CN114480317A - 表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的工程化微生物及提高pha产量的方法 - Google Patents

表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的工程化微生物及提高pha产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA产量的方法。本发明提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因能够明显促进菌株对PHA的合成和积累，显著提高PHA的产量；利用本发明提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因构建的工程化罗氏真养菌的细胞干重和PHA产量显著提高，为PHA的工程化菌株的开发提供了新的基因和菌株资源，对提高PHA的发酵生产效率和降低生产成本具有重要的应用价值。

Description

表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA产 量的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及提高聚羟基脂肪酸酯产量的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因，以及表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA产量的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的可再生、可降解且具有多元材料学性能的高分子聚合物，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。聚羟基脂肪酸酯广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。PHA根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。聚羟基丁酸酯（PHB）是PHA中的一种，是由细菌产生的商业上有用的复合生物聚合物，具有多种潜在应用，包括用作可生物降解/热塑性材料、某些抗生素有机合成的手性中心来源以及用作药物递送和骨替代的基质等。3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx，简称PHBH)，也是PHA中的一种，以不溶性微球状颗粒形式存在于细胞质中。
罗氏真养菌(Ralstonia eutropha，也称Cupriavidus necator)是研究PHA合成的重要模式细菌，是目前研究较多的用于PHB生成的菌株。当碳过剩、氮缺乏时，菌株可以大量积累PHB；而当胞内其他碳源代谢旺盛时，PHB的合成则会受到影响。目前，PHB在罗氏真养菌体内的合成途径已被阐述清楚：酯酰辅酶A（Acyl-CoA）在phaA（β-酮基硫解酶）的作用下合成乙酰乙酰辅酶A（acetoacetyl CoA），再通过phaB（乙酰乙酰辅酶A还原酶）合成3-羟基丁酸。菌株的发酵生产性能是影响PHA生产的关键因素，因此，开发有利于PHA合成和积累的基因和菌株具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供能够提高聚羟基脂肪酸酯产量的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因，以及用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程化微生物。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB）变体，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体与SEQ ID NO.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶A还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种：
（1）第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
（2）第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
（3）第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
（4）第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或组氨酸；
（5）第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
本发明提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体与SEQ ID NO.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶A还原酶相比存在的突变，可包含上述（1）~（5）中任选的一种突变，也可包含上述（1）~（5）中涉及突变的任意两个、三个、四个或五个的组合。
本发明通过实验证明，含有上述单一突变位点的变体以及含有任意两个、三个、四个或五个突变位点的组合的变体均能够显著提高菌株的生物量和PHA的含量，进而显著提高PHA的产量。
第二方面，本发明提供编码以上所述的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的核酸分子。
基于上述提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够获得编码以上所述的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的核酸分子的核苷酸序列，编码同一氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，但所有能够编码以上所述的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的核酸分子均在本发明的保护范围内。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-28任一所示。
第三方面，本发明提供含有以上所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
在本发明的一些实施方式中，含有以上所述的核酸分子的表达盒由启动子、编码以上所述的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的核酸分子以及终止子可操作性地连接得到。根据表达需要以及表达盒上下游序列的不同，表达盒中也可不包含终止子，或者含有增强子等其他转录、翻译调控元件。
在本发明的一些实施方式中，含有以上所述的核酸分子的载体为质粒载体，这些质粒载体包括复制性载体和非复制型载体。携带上述核酸分子的载体不局限于质粒载体，还可为噬菌体、病毒等载体。
在本发明的一些实施方式中提供了含有上述核酸分子、表达盒或载体的大肠杆菌细胞和罗氏真养菌细胞，但宿主细胞的种类并不局限于此，可以为任意的微生物细胞或可用于蛋白表达的动物细胞。
第四方面，本发明提供乙酰乙酰辅酶A还原酶变体或其编码基因在提高工程化微生物PHA产量中的应用，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体与SEQ ID NO.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶A还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种：
（1）第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
（2）第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
（3）第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
（4）第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或组氨酸；
（5）第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-28任一所示。
上述应用中，所述微生物优选为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
第五方面，本发明提供乙酰乙酰辅酶A还原酶变体或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在构建生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的微生物中的应用。
基于本发明提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体能够提高微生物的PHA产量的功能，编码这些变体的核酸分子以及含有这些核酸分子的生物材料可以用于构建生产PHA或其衍生物的菌株。
本发明中，PHA的衍生物是指以PHA为前体物质合成的代谢产物。在PHA合成能力提高的情况下，以PHA为前体合成的代谢产物的产量通常也可相应地提高。
上述应用中，所述微生物优选为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
在本发明的一些实施方式中，将SEQ ID NO.3-28任一所示的核酸分子导入罗氏真养菌中构建生产PHA的菌株。
第六方面，本发明提供一种工程化罗氏真养菌，所述工程化罗氏真养菌表达所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体。
所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体与SEQ ID NO.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶A还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种：
（1）第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
（2）第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
（3）第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
（4）第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或组氨酸；
（5）第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体为以下任一种：WP018973707.1、MBI1365550.1、WP 019621003.1、PZO88445.1、WP 188557499.1、WP018954578.1、WP 109722486.1、HBR97190.1、RKZ34011.1、PCI29794.1、WP 152128546.1、WP043577352.1、WP 028534370.1、WP 163146383.1、WP 020559877.1、EEV22383.1、WP054674877.1、WP 116473412.1 、WP 062152427.1、WP 070469244.1、MBE0623823.1、WP166570087.1、WP 187671963.1、WP 124635583.1、WP 175829488.1、WP 041099832.1。
本发明中，表达目标酶或其变体可通过以下任一种或多种方法实现：
（1）导入包含乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的质粒；
（2）在基因组中插入一个或多个拷贝的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因。
在本发明的一些实施方式中，通过在基因组中插入一个拷贝的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因来表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体。
在本发明的一些实施方式中，基因组中插入乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的位置为phaC基因的编码区或其编码区的下游。
在本发明的一些实施方式中，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因如SEQID NO.3-28任一所示。这些编码基因的序列为根据罗氏真养菌的密码子偏好性并结合人工优化和筛选得到的能够在罗氏真养菌中高效、正确表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的序列，使用这些序列有利于促进乙酰乙酰辅酶A还原酶变体更好地在罗氏真养菌中发挥提高PHA合成的作用。
在本发明的一些实施方式中，提供用于合成PHBH的工程化罗氏真养菌，为促进PHBH的合成，所述工程化罗氏真养菌还包含以下修饰中的一种或多种：
（1）表达能够合成PHBH的PHA聚合酶变体；
（2）(R)-烯酰辅酶A水合酶的表达和/或酶活性增强。
其中，能够合成PHBH的PHA聚合酶变体可通过对细菌的PHA聚合酶的氨基酸序列进行突变以使得其能够聚合C6脂肪酸（3-羟基己酸），可采用现有技术中的能够聚合C6脂肪酸（3-羟基己酸）的PHA聚合酶变体，也可通过将现有技术中能够合成PHBH的PHA聚合酶变体的突变位点进行组合，获得新的更高效的PHA聚合酶变体。
在本发明的一些实施方式中，所述能够合成PHBH的PHA聚合酶变体相比原始PHA聚合酶，含有第149位天冬酰胺突变为丝氨酸的突变和第171位天冬氨酸突变为甘氨酸的突变。
在本发明的一些实施方式中，所述PHA聚合酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。
上述表达能够合成PHBH的PHA聚合酶变体通过以下任一种或多种方式实现：
（1）导入包含所述能够合成PHBH的PHA聚合酶变体的编码基因的质粒；
（2）在基因组中插入一个或多个拷贝的所述能够合成PHBH的PHA聚合酶变体的编码基因。
在本发明的一些实施方式中，表达能够合成PHBH的PHA聚合酶变体，同时失活基因组原始的PHA聚合酶编码基因。
在本发明的一些实施方式中，将能够合成PHBH的PHA聚合酶变体的编码基因插入基因组中。
在本发明的一些实施方式中，导入含有能够合成PHBH的PHA聚合酶变体的编码基因的表达质粒。
在本发明的一些实施方式中，所述表达质粒为稳定表达质粒，质粒的稳定表达通过在质粒中携带菌株生长必需的代谢物的合成基因，同时将基因组中的该合成基因失活实现。
在本发明的一些实施方式中，所述含有SEQ ID NO.29所示的PHA聚合酶变体的编码基因的质粒还含有proC基因，且所述工程化罗氏真养菌的基因组proC基因失活。
上述增强酶的表达可通过以下（1）-（4）中的任意一种或多种方式实现：
（1）导入含有所述酶的编码基因的载体；
（2）增加基因组中所述酶的编码基因的拷贝数；
（3）改变基因组中所述酶的编码基因的转录和/或翻译调控元件（包括启动子等）的序列；
（4）改变所述酶的编码基因的核苷酸序列。
上述酶活性的增强可通过将所述酶的一个或多个氨基酸进行替换、缺失或插入实现。
在本发明的一些实施方式中，(R)-烯酰辅酶A水合酶的表达和/或酶活性增强通过以SEQ ID NO.30所示的启动子起始基因组(R)-烯酰辅酶A水合酶编码基因的转录实现。
在本发明的一些实施方式中，以SEQ ID NO.30所示的启动子起始基因组(R)-烯酰辅酶A水合酶编码基因的转录通过在基因组(R)-烯酰辅酶A水合酶编码基因与其上游基因的基因间区域插入SEQ ID NO.30所示的启动子实现。
在本发明的一些实施方式中，所述工程化罗氏真养菌是以野生型罗氏真养菌、罗氏真养菌H16菌株或罗氏真养菌BPS-050为出发菌株经修饰得到。
其中，罗氏真养菌（Ralstonia eutropha）BPS-050已于2021年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为富养罗尔斯通氏菌Ralstonia eutropha，保藏编号为CGMCC No.23600。
本发明经实验证实，在上述出发菌株中表达本发明提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体能够显著提升PHA的产量。
第七方面，本发明提供工程化罗氏真养菌转化体库，所述转化体库包含以上所述的工程化罗氏真养菌中的至少2株。
在本发明的一些实施方式中，所述转化体库中的工程化罗氏真养菌表达选自以下乙酰乙酰辅酶A还原酶变体中的任一种：WP 018973707.1、MBI1365550.1、WP 019621003.1、PZO88445.1、WP 188557499.1、WP 018954578.1、WP 109722486.1、HBR97190.1、RKZ34011.1、PCI29794.1、WP 152128546.1、WP 043577352.1、WP 028534370.1、WP163146383.1、WP 020559877.1、EEV22383.1、WP 054674877.1、WP 116473412.1 、WP062152427.1、WP 070469244.1、MBE0623823.1、WP 166570087.1、WP 187671963.1、WP124635583.1、WP 175829488.1、WP 041099832.1，所述转化体库中各株工程化罗氏真养菌表达的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的氨基酸序列不同。
在本发明的一些实施方式中，所述转化体库包含以上所述的工程化罗氏真养菌中的任意2-26株。
第八方面，本发明提供所述工程化罗氏真养菌的构建方法，所述方法包括修饰罗氏真养菌以表达所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的步骤。
在本发明的一些实施方式中，为促进工程化罗氏真养菌对PHBH的合成能力，所述方法还包括对罗氏真养菌进行以下修饰中的一种或多种：
（1）表达能够合成PHBH的PHA聚合酶变体；
（2）增强(R)-烯酰辅酶A水合酶的表达和/或酶活性。
在本发明的一些实施方式中，所述能够合成PHBH的PHA聚合酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括以SEQ ID NO.30所示的启动子起始基因组(R)-烯酰辅酶A水合酶编码基因的转录。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括将能够合成PHBH的PHA聚合酶变体的编码基因插入基因组中。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括导入含有能够合成PHBH的PHA聚合酶变体的编码基因的质粒。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括导入含有能够合成PHBH的PHA聚合酶变体的编码基因和proC基因的质粒，以及将基因组中的proC基因失活。
其中，基因失活可通过基因敲除、沉默表达、RNA干扰等方式实现。
第九方面，本发明提供所述工程化罗氏真养菌的以下任一种应用：
（1）在发酵生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物中的应用；
（2）在选育用于发酵生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的菌株中的应用。
本发明中，聚羟基脂肪酸酯（PHA）包括但不限于聚羟基丁酸酯（PHB）、3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx，简称PHBH)、3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物（PHBV）等。
上述应用中，选育用于发酵生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的菌株具体可为：以本发明提供的工程化罗氏真养菌为出发菌株，采用基因工程改造、诱变或驯化方法选育用于发酵生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的菌株。
第十方面，本发明提供一种发酵生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的方法，所述方法包括培养所述工程化罗氏真养菌并获得培养物的步骤。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括对所述工程化罗氏真养菌进行活化培养，将活化菌体接种至种子培养基中进行种子培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中，得到所述培养物。
上述培养可以选择罗氏真养菌培养常用的培养基。培养基中可含有碳源、氮源及无机盐。其中，碳源包括但不限于植物油（例如棕榈油）、蔗糖、葡萄糖、糖蜜、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖中的一种或多种的组合；氮源包括但不限于玉米浆、酵母膏、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾中的一种或多种的组合；无机盐包括但不限于磷酸盐、钾盐、钠盐、镁盐、锌盐、铁盐、锰盐、钙盐、硼酸盐、钴盐、铜盐、镍盐、钼盐中的一种或多种的组合。
在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括对培养得到的培养物进行分离提取，收集聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的步骤。
本发明的有益效果在于：本发明提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因能够明显促进菌株的PHA的合成和积累，同时促进菌株的生物量提高，进而显著提高了PHA的产量；利用本发明提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因构建的工程化罗氏真养菌的细胞干重和PHA产量显著提高，为PHA的工程化菌株的开发提供了新的基因和菌株资源，对提高PHA的发酵生产效率和降低生产成本具有重要的应用价值。
具体实施方式
本发明的应用不限于其在下文说明书所述或所举例说明的方案。本发明能够用于其它实施方案并且可以多种方式实施或进行。此外，本文所用的短语和术语是用于描述的目的，而不应被视为限定。本文所用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式旨在包括下文列举的项目及其等同物以及其它项目。
本发明提供的具体实施方案部分或全部基于以下发现：本发明发现了能够显著提高菌株PHA产量的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因。这些乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因可以导入具有PHA合成所需的其他基因的菌株中，用于提高这些菌株的PHA产量，由此得到工程化微生物。这些工程化微生物可用于生产PHA，进而提高现有PHA发酵生产菌株的发酵生产性能。在表达本发明提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的基础上，工程化微生物还可进行其他修饰，本发明发现了乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的表达至少可以与PHA聚合酶（phaC）变体的表达、phaJ的强化表达进行联合修饰，以使得PHA的产量进一步提升。
在一些实施方案中，本发明提供与SEQ ID NO.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶A还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体：
（1）第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
（2）第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
（3）第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
（4）第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或组氨酸；
（5）第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
在满足具有上述（1）-（5）所示的突变中的任意一种或多种突变的条件下，本发明提供具有与如WP 018973707.1、MBI1365550.1、WP 019621003.1、PZO88445.1、WP188557499.1、WP 018954578.1、WP 109722486.1、HBR97190.1、RKZ34011.1、PCI29794.1、WP152128546.1、WP 043577352.1、WP 028534370.1、WP 163146383.1、WP 020559877.1、EEV22383.1、WP 054674877.1、WP 116473412.1 、WP 062152427.1、WP 070469244.1、MBE0623823.1、WP 166570087.1、WP 187671963.1、WP 124635583.1、WP 175829488.1、WP041099832.1任一蛋白的氨基酸序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或前述数值中的任意两者构成的范围的相似性的氨基酸序列的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体。
乙酰乙酰辅酶A还原酶变体可以包括全长乙酰乙酰辅酶A还原酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶的片段、截短的乙酰乙酰辅酶A还原酶等所有具有催化乙酰乙酰辅酶A生成3-羟基丁酸活性的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体。
在一些实施方案中，本发明提供编码上述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的基因，这些基因具有SEQ ID NO.3-28任一所示的核苷酸序列。这些基因是在罗氏真养菌中优化表达的。
本发明提供的上述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因能够显著提高菌株的干重以及PHA含量，进而有效提高菌株的PHA产量。
在一些实施方案中，本发明提供在基因组中插入上述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。
在一些实施方案中，本发明提供在罗氏真养菌BPS-050菌株的基因组中插入上述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。这些工程化罗氏真养菌具有较罗氏真养菌BPS-050菌株明显提高的PHA产量。
在一些实施方案中，本发明提供在罗氏真养菌BPS-050菌株的基因组中phaC缺失的位置插入上述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。
在一些实施方案中，本发明提供在罗氏真养菌H16菌株的基因组中插入上述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。这些工程化罗氏真养菌具有较高的PHB产量。
在一些实施方案中，本发明提供在罗氏真养菌H16菌株的基因组中phaC基因处插入上述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。
在一些实施方案中，本发明提供将罗氏真养菌H16菌株的基因组中的phaC基因替换为编码PHA聚合酶变体（序列如SEQ ID NO.29所示）的基因、将其基因组phaJ基因以SEQID NO.30所示的启动子起始转录，并在其基因组中插入上述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。这些工程化罗氏真养菌具有明显提高的PHBH产量。
在相同的发酵培养条件下，上述实施方案中的工程化罗氏真养菌的聚羟基脂肪酸酯的产率较出发菌株显著提高。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的转化体库的构建以及乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的筛选
本实施例以罗氏真养菌BPS-050作为出发菌，构建含有不同乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的转化体库，具体包括如下步骤：
步骤1：构建基础质粒
以罗氏真养菌基因组为模板进行PCR扩增，得到phaC上下游同源片段phaC-H1和phaC-H2，在phaC-H1、phaC-H2的后端、前端加入BsaI位点以方便后续操作；以修饰后的质粒pK18mob (Orita,I., Iwazawa,et al. J.Biosci.Bioeng.113, 63-69)为模板PCR扩增得到载体片段，使用的引物序列如表1所示。将phaC-H1、phaC-H2通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pKO-C（序列如SEQ ID NO.1所示）。
表1
Figure 959010DEST_PATH_IMAGE001
步骤2：基因合成
将待筛选的不同的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因分别进行序列优化以使得其能够在罗氏真养菌中较好地表达。分别合成经优化后的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体编码基因，在合成的DNA序列的上游添加GGTCTCATC，下游添加GTGAAGAGACC，以便于后续操作。
步骤3：构建含有目的基因的目标菌株
将步骤1构建的pKO-C质粒与基因合成得到的含有乙酰乙酰辅酶A还原酶变体编码基因的质粒利用Goldengate方法进行组装，分别得到携带不同乙酰乙酰辅酶A还原酶变体编码基因的重组质粒pKO-C-N（N代表装载的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体编码基因）。将各质粒分别转化至大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌BPS-050中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有500μg/mL壮观霉素与100μg/mL安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中携带同源片段的重组质粒整合到基因组的phaC-H1和phaC-H2所在的特定位置，由此得到第一次同源重组菌。将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有壮观霉素抗性的克隆，并用引物FphaCH1-F：tggtctggctggcggactgag 和phaCH2-R：ggcgaactcatcctgcgcctc进行PCR，测序鉴定插入目的基因（不同的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因）的重组菌，得到的重组菌为稳定质粒版本的罗氏真养菌ReΔproCΔphaC::N，共得到221个转化子。
步骤4：构建过表达罗氏真养菌原始phaB基因的重组菌
参考步骤3中构建重组质粒的方法，利用Gibson组装方法构建含有罗氏真养菌原始phaB基因的重组质粒，具体方法如下：
以步骤1得到的pKO-C质粒为模板进行PCR扩增，得到质粒骨架片段，以罗氏真养菌基因组为模板扩增得到phaB基因片段，将上述两个片段通过Gibson Assembly方法连接，得到重组质粒pKO-C-phaB。构建过程中使用的引物如表2所示。
表2
Figure 626751DEST_PATH_IMAGE002
将pKO-C-phaB质粒转化至大肠杆菌S17-1中，按照上述步骤3的方法构建重组菌，最终得到phaB基因整合在罗氏真养菌的phaC基因处的过表达菌株ReΔphaC::phaB。
步骤5：筛选能够显著提高罗氏真养菌PHA产量的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体
（1）表达不同乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的重组菌的发酵培养
将步骤3得到的表达不同乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的重组菌进行平板划线，得到单克隆，将单克隆接在种子培养基（4 mL）中，培养12小时。将过夜培养的菌液转接到装有10mL LB活化培养基的100 mL玻璃锥形瓶，接种终OD量约0.1，30 ℃，220 rpm，培养8 h，即可进行转接培养。PHA发酵生产的培养是将OD值在6-7之间的前培养种子，按0.1OD接种于装有30ml发酵培养基的250ml摇瓶里，之后再加入300 μl的棕榈油和一定量的乳化剂。48 h后停止发酵，取发酵液进行离心得到菌体。将菌体烘干至恒重。
上述发酵培养基的配方如下：1% 棕榈油，1g/L NH4Cl， 10mL/L微量元素溶液I和1mL/L微量元素溶液II；其中微量元素溶液I的组成为：20g/L MgSO4，2g/L CaCl2。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO4·7H2O，30mg/L MnCl2·4H2O，300mg/L H3BO3，200mg/LCoCl2·6H2O，10mg/L CuSO4·5H2O，20mg/L NiCl2·6H2O，30mg/L NaMoO4·2H2O。上述试剂购自国药集团化学试剂公司。
（2）PHA的含量检测
酯化液的配制：取485mL无水甲醇，加入1g/L苯甲酸，缓慢加入15mL浓硫酸，即制成约500mL的酯化液。
样品制备：向精确称重样品后的酯化管中加入2mL 酯化液和2mL氯仿。称取10mg左右的PHA样品，同样方式处理作为标准样品。酯化管加盖密封后100℃反应4小时。反应结束后待酯化管冷却至室温，加入1mL去离子水，漩涡震荡至充分混合，静置分层。水相和有机相完全分离后，取下层有机相用于气相色谱法(GC)分析。
GC分析PHA组成及含量：使用岛津公司的GC-2014型气相色谱仪。色谱仪的配置为：HP-5型毛细管色谱柱，氢火焰离子化检测器FID，SPL分流进样口；高纯氮气作为载气，氢气为燃气，空气为助燃气；使用AOC-20S型自动进样器，丙酮为洗涤液。GC分析程序的设置为：进样口温度240℃，检测器温度250℃，柱温起始温度为80℃，维持1.5分钟；以30℃/分钟的速率升至140℃并维持0分钟；以40℃/分钟的速率升至240℃并维持2分钟；总计时间为8分钟。GC结果采用内标归一法根据峰面积进行定量计算PHA组成及含量。
对表达不同乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的重组菌的PHA产量进行检测，经筛选发现，大部分乙酰乙酰辅酶A还原酶变体并不能显著提高罗氏真养菌的PHA产量，甚至很多乙酰乙酰辅酶A还原酶变体使得罗氏真养菌的PHA产量明显下降（甚至降低至40%以下），仅有26个乙酰乙酰辅酶A还原酶变体能够显著提高罗氏真养菌的PHA产量（PHA含量达到83%以上）。表达这26个乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的重组菌的PHA产量和菌体干重的检测结果如表3所示，以出发菌罗氏真养菌BPS-050作为对照菌株，对照菌株的CDW为10.34g/L，PHA比例为82.21%，H比例为8.15mol%。
表3
Figure 764472DEST_PATH_IMAGE003
注：表3中“✔”代表分别含有V141I、M12T、I194V、E42K、F55V突变位点；“-”代表该位点氨基酸未发生突变；L、S等代表在相应的突变位点突变为亮氨酸、丝氨酸等其他氨基酸类型；PHA含量（%）为菌体中PHA的含量；H摩尔比（%）为PHBH（PHBHHx）中H（3HHx）的摩尔占比。
（3）过表达原始phaB的重组菌的发酵培养和PHA含量检测
将上述步骤4得到的过表达原始phaB基因的重组菌按照上述（1）中的方法进行发酵培养，并按照上述（2）中的方法进行PHA含量检测，以出发菌罗氏真养菌BPS-050作为对照菌株。
发酵结果如表4所示。结果表明，过表达罗氏真养菌自身的phaB基因无法提高PHA产量。
表4
Figure 475945DEST_PATH_IMAGE004
实施例2 乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的保守位点分析
对实施例1中筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶A还原酶变体（表3所示）的保守位点进行分析，同时随机选取16个PHA产量低于40%的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体，将这些乙酰乙酰辅酶A还原酶变体进行多序列比对，并通过一定的计算机算法对结果进行分析，最终确定能够有效提高PHA产量的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的保守位点：以罗氏真养菌的phaB基因作为序列基准，保守位点分别为V141I, M12T, I194V, E42K, F55V。
实施例3 以H16为出发菌构建表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的转化体库及其性能验证
本实施例以罗氏真养菌H16作为出发菌（罗氏真养菌H16菌株的phaC基因未发生突变，phaJ基因上游未引入启动子），在罗氏真养菌H16中分别表达实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶A还原酶变体。
重组质粒和重组菌的构建方法参考实施例1，区别在于将乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因插入基因组的phaC基因之后，相应地将实施例1中的上下游同源片段的引物phaCH1-F、phaCH1-R更改为iphaCH1 F：tggtacccggccaagtctgtgtggaactacgtggtcgac；iphaCH1 R：TGAGACCCAAGGTCTCCATtcatgccttggctttgacgtatc，其他操作同实施例1，构建得到分别表达实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的重组菌。
将构建得到的重组菌按照实施例1的方法进行发酵培养和PHA产量检测，菌体干重和PHA的产量检测结果如表5所示。结果表明，实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶A还原酶变体同样能够提高罗氏真养菌H16菌株的细胞干重和PHA含量，进而有效提高PHA的产量。
表5
Figure 699116DEST_PATH_IMAGE005
实施例4 以H16的基因改造菌为出发菌构建表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的转化体库及其性能验证
本实施例以罗氏真养菌H16作为出发菌，将其基因组phaC基因突变为phaC基因变体（编码蛋白序列如SEQ ID NO.29所示），并将在基因组phaJ基因的上游插入SEQ ID NO.30所示的启动子，在此基础上，再分别表达实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶A还原酶变体，具体方法如下：
步骤1：替换罗氏真养菌基因组phaC基因
phaC基因变体的基因合成序列如SEQ ID NO.2所示，该序列含有phaC基因上下游约600bp片段及phaC突变体，同时在合成序列的上游添加GGTCTCATC，下游添加GTGAAGAGACC，以便于后续与载体连接。将合成基因通过Goldengate方法与pKO-C载体片段连接，得到重组质粒pK18mob-ΔphaC::phaCac。
将重组质粒pK18mob-ΔphaC::phaCac转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌H16中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/mL卡那霉素与100μg/mL安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物phaC-H1 FP和phaC-H2 RP进行PCR，测序鉴别出phaC基因替换的重组菌，得到的重组菌为罗氏真养菌ReΔphaC::phaCac。
步骤2：构建phaJ4b基因上游插入特定启动子的重组菌
（1）以步骤1得到的罗氏真养菌ReΔphaC::phaCac的基因组为模板进行PCR扩增，使用phaJ-H1 Fp、phaJ-H1 Rp得到phaJ基因启动子的上游同源片段H1；使用phaJ-H2 Fp、phaJ-H2 Rp得到phaJ基因启动子的下游同源片段H2。
（2）基因合成phaJ基因的启动子phaJ43（SEQ ID NO.30）。
（3）将PCR得到的H1和H2以及phaJ43启动子通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pK18mob-phaJ43。上述使用的引物如表6所示。
表6
Figure 904969DEST_PATH_IMAGE006
（4）将重组质粒pK18mob-phaJ43转入大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌ReΔphaC::phaCac中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/mL卡那霉 素与100μg/mL安普霉素LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组的H1和H2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。将第一次同源重组菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物phaJ Fp和phaJ Rp进行PCR鉴别出相应大小的重组菌，得到的重组菌为罗氏真养菌ReΔphaC::phaCac_phaJ43。
（5）在罗氏真养菌ReΔphaC::phaCac_phaJ43中分别表达实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶A还原酶变体。
重组质粒和重组菌的构建方法参考实施例1，构建得到分别表达实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的ReΔphaC::phaCac_phaJ43重组菌。
将构建得到的重组菌按照实施例1的方法进行发酵培养和PHA产量检测。结果表明，表达有乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的重组菌相对于对照菌（本实施例中未表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的重组菌ReΔphaC::phaCac_phaJ43）在细胞干重和PHA含量方面的提升比例与实施例1相当。由此证明，实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶A还原酶变体同样能够显著提高罗氏真养菌ReΔphaC::phaCac_phaJ43菌株的细胞干重和PHA含量，进而显著提高PHA产量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 深圳蓝晶生物科技有限公司
<120> 表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA产量的方法
<130> KHP221111162.7YS
<160> 52
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4235
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgacgcttg catgagtgcc ggcgtgcgtc atgcacggcg ccggcaggcc tgcaggttcc 60
ctcccgtttc cattgaaagg actacacaat gactgacgtt gtcatcgtat ccgccgcccg 120
caccgcggtc ggcaagtttg gcggctcgct ggccaagatc ccggcaccgg aactgggtgc 180
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cgttatccga accatatgaa gcagcatgac ttcttcaagt ccgccatgcc ggaaggctat 960
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tcttgcggga tatcgtccat tccgacagca tcgccagtca ctatggcgtg ctgctagcgc 1680
tatatgcgtt gatgcaattt ctatgcgcac ccgttctcgg agcactgtcc gaccgctttg 1740
gccgccgccc agtcctgctc gcttcgctac ttggagccac tatcgactac gcgatcatgg 1800
cgaccacacc cgtcctgtgg atcctctacg ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg 1860
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gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg 1980
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gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc gcataaggga gagcgtcgac 2100
cgatgccctt gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg ggcatgacta 2160
tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag gtgccggcag 2220
cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct ttcgctggag cgcgacgatg atcggcctgt 2280
cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc tcgctcaagc cttcgtcact ggtcccgcca 2340
ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta tcgccggcat ggcggccgac gcgctgggct 2400
acgtcttgct ggcgttcgcg acgcgaggct ggatggcctt ccccattatg attcttctcg 2460
cttccggcgg catcgggatg cccgcgttgc aggccatgct gtccaggcag gtagatgacg 2520
accatcaggg acagcttcaa ggatcgctcg cggctcttac cagcctaact tcgatcactg 2580
gaccgctgat cgtcacggcg atttatgccg cctcggcgag cacatggaac gggttggcat 2640
ggattgtagg cgccgcccta taccttgtct gcctccccgc gttgcgtcgc ggtgcatgga 2700
gccgggccac ctcgacctga atggaagccg gcggcacctc gctaacggat tcaccactcc 2760
aagaattgga gccaatcaat ttgacttttg tccttttccg ctgcataacc ctgcttcggg 2820
gtcattatag cgattttttc ggtatatcca tcctttttcg cacgatatac aggattttgc 2880
caaagggttc gtgtagactt tccttggtgt atccaacggc gtcagccggg caggataggt 2940
gaagtaggcc cacccgcgag cgggtgttcc ttcttcactg tcccttattc gcacctggcg 3000
gtgctcaacg ggaatcctgc tctgcgaggc tggccgtagg ccggccgcga tgcaggtggc 3060
tgctgaaccc ccagccggaa ctgaccccac aaggcccaag atccgcagtt caacctgttg 3120
atagtacgta ctaagctctc atgtttcacg tactaagctc tcatgtttaa cgtactaagc 3180
tctcatgttt aacgaactaa accctcatgg ctaacgtact aagctctcat ggctaacgta 3240
ctaagctctc atgtttcacg tactaagctc tcatgtttga acaataaaat taatataaat 3300
cagcaactta aatagcctct aaggttttaa gttttataag aaaaaaaaga atatataagg 3360
cttttaaagc ttttaaggtt taacggttgt ggacaacaag ccagggatgt aacgcactga 3420
gaagccctta gagcctctca aagcaatttt gagtgacaca ggaacactta acggctgaca 3480
tggattaccc tgttatccct aattaccctg ttatccctaa ttaccctgtt atccctaatt 3540
accctgttat ccctaattac cctgttatcc ctaattaccc tgttatccct aattaccctg 3600
ttatccctaa ttaccctgtt atccctatgg tacccggcca agtctgcggg cgtgcccatg 3660
atgtagagca ccagcgccac cggcgccatg ccatacatca ggaaggtggc aacgcctgcc 3720
accacgttgt gctcggtgat cgccatcatc agcgccacgt agagccagcc aatggccacg 3780
atgtacatca aaaattcatc cttctcgcct atgctctggg gcctcggcag atgcgagcgc 3840
tgcataccgt ccggtaggtc gggaagcgtg cagtgccgag gcggattccc gcattgacag 3900
cgcgtgcgtt gcaaggcaac aatggactca aatgtctcgg aatcgctgac gattcccagg 3960
tttctccggc aagcatagcg catggcgtct ccatgcgaga atgtcgcgct tgccggataa 4020
aaggggagcc gctatcggaa tggacgcaag ccacggccgc agcaggtgcg gtcgagggct 4080
tccagccagt tccagggcag atgtgccggc agaccctccc gctttggggg aggcgcaagc 4140
cgggtccatt cggatagcat ctccccatgc aaagtgccgg ccagggcaat gcccggagcc 4200
ggttcgaata gtgacggcag agagacaatc aaatc 4235
<210> 2
<211> 2887
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgggcgtgcc catgatgtag agcaccagcg ccaccggcgc catgccatac atcaggaagg 60
tggcaacgcc tgccaccacg ttgtgctcgg tgatcgccat catcagcgcc acgtagagcc 120
agccaatggc cacgatgtac atcaaaaatt catccttctc gcctatgctc tggggcctcg 180
gcagatgcga gcgctgcata ccgtccggta ggtcgggaag cgtgcagtgc cgaggcggat 240
tcccgcattg acagcgcgtg cgttgcaagg caacaatgga ctcaaatgtc tcggaatcgc 300
tgacgattcc caggtttctc cggcaagcat agcgcatggc gtctccatgc gagaatgtcg 360
cgcttgccgg ataaaagggg agccgctatc ggaatggacg caagccacgg ccgcagcagg 420
tgcggtcgag ggcttccagc cagttccagg gcagatgtgc cggcagaccc tcccgctttg 480
ggggaggcgc aagccgggtc cattcggata gcatctcccc atgcaaagtg ccggccaggg 540
caatgcccgg agccggttcg aatagtgacg gcagagagac aatcaaatca tgagccaacc 600
atcttatggc ccgctgttcg aggccctggc ccactacaat gacaagctgc tggccatggc 660
caaggcccag acagagcgca ccgcccaggc gctgctgcag accaatctgg acgatctggg 720
ccaggtgctg gagcagggca gccagcaacc ctggcagctg atccaggccc agatgaactg 780
gtggcaggat cagctcaagc tgatgcagca caccctgctc aaaagcgcag gccagccgag 840
cgagccggtg atcaccccgg agcgcagcga tcgccgcttc aaggccgagg cctggagcga 900
acaacccatc tatgactacc tcaagcagtc ctacctgctc accgccaggc acctgctggc 960
ctcggtggat gccctggagg gcgtccccca gaagagccgg gagcggctgc gtttcttcac 1020
ccgccagtac gtctctgcca tggcccccag caacttcctg gccaccaacc ccgagctgct 1080
caagctgacc ctggagtccg gcggccagaa cctggtgcgc ggactggccc tcttggccga 1140
ggatctggag cgcagcgccg atcagctcaa catccgcctg accgacgaat ccgccttcga 1200
gctcgggcgg gatctggccc tgaccccggg ccgggtggtg cagcgcaccg agctctatga 1260
gctcattcag tacagcccga ctaccgagac ggtgggcaag acacctgtgc tgatagtgcc 1320
gcccttcatc aacaagtact acatcatgga catgcggccc cagaactccc tggtcgcctg 1380
gctggtcgcc cagggccaga cggtattcat gatctcctgg cgcaacccgg gcgtggccca 1440
ggcccaaatc gatctcgacg actacgtggt ggatggcgtc atcgccgccc tggacggcgt 1500
ggaggcggcc accggcgagc gggaggtgca cggcatcggc tactgcatcg gcggcaccgc 1560
cctgtcgctc gccatgggct ggctggcggc gcggcgccag aagcagcggg tgcgcaccgc 1620
caccctgttc actaccctgc tggacttctc ccagcccggg gagcttggca tcttcatcca 1680
cgagcccatc atagcggcgc tcgaggcgca aaatgaggcc aagggcatca tggacgggcg 1740
ccagctggcg gtcagcttca gcctgctgcg ggagaacagc ctctactgga actactacat 1800
cgacagctac ctcaagggtc agagcccggt ggccttcgat ctgctgcact ggaacagcga 1860
cagcaccaat gtggcgggca agacccacaa cagcctgctg cgccgtctct acctggagaa 1920
ccagctggtg aagggggagc tcaagatccg caacacccgc atcgatctcg gcaaggtgaa 1980
gacccctgtg ctgctggtgt cggcggtgga cgatcacatc gccctctggc agggcacctg 2040
gcagggcatg aagctgtttg gcggggagca gcgcttcctc ctggcggagt ccggccacat 2100
cgccggcatc atcaacccgc cggccgccaa caagtacggc ttctggcaca acggggccga 2160
ggccgagagc ccggagagct ggctggcagg ggcgacgcac cagggcggct cctggtggcc 2220
cgagatgatg ggctttatcc agaaccgtga cgaagggtca gagcccgtcc ccgcgcgggt 2280
cccggaggaa gggctggccc ccgcccccgg ccactatgtc aaggtgcggc tcaaccccgt 2340
gtttgcctgc ccaacagagg aggacgccgc atgacgcttg catgagtgcc ggcgtgcgtc 2400
atgcacggcg ccggcaggcc tgcaggttcc ctcccgtttc cattgaaagg actacacaat 2460
gactgacgtt gtcatcgtat ccgccgcccg caccgcggtc ggcaagtttg gcggctcgct 2520
ggccaagatc ccggcaccgg aactgggtgc cgtggtcatc aaggccgcgc tggagcgcgc 2580
cggcgtcaag ccggagcagg tgagcgaagt catcatgggc caggtgctga ccgccggttc 2640
gggccagaac cccgcacgcc aggccgcgat caaggccggc ctgccggcga tggtgccggc 2700
catgaccatc aacaaggtgt gcggctcggg cctgaaggcc gtgatgctgg ccgccaacgc 2760
gatcatggcg ggcgacgccg agatcgtggt ggccggcggc caggaaaaca tgagcgccgc 2820
cccgcacgtg ctgccgggct cgcgcgatgg tttccgcatg ggcgatgcca agctggtcga 2880
caccatg 2887
<210> 3
<211> 742
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaccagcc gcgtggccct ggtgaccggc ggcaccggcg gcatcggcac cgccatcgtg 60
aagcgcctgg cggccatggg ccacaaggtg gcgaccaact accgcgacga ggccaaggcc 120
aaggcctggg ccgacaagct gaagtcggag ggcgtggacg tgctgctggt gaagggcgac 180
gtgtcggaca ccgccagcag cgaggccatg atcaaggaga tcgagagcaa gctgggcccg 240
atcgacatcc tgatcaacaa cgcgggcatc acccgcgaca ccaccttcca caagatgtcg 300
gccatgcagt ggcaggaagt gatcaacacc aacctgaaca gcgtgttcaa cgtgacccgc 360
ccggtgatcg agggcatgcg caaccgcaag tggggccgca tcatccagat ctcgagcatc 420
aacggccaga agggccagta cggccaggcc aactacgcgg ccgccaaggc gggcatgcac 480
ggcttcacca tctcgctggc gcaggagaac gccaagttcg gcatcaccgt gaacaccgtg 540
agcccgggct acgtggccac cgagatggtg atggccgtgc cggaggacgt gcgcaacaag 600
atcgccgccc agatcccggt gggccgcctg ggcgagccgg aggagatcgc gtacgccatc 660
gagttcttcg tgaaggacga ggccaagtgg atcaccggcg ccaacctggc catcaacggt 720
ggccagtaca tgggctggta ag 742
<210> 4
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggccaagc gcaacgccat cgtgaccggc ggcacccgcg gcatcggcca cgccatcgcg 60
atcgccctga aggaagccgg ctgcaccgtg gcggccacct accacggcaa cgacgaggcc 120
gcgaaggcct tccacgagga aaccggcgtg gcggtgttca agtgggacgt gggcgactac 180
gacgcctgca aggcgggcgt ggccgagatc gagaaggccc acggcccgac cgacatcctg 240
gtgaacaacg ccggcgtgac ccgcgacggc ttcttccaca agatgacccc ggcccagtgg 300
cgcgaggtga tccgcgcgga cctggactcg gtgttcaaca tgacccacca ggtgttcccg 360
ggcatgcgcg agcgcggctt cggccgcatc atcaacatct cgagcatcaa cggccagaag 420
ggccagatgg gccagaccaa ctacagcgcc gcgaaggcgg gcatgatcgg cttcacccgc 480
gccctggccc aggaaggcgc gttcaagggc gtgaccgtga acgccgtggc cccgggctac 540
atcgccaccg acatggtggc gaagctggac gaaaccgtgc tgcagaagat cgtggcccag 600
atcccggtgg gccgcctggg cgaggcggag gagatcgcgc gctgcgtggc cttcctggcc 660
gacgacgcgg ccggcttcat caccggcagc gtgctgaccg tgaacggtgg ccagtacatc 720
gccgcgtaa 729
<210> 5
<211> 745
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgacccagc acatcgccgt ggtgaccggc gcctcgggcg gcctgggcga aaccatgtgc 60
aaggcgatgg tggaccaggg ccacaaggtg gcgggcagct acctgccggg caccgacgcc 120
gaggcgaaga gctggcagca gtcgatgcag gcggccggct acgaggtggc catctacccg 180
ctggacgtga ccaactacga caactgctgc tcgttcatcg ccaccgtgga gaaggacctg 240
ggcccgatca gcatcctggt gaacaacgcc ggcatcaccc gcgacgcccc gctgaagcgc 300
atgcagccgc agcagtggca ggacgtgctg cgcaccaacc tggactcgat gtacaacatg 360
tgccagccgg tgttcgacgc catgtgcaac cgcggcttcg gccgcatcgt gaacatctcg 420
tcgctgaacg gcgagcaggg ccagttcggc caggccaact acagcgcggc caaggccggc 480
atctacggct tcaccaaggc catcgccaag gaaggcgccc gcaagggcgt gaccgtgaac 540
gccgtgagcc cgggcttcat cgacaccccg atggtgcgcc aggtgccgga gaacgtgctg 600
gagagcatca tctcgggcat cccggtgggc cgcctgggcc agccggagga gatcgcccgc 660
gccgtggcct tcctgaccgc cgaggacgcg ggctacatca ccggctcgaa catcagcgtg 720
aacggcggcg agtacatgag ctaag 745
<210> 6
<211> 724
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaagaacg tggccatcgt gaccggcggc acccgcggca tcggcctgga gatcaccaag 60
gccctgatcg cggagggcta caaggtggcc gcgatctacc acggcaacga ggaagccgcc 120
aaggcctgcg aggccgaaac cggcgccaag gcgtacaaga tcgacgtggc cagctaccag 180
gcctgccacg acggctgcgc caagatcgag caggagatgg gcccgatcag cctgctggtg 240
aacaacgcgg gcatcaccaa ggacggcgtg ctgcacaaga tggccgagga ccagtggcac 300
gcggtgatcg aaaccaacct gacctcgtgc ttcaacatgt gccgcgcggt gatcaccggc 360
atgcgcgagc gcgtgtacgg ccgcatcgtg aacatctcga gcatcaacgg ccagaagggc 420
cagttcggcc agaccaacta cagcgcggcc aaggcgggca tgctgggctt caccaaggcc 480
ctggccctgg agtcggcggc caagggcatc accgtgaacg cgatctgccc gggctacatc 540
gaaaccgaga tgaccgccgc gatgaagcag gacgtgctgg actcgatcgt gcgccagatc 600
ccggcggccc gcatgggcaa gccgcaggag atcgccgacc tggtggtgtt cctggccagc 660
gagaaggcgg gcttcatcaa cggcgccacc atgaccgcca acggtggcca gtacatgatc 720
taag 724
<210> 7
<211> 748
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgaagaaca gcaccggccg cgtggccctg atcaccggca gcaccggcgg catcggcacc 60
gccctgtgca agaagctgtg cgaggaaggc ttccgcgtgg tgggcaactt ccgctgctgg 120
gagaaggccc aggcgatgca gaacaccctg caggacgtgg gctgcgaggt ggacatgcgc 180
cagggcgacg tggcggactt cgacagcgtg ggccgcatgg tgcgcgccgt ggagtcggag 240
atcggcccga tcgacgtgct gatcaacaac gcgggcatcg cccgcgacgt gcgcttcacc 300
aagatggaga aggccgactg ggacgacgtg atgaacacca acctgaacgg cgtgttcaac 360
tgcacccgcc acgtgatcga cggcatgatg gcccgtcgct acggccgcat catcaacatc 420
tcgagcatca acggccagaa gggccagttc ggccagacca actacagcgc ggccaaggcg 480
ggcatccacg gcttcaccaa gagcctggcc ctggaggtgg cgaagtacgg catcaccgtg 540
aacaccatct cgccgggcta catcgaaacc gagatggtga tggccgtgcc gcagaacatc 600
cgcgagcaga tcgtggccca gatcccggtg ggccgcatgg gctacatcga ggaagtggcc 660
gaggcggtga gctacctggt gtcggacaag agcggcttca tcaccggctc gaacctgagc 720
atcaacggtg gccagcacat gtactaag 748
<210> 8
<211> 751
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtgcggcg acctgaagaa caaggtggcc ctggtgaccg gcggcaccgg cggcatcggc 60
accgcgatct gcgcccgcct gtcggacctg ggctgccgcg tggccaccac ctaccgcaac 120
cgcgagaagg ccgaggcctg gcaggcccag atgaagcaga gcggccacca ggtgaccatc 180
tacgcctgcg acgtgggcga ctacgaggcc tgcgtgcagc tggccgaaac catcgagaag 240
gacctgggcc cggtggacat cctggtgaac aacgcgggca tcacccgcga caccaccctg 300
aagaagatga ccccgggcca ctggcgcgag gtgatctgcg cggacctgga ctcggtgttc 360
aacatgaccc agccgctgct gccgcgcatg gcggagcgcg gctggggccg cgtgatcaac 420
atctcgagca tcaacggcca gaagggccag ttcggccagg ccaactacag cgcggccaag 480
gcgggcatgc acggcttcac catggcggcc gcccaggaag tggcccgcaa gggcgtgacc 540
gtgaacacca tcagcccggg ctacatcgcg accgagatgg tgatggccgt gccggaggaa 600
gtgcgcgaca agatcatcgc ccagatcccg gtgggccgcc tgggccgtcc ggaggaagtg 660
gcccacgtgg tggcgttcct ggcctcggag cacgccggct tcatcaccgg cgccaacttc 720
gccgccaacg gtggccagca catgcactaa g 751
<210> 9
<211> 742
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgtcgcagc gcaccgccct ggtgaccggc ggcaccggcg gcatcggcac cgccatcgtg 60
cgctacctga gccgccaggg ccaccgcgtg gcgaccaact accgcgacgc ggcccgcgcg 120
gaggagtggc gcaagcgcat ggcggccgag ggcatcgagg tgtgcctggt gccgggcgac 180
gtggcggacc cggccagcgc cgaggcgatg gtgcgcgccg tggaggccaa gtgcggcccg 240
gtggagatcc tggtgaacaa cgccggcatc acccgcgaca ccaccttcca caagatgacc 300
taccagcagt ggaccgacgt ggtgaacacc aacctgaacg cgtgcttcaa cgtgacccgc 360
ccggtgatcg agggcatgcg cgcccgcaag tggggccgca tcgtgcagat ctcgagcatc 420
aacggccaga agggccagta cggccaggcc aactacgcgg ccgccaaggc gggcatgcac 480
ggcttcacca tcagcctggc ccaggagaac gcccgcttcg gcatcaccgt gaacaccgtg 540
agcccgggct acgtggccac cgacatggtg atggccgtgc cggaggaagt gcgcgagaag 600
atcgtggccc agatcccggt gggccgcctg ggcaagccgg aggagatcgc ccacgcggtg 660
gccttcttca ccaccgacga ggccagctgg atcaccggcg ccaacctggc catcaacggt 720
ggccactaca tgggctggta ag 742
<210> 10
<211> 724
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgagccgcg tggtggtggt gaccggcggc acccgcggca tcggcgagga gatctgcgtg 60
gagcacaagg cggccggcta caccgtggcc gcgatctacg gtggcaacga cgaggcggcc 120
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aacaacgccg gcatcacccg cgacggcgcc atgcacaaga tggacttcga gcgctggaac 300
gcggtgatcc agaccaacct gtcgagctgc ttcaacatgt cgaaggcggt gatcgacggc 360
atgcgcgagc gcgagttcgg ccgcatcgtg aacatcggct cggtgaacgg ccgcgccggc 420
cagtacggcc aggtgaacta cgcggccgcc aagagcggca tccacggctt caccaaggcc 480
ctggccctgg agggcgccag caagggcatc accgtgaacg ccatcgcccc gggctacgtg 540
ctgaccgaca tggtgcgcgc cgtgccgcag aaggtgctgg acaagatcat cgccaccatc 600
ccggtgggcc gcctgggcga cccgggcgac atcgcgcgcg ccgtgatgtt cctgaccagc 660
gacggctcgg gcttcgtgac cggcagcacc ctggacgtga acggtggcca gcacatgtac 720
taag 724
<210> 11
<211> 745
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgcaggacc gcatcgcctt cgtgaccggc ggcaccggcg gcatcggcag cgcgatctgc 60
aagatgctgg tggcggaggg ctgccgcgtg gccagcagct acatcccggt ggagaaggac 120
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tcgctgaacg gccgcaaggg ccagttcggc caggccaact acagcgcggc caaggccggc 480
atgcacggct tcaccatggc cctggcccag gaaaccgcca gcaagggcat caccgtgaac 540
accatctcgc cgggctacat cggcaccagc atggtgatgg ccatcccgga ggacatccgc 600
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ctggtggcct acctggcctc ggacaagggc gccttcatca ccggcgcgaa catcgacatc 720
aacggtggcc agcacatgca ctaag 745
<210> 12
<211> 745
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgaagaagc acaccgtgct ggtgaccggc ggcaccggcg gcatcggcaa ggccatctgc 60
atggcgctgt cggacgaggg cttctcggtg gtggccagct gcagcggcaa ctcgtgcaag 120
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ggcgacgtgg cggacttcga cagctgcacc aagatggtgc aggacgcgga gcagctgatc 240
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acccagcagg tgatcaacgg catgatcgag cgtcgcttcg gccgcatcat caacatctcg 420
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atgcacggct tcaccatggc cctggcccag gaagtggccc acaagggcat caccgtgaac 540
accgtgagcc cgggctacat cgccaccgag atggtgatgg cggtggacga ggacatccgc 600
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aacggtggca tgtacatgca ctaag 745
<210> 13
<211> 748
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggacaagg tgcaggtgtg cctggtgacc ggcggcgccg gcggcatcgg ccgcgagatc 60
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<210> 14
<211> 742
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgaccaagc gcatcgccct ggtgaccggc ggcatgggcg gcatcggcag cgccatctgc 60
aaggccctgg ccgaggcggg ccacatcgtg gtgacgacct acagcaagcc gggccgcgag 120
caggcctggc acgcggacat gaagggcctg ggcttcaacg acatccactc gtaccagtgc 180
gacgtgaccg acttcgcggc ctgccaggac atcgcggccc gcatcgccaa ggacatcggc 240
ccgatcagca tcctggtgaa caacgcgggc atcacccgcg acgcctcgtt caagaagcag 300
agcaaggacg actgggacgc ggtgatccgc accaacctgg actcggtgtt caacatgacc 360
aagccggtgc tggactcgat gctggaggcg ggcttcggcc gcatcgtgaa catctcgagc 420
atcaacggcc agaagggcca gttcggccag accaactaca gcgcggccaa ggccggcatg 480
cacggcttca ccatggcgct ggcccaggaa gtggccaaga agggcgtgac cgtgaacacc 540
atctcgccgg gctacatcgc gaccgagatg gtgatggcgg tgccggagga cgtgcgcagc 600
aagatcgtgg cccagatccc ggtgggccgc ctgggcaagc cggaggagat cgcggccctg 660
gtgggcttcc tgtgcagcga gaacgcgggc ttcatcaccg gcagcaacat cgccatgaac 720
ggtggccagc acatgatgta ag 742
<210> 15
<211> 739
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgaccaacc gcgtggccct ggtgaccggc ggcatgggcg gcatcggcaa cgccatctgc 60
aaggccctgg gcaaggcggg ccacaccgtg gtgaccacct actcgaagcc gggccgcgag 120
gacgcctggg tggccgagat gaagaccctg ggcatctcgg cccacgccta cccgtgcgac 180
gtgaccgacg cggcccagtg cgcggccctg gtggcgcagg tgtcgtcgga gatcggcccg 240
gtggccgtgc tggtgaacaa cgcgggcatc acccgcgacg gcaccctgcg caagatgagc 300
gcggaggact ggtcggcggt gctggccacc aacctggaca gcgtgttctt catggcacgc 360
ccggtgatcg acggcatgct ggacgcgggc tggggccgca tcatcaacat ctcgagcatc 420
aacggccaga agggccagtt cggccagacc aactacagcg cggccaaggc cggcatgcac 480
ggcttcacca tggccctggc ccaggaagtg gcccgcaagg gcgtgaccgt gaacaccatc 540
agcccgggct acatcgcgac cgagatggtg atggccgtgc cggaggacgt gcgcaacaag 600
atcatcggcc agatcccggt gggccgcctg ggcaccccgg aggagatcgc cggcctggtg 660
acctacctgg ccagcgacat cgccggcttc atcaccggcg ccaacctgag catcaacggt 720
ggccagcaca ccatgtaag 739
<210> 16
<211> 739
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atgatcaaga ccgccctgat caccggcggc atgggcggca tcggcgagat cgtggccaag 60
aagctgcacg acgcgggcta ccgcgtgatc gtgacccact cgagccgcaa cacccgcaag 120
aagatgtggc aggcggactg cctgaaggcc ggctacgact tcatctgcgt ggaggtggac 180
gtggaggaca tcgagtcgac ccgcaagatg gccaaccaca tcgcggacct gggctaccac 240
gtggacatca tcatcaacaa cgccggcatc accaaggaca tcagcttcaa gaagatgacc 300
tacgacgact ggaacatcgt gatccgcacc aacctggact cgctgtacaa cgtgaccagc 360
cagttcatca acaagatgat cgagaagaac tggggccgcg tgatcaacat ctcgagcatc 420
aacggctcga agggccagtt cggccagacc aactacgcgg ccagcaaggc cggcgtgatc 480
ggcttcacca agtcgctggc cctggaggtg gccgacaagg gcatcaccgt gaactgcatc 540
tcgccgggct accaggaaac cgccatggtg aacgcggtgg acccgctgat cctgcagcag 600
atcatcagca ccatcccgat gaagcgcctg ggccagccgc gcgagatcgc cgacctggtg 660
ctgtacctgt gctcggacac cagcgagttc atgaccggcg cgaacctgca catcaacggt 720
ggccagtaca tgggctaag 739
<210> 17
<211> 730
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgagcaagg tggccctggt gaccggcggc accggcggca tcggcagcgc cgtgtgcaag 60
cgcctggccg cggccggctt caaggtgatc agcacctact tcgagccgga ggagcaggcc 120
aaggcctggg ccgagaagca ggacttcgcg gtgggcctgt accactgcaa cgtgtcggac 180
tacgacagct gcgtgaagct gaagcaggcc atcgaggcgg acggcctgaa cgtggacgtg 240
atcgtgaaca acgccggcat cacccgcgac gcgaagttct cgaagatgac ctacgacatg 300
tggcgcgccg tgctgtcgac caacctggac agcctgttca acatctcgca ccagttcgtg 360
gacggcatga ccgagcgcgg ctggggccgc atcatcaaca tctcgtcggt gaacggccag 420
aagggccagg cgggccagac caactactcg gccgccaagg ccggcgtgca cggcttcacc 480
atggccctgg cccaggaagt ggtgcgcaag ggcgtgaccg tgaacaccat ctcgccgggc 540
tacatcggca ccgagatggt gatggccatc cgcgaggacg tgcgcgagaa gatcgtggcc 600
cagatcccga tgcagcgcct gggcaagccg gaggagatcg ccgcggtggc caacttcctg 660
gcctcggacg acgccgcctt catcaccggc gcggacttca gcgccaacgg tggccagtac 720
atgcactaag 730
<210> 18
<211> 775
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgaccaccg acaacccgac cgcgaacaag aagatcgccc tggtgaccgg cgccctgggc 60
ggcatcggca ccgccatctg ccacgccctg atccaggccg gctaccacat catcgccacc 120
tacacccaca aggccgacag caccgtgaac cgcggcgagg cctggctgaa ggaagagggc 180
atgaacggct cggacttcac cttcgtggaa accaacctga ccgaccacga ggcggccacc 240
aaggccatcg tggacgcgat cgagaaggcc ggccacatcg acgtgctggt gaacaacgcg 300
ggcatcaccc gcgacaccac cttcaagaag atgacctacg agcagtggtc ggaggtgatc 360
gacaccaacc tgaagagcct gttcaccgtg acccagccgg tgttcaacaa gatgctggag 420
cagaagtcgg gccgcatcgt gagcatctcg agcatcaacg gcctgaaggg ccagttcggc 480
cagaccaact actcggcgac caaggccggc atcatcggct tcagcaaggc cctggcccag 540
gaaggcgcca agagcggcgt gaccgtgaac gtggtggccc cgggctacac cggcaccaag 600
atggtgatgg ccgtgccgga gaaggtgatg gagagcatca aggcgggcat cccgatgggc 660
cgcatcgccc agccggagga gatcgcggcc gccgtgatgt acctggtgtc ggacggcgcc 720
gcctacatca ccggcgaaac catcaacgtg aacggtggcc agtacatgca ctaag 775
<210> 19
<211> 742
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgcagaagc tggccctgat caccggcagc aagggcggca tcggctcggc catcaccgag 60
aagctggtgc aggacggctt ccgcatcatc gcgacctact tcaccggcaa ctacgagtgc 120
gccaaggagt ggttcgacga gaagggcttc agcgaggacc aggtgaccct gttcgagctg 180
gacgtgaccg acgcggacag ctgccgcgag cgcctgacca agctgctgga gaacgagggc 240
accgtggacg tgctggtgaa caacgcgggc atcacccgcg actgcacctt caagcgcatg 300
accgccgagc agtggaacga cgtgatcaac accaacctga acagcgtgtt caacgtgacc 360
cagccgctgt tcgcggccat gtgcgagaag ggcggcggcc gcatcatcaa catctcgagc 420
gtgaacggcc tgaagggcca gttcggccag accaactact cggccgcgaa ggcgggcatg 480
atcggcttca gcaaggccct ggccttcgag ggcgcccgca gcggcgtgac cgtgaacgtg 540
gtggccccgg gctacaccgg caccccgatg gtgcaggcca tccgccagga cgtgctggac 600
agcatcatcg aaaccgtgcc gatgaagcgc ctggccaccc cggaggagat cgccagcgcc 660
gtggcctacc tggcctcgga cgccggcgcc tacatcaccg gcgaaaccct gagcgtgaac 720
ggcggcctgt acatgcagta ag 742
<210> 20
<211> 748
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atgacccaga agaagatcgc cctggtgacc ggcgcggcag gcggcatcgg caccgagatc 60
tgccgccagc tggccaacaa cggcttccgc gtggtggcca cccaccgccc gggcaaggcc 120
gagcaggccc aggcgtggct gcaggagcag aacctggccg accaggacat caagctgctg 180
gccctggacg tggccgacca cgagggcgtg tcgcaggccc tgggcgagct gctgaaggcc 240
gagggccgca tcgacgtgct ggtgaacaac gcgggcatca cccgcgacag cgtgttcaag 300
aagatgaccc tggagcagtg gcgcgacgtg atgtcgacca acctggacag cctgttctcg 360
gtgagccagc cggtgttcaa cgccatgtgc gagcagggcg gcggccgcat catcaacatc 420
tcgagcgtga acggcctgaa gggccagttc ggccaggtga actactcggc cgcgaaggcg 480
ggcatgatcg gcttcaccaa ggccctggcg gccgagggcg cccgcttcgg cgtgtgcgtg 540
aacgcggtgg ccccgggcta caccgccacc ccgatggtga ccgccatccg cgaggacgtg 600
ctggactcga tcaaggccac catcccgctg aagcgcctgg ccaccaccga ggaagtggcg 660
ggcgccgtgc tgtacctggc gggcgagcac ggtggctacg tgaccggcga aaccctgtcg 720
gtgaacggcg gcctgtacat gcagtaag 748
<210> 21
<211> 748
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgaccaaga aggtggccct ggtgaccggc ggcaccggcg gcatcggcac ccagatctgc 60
cgcaccctga gcaccgccgg ctacatcgtg gtggccaact ggctgaaggg catcgacgac 120
ggcccggcct gggaggcgaa gcagaaggcg gacggctacg acaacatcct gatcgccgag 180
ggcgacgtga gcgactacga ccaggccgtg gcgatggtga aggaagccgt ggagaaggcg 240
ggcgccccga tcgacatcct ggtgaacaac gccggcatca cccgcgacaa gatgttccgc 300
aagatggaga agtcgcagtg ggacgcggtg atcaacagca acctgtcgag catcttcaac 360
gtgaccaagc aggtgctgga cggcatggtg gagcgcggct ggggccgcat cgtgaacatc 420
tcgtcggtga acggccagaa gggccaggcg ggccaggcca actacagcgc ggccaaggcc 480
ggcatgcacg gcttcaccat ggccatcgcg caggaagtgg cctcgaaggg cgtgaccgtg 540
aacaccatca gcccgggcta catcggcacc gccatggtga tgagcatcaa ggaagagatc 600
cgcaaccaga tcgtggccca gatcccggtg ggccgcctgg gcaagccgga ggagatcgcc 660
tggaccgtgc agttcctggc cgacgagaag tcggcgttca tcaccggcgc caacatctcg 720
gtgaacggcg gcctgcacat gggctaag 748
<210> 22
<211> 751
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgacctcgg aaaccaagcg caccgccctg gtgaccggcg gcatcggcgg cctgggcacc 60
gccatcgcgc gctcgctggc cgaccgcggc caccaggtgc tggtggcgta ctacgtgagc 120
gacaacccga ccgagtggct ggccaagcag aaggaagacg gctacgactt caaggcctac 180
gcggtggacg tggcggactt cgagtcgtgc cagcagatgg tggagaagat ccacgtggac 240
ggcttcaaga tcgacatcct ggtgaacaac gccggcatca ccaaggaccg ctcgttccgc 300
aagatgagct acgaggactg ggaggcggtg ctgcgcacca acctggacag cgtgttcaac 360
gtgaccaagc aggtgatcga cgacatgctg gagtcgaagt ggggccgcat cgtgaccatc 420
tcgagcgtga acggcagcaa gggccagttc ggccaggcca actactcgag cgcgaagtcg 480
ggcatgtacg gcttcagcaa gaccctggcc ctggagttcg cggccaaggg catcaccgtg 540
aacaccgtga gcccgggcta catcatgacc gagatggtgg cgcagatgcc gcaggagatc 600
gtgaacgagc agatcatccc gcagatcccg atgcgtcgcc tgggcaagcc ggaggagatc 660
ggcgagctgg tggcctacat ctgcagcgag tcggccggct tcatgaccgg cgccaacatc 720
gccatcaacg gcggcctgca catgtactaa g 751
<210> 23
<211> 742
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atgaccgagc gcatcgcctt cgtgaccggc ggcatgggcg gcatcggcac cgccatctgc 60
aagcgcctgg cggccaacgg caacaaggtg gtggccaact gcctgccggg ctacgacaag 120
aaggacgact ggctgagctc gatgcgcgcc cagggctaca gcgtgcacgc ggccgagggc 180
aacgtggagg agttcgactc gtgcgccgac atgttctacc gcatcggcag catcatcggc 240
ccggtggaca tcctggtgaa caacgcgggc atcacccgcg acggcgtgtt caagcgcatg 300
tcggagagcg actggtacga cgtgatcaac accaacctga acagcgtgtt caacgtgacc 360
cgccaggtgg tggagggcat gaccgaccgc ggctggggcc gcatcatcaa cgtgtcgagc 420
gtgaacgccc tgaagggcca gttcggccag accaactaca gcgcggccaa ggccggcatg 480
cacggcttca gcaaggccct ggcccaggaa gtggtgcgca agggcgtgac cgtgaacacc 540
atctcgccgg gctacgtggc caccgagatg gtgatggcga tccgcaccga ggtgcgcgac 600
cagatcgtgg ccaccatccc gatgggccgc ctggcccagc cggacgagat cgccggcctg 660
gtggcctacc tggccagcga cgacgcgggc tacatcaccg gcgcgaacat cagcatcaac 720
ggcggcctgc acatggccta ag 742
<210> 24
<211> 748
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgggcagca ccagccgcat cgcggtggtg accggcggca tgggcggcat cggcaccagc 60
atcagccagc gcctgcacaa ggaaggcttc aaggtggtgg tgacctgcag cccgaactcg 120
agccgcaaga acgactggct gccgatccag cagaaggcgg gctacgactt cgagtgcgtg 180
gagatggacg tgaccgactg ggagagcacc aagaacgccc tgaagcaggt gcacgaggag 240
ttcggcccgg tggcggtgct ggtgaacaac gccggcatca cccgcgacgc cagcttccgc 300
aagctgaccc cggaggactg gaacgcggtg atcggcacca acctgaccag cctgttcaac 360
acctcgaagc aggtgctgga cggcatgctg gccaacggct ggggccgcat catcaacatc 420
tcgtcgatca acggccagcg cggccagttc ggccagacca actacagcgc ggccaaggcc 480
ggcatccacg gcttcaccat ggccctggcc cgcgaggtga gcggcaaggg cgtgaccgtg 540
aacaccgtgt cgccgggcta catccagacc gacatgaccg ccgcgatccg ccaggacatc 600
ctggacacca tgatcgcggc caccccggtg ggccgcctgg gccgtccgga ggagatcgcc 660
agcatcgtgg cctggctggc cagcgaggag tcggcctaca gcaccggcgc cgacttctcg 720
atcaacggtg gcatgaacat gcagtaag 748
<210> 25
<211> 748
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atgaccgaca gcgcccgcat cgccctggtg accggcggca tgggcggcat cggcaccgcc 60
atctcgcagc gcctgcaccg cgagggcttc accgtggtgg tgggctgcag cccggccagc 120
agccgcaaga acgactggat cagccgccag caggaagccg gctaccactt ccactgcgtg 180
gactgcgaca tcaccgactg ggagagcacc cgccagggct tcgagctggt gcgcgagtcg 240
gtgggcccga tcgacgtgct ggtgaacaac gcgggcatca cccgcgacgc caccttccgc 300
aagctgaccc cggagaactg gcgcgccgtg atcgaaacca acctgaacgg cctgttcaac 360
accaccaagc aggtgatcga cagcatgctg gcccgcaact ggggccgcat catcaacatc 420
tcgtcgatca acggccagcg cggccagttc ggccagacca actactcggc ggccaaggcg 480
ggcatccacg gcttcaccat ggccctggcc cgcgaggtgt cgggcaaggg cgtgaccgtg 540
aacaccgtga gcccgggcta catccagacc gacatgaccg cggccatccg cccggacatc 600
ctggagggca tgatcgcggg catcccggtg ggccgcctgg gccagccgga ggagatcgcc 660
agcatcgtgg cctggctggc cagcaccgag tcggcctacg ccaccggcgc cgacttctcg 720
gtgaacggtg gcatgaacat gcagtaag 748
<210> 26
<211> 748
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atgaacaccg agaaccagca catcgccctg gtgaccggcg ccaccggcgg cctgggcacc 60
cacatctgca agcgcctgtc ggaggacggc tacatcgtgt gcgccaacta ccgcagcgag 120
gagaaggcgc aggagtggaa gaagaagatg gaggccgagg gctaccagtt ctacctgtac 180
aaggcggacg tgtgcgacta cgacgccgtg gagcagatga tcaaggcgat cgagcaggac 240
cacggcgtgg tggacatcct ggtgaacaac gccggcatca ccaaggacgg catcttcaag 300
aagatgtcga aggagaactg gcaggacgtg atcgcgacca acctgaccag cgtgttcaac 360
tgctgccgcc acgtgatcaa ccagatgatc gaccagaatt acggccgcat cgtgaacatc 420
tcgtcggtga acggccagcg cgcccagttc ggccaggtga actacgcggc cgccaaggcc 480
ggcatgcacg gcatcaccaa gaccctggcg atcgaggtgg ccaacaaggg catcaccgtg 540
aacaccatct cgccgggcta cgtggcgacc gacatggtga tggccgtgcc ggaggaagtg 600
cgcaacaaga tcatcgcggg catcccggtg ggccgcctgg gcggcaccgg cgagatcgcc 660
cacctggtga gcttcctggc cgcccgcgac accgccttca tcaccggcgc gaactacgcc 720
atcaacggtg gccagcacgt gtactaag 748
<210> 27
<211> 745
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atgaccaagc gcatcgcggt ggtgaccggc ggcatgggcg gcctgggcga ggcggtgtcg 60
atccgcctga acgacgcggg ccaccgcgtg gtggtgacct acagcccgag caacaccggc 120
gccgaccgct ggctgaccga gatgcacgcc accggccgcg agttccacgc ctacccggtg 180
gacgtggcgg accacgacag ctgccagcag tgcatcgaga agatcgcccg cgacgtgggc 240
ccggtggaca tcctggtgaa caacgcgggc atcacccgcg acatgaccct gcgcaagctg 300
gacaaggtga actgggacgc ggtgatccgc accaacctgg actcggtgtt caacatgacc 360
aagccggtgt gcgagagcat ggtggagcgc ggctggggcc gcatcgtgaa catctcgtcg 420
gtgaacggca gcaagggctc ggtgggccag accaactacg cggccgccaa ggcgggcatg 480
cacggcttca ccaagagcct ggccctggag atcgcccgca agggcgtgac cgtgaacacc 540
gtgagcccgg gctacctggc gaccaagatg gtgaccgcca tcccgcagga catcctggac 600
tcgaagatcc tgccgcagat cccggccggc cgcctgggca agccggagga agtggccgcc 660
ctggtggcct acctgtgcag cgaggaagcc ggcttcgtga ccggcagcaa catcgccatc 720
aacggtggcc agcacatgca ctaag 745
<210> 28
<211> 742
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atgctgcgcg tggccctggt gaccggcggc atgggcggcc tgggcgaggc gatctgcatc 60
aagctggccg cgctgggcta caaggtggtg accacctact cgccgagcaa caccaaggcc 120
cacgagtggc tgcgcaccat gaacgacatg ggctacggct tcaaggccta cccgtgcgac 180
gtgggcgact tcgactcgtg caaggcgtgc gtggagcagg tgagcaagga cgtgggcgcg 240
gtggaggtgc tggtgaacaa cgcgggcatc acccgcgaca tgaccttcaa gaagatgacc 300
aaggccgact gggacgcggt gatccacacc aacctggact cgtgcttcaa catgaccaag 360
caggtgatgg acggcatgat ggagcgcggc tggggccgcg tgatcaacat ctcgtcggtg 420
aacggccaga agggcgcctt cggccagacc aactacagcg cggccaaggc cggcatgcac 480
ggcttcacca aggccctggc cctggaggtg gccaagaagg gcgtgaccgt gaacaccatc 540
agcccgggct acatcggcac caagatggtg atggcgatcc cgcaggaagt gctggagtcg 600
aagatcctgc cgcagatccc gcagtcgcgc ctgggcaagc cggaggaagt ggcgggcctg 660
gtggcctacc tgagctcgga ggaagccgcc ttcgtgaccg gcgccaacat cagcatcaac 720
ggtggccagc acatgtacta ag 742
<210> 29
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Met Ser Gln Pro Ser Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Ala Leu Ala His Tyr
1 5 10 15
Asn Asp Lys Leu Leu Ala Met Ala Lys Ala Gln Thr Glu Arg Thr Ala
20 25 30
Gln Ala Leu Leu Gln Thr Asn Leu Asp Asp Leu Gly Gln Val Leu Glu
35 40 45
Gln Gly Ser Gln Gln Pro Trp Gln Leu Ile Gln Ala Gln Met Asn Trp
50 55 60
Trp Gln Asp Gln Leu Lys Leu Met Gln His Thr Leu Leu Lys Ser Ala
65 70 75 80
Gly Gln Pro Ser Glu Pro Val Ile Thr Pro Glu Arg Ser Asp Arg Arg
85 90 95
Phe Lys Ala Glu Ala Trp Ser Glu Gln Pro Ile Tyr Asp Tyr Leu Lys
100 105 110
Gln Ser Tyr Leu Leu Thr Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Val Asp Ala
115 120 125
Leu Glu Gly Val Pro Gln Lys Ser Arg Glu Arg Leu Arg Phe Phe Thr
130 135 140
Arg Gln Tyr Val Ser Ala Met Ala Pro Ser Asn Phe Leu Ala Thr Asn
145 150 155 160
Pro Glu Leu Leu Lys Leu Thr Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asn Leu Val
165 170 175
Arg Gly Leu Ala Leu Leu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Ser Ala Asp Gln
180 185 190
Leu Asn Ile Arg Leu Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Leu Gly Arg Asp
195 200 205
Leu Ala Leu Thr Pro Gly Arg Val Val Gln Arg Thr Glu Leu Tyr Glu
210 215 220
Leu Ile Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Glu Thr Val Gly Lys Thr Pro Val
225 230 235 240
Leu Ile Val Pro Pro Phe Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Met Asp Met Arg
245 250 255
Pro Gln Asn Ser Leu Val Ala Trp Leu Val Ala Gln Gly Gln Thr Val
260 265 270
Phe Met Ile Ser Trp Arg Asn Pro Gly Val Ala Gln Ala Gln Ile Asp
275 280 285
Leu Asp Asp Tyr Val Val Asp Gly Val Ile Ala Ala Leu Asp Gly Val
290 295 300
Glu Ala Ala Thr Gly Glu Arg Glu Val His Gly Ile Gly Tyr Cys Ile
305 310 315 320
Gly Gly Thr Ala Leu Ser Leu Ala Met Gly Trp Leu Ala Ala Arg Arg
325 330 335
Gln Lys Gln Arg Val Arg Thr Ala Thr Leu Phe Thr Thr Leu Leu Asp
340 345 350
Phe Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gly Ile Phe Ile His Glu Pro Ile Ile
355 360 365
Ala Ala Leu Glu Ala Gln Asn Glu Ala Lys Gly Ile Met Asp Gly Arg
370 375 380
Gln Leu Ala Val Ser Phe Ser Leu Leu Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Trp
385 390 395 400
Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Tyr Leu Lys Gly Gln Ser Pro Val Ala Phe
405 410 415
Asp Leu Leu His Trp Asn Ser Asp Ser Thr Asn Val Ala Gly Lys Thr
420 425 430
His Asn Ser Leu Leu Arg Arg Leu Tyr Leu Glu Asn Gln Leu Val Lys
435 440 445
Gly Glu Leu Lys Ile Arg Asn Thr Arg Ile Asp Leu Gly Lys Val Lys
450 455 460
Thr Pro Val Leu Leu Val Ser Ala Val Asp Asp His Ile Ala Leu Trp
465 470 475 480
Gln Gly Thr Trp Gln Gly Met Lys Leu Phe Gly Gly Glu Gln Arg Phe
485 490 495
Leu Leu Ala Glu Ser Gly His Ile Ala Gly Ile Ile Asn Pro Pro Ala
500 505 510
Ala Asn Lys Tyr Gly Phe Trp His Asn Gly Ala Glu Ala Glu Ser Pro
515 520 525
Glu Ser Trp Leu Ala Gly Ala Thr His Gln Gly Gly Ser Trp Trp Pro
530 535 540
Glu Met Met Gly Phe Ile Gln Asn Arg Asp Glu Gly Ser Glu Pro Val
545 550 555 560
Pro Ala Arg Val Pro Glu Glu Gly Leu Ala Pro Ala Pro Gly His Tyr
565 570 575
Val Lys Val Arg Leu Asn Pro Val Phe Ala Cys Pro Thr Glu Glu Asp
580 585 590
Ala
<210> 30
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgcctccac accgctcgtc acatcctgtt gcgttcactg gaatcccacg atagagtttg 60
acctgcgagc aagctgtcac cggatgtgct ttccggtctg atgagtccgt gaggacgaaa 120
cagcctctac aaataatttt gtttaa 146
<210> 31
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Met Thr Gln Arg Ile Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ile Cys Gln Arg Leu Ala Lys Asp Gly Phe Arg Val Val Ala
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Asn Ser Pro Arg Arg Glu Lys Trp Leu Glu Gln Gln
35 40 45
Lys Ala Leu Gly Phe Asp Phe Ile Ala Ser Glu Gly Asn Val Ala Asp
50 55 60
Trp Asp Ser Thr Lys Thr Ala Phe Asp Lys Val Lys Ser Glu Val Gly
65 70 75 80
Glu Val Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Val Val
85 90 95
Phe Arg Lys Met Thr Arg Ala Asp Trp Asp Ala Val Ile Asp Thr Asn
100 105 110
Leu Thr Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Gly Met Ala
115 120 125
Asp Arg Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln
130 135 140
Lys Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Leu
145 150 155 160
His Gly Phe Thr Met Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Thr Lys Gly Val
165 170 175
Thr Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Ala Thr Asp Met Val Lys
180 185 190
Ala Ile Arg Gln Asp Val Leu Asp Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val
195 200 205
Lys Arg Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Ala Ser Ile Cys Ala Trp Leu
210 215 220
Ser Ser Glu Glu Ser Gly Phe Ser Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn
225 230 235 240
Gly Gly Leu His Met Gly
245
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcagacttgg ccgggtacca 20
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caccgctcgt cacatcctg 19
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tggtacccgg ccaagtctgc gggcgtgccc atgatgtaga 40
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tgagacccaa ggtctccatg atttgattgt ctctctgccg tc 42
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggagaccttg ggtctcagtg acgcttgcat gagtgccg 38
<210> 37
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
caggatgtga cgagcggtgc atggtgtcga ccagcttgg 39
<210> 38
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtgaagagac c 11
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tggtctggct ggcggactga g 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcgaactca tcctgcgcct c 21
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
catgatttga ttgtctctct gccg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgacgcttg catgagtgcc 20
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
agagagacaa tcaaatcatg actcagcgca ttgcgtatg 39
<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcactcatg caagcgtcac tcagcccata tgcaggccgc 40
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<211> 39
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tggtacccgg ccaagtctgt gtggaactac gtggtcgac 39
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgagacccaa ggtctccatt catgccttgg ctttgacgta tc 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctgggccgc cgaagtgagc ttcgacggcg tcttcgttcc 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgagcggtgt ggaggcatct attcagtcag ggatgcct 38
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctacaaataa ttttgtttaa ctgactgaat aggaagagca agc 43
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ccctgatttc cataaggcgc cgcacgccgc gcggtgacga c 41
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ttcgtggtct cggccgat 18
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
caaagtcact gggttcccg 19

Claims (11)

1.乙酰乙酰辅酶A还原酶变体或其编码基因在提高工程化微生物PHA产量中的应用，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体与SEQ ID NO.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶A还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种：
（1）第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
（2）第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
（3）第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
（4）第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或组氨酸；
（5）第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3-28任一所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述微生物为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
4.一种工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体与SEQ ID NO.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶A还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种：
（1）第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
（2）第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
（3）第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
（4）第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或组氨酸；
（5）第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
5.根据权利要求4所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体为以下任一种：WP 018973707.1、MBI1365550.1、WP 019621003.1、PZO88445.1、WP188557499.1、WP 018954578.1、WP 109722486.1、HBR97190.1、RKZ34011.1、PCI29794.1、WP152128546.1、WP 043577352.1、WP 028534370.1、WP 163146383.1、WP 020559877.1、EEV22383.1、WP 054674877.1、WP 116473412.1 、WP 062152427.1、WP 070469244.1、MBE0623823.1、WP 166570087.1、WP 187671963.1、WP 124635583.1、WP 175829488.1、WP041099832.1。
6.根据权利要求4所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述表达通过以下任一种或多种方式实现：
（1）导入包含所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因的质粒；
（2）在基因组中插入一个或多个拷贝的所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因。
7.根据权利要求6所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的编码基因如SEQ ID NO.3-28任一所示。
8.根据权利要求4~7任一项所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌还包含以下修饰中的一种或多种：
（1）表达能够合成PHBH的PHA聚合酶变体；
（2）(R)-烯酰辅酶A水合酶的表达和/或酶活性增强。
9.根据权利要求8所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于， 所述能够合成PHBH的PHA聚合酶变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示；
和/或，(R)-烯酰辅酶A水合酶的表达和/或酶活性增强通过以SEQ ID NO.30所示的启动子起始基因组(R)-烯酰辅酶A水合酶编码基因的转录实现。
10.权利要求4~9任一项所述的工程化罗氏真养菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括修饰罗氏真养菌以表达所述乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对罗氏真养菌进行以下修饰中的一种或多种：
（1）表达能够合成PHBH的PHA聚合酶变体；
（2）增强(R)-烯酰辅酶A水合酶的表达和/或酶活性。
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