JPWO2019168203A1 - 4−アミノ桂皮酸を製造する方法、並びに、それに用いられるベクター及び宿主細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
(1)4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換し、
(2)4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する
ことを含む方法。
[2]前記(1)の変換が、配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を用いて行われる、[1]の方法。
[3]前記(1)の変換が、前記第1の酵素を発現するよう改変された第1の宿主細胞を用いて行われる、[2]の方法。
[4]前記第1の宿主細胞が微生物である、[3]の方法。
[5]前記微生物が細菌である、[4]の方法。
[6]前記(1)の変換が、前記第1の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、[5]の方法。
[7]前記(2)の変換が、配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を用いて行われる、[1]〜[6]の方法。
[8]前記(2)の変換が、前記第2の酵素を発現する第2の宿主細胞を用いて行われる、[7]の方法。
[9]前記第2の宿主細胞が、前記第2の酵素を発現するよう改変された宿主細胞である、[8]に記載の方法。
[10]前記第2の宿主細胞が微生物である、[8]又は[9]の方法。
[11]前記微生物が細菌である、[10]の方法。
[12]前記(2)の変換が、前記第2の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、[11]の方法。
[13]前記休止菌体が培養菌体、粉末菌体、及び固定化菌体からなる群から選択される、[6]又は[12]の方法。
[14]前記(2)の変換がpH8〜9で行われる、[7]〜[13]の方法。
[15]グルコースから4−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
(a)グルコースからフェニルアラニンを産生し、
(b)前記(a)で得られたフェニルアラニンをニトロ化して4−ニトロフェニルアラニンに変換し、
(c)[1]〜[14]の方法により、前記(b)で得られた4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する
ことを含む方法。
[16]フェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
(b)フェニルアラニンをニトロ化して4−ニトロフェニルアラニンに変換し、
(c)[1]〜[14]の方法により、前記(b)で得られた4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する
ことを含む方法。
[17]4−ニトロフェニルアラニンから4−ニトロ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を用いることを含む方法。
[18]4−ニトロ桂皮酸から4−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を用いることを含む方法。
[19]配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
[20]配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
[21]配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
[22]配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
1.概要
本発明の第一の要旨は、4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する方法(以下適宜「本発明の第一の方法」と略称する。)に関する。本発明の第一の方法は、少なくとも(1)4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する工程、及び(2)4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する工程を含む。
本発明の第一の方法では、出発原料として4−ニトロフェニルアラニンを用いる。4−ニトロフェニルアラニンの種類は制限されず、天然のものでも合成されたものでもよい。4−ニトロフェニルアラニンを合成する種々の手法については後述する。
本発明の第一の方法では、まず工程(1)として、4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸へと変換する。本工程(1)を実施する手法は制限されず、例えば生物的手法や化学的手法等、任意の手法を用いることができる。中でも、本発明では4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸へと変換する酵素(ニトロフェニルアラニンアンモニアリアーゼ:以下適宜「第一の酵素」という。)を用いて、工程(1)を実施することが好ましい。
本発明の第一の方法では、次に工程(2)として、4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸へと変換する。本工程(2)を実施する手法も制限されず、例えば生物的手法や化学的手法等、任意の手法を用いることができる。中でも、本発明では4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸へと変換する酵素(ニトロレダクターゼ:以下適宜「第二の酵素」という。)を用いて、工程(2)を実施することが好ましい。
本発明の第一の方法では、前記第一の酵素を用いて工程(1)を実施する際、及び/又は、前記第二の酵素を用いて工程(2)を実施する際に、前記の第一及び/又は第二の酵素を発現する第一及び/又は第二の細胞として細菌の休止菌体を用いた反応(休止菌体反応)を用いることが好ましい(なお、第一の酵素を発現する細菌を以下「第一の細菌」といい、第二の酵素を発現する細菌を以下「第二の細菌」という)。
以上の手順により、(1)4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する工程、及び(2)4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する工程を実施することにより、4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造することができる。なお、工程(2)の終了後、当業者に公知の各種の手法で反応生成物から4−アミノ桂皮酸を単離・精製してもよい。
本発明の第二の要旨は、グルコースから4−アミノ桂皮酸を製造する方法(以下適宜「本発明の第二の方法」と略称する。)に関する。本発明の第二の方法は、少なくとも(a)グルコースからフェニルアラニンを産生する工程、(b)前記(a)で得られたフェニルアラニンをニトロ化して4−ニトロフェニルアラニンに変換する工程、及び、(c)本発明の第一の方法により、前記(b)で得られた4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する工程を含む。
本発明の第三の要旨は、フェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する方法(以下適宜「本発明の第三の方法」と略称する。)に関する。本発明の第三の方法は、少なくとも(b)フェニルアラニンをニトロ化して4−ニトロフェニルアラニンに変換する工程、及び、(c)本発明の第一の方法により、前記(b)で得られた4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する工程を含む。
本発明の第四の要旨は、フェニルアラニンから4−ニトロ桂皮酸を製造する方法(以下適宜「本発明の第四の方法」と略称する。)に関する。本発明の第四の方法は、少なくとも前述の第一の酵素を用いて、フェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する工程を含む。斯かる工程の詳細については、本発明の第一の方法の工程(1)として先に詳述したとおりである。
本発明の第五の要旨は、4−ニトロ桂皮酸から4−アミノ桂皮酸を製造する方法(以下適宜「本発明の第五の方法」と略称する。)に関する。本発明の第五の方法は、少なくとも前述の第二の酵素を用いて、4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する工程を含む。斯かる工程の詳細については、本発明の第一の方法の工程(2)として先に詳述したとおりである。
本発明の第六の要旨は、前述の第一及び/又は第二の酵素をコードする遺伝子を担持するベクター(なお、第一の酵素をコードする遺伝子を担持するベクターを以下「第一のベクター」といい、第二の酵素をコードする遺伝子を担持するベクターを以下「第二のベクター」といい、第一の酵素をコードする遺伝子及び第二の酵素をコードする遺伝子を共に担持するベクターを以下「第三のベクター」という。)に関する。
本発明の第七の要旨は、前述の第一及び/又は第二の酵素を発現するよう宿主細胞を改変して得られる細胞(なお、前述のように、第一の酵素を発現する細胞を「第一の細胞」といい、第二の酵素を発現する細胞を「第二の細胞」といい、第一及び第二の酵素を共に発現する細胞を「第三の細胞」という。)に関する。
装置: Hewlett Packerd社製 1200 infinity series
カラム: Millipore-Merck社製 Purospher STAR RP-18 endcapped カラム
検出波長: 280nm
溶離液A: 20mMリン酸カリウム(pH7.0)
溶離液B: 100%メタノール
プログラム: 0分(A:B=98%:2%)
7分(A:B=98%:2%)
12分(A:B=50%:50%)
17分(A:B=50%:50%)
19分(A:B=98%:2%)
23分(A:B=98%:2%)
装置 :BECKMAN COULTER社製DU800 UV/Vis Spectrophotometer
酵素量 :2mg/mL
緩衝溶液:50mM Tris−HClバッファー(pH=8.6)
基質濃度:0.3mM〜9.6mM
容量 :200μL
測定波長:4−ニトロフェニルアラニンから4−ニトロ桂皮酸 380nm
フェニルアラニンから桂皮酸 305nm
測定時間:10分
測定温度:25℃
[I.4−ニトロフェニルアラニンから4−ニトロ桂皮酸への変換]
1.プラスミドの構築及び大腸菌への導入
(1)pET28a−CamPALの構築及び大腸菌への導入
チャノキ(Camellia sinensis)由来の酵素であるCamPALを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成し、引き続き制限酵素NdeI及びEcoRIにより制限処理した。この制限処理したCamPALを、制限酵素NdeI及びEcoRIにより制限処理したプラスミドpET28a(Novagen社製)(以下、制限処理pET28aという)に対して、DNAライゲーションキットLigation High Ver.2(東洋紡社製)を用いて連結し、pET28a−CamPALを作製した。得られたpET28a−CamPALを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたCamPAL産生大腸菌株を培養してCamPALを発現させた。
ムラサキ(Lithospermum erythrorhizon)由来の酵素であるLiePALを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成した。得られたLiePALを、前記CamPALの制限処理に用いたものと同じ制限酵素を用いて制限処理した。以下、制限処理したLiePALを用いた以外は、前記のpET28a−CamPALの作製手順と同様の方法で前記制限処理pET28aと連結し、pET28a−LiePALを作製した。以下、上記同様の方法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたLiePAL産生大腸菌株を培養してLiePALを発現させた。
ロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)JN−1由来の酵素であるRgPALを、公知のポリヌクレオチド合成法により人工合成した。得られたRgPALを、前記CamPALの制限処理に用いたものと同じ制限酵素により制限処理した。以下、制限処理したRgPALを用いた以外は、前記のpET28a−CamPALの作製手順と同様の方法で、前記制限処理pET28aと連結し、pET28a−RgPALを作製した。得られたpET28a−RgPALを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたRgPAL産生大腸菌株を培養してRgPALを発現させた。
前記のCamPAL、LiePAL、及びRgPAL産生大腸菌株をそれぞれ、30mg/Lカナマイシン硫酸塩を含むLB培地5mLに植菌し、28℃で16時間培養した(以下、前培養ということがある)。その後、これを同培地200mLに植菌し、O.D600が0.6になるまで培養後、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside:IPTG)を終濃度0.5mMとなるように添加し、さらに30℃において20時間培養した。これらの培養の際の回転数は120rpmとした。培養した菌体を集菌し、0.5MNaClを含む20mMTris−HClバッファー(pH=7.5)に懸濁し、超音波破砕を行なった。引き続き遠心分離の後に、その上清をHis−Trapカラムを用いて精製し、得られた酵素を活性測定に用いた。
前記のCamPAL、LiePAL、及びRgPAL産生大腸菌株をそれぞれ、40mg/Lカナマイシン硫酸塩を含む3mLのLB培地を用い、300rpmの撹拌、28℃の条件において16時間前培養した。この前培養液1mLを40mg/Lのカナマイシン硫酸塩を含む100mLのLB培地に植菌し、120rpmで振盪しながら30℃で4時間培養した後、0.5mMのIPTGを添加して、更に20時間培養した。得られた菌体を反応バッファー(100mMTris−HClバッファー、pH8.5)で2回洗浄した。
また、対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。
1.プラスミドの構築及び大腸菌への導入
(1)pRSFDuet−1−scFrm2の構築及び大腸菌への導入
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の酵素であるscFrm2(アミノ酸配列を配列番号7、塩基配列の例を配列番号8にそれぞれ示す。)を、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のゲノムライブラリーから、プライマー5’−AACGGATCCGATGTCCCCAACTGGAAAC−3’(配列番号17)及び5’−GCCAAGCTTCAGTGATAAACGTTGATTACG−3’(配列番号18)を用いてPCRにより増幅した後、制限酵素BamHI及びHindIIIにより制限処理し、同じく制限酵素BamHI及びHindIIIにより制限処理したプラスミドpRSFDuet−1(Novagen)に対して、DNAライゲーションキットLigation High Ver.2(東洋紡社製)を用いて連結し、pRSFDuet−1−scFrm2を作製した。得られたpRSFDuet−1−scFrm2を、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたscFrm2産生大腸菌株を培養してscFrm2を発現させた。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の酵素であるscHbn1(アミノ酸配列を配列番号9、塩基配列の例を配列番号10にそれぞれ示す。)を、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のゲノムライブラリーから、プライマー5’−AACGGATCCGATGTCTGCTGTTGCAAC−3’(配列番号19)及び5’−GCCAAGCTTAATTGAAGATTTCAACATCG−3’(配列番号20)を用いてPCRにより増幅した後、前記scFrm2の制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、pRSFDuet−1−scHbn1を作製した。得られたpRSFDuet−1−scHbn1を、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたscHbn1産生大腸菌株を培養してscHbn1を発現させた。
クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)由来の酵素であるcdFLDZ(アミノ酸配列を配列番号11、塩基配列の例を配列番号12にそれぞれ示す。)を、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)のゲノムライブラリーから、プライマー5’−CCGGGATCCAATGAAGATTAGTTCTATG−3’(配列番号21)及び5’−CCGGAATTCTTATATATTTAATGCTAC−3’(配列番号22)を用いてPCRにより増幅した後、前記scFrm2の制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、pRSFDuet−1−cdFLDZを作製した。得られたpRSFDuet−1−cdFLDZを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたcdFLDZ産生大腸菌株を培養してcdFLDZを発現させた。
前記のscFrm2、scHbn1、及びcdFLDZ産生大腸菌株をそれぞれ、30mg/Lカナマイシン硫酸塩を含む3mLのLB培地を用い、300rpmで振盪しながら28℃で16時間前培養した。この前培養液1mLを30mg/Lカナマイシン硫酸塩を含む100mLのLB培地に植菌し、120rpmで振盪しながら30℃で4時間培養した後、0.1mMのIPTGを添加して、更に20℃で12時間培養した。得られた菌体を反応バッファー(100mMリン酸二水素カリウム(KH2PO4)、1mM硫酸マグネシウム(MgSO4)、0.5mM塩化チアミン、pH7.0)で2回洗浄した。
また、対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。
[III.4−ニトロフェニルアラニンから4−ニトロ桂皮酸への変換]
1.CamPALの菌体量と基質量の違いによる変換効率の評価
実施例1に記載のCamPAL産生大腸菌株を、40mg/Lカナマイシン硫酸塩を含む5mLのLB培地を用い、攪拌速度300rpmの撹拌、28℃の条件において16時間前培養した。この前培養液1mLを、以下の組成を有する100mLのTB培地に、80mg/Lカナマイシン硫酸塩を加えた後に植菌し、120rpmで振盪しながら30℃で4時間培養した後、0.1mMのIPTGを添加して、更に20時間培養した。遠心分離によって培養液から菌体を回収した後、−80℃で保存した。得られた凍結菌体を10g/L、20g/L及び30g/Lに計量した。さらに、基質である4−ニトロフェニルアラニンを4.2g/L、21g/L、42g/Lを計量した。
2Lジャーファーメンター(丸菱バイオエンジ社製:BNR−C−2LS)を反応器とし、実施例1に記載のCamPAL産生大腸菌株(菌体量20g/L〜30g/L)を用いて、基質である4−ニトロフェニルアラニン(基質量21g/L)を4−ニトロ桂皮酸へと変換する反応を行った。
[IV.4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸への変換反応]
1.4−ニトロ桂皮酸の4−アミノ桂皮酸への変換に適した炭素源の探索
大腸菌はニトロレダクターゼ(nfsA及びnfsB)を有していることが知られている。そこで、大腸菌を用いて4−ニトロ桂皮酸から4−アミノ桂皮酸への還元反応を行った。
1Lジャーファーメンター(Biott社製:BMJ−01)を用いて、上記のグリセロールを添加した条件下で、4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸への変換を行った。実施例2の前培養液5mLを、80mg/Lカナマイシン硫酸塩を加えた0.5LのTB培地を含む1Lジャーファーメンターに植菌し、通気量を0.7L/分、645rpmの撹拌、30℃の条件において4時間培養した後、0.1mMのIPTGを添加して、更に20時間培養した。
[4−ニトロ桂皮酸から4−アミノ桂皮酸への変換]
1.プラスミドの構築及び大腸菌への導入
(1)pCDF Duet−1−nfsAの構築及び大腸菌への導入
大腸菌(Escherichia coli)由来の酵素であるnfsA(アミノ酸配列を配列番号13、塩基配列の例を配列番号14にそれぞれ示す。)を、大腸菌(Escherichia coli)のゲノムライブラリーから、プライマー5’−CAGACCATGGGCACGCCAACCATTGAACTTATTTGTG−3’(配列番号23)及び5’−GAGGATCCTTAGCGCGTCGCCCAACCCTG−3’(配列番号24)を用いてPCRにより増幅した後、制限酵素NcoI及びBamHIにより制限処理し、同じく制限酵素NcoI及びBamHIにより制限処理したプラスミドpCDF Duet−1(Novagen)に対して、DNAライゲーションキットLigation High Ver.2(東洋紡社製)を用いて連結し、pCDF Duet−1−nfsAを作製した。得られたpCDF Duet−1−nfsAを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたnfsA産生大腸菌株を培養してnfsAを発現させた。
大腸菌(Escherichia coli)由来の酵素であるnfsB(アミノ酸配列を配列番号15、塩基配列の例を配列番号16にそれぞれ示す。)を、大腸菌(Escherichia coli)のゲノムライブラリーから、プライマー5’−CAGACCATGGGCGATATCATTTCTGTCGCC−3’(配列番号25)及び5’−GAGGATCCTTACACTTCGGTTAAGGTGATG−3’(配列番号26)を用いてPCRにより増幅した後、前記nfsAの制限酵素処理と同じ制限酵素処理及びプラスミドへの連結を行い、pCDF Duet−1−nfsAを作製した。得られたpCDF Duet−1−nfsBを、ヒートショックトランスフォーメンション法により大腸菌株BL21(DE3)に導入した。得られたnfsB産生大腸菌株を培養してnfsBを発現させた。
前記のnfsA及びnfsB産生大腸菌株をそれぞれ、40mg/Lのストレプトマイシン硫酸塩を含む5mLのLB培地を用い、300rpmで振盪しながら28℃で16時間前培養した。この前培養液1mLを、80mg/Lストレプトマイシン硫酸塩を含む100mLのTB培地に植菌し、120rpmで振盪しながら30℃で4時間培養した後、0.1mMのIPTGを添加して、更に30℃で18時間培養した。
また、対照として宿主大腸菌を用い、同様の実験を行った。
Claims (22)
- 4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
(1)4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換し、
(2)4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する
ことを含む方法。 - 前記(1)の変換が、配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記(1)の変換が、前記第1の酵素を発現するよう改変された第1の宿主細胞を用いて行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記第1の宿主細胞が微生物である、請求項3に記載の方法。
- 前記微生物が細菌である、請求項4に記載の方法。
- 前記(1)の変換が、前記第1の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、請求項5に記載の方法。
- 前記(2)の変換が、配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を用いて行われる、請求項1〜6の何れか一項に記載の方法。
- 前記(2)の変換が、前記第2の酵素を発現する第2の宿主細胞を用いて行われる、請求項7に記載の方法。
- 前記第2の宿主細胞が、前記第2の酵素を発現するよう改変された宿主細胞である、請求項8に記載の方法。
- 前記第2の宿主細胞が微生物である、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記微生物が細菌である、請求項10に記載の方法。
- 前記(2)の変換が、前記第2の宿主細胞である細菌の休止菌体を用いた休止菌体反応により行われる、請求項11に記載の方法。
- 前記休止菌体が培養菌体、粉末菌体、及び固定化菌体からなる群から選択される、請求項6又は12に記載の方法。
- 前記(2)の変換がpH8〜9で行われる、請求項7〜13の何れか一項に記載の方法。
- グルコースから4−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
(a)グルコースからフェニルアラニンを産生し、
(b)前記(a)で得られたフェニルアラニンをニトロ化して4−ニトロフェニルアラニンに変換し、
(c)請求項1〜14の何れか一項に記載の方法により、前記(b)で得られた4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する
ことを含む方法。 - フェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、
(b)フェニルアラニンをニトロ化して4−ニトロフェニルアラニンに変換し、
(c)請求項1〜14の何れか一項に記載の方法により、前記(b)で得られた4−ニトロフェニルアラニンから4−アミノ桂皮酸を製造する
ことを含む方法。 - 4−ニトロフェニルアラニンから4−ニトロ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を用いることを含む方法。
- 4−ニトロ桂皮酸から4−アミノ桂皮酸を製造する方法であって、配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を用いることを含む方法。
- 配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
- 配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素をコードする核酸を担持するベクター。
- 配列番号1、3、又は5で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロフェニルアラニンを4−ニトロ桂皮酸に変換する活性を有する第1の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
- 配列番号7、9、11、13又は15で表されるアミノ酸配列に対して80%以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、4−ニトロ桂皮酸を4−アミノ桂皮酸に変換する活性を有する第2の酵素を発現するよう改変された宿主細胞。
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