KR20230145092A - 에스테라아제 돌연변이체 및 이의 응용 - Google Patents
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Abstract
에스테라아제 돌연변이체 및 이의 응용이 제공된다. 상기 에스테라아제 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 서열을 가지며, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 N51G 부위를 포함한다. 상기 에스테라아제 돌연변이체는 단백질 구조 및 기능의 변화를 구현하여 효소 특이성과 효소 활성을 모두 향상시키고, 효소의 사용량을 저감하며, 산업 생산 비용을 절감한다.
Description
본 발명은 생명공학 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로는 에스테라아제 돌연변이체 및 이의 응용에 관한 것이다.
의약, 농약 및 기타 정밀 화학 산업의 발전으로 유기 합성은 점점 더 많은 도전에 직면하고 있다. 첫째, 생물체 내의 키랄 인식 능력으로 인해 종종 약물 분자 중 하나의 입체 이성질체만이 치료 작용이 있는 반면 다른 입체 이성질체는 치료 작용이 없거나 심지어 부작용이 있다. 둘째, 의약 제품 등 소규모 생산 뱃치(batch), 고부가가치 제품은 구조적 복잡성과 다양성을 가지고 있으며, 생산 공정이 화학적 및 위치 선택적이면 불필요한 보호 및 탈보호 단계를 피할 수 있어(기존의 유기 합성에서는 일반적으로 보호 및 탈보호 단계를 도입하여 반응의 화학적 및 위치 선택적 특성의 부족을 보완함), 생산 공정을 크게 최적화함으로써 생산 비용을 절감할 수 있다. 따라서, 새로운 유기 합성 기술은 높은 화학 선택성, 위치 선택성, 및 입체 선택성, 온화한 반응 조건, 반응 매체 및 후처리로 인한 환경 오염 저감과 같은 특징을 가져야 한다. 생체 촉매 반응 기술은 바로 이러한 특징을 가지고 있으며, 생체 촉매 반응 조건은 온화하며 일반적으로 중성 및 실온, 또는 이러한 조건에 가까운 조건에서 수행되고; 대부분의 경우 생체 촉매 반응은 수상에서 수행되므로 환경 오염이 적으며; 생체 촉매 반응은 일반적으로 화학 선택성, 위치 선택성, 입체 선택성이 높은 특징을 갖는다. 따라서 생체 촉매 반응 기술을 유기 합성에 적용하는 것은 매우 큰 과학적 의의와 실용적인 응용 가치를 갖는다.
에스테라아제는 에스테르 결합을 가수분해하는 능력을 갖는 효소 종류의 총칭으로 동물, 식물, 미생물에 널리 존재하며 유기 합성에 널리 적용되는 가수분해 효소의 일종이고, 또한 유전 공학에서 가장 많이 연구된 효소 종류이며 8개의 계열로 나뉜다. 작용 기질의 종류에 따라 카르복실레이트, 티오에스테르, 포스포모노에스테르, 포스포디에스테르, 인지질 황산염, 황산염으로 나뉜다. 상이한 유래의 에스테라아제는 상이한 촉매화 특징과 촉매화 활성을 갖는다.
특허(CN 105802935 B)에서는, 심해 샘플로부터 슈도모나다세아에 오리지하비탄스(Pseudomonadaceae oryzihabitans) 균주를 스크리닝하여, 에스테라아제 유전자 PHE14를 얻었고, 발현 벡터를 구축하고 발현 균주에 형질전환시켜 키랄 메틸 락테이트 제조에 사용할 수 있는 재조합 발현 에스테라아제 PHE14를 얻었으며; 특허(CN 104988165 B)에서는, 심해 슬러지로부터 에스테라아제 유전자 est4를 추출하고, 상기 에스테라아제 유전자 est4를 함유하는 유전자 조작된 균주를 구축하여 상기 유전자 est4의 이종 발현을 구현하였으며, 다양한 단쇄 테르펜 에스테르의 합성과 다양한 방향족 2차 알코올의 동력학적 분할(Kinetic resolution)을 촉매화하는데 성공적으로 사용하였다.
야생형 생체 촉매는 일반적으로 천연 기질에 대해 우수한 반응 활성 및 선택성을 갖지만, 비천연 기질에 대한 반응 활성, 안정성, 및 선택성은 종종 만족스럽지 않다. 유기 합성에 생체 촉매를 적용할 때 대부분은 비천연 기질인데, 일반적으로 유도 진화 방법을 통해 야생형 효소를 변형시켜 비천연 기질에 대한 반응 활성, 안정성, 선택성(화학 선택성, 위치 선택성, 입체 선택성을 포함)을 향상시킬 수 있으므로 생산에 적용할 수 있다.
본 발명의 목적은 효소의 특이성을 향상시키기 위한 에스테라아제 돌연변이체 및 이의 응용을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, 에스테라아제 돌연변이체가 제공된다. 상기 에스테라아제 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 아미노산 돌연변이가 발생한 서열을 가지며, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 N51G 부위를 포함한다.
또한, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 N51G, M52F/L/N/Y/G/W, W115P, T117L/M/F/W/A/I, S140A/G/N/C/T/V/L/P, A142V/L/P/S, V167M, I195L/F/T/V, W196I/L/V, D217M/Q/A/S/G, L231T/I, V267E/C/I/V, 및 S295T/A/Y/F/M/N 중 어느 하나 또는 다수를 더 포함하고, 여기서 "/"는 "또는"을 의미한다.
또한, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 N51G+T117M+S140G, N51G+T117M+S140N, N51G+T117M+S140C, N51G+T117M+S140T, N51G+T117M+S140A, N51G+T117M+A142V, N51G+T117M+A142P, N51G+T117M+A142S, N51G+T117M+A142L, N51G+T117M+D217Q, N51G+T117M+D217A, N51G+T117M+D217S, N51G+T117M+D217G, N51G+T117M+L231I, N51G+T117M+S140C+M52F, N51G+T117M+S140C+M52L, N51G+T117M+S140C+M52N, N51G+T117M+S140C+M52Y, N51G+T117M+S140C+M52G, N51G+T117M+S140C+M52W, N51G+T117M+S140C+I195F, N51G+T117M+S140C+I195L, N51G+T117M+S140C+I195T, N51G+T117M+S140C+I195V, N51G+T117M+S140C+D217S, N51G+T117M+S140C+L231I, N51G+T117M+S140C+V267I, N51G+T117M+S140C+I268V, N51G+T117M+S140C+S295F, N51G+T117M+S140C+S295M, N51G+T117M+S140C+S295N, N51G+T117M+S140C+S295G, N51G+T117M+S140C+S295D 중 어느 하나의 돌연변이 부위의 조합을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, DNA 분자가 제공된다. 상기 DNA 분자는 상기 에스테라아제 돌연변이체를 코딩한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 재조합 플라스미드가 제공된다. 상기 재조합 플라스미드에는 상기 DNA 분자 중 어느 하나가 연결된다.
또한, 재조합 플라스미드는 pET-22a(+), pET-22b(+), pET-3a(+), pET-3d(+), pET-11a(+), pET-12a(+), pET-14b, pET-15b(+), pET-16b(+), pET-17b(+), pET-19b(+), pET-20b(+), pET-21a(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-24a(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-35b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-42a(+), pET-43a(+), pET-43b(+), pET-44a(+), pET-49b(+), pQE2, pQE9, pQE30, pQE31, pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-1, pGEX-6p-1, pGEX-6p-2, pBV220, pBV221, pBV222, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18, pKK232-8, pUC-18, 또는 pUC-19이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 숙주 세포가 제공된다. 상기 숙주 세포는 상기 재조합 플라스미드 중 어느 하나를 함유한다.
또한, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함하고; 바람직하게는, 원핵 세포는 대장균 BL21 세포 또는 대장균 DH5α 컴피턴트 세포이며, 진핵 세포는 효모이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 키랄산의 생산 방법이 제공된다. 상기 방법은 에스테라아제를 사용하여 에스테르계 화합물에 대해 촉매 반응을 수행하는 단계를 포함하고, 에스테라아제는 상기 에스테라아제 돌연변이체 중 어느 하나이다.
또한, 에스테르계 화합물은 이고, 반응 생성물은 이되, R1은 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 또는 -CHCH3CH3을 나타내고; R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로 -H, -F, -Cl, -Br, -CH3, 또는 -CH2CH3을 나타내며; 바람직하게는, 에스테르계 화합물은 , , , , 또는 이다.
또한, 에스테라아제 돌연변이체의 촉매 반응의 pH는 8.5 ~ 9.0이고, 반응 온도는 30 ~ 35℃이다.
본 발명의 에스테라아제 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 에스테라아제를 기반으로 부위 특이적 돌연변이 유발(site-directed mutation) 방법에 의해 돌연변이를 일으킴으로써, 그 아미노산 서열을 변화시켜 단백질 구조 및 기능의 변화를 구현하고, 방향성 스크리닝 방법에 의해 상기 돌연변이 부위를 갖는 에스테라아제를 얻을 수 있으므로, 이러한 에스테라아제 돌연변이체는 효소 특이성이 크게 향상된 장점이 있으며, 효소 활성도 상응하게 향상시킴으로써, 효소의 사용량을 크게 저감하고, 산업 생산 비용을 절감할 수 있다.
여기서, 모순되지 않는 한, 본 발명의 실시형태 및 실시형태의 특징은 서로 결합될 수 있다. 이하, 실시형태와 함께 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 유도 진화 방법을 통해 에스테라아제의 특이성을 향상시키고, 에스테라아제의 사용량을 저감한다. 본 발명의 주형 아미노산의 서열(Bacillus sp.01-855로부터 유래되고, NCBI 서열번호는 AY640622이며, 웹 사이트 주소는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY640622임)은 서열번호 1(MGSNNDNMGKRGGNLMITIPT VHKVSLPNGEVMGYRKRDGGEKTILLVHGNMTSSKHWDLFFETFPASYTLVAIDMRGFGESSYNKRVEGIEDFAQDLKFFVDQLGLNDFTMIGWSTGGAVCMQFEAQYPGYCDKIVLISSASTRGYPFFGTHSDGTPDLNQRLKTVDDIEKDPMRTIPIQQAYDTGNRALLKTIWNSLIYTHNQPEEKRYEAYVDDMMTQRNLADVYHALNTFNISSVTNGLTEGTNQANLIRIPVLVLRGERDLVISKEMTEEIVEDLGTNSTYKELSASGHSPFIDDCDQLTNIITDFLEK)이고, 대응되는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2(ATGGGCAGCAATAACGACAACATGGGTAAACGTGGCGGCAACCTGA TGATCACCATCCCGACAGTGCATAAAGTGAGCCTGCCGAATGGCGAAGTGATGGGTTATCGTAAGCGCGACGGCGGTGAAAAAACCATCCTGCTGGTGCACGGCAACATGACCAGCAGCAAACATTGGGACCTGTTCTTCGAGACCTTTCCGGCAAGCTATACACTGGTGGCCATCGATATGCGCGGCTTCGGCGAAAGCAGCTATAACAAACGCGTGGAAGGCATCGAGGACTTTGCCCAGGACCTGAAATTCTTCGTGGATCAGCTGGGCCTGAACGATTTCACCATGATCGGTTGGAGCACAGGCGGCGCCGTGTGTATGCAGTTTGAAGCCCAGTATCCGGGCTACTGCGACAAGATTGTGCTGATTAGCAGCGCAAGCACCCGTGGCTATCCGTTTTTTGGTACCCACAGCGATGGCACCCCGGATCTGAATCAGCGCCTGAAGACCGTGGACGACATCGAAAAAGATCCTATGCGCACCATTCCGATCCAGCAGGCCTACGATACCGGTAACCGCGCCCTGCTGAAAACCATCTGGAATAGCCTGATTTACACCCACAACCAGCCGGAGGAAAAGCGCTATGAGGCCTATGTGGACGACATGATGACCCAGCGTAATCTGGCCGATGTGTATCACGCCCTGAACACATTCAACATTAGCAGCGTGACCAACGGCCTGACCGAGGGCACCAATCAGGCCAACCTGATCCGCATCCCTGTGCTGGTTCTGCGCGGCGAACGCGACCTGGTGATCAGCAAAGAGATGACCGAGGAGATCGTGGAGGATCTGGGCACCAACAGCACCTATAAAGAGCTGAGCGCCAGCGGCCACAGCCCTTTTATCGATGATTGCGACCAGCTGACCAACATCATCACCGATTTTCTGGAGAAATAA)이다.
먼저, 부위 특이적 돌연변이 유발 방식을 통해 에스테라아제에 돌연변이 부위를 도입하고, 돌연변이체의 특이성을 검출하여 특이성이 향상된 돌연변이체를 선별하였다. 여기서 돌연변이체 N51G의 특이성은 출발 주형에 비해 크게 향상되었다. 그 다음, 촉매화 활성이 향상된 돌연변이체를 얻기 위해 N51G를 주형으로 하여 돌연변이를 계속 진행하였다.
여기서, 부위 특이적 돌연변이 유발은 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 등의 방법을 통해 표적 DNA 단편(게놈 또는 플라스미드일 수 있음)에 필요한 변화(일반적으로 유리한 방향을 나타내는 변화)를 도입하는 것을 의미하며, 염기 추가, 삭제, 및 점 돌연변이 등을 포함한다. 부위 특이적 돌연변이 유발은 DNA에 의해 발현되는 표적 단백질의 성질 및 특성을 신속하고 효율적으로 향상시킬 수 있으며 유전자 연구에 매우 유용한 방법이다.
전체 플라스미드 PCR을 이용하여 부위 특이적 돌연변이 유발을 도입하는 방법은 간단하고 효과적이며, 현재 상대적으로 많이 사용되고 있는 방법이다. 그 원리는 돌연변이 부위를 포함하는 한 쌍의 프라이머(정방향 및 역방향)가 주형 플라스미드에 어닐링된 다음 중합 효소로 "순환 연장"되는 것이다. 여기서 순환 연장이란 중합 효소가 주형에 따라 프라이머를 한 번 연장한 후 프라이머 5' 말단으로 돌아가 종료한 다음, 가열, 어닐링, 연장의 순환을 반복하는 것을 의미하며, 이 반응은 회전환 증폭(rolling circle amplification)과 달리 종열 중복(multiple tandem copies)이 형성되지 않는다. 정방향 및 역방향 프라이머의 연장 생성물은 어닐링된 후 쌍을 이루어 닉(nick)이 있는 고리열림 플라스미드를 형성한다. Dpn I 효소 절단(Enzyme digestion) 연장 생성물은 원래의 주형 플라스미드가 통상적인 대장균으로부터 유래되었기 때문에 dam 메틸화에 의해 변형되어 Dpn I에 민감하여 절단되는 반면, 체외(in vitro)에서 합성된 돌연변이 서열을 갖는 플라스미드는 메틸화를 거치지 않았기에 절단되지 않으므로, 후속 형질전환에서 성공적으로 형질전환될 수 있고, 돌연변이 플라스미드의 클론을 얻을 수 있다. 돌연변이 플라스미드를 대장균 세포에 형질전환시킨 후 세포를 초음파로 파쇄하여 조효소(Crude Enzyme)를 얻었다.
상기 돌연변이 플라스미드는 대장균 세포에 형질전환된 후 대장균에서 과발현된다. 그 다음, 세포를 초음파로 파쇄하는 방법으로 조효소를 얻었다. 에스테라아제의 발현을 유도하는 최적 조건은 25℃ 및 0.1mM IPTG에서 16시간 동안 유도하는 것이다.
소프트웨어를 이용한 에스테라아제의 3차원 구조에 대한 컴퓨터 시뮬레이션 분석을 통해, 돌연변이된 부위가 기질 결합 부위 근처에 위치하고 돌연변이 후 기질과 효소의 결합이 강화될 수 있어 촉매화 효율이 향상됨을 발견하였다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, 에스테라아제 돌연변이체가 제공된다. 상기 에스테라아제 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 서열에서 아미노산 돌연변이가 발생한 서열을 가지며, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 N51G 부위를 포함한다.
바람직하게는, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 N51G, M52F/L/N/Y/G/W, W115P, T117L/M/F/W/A/I, S140A/G/N/C/T/V/L/P, A142V/L/P/S, V167M, I195L/F/T/V, W196I/L/V, D217M/Q/A/S/G, L231T/I, V267E/C/I/V, 및 S295T/A/Y/F/M/N 중 어느 하나 또는 다수를 더 포함하고, 여기서 "/"는 "또는"을 의미한다.
보다 바람직하게는, 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 N51G+T117M+S140G, N51G+T117M+S140N, N51G+T117M+S140C, N51G+T117M+S140T, N51G+T117M+S140A, N51G+T117M+A142V, N51G+T117M+A142P, N51G+T117M+A142S, N51G+T117M+A142L, N51G+T117M+D217Q, N51G+T117M+D217A, N51G+T117M+D217S, N51G+T117M+D217G, N51G+T117M+L231I, N51G+T117M+S140C+M52F, N51G+T117M+S140C+M52L, N51G+T117M+S140C+M52N, N51G+T117M+S140C+M52Y, N51G+T117M+S140C+M52G, N51G+T117M+S140C+M52W, N51G+T117M+S140C+I195F, N51G+T117M+S140C+I195L, N51G+T117M+S140C+I195T, N51G+T117M+S140C+I195V, N51G+T117M+S140C+D217S, N51G+T117M+S140C+L231I, N51G+T117M+S140C+V267I, N51G+T117M+S140C+I268V, N51G+T117M+S140C+S295F, N51G+T117M+S140C+S295M, N51G+T117M+S140C+S295N, N51G+T117M+S140C+S295G, N51G+T117M+S140C+S295D 중 어느 하나의 돌연변이 부위의 조합을 포함한다.
본 발명의 에스테라아제 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 에스테라아제를 기반으로 부위 특이적 돌연변이 유발 방법에 의해 돌연변이를 일으킴으로써, 그 아미노산 서열을 변화시켜 단백질 구조 및 기능의 변화를 구현하고, 방향성 스크리닝 방법에 의해 상기 돌연변이 부위를 갖는 에스테라아제를 얻을 수 있으므로, 이러한 에스테라아제 돌연변이체는 효소 특이성이 크게 향상된 장점이 있으며, 효소 활성도 상응하게 향상시킴으로써, 효소의 사용량을 크게 저감하고, 산업 생산 비용을 절감할 수 있다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, DNA 분자가 제공된다. 상기 DNA에 의해 코딩되어 얻은 에스테라아제는 효소 활성 및 효소의 안정성이 향상되어 있고, 아미노산의 산업적 생산에서 첨가되는 효소의 양을 저감할 수 있으며, 후처리의 난이도를 경감할 수 있다.
본 발명의 상기 DNA 분자는 또한 "발현 카세트"의 형태로 존재할 수 있다. "발현 카세트"는 선형 또는 원형 핵산 분자를 의미하며, 적절한 숙주 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 DNA 및 RNA 서열을 포함한다. 일반적으로, 표적 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하고, 이는 선택적으로 종결 신호 및/또는 다른 조절 요소에 작동 가능하게 연결된다. 발현 카세트는 뉴클레오티드 서열의 정확한 번역에 필요한 서열을 더 포함할 수 있다. 코딩 영역은 일반적으로 표적 단백질을 코딩하지만 센스 또는 안티센스 방향에서 예를 들어 안티센스 RNA 또는 번역되지 않은 RNA와 같은 표적 기능 RNA도 코딩한다. 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라(chimera)일 수 있는데, 이는 그의 조성 성분 중 적어도 하나가 그의 다른 조성 성분 중 적어도 하나와 이종임을 의미한다. 발현 카세트는 또한 자연 발생적일 수 있지만 이종 발현을 위한 효과적인 재조합 형성에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, 재조합 플라스미드가 제공된다. 상기 재조합 플라스미드는 상기 DNA 분자 중 어느 하나를 함유한다. 상기 재조합 플라스미드의 DNA 분자는 재조합 플라스미드의 적절한 위치에 배치되어 상기 DNA 분자가 정확하고 원활하게 복제, 전사, 또는 발현될 수 있도록 한다.
본 발명에서 상기 DNA 분자를 한정할 때 사용한 한정 용어가 "함유"이지만, 그 기능과 무관한 다른 서열이 DNA 서열의 양 말단에 임의로 부가될 수 있음을 의미하는 것은 아니다. 통상의 기술자라면 재조합 작업의 요구 사항을 충족시키기 위해 DNA 서열의 양 말단에 적절한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 추가하거나, 개시 코돈, 종결 코돈 등을 별도로 추가할 필요가 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서 폐쇄형 표현을 사용하여 한정하면 이러한 상황을 사실대로 커버할 수 없다.
본 발명에서 사용되는 용어 "플라스미드"는 이중 가닥 또는 단일 가닥의 선형 또는 원형 형태의 임의의 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 또는 아그로박테리움 이원 핵산 분자를 포함하고, 바람직하게는 재조합 발현 플라스미드를 포함하며, 이는 원핵 발현 플라스미드 또는 진핵 발현 플라스미드일 수 있지만, 바람직하게는 원핵 발현 플라스미드이고, 일부 실시형태에서, 재조합 플라스미드는 pET-22a(+), pET-22b(+), pET-3a(+), pET-3d(+), pET-11a(+), pET-12a(+), pET-14b, pET-15b(+), pET-16b(+), pET-17b(+), pET-19b(+), pET-20b(+), pET-21a(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-24a(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-35b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-42a(+), pET-43a(+), pET-43b(+), pET-44a(+), pET-49b(+), pQE2, pQE9, pQE30, pQE31, pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-1, pGEX-6p-1, pGEX-6p-2, pBV220, pBV221, pBV222, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18, pKK232-8, pUC-18, 또는 pUC-19로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 재조합 플라스미드는 pET-22b(+)이다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, 상기 재조합 플라스미드 중 어느 하나를 함유하는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명에 적용되는 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 원핵 세포는 대장균 BL21 세포 또는 대장균 DH5α 컴피턴트 세포이고, 진핵 세포는 효모이다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, 키랄산의 생산 방법이 제공된다. 상기 방법은 에스테라아제를 사용하여 에스테르계 화합물에 대해 촉매 반응을 수행하는 단계를 포함하고, 에스테라아제는 상기 에스테라아제 돌연변이체 중 어느 하나이다. 본 발명의 상기 에스테라아제는 특이성이 더욱 우수하고 심지어 효소의 촉매화 활성이 더욱 높기 때문에 본 발명의 에스테라아제 돌연변이체를 이용하여 키랄산을 제조하면 생산 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 얻어지는 아미노산의 ee값이 더욱 높다.
본 발명의 전형적인 실시형태에 따르면, 에스테르계 화합물은 이고, 반응 생성물은 이되, R1은 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 또는 -CHCH3CH3을 나타내고; R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로 -H, -F, -Cl, -Br, -CH3, 및 -CH2CH3 중 적어도 하나로 치환됨을 의미하며;
바람직하게는, 에스테르계 화합물은 , , , , 또는 이다.
바람직하게는, 에스테라아제 돌연변이체에 의한 촉매 반응의 pH 범위는 8.5 ~ 9.0이고, 반응 온도는 30 ~ 35℃이다.
이하, 구체적인 실시예와 함께 본 발명의 유익한 효과를 진일보로 설명한다.
실시예 1
20mg의 기질 1, 2mg의 에스테라아제, 0.3M pH 7.5 인산칼륨 완충액을 1mL의 반응 시스템에 넣었다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 1mL의 반응 시스템에 50μL의 6M HCl을 첨가하여 pH를 2 ~ 3으로 조절하고, 균일하게 혼합한 후 2mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 충분히 진탕한 후, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 적당량의 무수황산마그네슘을 첨가하고, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 기상 검출을 수행하여 전환율과 e.e.값을 검출하였으며, 기질 2 및 기질 3은 기질 1에 대한 설명과 같이, 동일한 시스템의 반응 및 처리 방식을 적용하였다. 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다.
| 효소 | 기질 1 | 기질 2 | 기질 3 | |||
| 활성 | e.e.(%) | 활성 | e.e.(%) | 활성 | e.e.(%) | |
| WT | -14.0 | -30 | -25 | |||
| N51G | - | *** | - | ** | + | *** |
| N51G+W115P | - | ** | - | ** | + | ** |
| N51G+T117L | + | *** | + | *** | + | ** |
| N51G+T117M | ++ | **** | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117F | - | *** | -- | *** | -- | * |
| N51G+T117W | - | *** | - | ** | - | *** |
| N51G+T117A | ++ | *** | + | * | + | *** |
| N51G+T117I | + | *** | - | *** | - | ** |
| N51G+A142V | +++ | *** | + | ** | - | *** |
| N51G+V167M | + | * | - | * | - | ** |
| N51G+W196I | - | ** | + | * | + | ** |
| N51G+W196L | + | *** | - | *** | - | ** |
| N51G+W196V | - | ** | + | ** | ++ | ** |
| N51G+D217M | + | ** | + | ** | + | ** |
| N51G+L231T | ++ | *** | - | ** | - | *** |
| N51G+L231I | + | *** | - | *** | - | ** |
| N51G+V267E | - | ** | + | ** | + | ** |
| N51G+V267C | ++ | ** | + | * | ++ | ** |
| N51G+S295T | + | ** | + | ** | + | ** |
| N51G+S295A | + | *** | ++ | *** | ++ | ** |
| N51G+S295Y | + | ** | + | ** | + | *** |
| N51G+S295F | + | ** | + | *** | + | ** |
모체(female parent)에 비한 활성의 감소 및 증가 배수에 있어서, ---는 10 ~ 50배 감소, --는 5 ~ 10배 감소, -는 1 ~ 5배 감소, +는 1 ~ 5배 증가, ++는 5 ~ 10배 증가, +++는 10 ~ 50배 증가, ++++는 50배 초과 증가를 나타낸다.
ee값이 0% 미만이면 *로, ee값이 0 ~ 50%이면 **로, ee값이 50 ~ 95%이면 ***로, ee값이 95% 초과이면 ****로 표시된다.
실시예 2
20mg의 기질 4, 2mg의 에스테라아제, 0.3M pH 7.5 인산칼륨 완충액을 1mL의 반응 시스템에 넣었다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 1mL의 반응 시스템에 50μL의 6M HCl을 첨가하여 pH를 2 ~ 3으로 조절하고, 균일하게 혼합한 후 2mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 충분히 진탕한 후, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 적당량의 무수황산마그네슘을 첨가하고, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 기상 검출을 수행하여 전환율과 e.e.값을 검출하였으며, 기질 5는 기질 4에 대한 설명과 같이, 동일한 시스템의 반응 및 처리 방식을 적용하였다. 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.
| 효소 | 기질 4 | 기질 5 | ||
| 활성 | e.e.(%) | 활성 | e.e.(%) | |
| WT | -20.0 | -10 | ||
| N51G | - | *** | - | ** |
| N51G+W115P | - | * | + | ** |
| N51G+T117L | + | *** | ++ | ** |
| N51G+T117M | ++ | **** | + | **** |
| N51G+T117F | - | *** | - | *** |
| N51G+T117W | - | *** | - | ** |
| N51G+T117A | ++ | ** | + | *** |
| N51G+T117I | + | *** | + | *** |
| N51G+A142V | +++ | *** | ++ | ** |
| N51G+V167M | + | ** | + | ** |
| N51G+W196I | - | ** | - | *** |
| N51G+W196L | + | *** | + | ** |
| N51G+W196V | - | ** | - | ** |
| N51G+D217M | + | ** | ++ | *** |
| N51G+L231T | ++ | *** | + | ** |
| N51G+L231I | + | *** | + | ** |
| N51G+V267E | - | ** | - | *** |
| N51G+V267C | ++ | ** | + | ** |
| N51G+S295T | + | ** | ++ | *** |
| N51G+S295A | + | *** | + | ** |
| N51G+S295Y | + | ** | ++ | ** |
| N51G+S295F | + | ** | + | *** |
모체에 비한 활성의 감소 및 증가 배수에 있어서, ---는 10 ~ 50배 감소, --는 5 ~ 10배 감소, -는 1 ~ 5배 감소, +는 1 ~ 5배 증가, ++는 5 ~ 10배 증가, +++는 10 ~ 50배 증가, ++++는 50배 초과 증가를 나타낸다.
ee값이 0% 미만이면 *로, ee값이 0 ~ 50%이면 **로, ee값이 50 ~ 95%이면 ***로, ee값이 95% 초과이면 ****로 표시된다.
돌연변이를 계속 수행하여 생성물의 ee값을 높이고 기질 농도를 높이며 반응 부피를 감소시켰다.
실시예 3
33mg의 기질 1, 3.3mg의 에스테라아제, 50μL의 N,N-디메틸포름아미드, 0.3M Tris-HCl pH 8.5 완충액을 1mL의 반응 시스템에 넣었다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 1mL의 반응 시스템에 50μL의 6M HCl을 첨가하여 pH를 2~3으로 조절하고, 균일하게 혼합한 후 2mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 충분히 진탕한 후, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 적당량의 무수황산마그네슘을 첨가하고, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 기상 검출을 수행하여 전환율과 e.e.값을 검출하였으며, 기질 2 및 기질 3은 기질 1에 대한 설명과 같이, 동일한 시스템의 반응 및 처리 방식을 적용하였다. 결과는 표 3에 나타낸 바와 같다.
| 효소 | 기질 1 | 기질 2 | 기질 3 | |||
| 활성 | e.e.(%) | 활성 | e.e.(%) | 활성 | e.e.(%) | |
| N51G+T117M+S140G | ++ | *** | +++ | *** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140N | ++ | *** | +++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C | +++ | **** | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140T | + | *** | + | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140A | ++ | *** | ++ | *** | + | *** |
| N51G+T117M+A142V | + | **** | ++ | **** | + | **** |
| N51G+T117M+A142P | + | **** | + | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+A142S | + | **** | + | *** | + | *** |
| N51G+T117M+A142L | + | *** | ++ | *** | + | *** |
| N51G+T117M+D217Q | + | **** | + | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+D217A | ++ | *** | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+D217S | ++ | **** | + | **** | ++ | *** |
| N51G+T117M+D217G | - | *** | - | *** | + | *** |
| N51G+T117M+L231I | + | *** | ++ | *** | + | *** |
모체에 비한 활성의 감소 및 증가 배수에 있어서, ---는 10 ~ 50배 감소, --는 5 ~ 10배 감소, -는 1 ~ 5배 감소, +는 1 ~ 5배 증가, ++는 5 ~ 10배 증가, +++는 10 ~ 50배 증가, ++++는 50배 초과 증가를 나타낸다.
ee값이 0% 미만이면 *로, ee값이 0 ~ 50%이면 **로, ee값이 50 ~ 95%이면 ***로, ee값이 95% 초과이면 ****로 표시된다.
실시예 4
33mg의 기질 4, 3.3mg의 에스테라아제, 50μL의 N,N-디메틸포름아미드, 0.3M Tris-HCl pH 8.5 완충액을 1mL의 반응 시스템에 넣었다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 1mL의 반응 시스템에 50μL의 6M HCl을 첨가하여 pH를 2 ~ 3으로 조절하고, 균일하게 혼합한 후 2mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 충분히 진탕한 후, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 적당량의 무수황산마그네슘을 첨가하고, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 기상 검출을 수행하여 전환율과 e.e.값을 검출하였으며, 기질 5는 기질 4에 대한 설명과 같이, 동일한 시스템의 반응 및 처리 방식을 적용하였다. 결과는 표 4에 나타낸 바와 같다.
| 효소 | 기질 4 | 기질 5 | ||
| 활성 | e.e.(%) | 활성 | e.e.(%) | |
| N51G+T117M+S140G | ++ | *** | +++ | *** |
| N51G+T117M+S140N | + | **** | ++ | *** |
| N51G+T117M+S140C | +++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140T | + | **** | + | *** |
| N51G+T117M+S140A | +++ | **** | ++ | *** |
| N51G+T117M+A142V | + | **** | + | **** |
| N51G+T117M+A142P | + | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+A142S | + | *** | + | **** |
| N51G+T117M+A142L | ++ | *** | + | *** |
| N51G+T117M+D217Q | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+D217A | ++ | **** | + | **** |
| N51G+T117M+D217S | ++ | **** | ++ | *** |
| N51G+T117M+D217G | + | *** | - | *** |
| N51G+T117M+L231I | + | *** | + | *** |
모체에 비한 활성의 감소 및 증가 배수에 있어서, ---는 10 ~ 50배 감소, --는 5 ~ 10배 감소, -는 1 ~ 5배 감소, +는 1 ~ 5배 증가, ++는 5 ~ 10배 증가, +++는 10 ~ 50배 증가, ++++는 50배 초과 증가를 나타낸다.
ee값이 0% 미만이면 *로, ee값이 0 ~ 50%이면 **로, ee값이 50 ~ 95%이면 ***로, ee값이 95% 초과이면 ****로 표시된다.
유익한 돌연변이 부위를 추가로 조합하여 기질 농도를 더욱 높이고 반응 부피를 감소시켰다.
실시예 5
50mg의 기질 1, 5mg의 에스테라아제, 50μL의 N,N-디메틸포름아미드, 0.3M Tris-HCl pH 8.5 완충액을 1mL의 반응 시스템에 넣었다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 1mL의 반응 시스템에 50μL의 6M HCl을 첨가하여 pH를 2 ~ 3으로 조절하고, 균일하게 혼합한 후 2mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 충분히 진탕한 후, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 적당량의 무수황산마그네슘을 첨가하고, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 기상 검출을 수행하여 전환율과 e.e.값을 검출하였으며, 기질 2 및 기질 3은 기질 1에 대한 설명과 같이, 동일한 시스템의 반응 및 처리 방식을 적용하였다. 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다.
| 효소 | 기질 1 | 기질 2 | 기질 3 | |||
| 활성 | e.e.(%) | 활성 | e.e.(%) | 활성 | e.e.(%) | |
| N51G+T117M+S140C+M52F | ++ | *** | ++ | *** | ++ | *** |
| N51G+T117M+S140C+M52L | +++ | *** | +++ | **** | ++ | *** |
| N51G+T117M+S140C+M52N | ++ | **** | + | **** | + | *** |
| N51G+T117M+S140C+M52Y | + | **** | + | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+M52G | + | **** | ++ | **** | + | **** |
| N51G+T117M+S140C+M52W | +++ | **** | ++ | *** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+I195F | ++ | **** | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+I195L | +++ | **** | ++ | **** | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+I195T | + | **** | + | **** | + | **** |
| N51G+T117M+S140C+I195V | ++ | *** | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+D217S | +++ | **** | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+L231I | + | **** | + | **** | + | *** |
| N51G+T117M+S140C+V267I | + | **** | + | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+I268V | + | *** | ++ | *** | + | *** |
| N51G+T117M+S140C+S295F | +++ | **** | +++ | **** | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295M | ++ | *** | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | +++ | **** | ++ | **** | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295G | +++ | **** | ++ | **** | ++ | *** |
| N51G+T117M+S140C+S295D | ++ | **** | ++ | **** | +++ | **** |
모체에 비한 활성의 감소 및 증가 배수에 있어서, ---는 10 ~ 50배 감소, --는 5 ~ 10배 감소, -는 1 ~ 5배 감소, +는 1 ~ 5배 증가, ++는 5 ~ 10배 증가, +++는 10 ~ 50배 증가, ++++는 50배 초과 증가를 나타낸다.
ee값이 0% 미만이면 *로, ee값이 0 ~ 50%이면 **로, ee값이 50 ~ 95%이면 ***로, ee값이 95% 초과이면 ****로 표시된다.
실시예 6
50mg의 기질 4, 5mg의 에스테라아제, 50μL의 N,N-디메틸포름아미드, 0.3M Tris-HCl pH 8.5 완충액을 1mL의 반응 시스템에 넣었다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 1mL의 반응 시스템에 50μL의 6M HCl을 첨가하여 pH를 2 ~ 3으로 조절하고, 균일하게 혼합한 후 2mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 충분히 진탕한 후, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 적당량의 무수황산마그네슘을 첨가하고, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 기상 검출을 수행하여 전환율과 e.e.값을 검출하였으며, 기질 5는 기질 4에 대한 설명과 같이, 동일한 시스템의 반응 및 처리 방식을 적용하였다. 결과는 표 6에 나타낸 바와 같다.
| 효소 | 기질 4 | 기질 5 | ||
| 활성 | e.e.(%) | 활성 | e.e.(%) | |
| N51G+T117M+S140C+M52F | ++ | *** | ++ | *** |
| N51G+T117M+S140C+M52L | ++ | *** | + | *** |
| N51G+T117M+S140C+M52N | ++ | **** | + | **** |
| N51G+T117M+S140C+M52Y | + | *** | + | **** |
| N51G+T117M+S140C+M52G | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+M52W | ++ | **** | +++ | *** |
| N51G+T117M+S140C+I195F | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+I195L | +++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+I195T | + | **** | + | **** |
| N51G+T117M+S140C+I195V | +++ | **** | +++ | *** |
| N51G+T117M+S140C+D217S | ++ | **** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+L231I | ++ | *** | + | **** |
| N51G+T117M+S140C+V267I | + | **** | + | **** |
| N51G+T117M+S140C+I268V | + | *** | ++ | *** |
| N51G+T117M+S140C+S295F | ++ | **** | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295M | ++ | **** | +++ | *** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | +++ | **** | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295G | ++ | *** | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295D | ++ | **** | +++ | *** |
모체에 비한 활성의 감소 및 증가 배수에 있어서, ---는 10 ~ 50배 감소, --는 5 ~ 10배 감소, -는 1 ~ 5배 감소, +는 1 ~ 5배 증가, ++는 5 ~ 10배 증가, +++는 10 ~ 50배 증가, ++++는 50배 초과 증가를 나타낸다.
ee값이 0% 미만이면 *로, ee값이 0 ~ 50%이면 **로, ee값이 50 ~ 95%이면 ***로, ee값이 95% 초과이면 ****로 표시된다.
실시예 7
반응 조건을 기반으로 반응 시스템을 최적화하였다.
50mg의 기질 1, 5mg의 에스테라아제(N51G+T117M+S140C+S295N), 50μL의 N,N-디메틸포름아미드, 0.3M Tris-HCl pH 8.5 완충액을 1mL의 반응 시스템에 넣었다. 반응 조건을 기반으로, 상이한 용해도의 공용매 DMSO(0% ~ 20%), DMF(0% ~ 20%), 상이한 농도의 완충액(0.1M ~ 1M Tris-HCl pH 8.5), 상이한 pH의 완충액(0.3M KPB pH 7 ~ 8, 0.3M Tris-HCl pH 8 ~ 9), 반응 온도(20℃ ~ 50℃)에서, 반응 시스템을 최적화하였다. 16시간 동안 반응시킨 후, 1mL의 반응 시스템에 50μL의 6M HCl을 첨가하여 pH를 2 ~ 3으로 조절하고, 균일하게 혼합한 후 2mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 충분히 진탕한 후, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 적당량의 무수황산마그네슘을 첨가하고, 12000rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 기상 검출을 수행하여 전환율과 e.e.값을 검출하였다. 결과는 표 7 내지 표 10에 나타낸 바와 같다.
| 효소 | 공용매 | 기질 1 | |
| 활성 | e.e.(%) | ||
| N51G+T117M+S140C+S295N | DMSO 0% | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | DMSO 5% | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | DMSO 10% | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | DMSO 15% | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | DMSO 20% | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | DMF 0% | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | DMF 5% | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | DMF 10% | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | DMF 15% | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | DMF 20% | + | **** |
| 효소 | 완충액 | 기질 1 | |
| 활성 | e.e.(%) | ||
| N51G+T117M+S140C+S295N | 0.1M Tris-HCl pH 8.5 | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 0.3M Tris-HCl pH 8.5 | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 0.5M Tris-HCl pH 8.5 | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 0.7M Tris-HCl pH 8.5 | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 1M Tris-HCl pH 8.5 | ++ | **** |
| 효소 | 완충액 | 기질 1 | |
| 활성 | e.e.(%) | ||
| N51G+T117M+S140C+S295N | 0.3M KPB pH 7.0 | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 0.3M KPB pH 7.5 | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 0.3M KPB pH 8.0 | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 0.3M Tris-HCl pH 8.0 | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 0.3M Tris-HCl pH 8.5 | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 0.3M Tris-HCl pH 9.0 | +++ | **** |
| 효소 | 반응 온도 | 기질 1 | |
| 활성 | e.e.(%) | ||
| N51G+T117M+S140C+S295N | 20℃ | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 25℃ | ++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 30℃ | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 35℃ | +++ | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 40℃ | + | **** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 45℃ | + | *** |
| N51G+T117M+S140C+S295N | 50℃ | + | *** |
모체에 비한 활성의 감소 및 증가 배수에 있어서, ---는 10 ~ 50배 감소, --는 5 ~ 10배 감소, -는 1 ~ 5배 감소, +는 1 ~ 5배 증가, ++는 5 ~ 10배 증가, +++는 10 ~ 50배 증가, ++++는 50배 초과 증가를 나타낸다.
ee값이 0% 미만이면 *로, ee값이 0 ~ 50%이면 **로, ee값이 50 ~ 95%이면 ***로, ee값이 95% 초과이면 ****로 표시된다.
최적화된 반응 시스템에 따라 기질 10g의 증폭 반응을 수행하였다.
실시예 8
최적화된 반응 시스템을 기반으로 증폭 반응을 수행하였으며, 10g의 기질 1, 250mg의 에스테라아제(N51G+T117M+S140C+S295N), 5mL의 N,N-디메틸포름아미드, 0.5M Tris-HCl pH 9.0 완충액을 100mL의 반응 시스템에 넣었다. 30℃에서 반응시키고, 반응 시간을 추적하며 샘플링하여 검출하고, pH를 약 9.0으로 조절하고, 50시간 반응시켰을 때 전환율은 48%이고 e.e.값은 98%였다. 반응 샘플을 후처리하고, 6M HCl을 첨가하여 pH를 2 ~ 3으로 조절하고, 균일하게 혼합한 후 200mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 추출하고, 충분히 진탕한 후, 유기층을 분리하고, 적당량의 무수황산나트륨을 첨가해 추가로 여과하고, 유기층을 회전증발하여 최종적으로 순도가 98%이고 e.e.값이 98%인 4.4g의 샘플을 얻었고, 또한 핵자기 검출 결과 수율은 45%였다.
실시예 9
최적화된 반응 시스템을 기반으로 증폭 반응을 수행하였으며, 10g의 기질 4, 250mg의 에스테라아제(N51G+T117M+S140C+S295N), 5mL의 N,N-디메틸포름아미드, 0.5M Tris-HCl pH 9.0 완충액을 100mL의 반응 시스템에 넣었다. 30℃에서 반응시키고, 반응 시간을 추적하며 샘플링하여 검출하고, pH를 약 9.0으로 조절하고, 60시간 반응시켰을 때 전환율은 48%이고 e.e.값은 98%였다. 반응 샘플을 후처리하고, 6M HCl을 첨가하여 pH를 2~3으로 조절하고, 균일하게 혼합한 후 300mL의 에틸아세테이트를 첨가하여 추출하고, 충분히 진탕한 후, 유기층을 분리하고, 적당량의 무수황산나트륨을 첨가해 추가로 여과하고, 유기층을 회전증발하여 최종적으로 순도가 98%이고 e.e.값이 98%인 4.3g의 샘플을 얻었고, 또한 핵자기 검출 결과 수율은 44%였다.
이상은 본 발명의 바람직한 실시예일뿐이고 본 발명을 제한하지 않으며, 통상의 기술자라면 본 발명에 대해 다양한 수정 및 변경을 가할 수 있다. 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 이루어진 모든 수정, 균등 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호 범위 내에 포함되어야 한다.
<110> ASYMCHEN LIFE SCIENCE (TIANJIN) CO., LTD.
<120> Esterase Mutant and Use thereof
<130> PN206602KLY
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<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 314
<212> PRT
<213> Bacillus sp. 01-855
<400> 1
Met Gly Ser Asn Asn Asp Asn Met Gly Lys Arg Gly Gly Asn Leu Met
1 5 10 15
Ile Thr Ile Pro Thr Val His Lys Val Ser Leu Pro Asn Gly Glu Val
20 25 30
Met Gly Tyr Arg Lys Arg Asp Gly Gly Glu Lys Thr Ile Leu Leu Val
35 40 45
His Gly Asn Met Thr Ser Ser Lys His Trp Asp Leu Phe Phe Glu Thr
50 55 60
Phe Pro Ala Ser Tyr Thr Leu Val Ala Ile Asp Met Arg Gly Phe Gly
65 70 75 80
Glu Ser Ser Tyr Asn Lys Arg Val Glu Gly Ile Glu Asp Phe Ala Gln
85 90 95
Asp Leu Lys Phe Phe Val Asp Gln Leu Gly Leu Asn Asp Phe Thr Met
100 105 110
Ile Gly Trp Ser Thr Gly Gly Ala Val Cys Met Gln Phe Glu Ala Gln
115 120 125
Tyr Pro Gly Tyr Cys Asp Lys Ile Val Leu Ile Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Arg Gly Tyr Pro Phe Phe Gly Thr His Ser Asp Gly Thr Pro Asp Leu
145 150 155 160
Asn Gln Arg Leu Lys Thr Val Asp Asp Ile Glu Lys Asp Pro Met Arg
165 170 175
Thr Ile Pro Ile Gln Gln Ala Tyr Asp Thr Gly Asn Arg Ala Leu Leu
180 185 190
Lys Thr Ile Trp Asn Ser Leu Ile Tyr Thr His Asn Gln Pro Glu Glu
195 200 205
Lys Arg Tyr Glu Ala Tyr Val Asp Asp Met Met Thr Gln Arg Asn Leu
210 215 220
Ala Asp Val Tyr His Ala Leu Asn Thr Phe Asn Ile Ser Ser Val Thr
225 230 235 240
Asn Gly Leu Thr Glu Gly Thr Asn Gln Ala Asn Leu Ile Arg Ile Pro
245 250 255
Val Leu Val Leu Arg Gly Glu Arg Asp Leu Val Ile Ser Lys Glu Met
260 265 270
Thr Glu Glu Ile Val Glu Asp Leu Gly Thr Asn Ser Thr Tyr Lys Glu
275 280 285
Leu Ser Ala Ser Gly His Ser Pro Phe Ile Asp Asp Cys Asp Gln Leu
290 295 300
Thr Asn Ile Ile Thr Asp Phe Leu Glu Lys
305 310
<210> 2
<211> 945
<212> DNA
<213> Bacillus sp. 01-855
<400> 2
atgggcagca ataacgacaa catgggtaaa cgtggcggca acctgatgat caccatcccg 60
acagtgcata aagtgagcct gccgaatggc gaagtgatgg gttatcgtaa gcgcgacggc 120
ggtgaaaaaa ccatcctgct ggtgcacggc aacatgacca gcagcaaaca ttgggacctg 180
ttcttcgaga cctttccggc aagctataca ctggtggcca tcgatatgcg cggcttcggc 240
gaaagcagct ataacaaacg cgtggaaggc atcgaggact ttgcccagga cctgaaattc 300
ttcgtggatc agctgggcct gaacgatttc accatgatcg gttggagcac aggcggcgcc 360
gtgtgtatgc agtttgaagc ccagtatccg ggctactgcg acaagattgt gctgattagc 420
agcgcaagca cccgtggcta tccgtttttt ggtacccaca gcgatggcac cccggatctg 480
aatcagcgcc tgaagaccgt ggacgacatc gaaaaagatc ctatgcgcac cattccgatc 540
cagcaggcct acgataccgg taaccgcgcc ctgctgaaaa ccatctggaa tagcctgatt 600
tacacccaca accagccgga ggaaaagcgc tatgaggcct atgtggacga catgatgacc 660
cagcgtaatc tggccgatgt gtatcacgcc ctgaacacat tcaacattag cagcgtgacc 720
aacggcctga ccgagggcac caatcaggcc aacctgatcc gcatccctgt gctggttctg 780
cgcggcgaac gcgacctggt gatcagcaaa gagatgaccg aggagatcgt ggaggatctg 840
ggcaccaaca gcacctataa agagctgagc gccagcggcc acagcccttt tatcgatgat 900
tgcgaccagc tgaccaacat catcaccgat tttctggaga aataa 945
Claims (12)
- 에스테라아제 돌연변이체로서,
서열번호 1로 표시되는 서열에서 아미노산 돌연변이가 발생한 서열을 가지며, 상기 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 N51G 부위인 것을 특징으로 하는 에스테라아제 돌연변이체. - 제1항에 있어서,
상기 아미노산 돌연변이가 발생한 부위는 N51G+W115P, N51G+T117L, N51G+T117M, N51G+T117F, N51G+T117W, N51G+T117A, N51G+T117I, N51G+A142V, N51G+V167M, N51G+W196I, N51G+W196L, N51G+W196V, N51G+D217M, N51G+L231T, N51G+L231I, N51G+V267E, N51G+V267C, N51G+S295T, N51G+S295A, N51G+S295Y, N51G+S295F, N51G+T117M+S140G, N51G+T117M+S140N, N51G+T117M+S140C, N51G+T117M+S140T, N51G+T117M+S140A, N51G+T117M+A142V, N51G+T117M+A142P, N51G+T117M+A142S, N51G+T117M+A142L, N51G+T117M+D217Q, N51G+T117M+D217A, N51G+T117M+D217S, N51G+T117M+D217G, N51G+T117M+L231I, N51G+T117M+S140C+M52F, N51G+T117M+S140C+M52L, N51G+T117M+S140C+M52N, N51G+T117M+S140C+M52Y, N51G+T117M+S140C+M52G, N51G+T117M+S140C+M52W, N51G+T117M+S140C+I195F, N51G+T117M+S140C+I195L, N51G+T117M+S140C+I195T, N51G+T117M+S140C+I195V, N51G+T117M+S140C+D217S, N51G+T117M+S140C+L231I, N51G+T117M+S140C+V267I, N51G+T117M+S140C+I268V, N51G+T117M+S140C+S295F, N51G+T117M+S140C+S295M, N51G+T117M+S140C+S295N, N51G+T117M+S140C+S295G, N51G+T117M+S140C+S295D 중 어느 하나의 돌연변이 부위의 조합인 것을 특징으로 하는 에스테라아제 돌연변이체. - 제1항 또는 제2항에 따른 에스테라아제 돌연변이체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
- 제3항에 따른 DNA 분자가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드.
- 제4항에 있어서,
상기 재조합 플라스미드는 pET-22a(+), pET-22b(+), pET-3a(+), pET-3d(+), pET-11a(+), pET-12a(+), pET-14b, pET-15b(+), pET-16b(+), pET-17b(+), pET-19b(+), pET-20b(+), pET-21a(+), pET-23a(+), pET-23b(+), pET-24a(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-29a(+), pET-30a(+), pET-31b(+), pET-32a(+), pET-35b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a(+), pET-41b(+), pET-42a(+), pET-43a(+), pET-43b(+), pET-44a(+), pET-49b(+), pQE2, pQE9, pQE30, pQE31, pQE32, pQE40, pQE70, pQE80, pRSET-A, pRSET-B, pRSET-C, pGEX-5X-1, pGEX-6p-1, pGEX-6p-2, pBV220, pBV221, pBV222, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18, pKK232-8, pUC-18, 또는 pUC-19인 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드. - 제4항 또는 제5항에 따른 재조합 플라스미드를 함유하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제6항에 있어서,
원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포. - 제7항에 있어서,
상기 원핵 세포는 대장균 BL21 세포 또는 대장균 DH5α 컴피턴트 세포이고, 상기 진핵 세포는 효모인 것을 특징으로 하는 숙주 세포. - 에스테라아제를 사용하여 에스테르계 화합물에 대해 촉매 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 키랄산을 생산하는 방법으로서,
상기 에스테라아제는 제1항 또는 제2항에 따른 에스테라아제 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 에스테르계 화합물은 이고, 반응 생성물은 이되, R1은 -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, 또는 -CHCH3CH3을 나타내고; R2, R3, R4, R5는 각각 독립적으로 -H, -F, -Cl, -Br, -CH3, 또는 -CH2CH3을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 에스테르계 화합물은 , , , , 또는 인 것을 특징으로 하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 에스테라아제 돌연변이체의 촉매 반응의 pH는 8.5 ~ 9.0이고, 반응 온도는 30 ~ 35℃인 것을 특징으로 하는 방법.
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