KR20210153117A - 모노옥시게나아제 돌연변이체 및 이의 응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 모노옥시게나아제 돌연변이체 및 이의 응용을 공개한다. 상기 모노옥시게나아제 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻은 아미노산 서열이고, 돌연변이는 제49 부위, 제60 부위, 제61 부위, 제144 부위, 제145 부위, 제146 부위, 제147 부위, 제167 부위, 제169 부위, 제189 부위, 제246 부위, 제247 부위, 제280 부위, 제284 부위, 제285 부위, 제286 부위, 제287 부위, 제328 부위, 제330 부위, 제332 부위, 제382 부위, 제427 부위, 제428 부위, 제429 부위, 제430 부위, 제431 부위, 제432 부위 등 중 적어도 하나의 돌연변이 부위를 포함하며, 상기 모노옥시게나아제 돌연변이체는 입체 선택성이 크게 향상되는 장점을 가지며 효소 활성도 이에 따라 증가된다.
Description
본 발명은 생물 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로, 모노옥시게나아제 돌연변이체 및 이의 응용에 관한 것이다.
기존의 화학 산화제는 대부분 독성체 및/또는 쉽게 폭발하는 것이며, 입체 선택성이 아주 낮은 것으로, 친환경적이고 또한 광학 순도가 높은 약물 및 농약의 합성에 대한 필요성으로 인해, 신규 산화제를 지속적으로 개발하고 있다. 시클로헥사논 모노옥시게나아제(CHMO)는 케톤, 알데히드 및 일부 황화물, 셀렌화물의 산화 반응에 대해 촉매 작용할 수 있는 환원형 보조효소 I(NADPH) 의존형 산화 효소이다. 모노옥시게나아제는 유기 합성에 널리 사용되며, 우수한 선택성, 제어 가능성 및 경제성을 가진다. 키랄 약물 합성에 있어서, 일반적으로 제품 배열이 다름에 따라, 그 기능, 독성 차이가 아주 크므로, 광학 순도가 높은 키랄 화합물을 얻는 것은 제약 연구 개발에서 아주 중요하다. 최근 수십년 동안, 모노옥시게나아제는 일련의 가치 있는 키랄 화합물을 합성하기 위해 입체 선택성에 대해 촉매 작용하기 위한 반응에서 생물 촉매로서 사용되어 왔다[Protein Engineering of Stereoselective Baeyer―Villiger Monooxygenases].[J].Chemistry-A European Journal,2012,18(33).
설로페넴은 페넴계 항생제로서, 미국 Pfizer사에 의해 연구 개발된 항균 스펙트럼이 넓고 항균 활성이 강하며 β-락타마아제에 의해 쉽게 가수분해되지 않는 등 특성을 가지는 주사용 페넴계 항생제이며[Antibacterial activity of sulopenem,a new parenteral penem antibiotic].[J].Japanese Journal of Antibiotics,1996,49(4):338, 세계 항생제 시장에서 점점 더 중요한 위치를 차지하고 있다.
비대칭 합성을 위한 생물학적 효소법의 사용은 자체의 높은 선택성 및 친환경성 등 장점으로 인해 사람들의 관심을 점점 더 많이 받고 있다. (R)-3-히드록시-테트라히드로티오펜은 항생제인 설로페넴 등 다양한 약물을 생산하는 핵심 중간체이고, 효소 촉매 작용으로 설로페넴 측쇄를 합성하는 방법에서(하기 도면을 참조), 단백질 변형을 통해 선택성 및 활성이 모두 크게 향상된 케토리덕타아제(ketoreductase) 돌연변이체를 이미 얻었고, 3-케토테트라히드로티오펜을 (R)-3-히드록시-테트라히드로티오펜으로 전환시키는 첫 번째 단계에 대해 촉매 작용할 수 있다[특허: 케토리덕타아제 돌연변이체 및 이의 응용(공개 번호: CN108048417A)]. 두 번째 단계의 효소 촉매 작용 반응에서, 모노옥시게나아제로 화학법을 대체하여 (R)-3-히드록시-테트라히드로티오펜의 산화 반응을 진행하여, 화학 발열 반응을 방지하는 동시에 광학 순도가 높은 제품인 (R,R)-1-옥소-3-히드록시테트라히드로티오펜을 생성할 수 있다.
하지만, 현재 야생형의 모노옥시게나아제는 선택성이 아주 낮고 활성이 낮은 등 결점이 존재하여 산업 응용과는 거리가 멀다. 일반적으로, 단백질 공학의 수단을 통해 야생형 효소를 변형시켜 효소의 입체 선택성 및 활성을 향상시킬 수 있음으로써, 산업 생산에 응용할 수 있다.
본 발명은 종래기술에서 모노옥시게나아제의 선택성이 낮고 효소 활성이 낮은 기술적 과제를 해결하기 위한 모노옥시게나아제 돌연변이체 및 이의 응용을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 모노옥시게나아제 돌연변이체를 제공한다. 상기 모노옥시게나아제 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻은 아미노산 서열이고, 돌연변이는 제49 부위, 제60 부위, 제61 부위, 제144 부위, 제145 부위, 제146 부위, 제147 부위, 제167 부위, 제169 부위, 제189 부위, 제246 부위, 제247 부위, 제280 부위, 제284 부위, 제285 부위, 제286 부위, 제287 부위, 제328 부위, 제330 부위, 제332 부위, 제382 부위, 제427 부위, 제428 부위, 제429 부위, 제430 부위, 제431 부위, 제432 부위, 제433 부위, 제434 부위, 제435 부위, 제436 부위, 제438 부위, 제441 부위, 제493 부위, 제494 부위, 제508 부위, 제509 부위, 제510 부위, 제511 부위, 제512 부위 및 제513 부위 중 적어도 하나의 돌연변이 부위를 포함하며, 돌연변이는 제49 부위의 트립토판에서 알라닌으로의 돌연변이; 제60 부위의 아스파르트산에서 류신으로의 돌연변이; 제61 부위의 트레오닌에서 글루타민으로의 돌연변이; 제144 부위의 발린에서 글루탐산으로의 돌연변이; 제145 부위의 글리신에서 페닐알라닌으로의 돌연변이; 제146 부위의 류신에서 페닐알라닌 또는 티로신으로의 돌연변이; 제147 부위의 류신에서 메티오닌, 트레오닌 또는 티로신으로의 돌연변이; 제167 부위의 히스티딘에서 트립토판으로의 돌연변이; 제169 부위의 알라닌에서 라이신으로의 돌연변이; 제189 부위의 세린에서 메티오닌으로의 돌연변이; 제246 부위의 알라닌에서 발린으로의 돌연변이; 제247 부위의 발린에서 트레오닌으로의 돌연변이; 제280 부위의 페닐알라닌에서 티로신, 트립토판 또는 발린으로의 돌연변이; 제284 부위의 페닐알라닌에서 세린으로의 돌연변이; 제285 부위의 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이; 제286 부위의 트레오닌에서 알라닌으로의 돌연변이; 제287 부위의 페닐알라닌에서 아스파르트산으로의 돌연변이; 제328 부위의 알라닌에서 아스파라긴으로의 돌연변이; 제330 부위의 아르기닌에서 알라닌으로의 돌연변이; 제332 부위의 류신에서 아르기닌으로의 돌연변이; 제382 부위의 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이; 제427 부위의 메티오닌에서 이소류신으로의 돌연변이; 제428 부위의 발린에서 알라닌으로의 돌연변이; 제429 부위의 류신에서 티로신으로의 돌연변이; 제430 부위의 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이; 제431 부위의 프롤린에서 알라닌으로의 돌연변이; 제432 부위의 아스파라긴에서 티로신으로의 돌연변이; 제433 부위의 글리신에서 티로신으로의 돌연변이; 제434 부위의 프롤린에서 알라닌으로의 돌연변이; 제435 부위의 페닐알라닌에서 세린, 알라닌, 아스파라긴 또는 티로신으로의 돌연변이; 제436 부위의 트레오닌에서 알라닌, 세린, 글리신, 글루탐산 또는 시스테인으로의 돌연변이; 제438 부위의 류신에서 글리신, 알라닌, 티로신, 페닐알라닌 또는 세린으로의 돌연변이; 제441 부위의 세린에서 류신 및 발린으로의 돌연변이; 제493 부위의 트립토판에서 알라닌으로의 돌연변이; 제494 부위의 이소류신에서 알라닌, 메티오닌 또는 세린으로의 돌연변이; 제508 부위의 페닐알라닌에서 티로신, 메티오닌 또는 아스파라긴으로의 돌연변이; 제509 부위의 티로신에서 메티오닌으로의 돌연변이; 제510 부위의 류신에서 발린으로의 돌연변이; 제511 부위의 글리신에서 류신으로의 돌연변이; 제512 부위의 글리신에서 이소류신으로의 돌연변이; 제513 부위의 류신에서 발린으로의 돌연변이이거나; 또는 모노옥시게나아제 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이된 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 구비하며, 돌연변이된 아미노산 서열과 80 % 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열이다.
또한, 돌연변이는 F435A+F508Y; F435S+F508Y; L147Y+F508M; F280Y+F508M; F280Y+F508N; F435A+L510V; F435S+L510V; F435N+L510V; T436A+L510V; L438A+L510V; T436A+L438A; F435A+T436A; F435S+T436A; F435N+T436A; L146Y+F508M; L146F+F508M; F280Y+F508Y; F280Y+F508N; F435A+T436A+F508Y; F435A+T436A+F508M; F435A+T436A+L510V; F435S+T436A+L510V; T436A+L438A+F508Y; T436A+L438A+F508M; T436A+L438A+F508N; L147Y+F435A+F508M; L147Y+F435A+F508Y; L147Y+F435A+F508N; L147Y+F435S+F508Y; L147Y+F435N+F508Y; L147Y+F435S+F508Y; L147Y+F435N+F508Y; F508Y+F435A+L438A; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438A+T436A; F508Y+F435A+L438A+T436S; F508M+F435A+L438A+T436A; F508M+F435A+L438A+T436S; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280W; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280A; F508Y+F435A+L438A+T436A+S441L; F508M+F435A+L438A+T436A+F280W; F508M+F435A+L438A+T436A+F280V; F508M+F435A+L438A+T436A+S441V; F508M+F435A+L438A+T436A+S441A; F508Y+F435N+L438A+T436S; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V; F508Y+F435N+L438A+T436S+S441L; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147M+I494A; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L; F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+T61Q; F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+G145F; F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+A169K; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+S189M; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+D60L+L332R; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+D60L+A328N; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+G430A; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147M+I494A+D60L+N432Y; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S+D60L+Y509M; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M+D60L+G512I; F508Y+F435A+L438A+W49A+D60L; F508Y+F435A+L438A+V144E; F508Y+F435A+L438A+G145F; F508Y+F435A+L438A+T436A+H167W; F508Y+F435A+L438A+T436A+A169K; F508Y+F435A+L438A+T436A+S179M; F508Y+F435A+L438A+T436A+A246V; F508Y+F435A+L438A+T436A+V247T; F508Y+F435A+L438A+T436A+F284S; F508Y+F435A+L438A+T436A+G285A; F508M+F435A+L438A+T436A+T286A; F508M+F435A+L438A+T436A+R330A; F508M+F435A+L438A+T436A+L332R; F508M+F435A+L438A+T436A+A328N; F508Y+F435A+L438A+T436S+G382A; F508Y+F435A+L438A+T436S+M427I; F508Y+F435A+L438A+T436S+V428A; F508Y+F435A+L438A+T436S+G430A; F508Y+F435A+L438A+T436S+P431A; F508Y+F435A+L438A+T436S+N432Y; F508Y+F435A+L438A+T436S+G433Y; F508Y+F435A+L438A+T436S+P434A; F508Y+F435A+L438A+T436S+Y509M; F508Y+F435A+L438A+T436S+G511L; F508Y+F435A+L438A+T436S+G512I; F508Y+F435A+L438A+T436S+L513V; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+D60L+P431A; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+D60L; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438A+T436A; F508Y+F435A+L438A+T436S; F508M+F435A+L438A+T436A; F508M+F435A+L438A+T436S; F508Y+F435A+L438A; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438A+T436A; F508Y+F435A+L438A+T436S; F508M+F435A+L438A+T436A; F508M+F435A+L438A+T436S; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280W+D60L; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280A+V247T; F508Y+F435A+L438A+T436A+S441L+F285A; F508Y+F435N+L438A+T436S+R330A; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+G430A; F508Y+F435N+L438A+T436S+S441L+P434A; F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+T286A+Y509M; F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+T61Q+V247T; F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+F287D+R330A; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+V144E+G145F+M427I; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+Q60L+L322R+N432Y; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+R330A+P321A+G512I; 및 F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+T61Q+R330A+G430A 중 적어도 하나의 돌연변이 부위 조합을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, DNA 분자를 제공한다. 상기 DNA 분자는 상기 임의의 하나의 모노옥시게나아제 돌연변이체를 코딩한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 재조합 플라스미드를 제공한다. 상기 재조합 플라스미드는 상기 임의의 하나의 DNA 분자를 함유한다.
또한, 재조합 플라스미드는 pET-22b(+), pET-22b(+), pET-3a(+), pET-3d(+), pET-11a(+), pET-12a(+), pET-14b(+), pET-15b(+), pET-16b(+), pET-17b(+), pET-19b(+), pET-20b(+), pET-21a(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-24a(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-35b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-42a(+), pET-43a(+), pET-43b(+), pET-44a(+), pET-49b(+), pQE2, pQE9, pQE30, pQE31, pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-1, pGEX-6p-1, pGEX-6p-2, pBV220, pBV221, pBV222, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18, pKK232-18, pUC-18 또는 pUC-19이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 상기 임의의 하나의 재조합 플라스미드를 함유한다.
또한, 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 또는 진핵 세포를 포함하고; 바람직하게는, 원핵 세포는 대장균 BL21 세포 또는 대장균 DH5α 컴피턴트 세포이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 티오에테르계 화합물 또는 케톤계 화합물의 일산소화 반응(mono-oxygenation reaction)에 대해 촉매 작용하는데 있어서의 상기 임의의 하나의 모노옥시게나아제 돌연변이체의 응용을 제공한다.
또한, 티오에테르계 화합물은 
이고, 여기서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴을 나타내며; R1 및 R2는 단독으로 또는 양자가 서로 결합되어 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 수 있고;
바람직하게는, R1 및 R2는 탄소 원자수가 1~20인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이며, 더 바람직하게는, 탄소 원자수가 1~10인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이고;
바람직하게는, 아릴은 페닐, 나프틸, 피리딜, 티에닐, 옥사디아졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 푸라닐, 피롤릴, 페녹시, 나프톡시, 피리딜옥시, 티에닐옥시, 옥사디아졸릴옥시, 이미다졸릴옥시, 티아졸릴옥시, 푸라닐옥시 및 피롤릴옥시를 포함하며;
바람직하게는, 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, sec-부틸, tert-부틸, 메톡시, 에톡시, tert-부톡시, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 비닐, 알릴, 시클로펜틸 및 시클로헵틸을 포함하고;
바람직하게는, 아랄킬은 벤질이며;
바람직하게는, 치환은 할로겐 원자, 질소 원자, 황 원자, 히드록시, 니트로, 시아노, 메톡시, 에톡시, 카르복실, 카르복시메틸, 카르복시에틸 또는 메틸렌디옥시에 의해 치환됨을 의미한다.
또한, 케톤계 화합물은 
이고, 여기서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴을 나타내며; R3 및 R4는 단독으로 또는 양자가 서로 결합되어 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 수 있고;
바람직하게는, R3 및 R4는 탄소 원자수가 1~20인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이며, 더 바람직하게는, 탄소 원자수가 1~10인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이고;
바람직하게는, 아릴은 페닐, 나프틸, 피리딜, 티에닐, 옥사디아졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 푸라닐, 피롤릴, 페녹시, 나프톡시, 피리딜옥시, 티에닐옥시, 옥사디아졸릴옥시, 이미다졸릴옥시, 티아졸릴옥시, 푸라닐옥시 및 피롤릴옥시를 포함하며;
바람직하게는, 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, sec-부틸, tert-부틸, 메톡시, 에톡시, tert-부톡시, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 비닐, 알릴, 시클로펜틸 및 시클로헵틸을 포함하고;
바람직하게는, 아랄킬은 벤질이며;
바람직하게는, 치환은 할로겐 원자, 질소 원자, 황 원자, 히드록시, 니트로, 시아노, 메톡시, 에톡시, 카르복실, 카르복시메틸, 카르복시에틸 또는 메틸렌디옥시에 의해 치환됨을 의미한다.
또한, 응용은 설로페넴 측쇄 합성（sulopenem sidechain reaction）이다.
또한, 모노옥시게나아제는 상기 임의의 하나의 모노옥시게나아제 돌연변이체의 용액, 동결건조 분말, 고정화 효소 또는 고정화 세포이다.
또한, 일산소화 반응의 반응계는 보조 인자를 더 포함하고, 보조 인자는 NAD+/NADH 및/또는 NADP+/NADPH이며, 보조 인자 순환 시스템은 글루코스 및 글루코스 탈수소 효소, 포름산염 및 포름산 탈수소 효소, 글루코스-6-인산 및 글루코스-6-인산 탈수소 효소, 또는 이차 알코올 및 이차 알코올 탈수소 효소를 포함한다.
또한, 일산소화 반응의 온도는 10 ~ 37℃이고, 바람직하게는 15 ~ 35℃이다.
또한, 일산소화 반응의 시간은 3 ~ 48시간이고, 더 바람직하게는 6 ~ 16시간이다.
또한, 일산소화 반응은 pH가 5.0 ~ 10.0인 조건에서 진행되고, 바람직하게는 pH는 6.0 ~ 9.0이다.
본 발명의 모노옥시게나아제 돌연변이체는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 모노옥시게나아제에 기초하여, 부위 지정 돌연변이 방법을 통해 돌연변이를 진행함으로써, 이의 아미노산 서열을 변화시켜 단백질 구조 및 기능을 변화시킨 다음, 방향성 스크리닝 방법을 통해 상기 돌연변이 부위가 구비된 모노옥시게나아제를 얻으므로, 본 발명의 모노옥시게나아제 돌연변이체는 입체 선택성이 크게 향상되는 장점을 가지며 효소 활성도 이에 따라 증가된다.
모순되지 않는 한, 본 발명의 실시예 및 실시예의 특징은 서로 조합될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 이하, 실시예와 함께 본 발명을 상세히 설명한다.
Rhodococcus sp.로부터 유래된 모노옥시게나아제는 티오에테르계 화합물 및 케톤계 화합물의 반응에 대해 촉매 작용하지만, 활성이 낮고, 입체 선택성이 낮으며, 특히, 촉매 반응인 (R)-3-히드록시-테트라히드로티오펜의 산화에 의해 얻은 제품은 S 배열로 목적 산물과 반대인 배열이다. 본 발명은 단백질 공학 방법을 통해 모노옥시게나아제의 입체 선택성을 향상시키고 모노옥시게나아제의 활성을 향상시켜 효소 촉매 작용 특성이 개선된 돌연변이체를 얻으며, 키랄 화합물 생산 제조 과정에서, 효소의 사용량을 감소시켜 광학 순도가 높은 제품을 얻도록 한다.
본 발명의 발명자는 방향성 진화 방법을 통해 모노옥시게나아제 SEQ ID NO: 1의 활성과 입체 선택성을 향상시키고, 효소의 사용량을 감소시켰다. 먼저, 전장 플라스미드 PCR 방법으로 모노옥시게나아제 SEQ ID NO: 1에 돌연변이 부위를 도입하고, 돌연변이체에 대해 활성 및 입체 선택성 검출을 진행하여 활성 또는 입체 선택성이 향상된 돌연변이체를 선택하였다.
SEQ ID NO: 1은 MTAQISPTVVDAVVIGAGFGGIYAVHKLHNEQGLTVVGFDKADGPGGTWYWNRYPGALSDTESHLYRFSFDRDLLQDGTWKTTYITQPEILEYLESVVDRFDLRRHFRFGTEVTSAIYLEDENLWEVSTDKGEVYRAKYVVNAVGLLSAINFPDLPGLDTFEGETIHTAAWPEGKNLAGKRVGVIGTGSTGQQVITALAPEVEHLTVFVRTPQYSVPVGNRPVTKEQIDAIKADYDGIWDSVKKSAVAFGFEESTLPAMSVSEEERNRIFQEAWDHGGGFRFMFGTFGDIATDEAANEAAASFIRSKIAEIIEDPETARKLMPTGLYAKRPLCDNGYYEVYNRPNVEAVAIKENPIREVTAKGVVTEDGVLHELDVLVFATGFDAVDGNYRRIEIRGRNGLHINDHWDGQPTSYLGVTTANFPNWFMVLGPNGPFTNLPPSIETQVEWISDTVAYAERNEIRAIEPTPEAEEEWTQTCTDIANATLFTRGDSWIFGANVPGKKPSVLFYLGGLGNYRNVLAGVVADSYRGFELKSAVPVTA로 표시된다. SEQ ID NO: 1을 주형으로 하여, 60쌍의 부위 지정 돌연변이 프라이머(돌연변이 부위는 제49 부위, 제60 부위, 제61 부위, 제144 부위, 제145 부위, 제146 부위, 제147 부위, 제167 부위, 제169 부위, 제189 부위, 제246 부위, 제247 부위, 제280 부위, 제284 부위, 제285 부위, 제286 부위, 제287 부위, 제328 부위, 제330 부위, 제332 부위, 제382 부위, 제427 부위, 제428 부위, 제429 부위, 제430 부위, 제431 부위, 제432 부위, 제433 부위, 제434 부위, 제435 부위, 제436 부위, 제438 부위, 제441 부위, 제493 부위, 제494 부위, 제508 부위, 제509 부위, 제510 부위, 제511 부위, 제512 부위, 제513 부위 등임)를 설계하고 부위 지정 돌연변이 수단을 이용하여, pET-22b(+)를 발현 벡터로 하여, 표적 유전자가 구비된 돌연변이 플라스미드를 얻는다.
여기서, 부위 지정 돌연변이는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 등 방법을 통해 표적 DNA 단편(게놈일 수 있고, 플라스미드일 수도 있음)에 염기의 추가, 삭제, 점 돌연변이 등을 포함하는 필요한 변화(일반적으로 유리한 방향으로의 변화임)를 도입하는 것을 의미한다. 부위 지정 돌연변이는 DNA에 의해 발현되는 표적 단백질의 형질 및 표징을 신속하고 고효율적으로 향상시킬 수 있으므로, 유전자 연구 작업에서 아주 유용한 수단이다.
전장 플라스미드 PCR을 이용하여 부위 지정 돌연변이를 도입하는 방법은 간단하고 효과적이며, 현재 흔히 사용하는 수단이다. 그 원리는, 돌연변이 부위를 포함하는 한 쌍의 프라이머(정방향, 역방향), 그리고 주형 플라스미드를 어닐링한 후 중합효소를 사용하여 "순환 확장"(이른바 순환 확장이란 중합효소가 주형에 따라 프라이머를 확장시키고, 한 바퀴 된 후, 프라이머 5' 말단에 돌아가 정지한 다음, 반복적인 가열, 어닐링 및 확장의 순환을 거치는 것을 의미하고, 이 반응은 회전 환 증폭(rolling circle amplification, RCA)과 달리 다수의 직렬 복제를 형성하지 않는다)시킨다. 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 확장 산물은 어닐링된 후 쌍을 이루어 노치(notch)가 구비된 고리열림 플라스미드로 된다. dam+ 균주로부터 유래된 주형 DNA는 메틸화 부위를 구비하므로, Dpn I에 의해 식별 절단될 수 있고, 체외에서 합성되고 돌연변이 서열이 구비된 플라스미드는 메틸화 부위를 구비하지 않으므로 소화되지 않으며, 대장균에 형질전환된 후 노치는 자연적으로 복원될 수 있는데, 즉 돌연변이 플라스미드가 구비된 클론을 얻을 수 있다. 돌연변이 플라스미드를 대장균 컴피턴트 세포 내에 형질전환시키고, LB 고체 배지(100 μg/mL의 암피실린)를 함유한 페트리 접시에 도포하며, 37℃에서 하룻밤 배양한다. 고체 배지에서 생장된 단일 클론을 활성화시킨다. 시퀀싱을 통해 정확한 것으로 감정된 후, 25℃, 0.2 mM의 IPTG의 조건에서, 모노옥시게나아제의 발현을 하룻밤 유도한다. 다음, 원심분리, 초음파로 세포를 분쇄하는 방법을 통해 조 효소액을 얻어 반응 특성 검출에 사용한다.
단일 점 돌연변이에 의해 촉매 작용 특성이 향상된 돌연변이체를 얻은 기초에서, 유익한 부위를 조합하여 형질이 더 우수한 돌연변이체를 얻을 수 있다. 조합 돌연변이 중 이중 점 돌연변이의 구축 방법은 단일 점 돌연변이의 구축 방법과 마찬가지로, 전장 플라스미드 PCR 방법으로 구축된다. 2개 이상의 부위를 동시에 돌연변이시키는 다중 점 돌연변이는 중첩 확장 PCR 증폭을 통해 진행되는데, 이에 의해 다중 점 돌연변이를 포함한 돌연변이 유전자를 얻고, 양단을 제한 엔도뉴클레아제로 이중 효소 절단한 후, 발현 벡터에 연결하며, 대장균 세포 내에 형질전환시키고, 100 μg/mL의 암피실린을 함유한 LB 페트리 접시에 도포하며, 37℃에서 하룻밤 배양하여 조합 돌연변이체를 얻고, 시퀀싱하여 감정한다.
중첩 확장 PCR 기술(gene splicing by overlap extension PCR, SOEPCR로 약칭)은 상보적 말단을 가지는 프라이머를 사용하여 PCR 산물이 중첩 사슬을 형성하도록 함으로써, 이후의 증폭 반응에서 중첩 사슬을 통해 확장되고, 상이한 유래의 증폭 단편을 중첩 스플라이싱하는 것이다. 이 기술은 PCR 기술을 이용하여 체외에서 효과적인 유전자 재조합을 진행할 수 있으므로, 흔히 다중 점 돌연변이의 구축에 사용된다.
컴퓨터를 사용하여 모노옥시게나아제 및 기질의 3차원 구조에 대해 도킹 시뮬레이션 분석을 진행한 결과, 효소 촉매 작용 중심 부근에서 일부 아미노산으로부터 기질까지의 거리가 5 Å인 것으로 기질에 대한 효소의 입체 선택성 및 활성과 아주 큰 관련이 있을 수 있음을 발견하였다. 다중 점 조합 돌연변이의 기초에서, 이들에 영향을 미칠 수 있는 아미노산 부위에 대해 반복적 포화 돌연변이를 진행하여 활성 및 입체 선택성이 모두 크게 향상된 돌연변이체를 얻을 수 있다.
포화 돌연변이는 표적 단백질의 코딩 유전자를 변형시켜 단시간 내에 표적 부위 아미노산이 각각 다른 19가지 아미노산에 의해 대체된 돌연변이체를 얻는 방법이다. 이 방법은 단백질을 방향성 변형시키는 강력한 도구일 뿐만 아니라, 단백질 구조-기능 관계 연구에서 중요한 수단이기도 하다. 포화 돌연변이는 흔히 단일 점 돌연변이보다 더 이상적인 진화체를 얻을 수 있다. 부위 지정 돌연변이 방법으로 해결할 수 없는 이러한 문제는 마침 포화 돌연변이 방법의 뛰어난 독특한 부분이다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, 모노옥시게나아제 돌연변이체를 제공한다. 상기 모노옥시게나아제 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻은 아미노산 서열이고, 상기 돌연변이는 제49 부위, 제60 부위, 제61 부위, 제144 부위, 제145 부위, 제146 부위, 제147 부위, 제167 부위, 제169 부위, 제189 부위, 제246 부위, 제247 부위, 제280 부위, 제284 부위, 제285 부위, 제286 부위, 제287 부위, 제328 부위, 제330 부위, 제332 부위, 제382 부위, 제427 부위, 제428 부위, 제429 부위, 제430 부위, 제431 부위, 제432 부위, 제433 부위, 제434 부위, 제435 부위, 제436 부위, 제438 부위, 제441 부위, 제493 부위, 제494 부위, 제508 부위, 제509 부위, 제510 부위, 제511 부위, 제512 부위 및 제513 부위 중 적어도 하나의 돌연변이 부위를 포함하며, 상기 돌연변이는 제49 부위의 트립토판에서 알라닌으로의 돌연변이; 제60 부위의 아스파르트산에서 류신으로의 돌연변이; 제61 부위의 트레오닌에서 글루타민으로의 돌연변이; 제144 부위의 발린에서 글루탐산으로의 돌연변이; 제145 부위의 글리신에서 페닐알라닌으로의 돌연변이; 제146 부위의 류신에서 페닐알라닌 또는 티로신으로의 돌연변이; 제147 부위의 류신에서 메티오닌, 트레오닌 또는 티로신으로의 돌연변이; 제167 부위의 히스티딘에서 트립토판으로의 돌연변이; 제169 부위의 알라닌에서 라이신으로의 돌연변이; 제189 부위의 세린에서 메티오닌으로의 돌연변이; 제246 부위의 알라닌에서 발린으로의 돌연변이; 제247 부위의 발린에서 트레오닌으로의 돌연변이; 제280 부위의 페닐알라닌에서 티로신, 트립토판 또는 발린으로의 돌연변이; 제284 부위의 페닐알라닌에서 세린으로의 돌연변이; 제285 부위의 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이; 제286 부위의 트레오닌에서 알라닌으로의 돌연변이; 제287 부위의 페닐알라닌에서 아스파르트산으로의 돌연변이; 제328 부위의 알라닌에서 아스파라긴으로의 돌연변이; 제330 부위의 아르기닌에서 알라닌으로의 돌연변이; 제332 부위의 류신에서 아르기닌으로의 돌연변이; 제382 부위의 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이; 제427 부위의 메티오닌에서 이소류신으로의 돌연변이; 제428 부위의 발린에서 알라닌으로의 돌연변이; 제429 부위의 류신에서 티로신으로의 돌연변이; 제430 부위의 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이; 제431 부위의 프롤린에서 알라닌으로의 돌연변이; 제432 부위의 아스파라긴에서 티로신으로의 돌연변이; 제433 부위의 글리신에서 티로신으로의 돌연변이; 제434 부위의 프롤린에서 알라닌으로의 돌연변이; 제435 부위의 페닐알라닌에서 세린, 알라닌, 아스파라긴 또는 티로신으로의 돌연변이; 제436 부위의 트레오닌에서 알라닌, 세린, 글리신, 글루탐산 또는 시스테인으로의 돌연변이; 제438 부위의 류신에서 글리신, 알라닌, 티로신, 페닐알라닌 또는 세린으로의 돌연변이; 제441 부위의 세린에서 류신 및 발린으로의 돌연변이; 제493 부위의 트립토판에서 알라닌으로의 돌연변이; 제494 부위의 이소류신에서 알라닌, 메티오닌 또는 세린으로의 돌연변이; 제508 부위의 페닐알라닌에서 티로신, 메티오닌 또는 아스파라긴으로의 돌연변이; 제509 부위의 티로신에서 메티오닌으로의 돌연변이; 제510 부위의 류신에서 발린으로의 돌연변이; 제511 부위의 글리신에서 류신으로의 돌연변이; 제512 부위의 글리신에서 이소류신으로의 돌연변이; 제513 부위의 류신에서 발린으로의 돌연변이이거나; 또는 상기 모노옥시게나아제 돌연변이체의 아미노산 서열은 상기 돌연변이된 아미노산 서열 중의 상기 돌연변이 부위를 구비하며, 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 80 % 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열이다.
반응을 통해 활성을 측정하여, ee 값 및 활성이 향상된 돌연변이체를 얻는다. 구체적으로, 바람직하게는, 다음과 같은 조합을 포함하는 바, 돌연변이는 F435A+F508Y; F435S+F508Y; L147Y+F508M; F280Y+F508M; F280Y+F508N; F435A+L510V; F435S+L510V; F435N+L510V; T436A+L510V; L438A+L510V; T436A+L438A; F435A+T436A; F435S+T436A; F435N+T436A; L146Y+F508M; L146F+F508M; F280Y+F508Y; F280Y+F508N; F435A+T436A+F508Y; F435A+T436A+F508M; F435A+T436A+L510V; F435S+T436A+L510V; T436A+L438A+F508Y; T436A+L438A+F508M; T436A+L438A+F508N; L147Y+F435A+F508M; L147Y+F435A+F508Y; L147Y+F435A+F508N; L147Y+F435S+F508Y; L147Y+F435N+F508Y; L147Y+F435S+F508Y; L147Y+F435N+F508Y; F508Y+F435A+L438A; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438A+T436A; F508Y+F435A+L438A+T436S; F508M+F435A+L438A+T436A; F508M+F435A+L438A+T436S; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280W; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280A; F508Y+F435A+L438A+T436A+S441L; F508M+F435A+L438A+T436A+F280W; F508M+F435A+L438A+T436A+F280V; F508M+F435A+L438A+T436A+S441V; F508M+F435A+L438A+T436A+S441A; F508Y+F435N+L438A+T436S; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V; F508Y+F435N+L438A+T436S+S441L; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147M+I494A; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L; F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+T61Q; F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+G145F; F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+A169K; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+S189M; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+D60L+L332R; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+D60L+A328N; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+G430A; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147M+I494A+D60L+N432Y; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S+D60L+Y509M; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M+D60L+G512I; F508Y+F435A+L438A+W49A+D60L; F508Y+F435A+L438A+V144E; F508Y+F435A+L438A+G145F; F508Y+F435A+L438A+T436A+H167W; F508Y+F435A+L438A+T436A+A169K; F508Y+F435A+L438A+T436A+S179M; F508Y+F435A+L438A+T436A+A246V; F508Y+F435A+L438A+T436A+V247T; F508Y+F435A+L438A+T436A+F284S; F508Y+F435A+L438A+T436A+G285A; F508M+F435A+L438A+T436A+T286A; F508M+F435A+L438A+T436A+R330A; F508M+F435A+L438A+T436A+L332R; F508M+F435A+L438A+T436A+A328N; F508Y+F435A+L438A+T436S+G382A; F508Y+F435A+L438A+T436S+M427I; F508Y+F435A+L438A+T436S+V428A; F508Y+F435A+L438A+T436S+G430A; F508Y+F435A+L438A+T436S+P431A; F508Y+F435A+L438A+T436S+N432Y; F508Y+F435A+L438A+T436S+G433Y; F508Y+F435A+L438A+T436S+P434A; F508Y+F435A+L438A+T436S+Y509M; F508Y+F435A+L438A+T436S+G511L; F508Y+F435A+L438A+T436S+G512I; F508Y+F435A+L438A+T436S+L513V; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+D60L+P431A; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+D60L; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438A+T436A; F508Y+F435A+L438A+T436S; F508M+F435A+L438A+T436A; F508M+F435A+L438A+T436S; F508Y+F435A+L438A; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438A+T436A; F508Y+F435A+L438A+T436S; F508M+F435A+L438A+T436A; F508M+F435A+L438A+T436S; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280W+D60L; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280A+V247T; F508Y+F435A+L438A+T436A+S441L+F285A; F508Y+F435N+L438A+T436S+R330A; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+G430A; F508Y+F435N+L438A+T436S+S441L+P434A; F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+T286A+Y509M; F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+T61Q+V247T; F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+F287D+R330A; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+V144E+G145F+M427I; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+Q60L+L322R+N432Y; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+R330A+P321A+G512I; 및 F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+T61Q+R330A+G430A; 및 F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+T61Q+R330A+G430A 중 적어도 하나의 돌연변이 부위 조합을 포함한다. 여기서, 설명의 편의를 위해, 제435 부위의 페닐알라닌에서 알라닌으로의 돌연변이 및 제508 부위의 페닐알라닌에서 티로신으로의 돌연변이를 F435A+F508Y로 설명하고, 다른 것들도 마찬가지로 이러한 방식으로 설명된다.
본 발명의 모노옥시게나아제 돌연변이체는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 모노옥시게나아제의 기초에서, 부위 지정 돌연변이 방법을 통해 돌연변이를 진행함으로써, 이의 아미노산 서열을 변화시켜 단백질 구조 및 기능을 변화시킨 다음, 방향성 스크리닝 방법을 통해 상기 돌연변이 부위가 구비된 모노옥시게나아제를 얻으므로, 본 발명의 모노옥시게나아제 돌연변이체는 입체 선택성이 크게 향상되는 장점을 가지며 효소 활성도 이에 따라 증가된다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, DNA 분자를 제공한다. 상기 DNA 분자는 상기 모노옥시게나아제 돌연변이체를 코딩한다. 상기 DNA로 코딩하여 얻은 모노옥시게나아제는 효소 활성 및 효소의 입체 선택성을 향상시키고, 티오에테르계 화합물 또는 케톤계 화합물의 일산소화 반응에 대한 촉매 작용에서 첨가된 효소량을 감소시키고, 후처리 난이도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 상기 DNA 분자는 "발현 카세트"의 형태로 존재할 수도 있다. "발현 카세트"는 선형 또는 환형상 핵산 분자를 의미하고, 특정 뉴클레오티드 서열이 적절한 숙주 세포에서 발현하도록 가이드할 수 있는 DNA 및 RNA 서열을 포함한다. 일반적으로, 표적 뉴클레오티드와 효과적으로 연결된 프로모터를 포함하고, 이는 종료 신호 및/또는 다른 조절 요소와 효과적으로 연결된 것을 임의로 선택한다. 발현 카세트는 뉴클레오티드 서열의 정확한 번역에 필요한 서열을 더 포함할 수 있다. 코딩 영역은 일반적으로 표적 단백질을 코딩하지만, 센스 또는 안티센스 방향에서 표적 기능 RNA도 코딩하는데, 예를 들어, 안티센스 RNA 또는 번역되지 않은 RNA도 코딩한다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 발현 카세트는 키메라일 수 있는데, 이의 적어도 하나의 조성성분이 이의 적어도 하나의 다른 조성성분과 이종(異種)인 것을 의미한다. 발현 카세트는 천연적으로 존재할 수도 있지만, 이종 발현을 위한 효과적 재조합으로 형성되어 획득될 수 도 있다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, 재조합 플라스미드를 제공한다. 상기 재조합 플라스미드는 상기 임의의 하나의 DNA 분자를 함유한다. 상기 재조합 플라스미드 중의 DNA 분자는 재조합 플라스미드의 적절한 위치에 위치하여 상기 DNA 분자가 정확하고 원활하게 복제, 전사 또는 발현될 수 있도록 한다.
비록 본 발명에서 상기 DNA 분자를 한정할 때 사용한 한정 용어가 "함유"이지만, DNA 서열의 양단에 이의 기능과 관련이 없는 다른 서열을 임의로 추가할 수 있음을 의미하지는 않는다. 본 분야의 기술자라면, 재조합 조작의 요구를 만족시키기 위해 DNA 서열의 양단에 적합한 제한 엔도뉴클레아제의 효소 절단 부위를 추가하거나, 시작 코돈, 종료 코돈 등을 별도로 추가해야 하므로, 폐쇄적인 표현으로 한정하면 이러한 상황을 진실하게 커버할 수 없음을 이해할 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "플라스미드"는 이중 사슬 또는 단일 사슬 선형 또는 환형상 형태의 임의의 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지 또는 아그로박테륨 이원 핵산 분자를 포함하고, 바람직하게는 재조합 발현 플라스미드이며, 원핵 발현 플라스미드일 수 있고, 진핵 발현 플라스미드일 수도 있으나, 바람직하게는 원핵 발현 플라스미드이며, 일부 실시형태에서, 재조합 플라스미드는 pET-22b(+), pET-22b(+), pET-3a(+), pET-3d(+), pET-11a(+), pET-12a(+), pET-14b(+), pET-15b(+), pET-16b(+), pET-17b(+), pET-19b(+), pET-20b(+), pET-21a(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-24a(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-35b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-42a(+), pET-43a(+), pET-43b(+), pET-44a(+), pET-49b(+), pQE2, pQE9, pQE30, pQE31, pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-1, pGEX-6p-1, pGEX-6p-2, pBV220, pBV221, pBV222, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18, pKK232-18, pUC-18 또는 pUC-19로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 상기 재조합 플라스미드는 pET-22b(+)이다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, 상기 임의의 하나의 재조합 플라스미드를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 적용되는 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 또는 진핵 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 원핵 세포는 그람음성균 또는 그람양성균과 같은 진정세균이다. 더 바람직하게는, 원핵 세포는 대장균 BL21 세포 또는 대장균 DH5α 컴피턴트 세포이다. 모노옥시게나아제 발현 유도를 위한 최적의 조건은 25℃, 0.2 mM의 IPTG에서 16시간 동안 유도하는 것이다. 돌연변이 플라스미드를 대장균 세포 내에 형질전환시킨 후, 초음파로 세포를 분쇄하는 방법을 통해 조 효소(crude enzyme)를 얻는다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, 티오에테르계 화합물 또는 케톤계 화합물의 일산소화 반응에 대해 촉매 작용하는 모노옥시게나아제 돌연변이체의 응용을 제공한다. 여기서, 모노옥시게나아제는 상기 임의의 하나의 모노옥시게나아제 돌연변이체이다. 본 발명의 상기 모노옥시게나아제 돌연변이체는 더 높은 효소 촉매 작용 활성을 가지므로, 본 발명의 모노옥시게나아제 돌연변이체를 이용한 산업 생산은 생산 원가를 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 더 순수한 키랄성을 갖는 제품을 얻을 수도 있다.
본 발명의 전형적인 실시형태에서, 티오에테르계 화합물은 
이고, 상기 식에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴을 나타낸다. 이 밖에, R1 및 R2는 단독으로 또는 양자가 서로 결합되어 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 수 있다. R1 및 R2는 바람직하게는 탄소 원자수가 1~20인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이며, 더 바람직하게는, 탄소 원자수가 1~10인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이다. 아릴로서, 페닐, 나프틸, 피리딜, 티에닐, 옥사디아졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 푸라닐, 피롤릴, 페녹시, 나프톡시, 피리딜옥시, 티에닐옥시, 옥사디아졸릴옥시, 이미다졸릴옥시, 티아졸릴옥시, 푸라닐옥시, 피롤릴옥시 등을 예를 들 수 있다. 알킬로서, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, sec-부틸, tert-부틸, 메톡시, 에톡시, tert-부톡시, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 비닐, 알릴, 시클로펜틸, 시클로헵틸 등을 예를 들 수 있다. 아랄킬로서, 벤질 등을 예를 들 수 있다. 이들 그룹은 더 치환될 수도 있으며, 그 치환기로서, 할로겐 원자, 질소 원자, 황 원자, 히드록시, 니트로, 시아노, 메톡시, 에톡시, 카르복실, 카르복시메틸, 카르복시에틸 또는 메틸렌디옥시 등을 예를 들 수 있다. 이 밖에, 고리의 형성도 이들 치환기를 통할 수 있다. 케톤계 화합물은 
이고, 상기 식에서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴을 나타낸다. 이 밖에, R3 및 R4는 단독으로 또는 양자가 서로 결합되어 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 수 있다. R3 및 R4는 바람직하게는 탄소 원자수가 1~20인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이며, 더 바람직하게는, 탄소 원자수가 1~10인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이다. 아릴로서, 페닐, 나프틸, 피리딜, 티에닐, 옥사디아졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 푸라닐, 피롤릴, 페녹시, 나프톡시, 피리딜옥시, 티에닐옥시, 옥사디아졸릴옥시, 이미다졸릴옥시, 티아졸릴옥시, 푸라닐옥시, 피롤릴옥시 등을 예를 들 수 있다. 알킬로서, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, sec-부틸, tert-부틸, 메톡시, 에톡시, tert-부톡시, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 비닐, 알릴, 시클로펜틸, 시클로헵틸 등을 예를 들 수 있다. 아랄킬로서, 벤질 등을 예를 들 수 있다. 이들 그룹은 더 치환될 수도 있으며, 그 치환기로서, 할로겐 원자, 질소 원자, 황 원자, 히드록시, 니트로, 시아노, 메톡시, 에톡시, 카르복실, 카르복시메틸, 카르복시에틸 또는 메틸렌디옥시 등을 예를 들 수 있다. 이 밖에, 고리의 형성도 이들 치환기를 통할 수 있다.
반응식은 하기와 같다.
본 발명의 전형적인 실시형태에서, 본 발명의 모노옥시게나아제 돌연변이체는 설로페넴 측쇄 합성에 응용되고, 반응식은 하기와 같다.
본 발명에서 얻은 모노옥시게나아제 돌연변이체는 설로페넴 측쇄의 합성에 사용될 수 있으므로, 발열 반응을 방지하고, 광학 순도가 높은 (R,R)-1-옥소-3-히드록시테트라히드로티오펜(전환율＞99 %, ee 값은 95.0 %임)을 얻음으로써, 상기 화합물의 산업 생산 원가를 크게 절감하고, 산업 생산에서의 상기 효소의 응용 가치를 더 높인다.
모노옥시게나아제는 모노옥시게나아제 돌연변이체의 용액, 동결건조 분말, 고정화 효소 또는 고정화 세포일 수 있다.
바람직하게는, 일산소화 반응에 대해 촉매 작용하는 보조 인자는 NAD+/NADH 및/또는 NADP+/NADPH이고, 보조 인자 순환 시스템은 글루코스 및 글루코스 탈수소 효소, 포름산염 및 포름산 탈수소 효소, 글루코스-6-인산 및 글루코스-6-인산 탈수소 효소, 이차 알코올(예를 들어, 이소프로판올) 및/또는 이차 알코올 탈수소 효소 및 유사한 시스템을 포함하며, 가장 바람직하게는 이소프로판올 및 알코올 탈수소 효소를 사용한다.
바람직하게는, 일산소화 반응에 대해 촉매 작용하는 온도는 10 ~ 37℃이고, 더 바람직하게는 15 ~ 35℃이며; 일산소화 반응에 대해 촉매 작용하는 시간은 3 ~ 48시간이고, 더 바람직하게는 6 ~ 16시간이며; 일산소화 반응에 대한 촉매 작용은 pH가 6.0 ~ 10.0인 조건에서 진행되고, 더 바람직하게는 pH가 6.0 ~ 9.0이며; 이 반응 조건에서, 효소의 촉매 작용 성능을 더 잘 발휘할 수 있다.
이하, 실시예와 함께 본 발명의 유익한 효과를 진일보로 설명한다.
실시예 1
모노옥시게나아제 부위 지정 돌연변이에 의해 제조된 (R,R)-1-옥소-3-히드록시테트라히드로티오펜의 반응 특성 비교
50 mL의 유리 삼각 플라스크에서, 100 mg의 (R)-3-히드록시테트라히드로티오펜을 850 μL의 이소프로판올에 넣어 균일하게 혼합하며, pH를 6.0 ~ 9.0으로 조절한 다음, 800 mg의 모노옥시게나아제, 0.12 g의 이소프로판올 탈수소 효소, 50 μL(20 mg/mL)의 NADP+, 0.1 M의 Tris-HCl 완충액(buffer)을 포함한 조 효소액에 넣고, 총 반응 부피는 10 mL이며, 체계 pH는 6.0 ~ 9.0이고, 15℃ ~ 30℃의 일정 온도에서 진탕 플라스크에서 반응시켰다. 16시간 후, 700 μL의 반응계를 취하여 1.4 mL의 무수 에탄올을 넣고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액에 0.5 g의 무수 MgSO4를 넣어 물을 제거하고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액을 취하여 N2로 불어 건조시킨 후 700 μL의 무수 에탄올로 다시 용해시키고, GC로 분석하였다. 부분 돌연변이체 반응 특성은 하기 표 1과 같다.
| 돌연변이체 | 전환율 | e.e. |
| 야생형 | + | * |
| F508M | ++ | * |
| F508Y | +++ | ** |
| F508N | + | ** |
| F435S | +++ | ** |
| F435N | +++ | * |
| F435A | +++ | * |
| F435Y | +++ | * |
| L147Y | ++ | ** |
| L147T | + | ** |
| L147M | ++ | ** |
| L146F | + | ** |
| L146Y | + | ** |
| F280Y | ++ | * |
| L429Y | ++ | * |
| T436A | +++ | ** |
| T436S | ++ | ** |
| L438A | ++ | ** |
| L438F | ++ | ** |
| L438S | ++ | ** |
| I494A | ++ | ** |
| W493A | ++ | * |
| L510V | ++ | * |
전환율이 10 % ~ 50 %이면 +이고, 50 % ~ 90 %이면 ++이며, 90 % 이상이면 +++이고; ee 값이 -99 % ~ -50 %이면 *이며, -50 % ~ 0 %이면 **이다.단일 점 돌연변이체의 입체 선택성 및 활성은 모두 모체보다 향상되었지만, 가장 이상적인 효과에 도달하지 못했으므로, 유익한 활성 부위를 다양하게 조합하여 더 우수한 돌연변이체를 얻을 수 있다.
실시예 2
모노옥시게나아제 조합 돌연변이에 의해 제조된 (R,R)-1-옥소-3-히드록시테트라히드로티오펜의 반응 특성 비교
50 mL의 유리 삼각 플라스크에서, 100 mg의 (R)-3-히드록시테트라히드로티오펜을 850 μL의 이소프로판올에 넣어 균일하게 혼합하며, pH를 6.0 ~ 9.0으로 조절한 다음, 800 mg의 모노옥시게나아제, 0.12 g의 이소프로판올 탈수소 효소, 50 μL(20 mg/mL)의 NADP+, 0.1 M의 Tris-HCl 완충액(buffer)을 포함한 조 효소액에 넣고, 총 반응 부피는 10 mL이며, 체계 pH는 6.0 ~ 9.0이고, 15℃ ~ 30℃의 일정 온도에서 진탕 플라스크에서 반응시켰다. 16시간 후, 700 μL의 반응계를 취하여 1.4 mL의 무수 에탄올을 넣고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액에 0.5 g의 무수 MgSO4를 넣어 물을 제거하고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액을 취하여 N2로 불어 건조시킨 후 700 μL의 무수 에탄올로 다시 용해시키고, GC로 분석하였다. 부분 돌연변이체 반응 특성은 하기 표 2와 같다.
| 돌연변이체 | 전환율 | e.e. |
| 야생형 | + | * |
| F435A+F508Y | +++ | *** |
| F435S+F508Y | ++ | ** |
| L147Y+F508M | ++ | *** |
| F280Y+F508M | ++ | ** |
| F280Y+F508N | +++ | ** |
| F435A+L510V | +++ | *** |
| F435S+L510V | ++ | ** |
| F435N+L510V | +++ | *** |
| T436A+L510V | +++ | *** |
| L438A+L510V | +++ | ** |
| T436A+L438A | +++ | ** |
| F435A+T436A | +++ | ** |
| F435S+T436A | +++ | *** |
| F435N+T436A | +++ | ** |
| L146Y+F508M | ++ | *** |
| L146F+F508M | ++ | ** |
| F280Y+F508Y | +++ | ** |
| F280Y+F508N | ++ | ** |
| F435A+T436A+F508Y | ++ | ** |
| F435A+T436A+F508M | ++ | ** |
| F435A+T436A+L510V | +++ | ** |
| F435S+T436A+L510V | ++ | *** |
| T436A+L438A+F508Y | ++ | ** |
| T436A+L438A+F508M | ++ | ** |
| T436A+L438A+F508N | +++ | *** |
| L147Y+F435A+F508M | ++ | *** |
| L147Y+F435A+F508Y | ++ | ** |
| L147Y+F435A+F508N | ++ | * |
| L147Y+F435S+F508Y | +++ | ** |
| L147Y+F435N+F508Y | ++ | ** |
| L147Y+F435S+F508Y | +++ | *** |
| L147Y+F435N+F508Y | +++ | ** |
전환율이 10 % ~ 50 %이면 +이고, 50 % ~ 90 %이면 ++이며, 90 % 이상이면 +++이고; ee 값이 -99 % ~ -50 %이면 *이며, ee 값이 -50 % ~ 0 %이면 **이고, 0 % ~ 20 %이면 ***이며, 20 % ~ 60 %이면 ****이고, 60 % ~ 80 %이면 *****이며, 80 % ~ 99 %이면 ******이다.
실시예 3
모노옥시게나아제 포화 돌연변이에 의해 제조된 (R,R)-1-옥소-3-히드록시테트라히드로티오펜의 반응 특성 비교
50 mL의 유리 삼각 플라스크에서, 100 mg의 (R)-3-히드록시테트라히드로티오펜을 850 μL의 이소프로판올에 넣어 균일하게 혼합하며, pH를 6.0 ~ 9.0으로 조절한 다음, 800 mg의 모노옥시게나아제, 0.12 g의 이소프로판올 탈수소 효소, 50 μL(20 mg/mL)의 NADP+, 0.1 M의 Tris-HCl 완충액(buffer)을 포함한 조 효소액에 넣고, 총 반응 부피는 10 mL이며, 체계 pH는 6.0 ~ 9.0이고, 15℃ ~ 30℃의 일정 온도에서 진탕 플라스크에서 반응시켰다. 16시간 후, 700 μL의 반응계를 취하여 1.4 mL의 무수 에탄올을 넣고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액에 0.5 g의 무수 MgSO4를 넣어 물을 제거하고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액을 취하여 N2로 불어 건조시킨 후 700 μL의 무수 에탄올로 다시 용해시키고, GC로 분석하였다. 부분 돌연변이체 반응 특성은 하기 표 3과 같다.
| 돌연변이체 | 활성 | e.e. |
| 야생형 | + | * |
| F508Y+F435A+L438A | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438Y | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438Y | +++ | *** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A | +++ | ***** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S | +++ | ***** |
| F508M+F435A+L438A+T436A | +++ | **** |
| F508M+F435A+L438A+T436S | +++ | ***** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+F280W | +++ | ****** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+F280A | +++ | ****** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+S441L | +++ | ****** |
| F508M+F435A+L438A+T436A+F280W | +++ | ****** |
| F508M+F435A+L438A+T436A+F280V | +++ | ****** |
| F508M+F435A+L438A+T436A+S441V | +++ | ****** |
| F508M+F435A+L438A+T436A+S441A | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+S441L | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | ****** |
| F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | ****** |
| F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | ***** |
| F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | ***** |
| F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F +L147M +I494A | ++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V +L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S | ++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L | +++ | ****** |
| F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+T61Q | +++ | ****** |
| F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+G145F | +++ | ***** |
| F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+A169K | +++ | ***** |
| F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+S189M | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+D60L+L332R | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+D60L+A328N | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+G430A | +++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V +L429Y+W493A+L146F +L147M+I494A+D60L+N432Y |
++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V +L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S+D60L+Y509M |
++ | ****** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V +L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M+D60L+G512I |
+++ | **** |
전환율이 10 % ~ 50 %이면 활성은 +이고, 50 % ~ 90 %이면 ++이며, 90 % 이상이면 +++이고; ee 값이 -99 % ~ -50 %이면 *이며, -50 % ~ 0 %이면 **이고, 0 % ~ 20 %이면 ***이며, 20 % ~ 60 %이면 ****이고, 60 % ~ 80 %이면 *****이며, 80 % ~ 99 %이면 ******이다.
반복적 포화 돌연변이를 통해, 입체 선택성이 향상된 돌연변이 부위를 중첩시켜 ee 값이 안정적이고 향상된 돌연변이체를 얻으며; 동시에 초기 스크리닝하여 얻은 활성 부위 아미노산에 대해 조합 포화 돌연변이를 진행함으로써, 진화 과정에서 진화 결과가 일부 최고점에만 도달하고 전체 최고점에 도달할 수 없는 것을 방지한다. 최종적으로 입체 선택성 및 활성이 최적인 돌연변이체를 얻는다.
실시예 4
부분 돌연변이체에 의해 제조된 (R,R)-1-옥소-3-히드록시테트라히드로티오펜의 반응 특성 비교
50 mL의 유리 삼각 플라스크에서, 100 mg의 (R)-3-히드록시테트라히드로티오펜을 850 μL의 이소프로판올에 넣어 균일하게 혼합하며, pH를 6.0 ~ 9.0으로 조절한 다음, 800 mg의 모노옥시게나아제, 0.12 g의 이소프로판올 탈수소 효소, 50 μL(20 mg/mL)의 NADP+, 0.1 M의 Tris-HCl 완충액(buffer)을 포함한 조 효소액에 넣고, 총 반응 부피는 10 mL이며, 체계 pH는 6.0 ~ 9.0이고, 15℃ ~ 30℃의 일정 온도에서 진탕 플라스크에서 반응시켰다. 16시간 후, 700 μL의 반응계를 취하여 1.4 mL의 무수 에탄올을 넣고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액에 0.5 g의 무수 MgSO4를 넣어 물을 제거하고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액을 취하여 N2로 불어 건조시킨 후 700 μL의 무수 에탄올로 다시 용해시키고, GC로 분석하였다. 부분 돌연변이체 반응 특성은 하기 표 4와 같다.
| 돌연변이체 | 활성 | e.e. |
| 야생형 | + | * |
| F508Y+F435A+L438A+W49A+D60L | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+V144E | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+G145F | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+H167W | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+A169K | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+S179M | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+A246V | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+V247T | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+F284S | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+G285A | +++ | **** |
| F508M+F435A+L438A+T436A+T286A | +++ | **** |
| F508M+F435A+L438A+T436A+R330A | +++ | **** |
| F508M+F435A+L438A+T436A+L332R | +++ | **** |
| F508M+F435A+L438A+T436A+A328N | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+G382A | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+M427I | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+V428A | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+G430A | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+P431A | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+N432Y | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+G433Y | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+P434A | +++ | ***** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S +Y509M | +++ | ***** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+G511L | +++ | ***** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+G512I | +++ | ***** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S+L513V | +++ | ***** |
전환율이 10 % ~ 50 %이면 활성은 +이고, 50 % ~ 90 %이면 ++이며, 90 % 이상이면 +++이고; ee 값이 -99 % ~ -50 %이면 *이며, -50 % ~ 0 %이면 **이고, 0 % ~ 20 %이면 ***이며, 20 % ~ 60 %이면 ****이고, 60 % ~ 80 %이면 *****이며, 80 % ~ 99 %이면 ******이다.
실시예 5
모노옥시게나아제에 의해 제조된 (R,R)-1-옥소-3-히드록시테트라히드로티오펜의 응용
500 mL의 유리 삼각 플라스크에서, 1 g의 (R)-3-히드록시테트라히드로티오펜을 8.5 mL의 이소프로판올에 넣어 균일하게 혼합하며, pH를 6.0 ~ 9.0으로 조절하고, 2 g의 모노옥시게나아제, 0.4 g의 이소프로판올 탈수소 효소, 500 μL(20 mg/mL)의 NADP+, 0.1 M의 Tris-HCl 완충액(buffer)을 포함한 조 효소액에 적가하며, 총 반응 부피는 100 mL이고, 체계 pH는 6.0 ~ 9.0이며, 15℃ ~ 30℃의 일정 온도에서 진탕 플라스크에서 반응시켰다. 16시간 후, 700 μL의 반응계를 취하여 1.4 mL의 무수 에탄올을 넣고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액에 0.5 g의 무수 MgSO4를 넣어 물을 제거하고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액을 취하여 N2로 불어 건조시킨 후 700 μL의 무수 에탄올로 다시 용해시키고, GC로 분석하였으며, 반응 결과는 하기 표 5와 같다.
| 돌연변이체 | 활성 | e.e. | 수율 |
| 야생형 | + | * | # |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V | +++ | ****** | ### |
| F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | ****** | ### |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V | +++ | ****** | ### |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V | +++ | ****** | ### |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V | +++ | ****** | ### |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V +L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S | ++ | ****** | ### |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V +L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M | +++ | **** | ### |
| F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L | +++ | ****** | ### |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+D60L+P431A | +++ | ****** | ### |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+D60L | +++ | ****** | ### |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L | +++ | ****** | ### |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L +L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S | +++ | ****** | ### |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L +L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M | +++ | ****** | ### |
전환율이 10 % ~ 50 %이면 활성은 +이고, 50 % ~ 90 %이면 ++이며, 90 % 이상이면 +++이고; ee 값이 -99 % ~ -50 %이면 *이며, -50 % ~ 0 %이면 **이고, 0 % ~ 20 %이면 ***이며, 20 % ~ 60 %이면 ****이고, 60 % ~ 80 %이면 *****이며, 80 % ~ 99 %이면 ******이고; 수율(收率)이 0 % ~ 20 %이면 #이며, 20 % ~ 40 %이면 ##이고, 40 % ~ 60 %이면 ###이다.
실시예 6
기질인 4-메틸시클로헥사논에 대한 모노옥시게나아제 돌연변이체의 반응 특성 비교
50 mL의 유리 삼각 플라스크에서, 100 mg의 4-메틸시클로헥사논을 850 μL의 이소프로판올에 넣어 균일하게 혼합하며, pH를 6.0 ~ 9.0으로 조절한 다음, 800 mg의 모노옥시게나아제, 0.12 g의 이소프로판올 탈수소 효소, 50 μL(20 mg/mL)의 NADP+, 0.1 M의 Tris-HCl 완충액(buffer)을 포함한 조 효소액에 넣고, 총 반응 부피는 10 mL이며, 체계 pH는 6.0 ~ 9.0이고, 15℃ ~ 30℃의 일정 온도에서 진탕 플라스크에서 반응시켰다. 16시간 후, 700 μL의 반응계를 취하여 1.4 mL의 아세토니트릴을 넣고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액을 취하여 HPLC로 분석하였다. 돌연변이체 반응 특성은 하기 표 6과 같다.
| 돌연변이체 | 활성 |
| 야생형 | + |
| F508Y+F435A+L438Y | ++ |
| F508Y+F435A+L438A+T436A | ++ |
| F508Y+F435A+L438A+T436S | ++ |
| F508M+F435A+L438A+T436A | ++ |
| F508M+F435A+L438A+T436S | ++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V | ++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | ++ |
| F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ |
| F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | ++ |
| F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ |
| F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V | +++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V | +++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V | +++ |
| F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+G145F | ++ |
| F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+A169K | +++ |
| F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+S189M | +++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+D60L+L332R | +++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+D60L+A328N | +++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+G430A | +++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V +L429Y+W493A+L146F+L147M+I494A+D60L+N432Y |
+++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V +L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S+D60L+Y509M |
+++ |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V +L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M+D60L+G512I |
+++ |
전환율이 10 % ~ 50 %이면 활성은 +이고, 50 % ~ 80 %이면 ++이며, 80 % 이상이면 +++이다.
실시예 7
기질인 티오아니솔에 대한 모노옥시게나아제 돌연변이체의 반응 특성 비교
50 mL의 유리 삼각 플라스크에서, 100 mg의 티오아니솔을 850 μL의 이소프로판올에 넣어 균일하게 혼합하며, pH를 6.0 ~ 9.0으로 조절한 다음, 800 mg의 모노옥시게나아제, 0.12 g의 이소프로판올 탈수소 효소, 50 μL(20 mg/mL)의 NADP+, 0.1 M의 Tris-HCl 완충액(buffer)을 포함한 조 효소액에 넣고, 총 반응 부피는 10 mL이며, 체계 pH는 6.0 ~ 9.0이고, 15℃ ~ 30℃의 일정 온도에서 진탕 플라스크에서 반응시켰다. 16시간 후, 700 μL의 반응계를 취하여 1.4 mL의 아세토니트릴을 넣고, 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리하며, 상청액을 취하여 HPLC로 분석하였다. 부분 돌연변이체 반응 특성은 하기 표 7과 같다.
| 돌연변이체 | 활성 | e.e. |
| 야생형 | + | * |
| F508Y+F435A+L438A | ++ | ** |
| F508Y+F435A+L438Y | ++ | *** |
| F508Y+F435A+L438Y | ++ | *** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A | ++ | *** |
| F508Y+F435A+L438A+T436S | ++ | *** |
| F508M+F435A+L438A+T436A | ++ | *** |
| F508M+F435A+L438A+T436S | +++ | *** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+F280W+D60L | +++ | *** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+F280A+V247T | +++ | **** |
| F508Y+F435A+L438A+T436A+S441L+F285A | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+R330A | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+G430A | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+S441L+P434A | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | **** |
| F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | **** |
| F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | **** |
| F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | **** |
| F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V | +++ | **** |
| F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+T286A+Y509M | +++ | **** |
| F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+T61Q+V247T | +++ | **** |
| F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+F287D+R330A | +++ | **** |
| F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+V144E+G145F+M427I | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+Q60L+L322R+N432Y | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+R330A+P321A+G512I | +++ | **** |
| F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+T61Q+R330A+G430A | +++ | **** |
전환율이 10 % ~ 50 %이면 활성은 +이고, 50 % ~ 90 %이면 ++이며, 90 % 이상이면 +++이고; ee 값이 0 % ~ 20 %이면 *이며, 20 % ~ 60 %이면 **이고, 60 % ~ 80 %이면 ***이고, 80 % ~ 99 %이면 ****이다.
상술한 내용은 단지 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명을 한정하지 않으며, 본 분야의 기술자라면, 본 발명에 대해 다양한 변경 및 변형을 가할 수 있다. 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 이루어지는 어떠한 수정, 균등치환, 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위 내에 포함되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> ASYMCHEM LIFE SCIENCE (TIANJIN) CO., LTD.
<120> MONOOXYGENASE MUTANT AND USE THEREOF
<130> PN156942KLY
<140> PCT/CN2019/083051
<141> 2019-04-17
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 541
<212> PRT
<213> Rhodococcus sp.
<400> 1
Met Thr Ala Gln Ile Ser Pro Thr Val Val Asp Ala Val Val Ile Gly
1 5 10 15
Ala Gly Phe Gly Gly Ile Tyr Ala Val His Lys Leu His Asn Glu Gln
20 25 30
Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr
35 40 45
Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr Glu Ser His
50 55 60
Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp
65 70 75 80
Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser
85 90 95
Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu
100 105 110
Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser
115 120 125
Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val
130 135 140
Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr
145 150 155 160
Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn
165 170 175
Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln
180 185 190
Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe
195 200 205
Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr
210 215 220
Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp
225 230 235 240
Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu
245 250 255
Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu
260 265 270
Ala Trp Asp His Gly Gly Gly Phe Arg Phe Met Phe Gly Thr Phe Gly
275 280 285
Asp Ile Ala Thr Asp Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Ala Ser Phe Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ile Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ala Arg Lys
305 310 315 320
Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly
325 330 335
Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys
340 345 350
Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp
355 360 365
Gly Val Leu His Glu Leu Asp Val Leu Val Phe Ala Thr Gly Phe Asp
370 375 380
Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly
385 390 395 400
Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly
405 410 415
Val Thr Thr Ala Asn Phe Pro Asn Trp Phe Met Val Leu Gly Pro Asn
420 425 430
Gly Pro Phe Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp
435 440 445
Ile Ser Asp Thr Val Ala Tyr Ala Glu Arg Asn Glu Ile Arg Ala Ile
450 455 460
Glu Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Glu Trp Thr Gln Thr Cys Thr Asp
465 470 475 480
Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly
485 490 495
Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gly
500 505 510
Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr
515 520 525
Arg Gly Phe Glu Leu Lys Ser Ala Val Pro Val Thr Ala
530 535 540
Claims (16)
- 모노옥시게나아제 돌연변이체에 있어서,
상기 모노옥시게나아제 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻은 아미노산 서열이고, 상기 돌연변이는 제49 부위, 제60 부위, 제61 부위, 제144 부위, 제145 부위, 제146 부위, 제147 부위, 제167 부위, 제169 부위, 제189 부위, 제246 부위, 제247 부위, 제280 부위, 제284 부위, 제285 부위, 제286 부위, 제287 부위, 제328 부위, 제330 부위, 제332 부위, 제382 부위, 제427 부위, 제428 부위, 제429 부위, 제430 부위, 제431 부위, 제432 부위, 제433 부위, 제434 부위, 제435 부위, 제436 부위, 제438 부위, 제441 부위, 제493 부위, 제494 부위, 제508 부위, 제509 부위, 제510 부위, 제511 부위, 제512 부위 및 제513 부위 중 적어도 하나의 돌연변이 부위를 포함하며, 상기 돌연변이는 제49 부위의 트립토판에서 알라닌으로의 돌연변이; 제60 부위의 아스파르트산에서 류신으로의 돌연변이; 제61 부위의 트레오닌에서 글루타민으로의 돌연변이; 제144 부위의 발린에서 글루탐산으로의 돌연변이; 제145 부위의 글리신에서 페닐알라닌으로의 돌연변이; 제146 부위의 류신에서 페닐알라닌 또는 티로신으로의 돌연변이; 제147 부위의 류신에서 메티오닌, 트레오닌 또는 티로신으로의 돌연변이; 제167 부위의 히스티딘에서 트립토판으로의 돌연변이; 제169 부위의 알라닌에서 라이신으로의 돌연변이; 제189 부위의 세린에서 메티오닌으로의 돌연변이; 제246 부위의 알라닌에서 발린으로의 돌연변이; 제247 부위의 발린에서 트레오닌으로의 돌연변이; 제280 부위의 페닐알라닌에서 티로신, 트립토판 또는 발린으로의 돌연변이; 제284 부위의 페닐알라닌에서 세린으로의 돌연변이; 제285 부위의 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이; 제286 부위의 트레오닌에서 알라닌으로의 돌연변이; 제287 부위의 페닐알라닌에서 아스파르트산으로의 돌연변이; 제328 부위의 알라닌에서 아스파라긴으로의 돌연변이; 제330 부위의 아르기닌에서 알라닌으로의 돌연변이; 제332 부위의 류신에서 아르기닌으로의 돌연변이; 제382 부위의 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이; 제427 부위의 메티오닌에서 이소류신으로의 돌연변이; 제428 부위의 발린에서 알라닌으로의 돌연변이; 제429 부위의 류신에서 티로신으로의 돌연변이; 제430 부위의 글리신에서 알라닌으로의 돌연변이; 제431 부위의 프롤린에서 알라닌으로의 돌연변이; 제432 부위의 아스파라긴에서 티로신으로의 돌연변이; 제433 부위의 글리신에서 티로신으로의 돌연변이; 제434 부위의 프롤린에서 알라닌으로의 돌연변이; 제435 부위의 페닐알라닌에서 세린, 알라닌, 아스파라긴 또는 티로신으로의 돌연변이; 제436 부위의 트레오닌에서 알라닌, 세린, 글리신, 글루탐산 또는 시스테인으로의 돌연변이; 제438 부위의 류신에서 글리신, 알라닌, 티로신, 페닐알라닌 또는 세린으로의 돌연변이; 제441 부위의 세린에서 류신 및 발린으로의 돌연변이; 제493 부위의 트립토판에서 알라닌으로의 돌연변이; 제494 부위의 이소류신에서 알라닌, 메티오닌 또는 세린으로의 돌연변이 제508 부위의 페닐알라닌에서 티로신, 메티오닌 또는 아스파라긴으로의 돌연변이; 제509 부위의 티로신에서 메티오닌으로의 돌연변이; 제510 부위의 류신에서 발린으로의 돌연변이; 제511 부위의 글리신에서 류신으로의 돌연변이; 제512 부위의 글리신에서 이소류신으로의 돌연변이; 제513 부위의 류신에서 발린으로의 돌연변이이거나; 또는 상기 모노옥시게나아제 돌연변이체의 아미노산 서열은 상기 돌연변이된 아미노산 서열 중의 상기 돌연변이 부위를 구비하며, 상기 돌연변이된 아미노산 서열과 80 % 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 모노옥시게나아제 돌연변이체. - 제1항에 있어서,
상기 돌연변이는 F435A+F508Y; F435S+F508Y; L147Y+F508M; F280Y+F508M; F280Y+F508N; F435A+L510V; F435S+L510V; F435N+L510V; T436A+L510V; L438A+L510V; T436A+L438A; F435A+T436A; F435S+T436A; F435N+T436A; L146Y+F508M; L146F+F508M; F280Y+F508Y; F280Y+F508N; F435A+T436A+F508Y; F435A+T436A+F508M; F435A+T436A+L510V; F435S+T436A+L510V; T436A+L438A+F508Y; T436A+L438A+F508M; T436A+L438A+F508N; L147Y+F435A+F508M; L147Y+F435A+F508Y; L147Y+F435A+F508N; L147Y+F435S+F508Y; L147Y+F435N+F508Y; L147Y+F435S+F508Y; L147Y+F435N+F508Y; F508Y+F435A+L438A; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438A+T436A; F508Y+F435A+L438A+T436S; F508M+F435A+L438A+T436A; F508M+F435A+L438A+T436S; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280W; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280A; F508Y+F435A+L438A+T436A+S441L; F508M+F435A+L438A+T436A+F280W; F508M+F435A+L438A+T436A+F280V; F508M+F435A+L438A+T436A+S441V; F508M+F435A+L438A+T436A+S441A; F508Y+F435N+L438A+T436S; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V; F508Y+F435N+L438A+T436S+S441L; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147M+I494A; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L; F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+T61Q; F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+G145F; F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+A169K; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L+S189M; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+D60L+L332R; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+D60L+A328N; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+G430A; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147M+I494A+D60L+N432Y; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S+D60L+Y509M; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M+D60L+G512I; F508Y+F435A+L438A+W49A+D60L; F508Y+F435A+L438A+V144E; F508Y+F435A+L438A+G145F; F508Y+F435A+L438A+T436A+H167W; F508Y+F435A+L438A+T436A+A169K; F508Y+F435A+L438A+T436A+S179M; F508Y+F435A+L438A+T436A+A246V; F508Y+F435A+L438A+T436A+V247T; F508Y+F435A+L438A+T436A+F284S; F508Y+F435A+L438A+T436A+G285A; F508M+F435A+L438A+T436A+T286A; F508M+F435A+L438A+T436A+R330A; F508M+F435A+L438A+T436A+L332R; F508M+F435A+L438A+T436A+A328N; F508Y+F435A+L438A+T436S+G382A; F508Y+F435A+L438A+T436S+M427I; F508Y+F435A+L438A+T436S+V428A; F508Y+F435A+L438A+T436S+G430A; F508Y+F435A+L438A+T436S+P431A; F508Y+F435A+L438A+T436S+N432Y; F508Y+F435A+L438A+T436S+G433Y; F508Y+F435A+L438A+T436S+P434A; F508Y+F435A+L438A+T436S+Y509M; F508Y+F435A+L438A+T436S+G511L; F508Y+F435A+L438A+T436S+G512I; F508Y+F435A+L438A+T436S+L513V; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+D60L; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+D60L+P431A; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+D60L; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+L429Y+W493A+L146F+L147Y+I494S; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+D60L+L429Y+W493A+L146F+L147T+I494M; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438A+T436A; F508Y+F435A+L438A+T436S; F508M+F435A+L438A+T436A; F508M+F435A+L438A+T436S; F508Y+F435A+L438A; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438Y; F508Y+F435A+L438A+T436A; F508Y+F435A+L438A+T436S; F508M+F435A+L438A+T436A; F508M+F435A+L438A+T436S; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280W+D60L; F508Y+F435A+L438A+T436A+F280A+V247T; F508Y+F435A+L438A+T436A+S441L+F285A; F508Y+F435N+L438A+T436S+R330A; F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+G430A; F508Y+F435N+L438A+T436S+S441L+P434A; F508M+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+T286A+Y509M; F508M+F435A+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+T61Q+V247T; F508M+F435S+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V+Q60L+F287D+R330A; F508Y+F435S+L438Y+T436S+F280V+S441V+L510V+V144E+G145F+M427I; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441V+L510V+Q60L+L322R+N432Y; F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441A+L510V+R330A+P321A+G512I; 및 F508Y+F435N+L438A+T436A+F280V+S441L+L510V+T61Q+R330A+G430A 중 적어도 하나의 돌연변이 부위 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 모노옥시게나아제 돌연변이체. - 제1항 또는 제2항에 따른 모노옥시게나아제 돌연변이체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
- 제3항에 따른 DNA 분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
- 제4항에 있어서,
상기 재조합 플라스미드는 pET-22b(+), pET-22b(+), pET-3a(+), pET-3d(+), pET-11a(+), pET-12a(+), pET-14b(+), pET-15b (+), pET-16b(+), pET-17b(+), pET-19b(+), pET-20b(+), pET-21a(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-24a(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-35b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-42a(+), pET-43a(+), pET-43b(+), pET-44a(+), pET-49b(+), pQE2, pQE9, pQE30, pQE31, pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-1, pGEX-6p-1, pGEX-6p-2, pBV220, pBV221, pBV222, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18, pKK232-18, pUC-18 또는 pUC-19인 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드. - 제4항 또는 제5항에 따른 재조합 플라스미드를 함유하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제6항에 있어서,
상기 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 또는 진핵 세포를 포함하고; 바람직하게는, 상기 원핵 세포는 대장균 BL21 세포 또는 대장균 DH5α 컴피턴트 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포. - 티오에테르계 화합물 또는 케톤계 화합물의 일산소화 반응(mono-oxygenation reaction)에 대해 촉매 작용하는데 있어서의 제1항 또는 제2항에 따른 모노옥시게나아제 돌연변이체의 응용.
- 제8항에 있어서,
상기 티오에테르계 화합물은이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴을 나타내며; R1 및 R2는 단독으로 또는 양자가 서로 결합되어 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 수 있고;
바람직하게는, R1 및 R2는 탄소 원자수가 1~20인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이며, 더 바람직하게는, 탄소 원자수가 1~10인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이고;
바람직하게는, 상기 아릴은 페닐, 나프틸, 피리딜, 티에닐, 옥사디아졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 푸라닐, 피롤릴, 페녹시, 나프톡시, 피리딜옥시, 티에닐옥시, 옥사디아졸릴옥시, 이미다졸릴옥시, 티아졸릴옥시, 푸라닐옥시 및 피롤릴옥시를 포함하며;
바람직하게는, 상기 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, sec-부틸, tert-부틸, 메톡시, 에톡시, tert-부톡시, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 비닐, 알릴, 시클로펜틸 및 시클로헵틸을 포함하고;
바람직하게는, 상기 아랄킬은 벤질이며;
바람직하게는, 상기 치환은 할로겐 원자, 질소 원자, 황 원자, 히드록시, 니트로, 시아노, 메톡시, 에톡시, 카르복실, 카르복시메틸, 카르복시에틸 또는 메틸렌디옥시에 의해 치환됨을 의미하는 것을 특징으로 하는 응용. - 제8항에 있어서,
상기 케톤계 화합물은이고, R3 및 R4는 각각 독립적으로 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴을 나타내며; R3 및 R4는 단독으로 또는 양자가 서로 결합되어 치환 또는 비치환된 고리를 형성할 수 있고;
바람직하게는, R3 및 R4는 탄소 원자수가 1~20인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이며, 더 바람직하게는, 탄소 원자수가 1~10인 선택적 치환 또는 비치환된 알킬, 선택적 치환 또는 비치환된 아랄킬, 또는 선택적 치환 또는 비치환된 아릴이고;
바람직하게는, 상기 아릴은 페닐, 나프틸, 피리딜, 티에닐, 옥사디아졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 푸라닐, 피롤릴, 페녹시, 나프톡시, 피리딜옥시, 티에닐옥시, 옥사디아졸릴옥시, 이미다졸릴옥시, 티아졸릴옥시, 푸라닐옥시 및 피롤릴옥시를 포함하며;
바람직하게는, 상기 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 이소프로필, sec-부틸, tert-부틸, 메톡시, 에톡시, tert-부톡시, 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 비닐, 알릴, 시클로펜틸 및 시클로헵틸을 포함하고;
바람직하게는, 상기 아랄킬은 벤질이며;
바람직하게는, 상기 치환은 할로겐 원자, 질소 원자, 황 원자, 히드록시, 니트로, 시아노, 메톡시, 에톡시, 카르복실, 카르복시메틸, 카르복시에틸 또는 메틸렌디옥시에 의해 치환됨을 의미하는 것을 특징으로 하는 응용. - 제8항에 있어서,
상기 응용은 설로페넴 측쇄 합성（sulopenem sidechain reaction）인 것을 특징으로 하는 응용. - 제8항에 있어서,
상기 모노옥시게나아제는 제1항 또는 제2항에 따른 모노옥시게나아제 돌연변이체의 용액, 동결건조 분말, 고정화 효소 또는 고정화 세포인 것을 특징으로 하는 응용. - 제8항에 있어서,
상기 일산소화 반응의 반응계는 보조 인자를 더 포함하고, 상기 보조 인자는 NAD+/NADH 및/또는 NADP+/NADPH이며, 보조 인자 순환 시스템은 글루코스 및 글루코스 탈수소 효소, 포름산염 및 포름산 탈수소 효소, 글루코스-6-인산 및 글루코스-6-인산 탈수소 효소, 또는 이차 알코올 및 이차 알코올 탈수소 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 응용. - 제8항에 있어서,
상기 일산소화 반응의 온도는 10 ~ 37℃이고, 바람직하게는 15 ~ 35℃인 것을 특징으로 하는 응용. - 제8항에 있어서,
상기 일산소화 반응의 시간은 3 ~ 48시간이고, 더 바람직하게는 6 ~ 16시간인 것을 특징으로 하는 응용. - 제8항에 있어서,
상기 일산소화 반응은 pH가 5.0 ~ 10.0인 조건에서 진행되고, 바람직하게는 pH가 6.0 ~ 9.0인 것을 특징으로 하는 응용.
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