酸转化为4-硝基肉桂酸；
(2)将4-硝基肉桂酸转化为4-氨基肉桂酸，
其中，所述(1)的转化使用第一酶来进行，所述第一酶为由序列号1、3或5表示的氨基酸序列，
所述(2)的转化使用第二酶来进行，所述第二酶为由序列号7、9、11、13或15表示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述(1)的转化使用第一宿主细胞来进行，所述第一宿主细胞被修饰为能表达所述第一酶。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述第一宿主细胞为微生物。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述微生物为细菌。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述(1)的转化利用休止菌体反应来进行，所述休止菌体反应中，使用了作为所述第一宿主细胞的细菌的休止菌体。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述(2)的转化使用表达所述第二酶的第二宿主细胞来进行。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述第二宿主细胞被修饰为能表达所述第二酶。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述第二宿主细胞为微生物。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述微生物为细菌。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述(2)的转化利用休止菌体反应来进行，所述休止菌体反应中，使用了作为所述第二宿主细胞的细菌的休止菌体。
11.如权利要求5或10所述的方法，其中，所述休止菌体选自由培养菌体、粉末菌体、及固定化菌体组成的组。
12.如权利要求6或7所述的方法，其中，于pH8～9进行所述(2)的转化。
13.从葡萄糖制造4-氨基肉桂酸的方法，所述方法包括：
(a)从葡萄糖产生苯丙氨酸；
(b)将所述(a)中得到的苯丙氨酸进行硝基化而转化为4-硝基苯丙氨酸；
(c)利用权利要求1～12中任一项所述的方法，从所述(b)中得到的4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸。
14.从苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸的方法，所述方法包括：
(b)将苯丙氨酸进行硝基化而转化为4-硝基苯丙氨酸；
(c)利用权利要求1～12中任一项所述的方法，从所述(b)中得到的4-硝基苯丙氨酸制造4-氨基肉桂酸。
CN201980016395.5A 2018-03-02 2019-03-04 制造4-氨基肉桂酸的方法、以及用于其的载体及宿主细胞 Active CN111801420B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-037794 2018-03-02
JP2018037794 2018-03-02
PCT/JP2019/008482 WO2019168203A1 (ja) 2018-03-02 2019-03-04 ４－アミノ桂皮酸を製造する方法、並びに、それに用いられるベクター及び宿主細胞

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111801420A CN111801420A (zh) 2020-10-20
CN111801420B true CN111801420B (zh) 2023-10-24

Family

ID=67805416

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980016395.5A Active CN111801420B (zh) 2018-03-02 2019-03-04 制造4-氨基肉桂酸的方法、以及用于其的载体及宿主细胞

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11352652B2 (zh)
EP (1) EP3760723A4 (zh)
JP (1) JP7228914B2 (zh)
CN (1) CN111801420B (zh)
WO (1) WO2019168203A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11352652B2 (en) * 2018-03-02 2022-06-07 Japan Science And Technology Agency Method for producing 4-aminocinnamic acid, and vector and host cell used in same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146773A (zh) * 2013-03-08 2013-06-12 江南大学 一种增强大肠杆菌l-苯丙氨酸胞外分泌的方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2202607C2 (ru) 2000-03-03 2003-04-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм бактерий methylophilus methylotrophus - продуцент l-фенилаланина (варианты), способ получения l-фенилаланина
WO2003000255A1 (en) * 2001-06-25 2003-01-03 Essential Therapeutics, Inc. Novel nitrofuran-containing heterocyclic compounds and uses thereof
AU2007299219A1 (en) 2006-04-05 2008-03-27 Metanomics Gmbh Process for the production of a fine chemical
AU2010321223A1 (en) * 2009-11-18 2012-08-02 Basf Plant Science Company Gmbh Process for the production of fine chemicals
CN103906790B (zh) * 2011-11-17 2016-05-25 国立研究开发法人科学技术振兴机构 高分子原料和高分子材料
JP6796927B2 (ja) * 2014-02-06 2020-12-09 国立研究開発法人科学技術振興機構 酵素を用いた４−アミノ桂皮酸の製造方法
EP3121275A4 (en) * 2014-03-20 2017-11-22 Japan Science and Technology Agency Method for producing aniline derivative by fermentation from carbon source
US11352652B2 (en) * 2018-03-02 2022-06-07 Japan Science And Technology Agency Method for producing 4-aminocinnamic acid, and vector and host cell used in same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146773A (zh) * 2013-03-08 2013-06-12 江南大学 一种增强大肠杆菌l-苯丙氨酸胞外分泌的方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NP_009904.2.NCBI .2016,VERSION、SOURCE、FEATURES、ORIGIN 部分. *
NP_065436.1.NCBI .2016,VERSION、SOURCE、FEATURES、ORIGIN 部分. *
O49836.1.UniProtKB/Swiss-Prot.2016,VERSION、SOURCE、FEATURES、ORIGIN 部分. *
P45726.1.UniProtKB/Swiss-Prot.2016,VERSION、SOURCE、FEATURES、ORIGIN 部分. *
Sarah L. Lovelock et al..Phenylalanine Ammonia Lyase Catalyzed Synthesis of Amino Acids by an MIO-Cofactor Independent Pathway.Angew. Chem. Int. Ed..2014,第53卷摘要，第4653页左栏第2段，表2. *
WP_000189159.1.NCBI.2015,标题、VERSION、FEATURES、ORIGIN 部分. *
WP_000351487.1.WP_000351487.1.2016,VERSION、SOURCE、FEATURES、ORIGIN 部分. *
WP_004455018.1.NCBI .2016,VERSION、SOURCE、FEATURES、ORIGIN 部分. *
Yoshitaro TAKAYAMA and Yasuji TSUBUKU.Studies on Amino-Acid and Related Compounds. XIV.* Action of Nitric Acid on Phenylatanine, Tyrosine, and p-Hydroxybenzoic Acid.Bulletin of the Chemical Society of Japan.1941,第17卷(第3期),第110页. *
胡涛等.3-硝基肉桂酸和3-氨基肉桂酸的合成.天津理工大学学报.2010,第26卷(第3期),第83页右栏最后一段，路线1. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111801420A (zh) 2020-10-20
JP7228914B2 (ja) 2023-02-27
WO2019168203A1 (ja) 2019-09-06
US20210017555A1 (en) 2021-01-21
US11352652B2 (en) 2022-06-07
EP3760723A1 (en) 2021-01-06
EP3760723A4 (en) 2021-12-15
JPWO2019168203A1 (ja) 2021-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108239633B (zh) 一种催化活性得到提高的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用
CN110079489B (zh) 一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法
JP2020174686A (ja) 酵素を用いた４−アミノ桂皮酸の製造方法
WO2019094447A2 (en) Production of mycosporine-like amino acids in cyanobacteria
CN114480317A (zh) 表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的工程化微生物及提高pha产量的方法
CN108239632B (zh) 一种热稳定性得到改善的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用
CN111801420B (zh) 制造4-氨基肉桂酸的方法、以及用于其的载体及宿主细胞
CN112358530B (zh) 多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用
CN110904062B (zh) 一株高产l-丙氨酸的菌株
CN109182286B (zh) 一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用
CN115786319A (zh) 一种热稳定性提高的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及突变体
CN114806913A (zh) 具有线粒体定位还原tca途径的高产琥珀酸酵母工程菌株及其构建方法和应用
CN114134127A (zh) 用于合成依克多因的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体
CN113249240A (zh) 一种高产羟基酪醇的酿酒酵母及其构建方法
WO2018180568A1 (ja) 変異型２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素
CN114250237B (zh) 一种酪氨酸酚裂解酶突变体、工程菌及在催化合成左旋多巴中的应用
CN114196609B (zh) 从乳酸合成纯聚乳酸的大肠杆菌工程菌及其制备方法和应用
CN111057698B (zh) L-阿拉伯糖异构酶、突变体及其应用
JP6954603B2 (ja) ミオ−イノシトールの製造方法
CN117683754A (zh) 腈水解酶突变体及其在农药合成中的应用
CN114277003A (zh) 谷氨酰胺合酶突变体及其应用
KR101710553B1 (ko) 헤모필루스 인플루엔자 Rd KW20 균주 유래 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 변이체
CN118638759A (zh) 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
CN117730147A (zh) 苯丙素类化合物的生物合成
CN115873852A (zh) 重组核酸序列、基因工程菌及生产1,5-戊二胺的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant