CN112430585A - 酯酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酯酶突变体及其应用。其中，该酯酶突变体具有SEQ ID NO:1所示序列发生氨基酸突变的序列，发生氨基酸突变的位点包括N51G位点。本发明的酯酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的酯酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的酯酶，因此这些酯酶突变体具有酶特异性大幅度提高的优势，并且酶活性也有相应提高，从而大幅度降低了酶的使用量，降低了工业生产中的成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种酯酶突变体及其应用。
背景技术
随着医药、农药及其他精细化工工业的发展，有机合成面临着越来越大的挑战。首先，由于生物体内的手性识别能力，药物分子中往往只有一个立体异构体有治疗作用，另外的立体异构体则没有治疗作用或甚至有副作用。其次，医药制品等小生产批量、高附加值的产品具有结构的复杂性和多样性，如果生产的工艺过程具有化学和区域选择性，则可以免除不必要的保护和去保护步骤（在传统的有机合成中通常引入保护和去保护步骤来弥补反应的化学和区域选择性的不足），大大优化生产工艺过程，从而降低生产成本。因此，新型的有机合成技术必须具备以下的一些特点：高化学选择性、区域选择性和立体选择性；反应条件温和；反应介质及后处理对环境产生的污染少等。生物催化技术正好具有这些特点，生物催化反应条件温和，通常在中性和室温，或接近这样的条件下进行；多数情况下生物催化反应在水相中进行，因而环境污染少；生物催化反应通常具有高化学选择性、区域选择性和立体选择性等特点。因此，生物催化技术在有机合成方面的应用具有非常重大的科学意义和实际应用价值。
酯酶是指具有水解酯键能力的一类酶的统称，广泛存在于动物、植物、微生物中，是一类广泛应用于有机合成的水解酶，也是基因工程改造研究得最多的酶类，被分为8个族，根据作用底物的种类进行分类：羧酸酯，硫酯，磷酸单酯，磷酸二酯，硫酸磷脂，硫酸酯。不同来源的酯酶具有不同的催化特点和催化活力。
在专利(CN 105802935 B)中，在深海样品中筛选得到一株海洋假单胞菌，得到酯酶基因PHE14，并构建表达载体及转化于表达性菌株，得到重组表达酯酶PHE14，可用于制备手性乳酸甲酯；在专利(CN 104988165 B)中，从深海污泥中提取酯酶基因est4，并构建含该酯酶基因est4的基因工程菌株，实现该基因est4的异源表达，并成功用于催化合成多种短链萜烯酯和动力学拆分多种芳香仲醇等反应中。
虽然野生型生物催化剂对于其天然底物通常具有较好的反应活性和选择性，但是对于非天然底物，它们的反应活性、稳定性和选择性却常不尽人意。生物催化剂在有机合成中应用时，多数情况下是非天然底物，一般而言，可以通过定向进化的手段对野生酶进行改造，以提高其对非天然底物的反应活性、稳定性和选择性（包括化学选择性、区域选择性和立体选择性），从而可以应用在生产中。
发明内容
本发明旨在提供一种酯酶突变体及其应用，以提高酶的特异性。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种酯酶突变体。该酯酶突变体具有SEQ ID NO: 1所示序列发生氨基酸突变的序列，发生氨基酸突变的位点包括N51G位点。
进一步地，发生氨基酸突变的位点还包括如下任意一个或多个：N51G、M52F/L/N/Y/G/W、W115P、T117L/M/F/W/A/I、S140A/G/N/C/T/V/L/P、A142V/L/P/S、V167M、I195L/F/T/V、W196I/L/V、D217M/Q/A/S/G、L231T/I、V267E/C/I/V以及S295T/A/Y/F/M/N，其中“/”表示“或”。
进一步地，发生氨基酸突变的位点包括如下任一种组合突变位点：N51G+T117M+S140G、N51G+T117M+S140N、N51G+T117M+S140C、N51G+T117M+S140T、N51G+T117M+S140A、N51G+T117M+A142V、N51G+T117M+A142P、N51G+T117M+A142S、N51G+T117M+A142L、N51G+T117M+D217Q、N51G+T117M+D217A、N51G+T117M+D217S、N51G+T117M+D217G、N51G+T117M+L231I、N51G+T117M+S140C+M52F、N51G+T117M+S140C+M52L、N51G+T117M+S140C+M52N、N51G+T117M+S140C+M52Y、N51G+T117M+S140C+M52G、N51G+T117M+S140C+M52W、N51G+T117M+S140C+I195F、N51G+T117M+S140C+I195L、N51G+T117M+S140C+I195T、N51G+T117M+S140C+I195V、N51G+T117M+S140C+D217S、N51G+T117M+S140C+L231I、N51G+T117M+S140C+V267I、N51G+T117M+S140C+I268V、N51G+T117M+S140C+S295F、N51G+T117M+S140C+S295M、N51G+T117M+S140C+S295N、N51G+T117M+S140C+S295G、N51G+T117M+S140C+S295D。
根据本发明的另一个方面，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述酯酶突变体。
根据本发明的再一个方面，提供一种重组质粒。该重组质粒连接有上述任一种DNA分子。
进一步地，重组质粒为pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。
根据本发明的又一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞，真核细胞为酵母。
根据本发明的再一个方面，提供一种生产手性酸的方法。该方法包括采用酯酶对酯类化合物进行催化反应的步骤，酯酶为上述任一种酯酶突变体。
进一步地，酯类化合物为
，反应产物为
，其中，R1代表-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CHCH3CH3； R2、R3、R4、R5 各自独立地代表-H、-F、-Cl、-Br、-CH3 或-CH2CH3；优选的，酯类化合物为
、
、
、
或
。
进一步地，酯酶突变体催化反应的pH为8.5~9.0，反应温度为30~35℃。
本发明的酯酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的酯酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的酯酶，因此这些酯酶突变体具有酶特异性大幅度提高的优势，并且酶活性也有相应提高，从而大幅度降低了酶的使用量，降低了工业生产中的成本。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
本发明通过定向进化的方法提高酯酶的特异性，降低酯酶的使用量。本发明的模板氨基酸的序列（来源于Bacillus sp. 01-855）为SEQ ID NO：1（MGSNNDNMGKRGGNLMITIPTVHKVSLPNGEVMGYRKRDGGEKTILLVHGNMTSSKHWDLFFETFPASYTLVAIDMRGFGESSYNKRVEGIEDFAQDLKFFVDQLGLNDFTMIGWSTGGAVCMQFEAQYPGYCDKIVLISSASTRGYPFFGTHSDGTPDLNQRLKTVDDIEKDPMRTIPIQQAYDTGNRALLKTIWNSLIYTHNQPEEKRYEAYVDDMMTQRNLADVYHALNTFNISSVTNGLTEGTNQANLIRIPVLVLRGERDLVISKEMTEEIVEDLGTNSTYKELSASGHSPFIDDCDQLTNIITDFLEK），对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：2（ATGGGCAGCAATAACGACAACATGGGTAAACGTGGCGGCAACCTGA TGATCACCATCCCGACAGTGCATAAAGTGAGCCTGCCGAATGGCGAAGTGATGGGTTATCGTAAGCGCGACGGCGGTGAAAAAACCATCCTGCTGGTGCACGGCAACATGACCAGCAGCAAACATTGGGACCTGTTCTTCGAGACCTTTCCGGCAAGCTATACACTGGTGGCCATCGATATGCGCGGCTTCGGCGAAAGCAGCTATAACAAACGCGTGGAAGGCATCGAGGACTTTGCCCAGGACCTGAAATTCTTCGTGGATCAGCTGGGCCTGAACGATTTCACCATGATCGGTTGGAGCACAGGCGGCGCCGTGTGTATGCAGTTTGAAGCCCAGTATCCGGGCTACTGCGACAAGATTGTGCTGATTAGCAGCGCAAGCACCCGTGGCTATCCGTTTTTTGGTACCCACAGCGATGGCACCCCGGATCTGAATCAGCGCCTGAAGACCGTGGACGACATCGAAAAAGATCCTATGCGCACCATTCCGATCCAGCAGGCCTACGATACCGGTAACCGCGCCCTGCTGAAAACCATCTGGAATAGCCTGATTTACACCCACAACCAGCCGGAGGAAAAGCGCTATGAGGCCTATGTGGACGACATGATGACCCAGCGTAATCTGGCCGATGTGTATCACGCCCTGAACACATTCAACATTAGCAGCGTGACCAACGGCCTGACCGAGGGCACCAATCAGGCCAACCTGATCCGCATCCCTGTGCTGGTTCTGCGCGGCGAACGCGACCTGGTGATCAGCAAAGAGATGACCGAGGAGATCGTGGAGGATCTGGGCACCAACAGCACCTATAAAGAGCTGAGCGCCAGCGGCCACAGCCCTTTTATCGATGATTGCGACCAGCTGACCAACATCATCACCGATTTTCTGGAGAAATAA）。
首先通过定点突变的方式在酯酶上引入突变位点，对突变体进行特异性检测，挑选特异性提高的突变体。其中突变体N51G相较于起始模板特异性提高幅度较大。后续，以N51G为模板继续进行突变，以期得到催化活性提高的突变体。
其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
利用全质粒 PCR 引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物（正、反向），和模板质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物 5’ 端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对 Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。
上述得将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在大肠杆菌中过量表达。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。酯酶诱导表达最佳条件：25 oC，0.1 mM IPTG 诱导16 h。
通过采用软件对酯酶的三维结构进行计算机模拟分析，发现进行突变的位点位于底物结合位点附近，突变后有可能增强了底物和酶的结合，从而提高了催化效率。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种酯酶突变体。该酯酶突变体具有SEQID NO: 1所示序列发生氨基酸突变的序列，发生氨基酸突变的位点包括N51G位点。
优选的，发生氨基酸突变的位点还包括如下任意一个或多个：N51G、M52F/L/N/Y/G/W、W115P、T117L/M/F/W/A/I、S140A/G/N/C/T/V/L/P、A142V/L/P/S、V167M、I195L/F/T/V、W196I/L/V、D217M/Q/A/S/G、L231T/I、V267E/C/I/V以及S295T/A/Y/F/M/N，其中“/”表示“或”。
更优选的，发生氨基酸突变的位点包括如下任一种组合突变位点：N51G+T117M+S140G、N51G+T117M+S140N、N51G+T117M+S140C、N51G+T117M+S140T、N51G+T117M+S140A、N51G+T117M+A142V、N51G+T117M+A142P、N51G+T117M+A142S、N51G+T117M+A142L、N51G+T117M+D217Q、N51G+T117M+D217A、N51G+T117M+D217S、N51G+T117M+D217G、N51G+T117M+L231I、N51G+T117M+S140C+M52F、N51G+T117M+S140C+M52L、N51G+T117M+S140C+M52N、N51G+T117M+S140C+M52Y、N51G+T117M+S140C+M52G、N51G+T117M+S140C+M52W、N51G+T117M+S140C+I195F、N51G+T117M+S140C+I195L、N51G+T117M+S140C+I195T、N51G+T117M+S140C+I195V、N51G+T117M+S140C+D217S、N51G+T117M+S140C+L231I、N51G+T117M+S140C+V267I、N51G+T117M+S140C+I268V、N51G+T117M+S140C+S295F、N51G+T117M+S140C+S295M、N51G+T117M+S140C+S295N、N51G+T117M+S140C+S295G、N51G+T117M+S140C+S295D。
本发明的酯酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的酯酶的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到具有上述突变位点的酯酶，因此这些酯酶突变体具有酶特异性大幅度提高的优势，并且酶活性也有相应提高，从而大幅度降低了酶的使用量，降低了工业生产中的成本。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。上述DNA编码得到的酯酶，提高了酶活性和酶的稳定性，在氨基酸的工业生产中可以减少加入的酶量，降低后处理难度。
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b（+）。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞或真核细胞。优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞，真核细胞为酵母。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性酸的方法。该方法包括采用酯酶对酯类化合物进行催化反应的步骤，酯酶为上述任一种酯酶突变体。由于本发明的上述酯酶具有更好的特异性，甚至更高的酶催化活性，因而利用本发明的酯酶突变体制备手性酸不仅能够降低生产成本，而且所获得的氨基酸ee值更高。
根据本发明一种典型的实施方式，酯类化合物为
，反应产物为
，其中，其中，R1代表-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CHCH3CH3；R2、R3、R4、R5 各自独立地代表-H、-F、-Cl、-Br、-CH3 和-CH2CH3中的至少一个基团所取代；
优选的，酯类化合物为
、
、
、
或
。
优选的，酯酶突变体催化反应的pH范围为8.5~9.0，反应温度为30~35℃。
下面将结合具体的实施例进一步说明本发明的有益效果。
底物1 底物2 底物3 底物4 底物5
实施例1
底物1加入20 mg，1 mL反应体系，酯酶 2 mg，0.3 M 磷酸钾缓冲液 pH 7.5。30oC反应16 h后，在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl，pH在 2~3之间，混匀后加入2 mL的乙酸乙酯，充分震荡后，12000 rpm离心3 min，取上清液加入适量的无水硫酸镁，12000 rpm离心3min，取上清液体进行气相检测，检测转化率和e.e.值，底物2和底物3如底物1所述，建立同样体系的反应及处理方式。结果见表1。
表1
活性相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例2
底物4加入20 mg，1 mL反应体系，酯酶 2 mg，0.3 M 磷酸钾缓冲液 pH 7.5。30oC反应16 h后，在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl，pH在 2~3之间，混匀后加入2 mL的乙酸乙酯，充分震荡后，12000 rpm离心3 min，取上清液加入适量的无水硫酸镁，12000 rpm离心3min，取上清液体进行气相检测，检测转化率和e.e.值，底物5如底物4所述，建立同样体系的反应及处理方式。结果见表2。
表2
活性相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
继续进行突变，提高产物ee值，以及提高底物浓度，降低反应体积。
实施例3
底物1加入33 mg，1 mL反应体系，酯酶 3.3 mg，N,N-二甲基甲酰胺50 μL，0.3 M Tris-HCl pH 8.5 缓冲液。30oC反应16 h后，在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl，pH在 2~3之间，混匀后加入2 mL的乙酸乙酯，充分震荡后，12000 rpm离心3 min，取上清液加入适量的无水硫酸镁，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行气相检测，检测转化率和e.e.值，底物2和底物3如底物1所述，建立同样体系的反应及处理方式。结果见表3。
表3
活性相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例4
底物4加入33 mg，1 mL反应体系，酯酶 3.3 mg，N,N-二甲基甲酰胺50 μL，0.3 M Tris-HCl pH 8.5 缓冲液。30oC反应16 h后，在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl，pH在 2~3之间，混匀后加入2 mL的乙酸乙酯，充分震荡后，12000 rpm离心3 min，取上清液加入适量的无水硫酸镁，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行气相检测，检测转化率和e.e.值，底物5如底物4所述，建立同样体系的反应及处理方式。结果见表4。
表4
活性相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
有益突变位点进一步进行组合，进一步提高底物浓度，降低反应体积。
实施例5
底物1加入50 mg，1 mL反应体系，酯酶 5 mg，N,N-二甲基甲酰胺50 μL，0.3 M Tris-HCl pH 8.5 缓冲液。30oC反应16 h后，在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl，pH在 2~3之间，混匀后加入2 mL的乙酸乙酯，充分震荡后，12000 rpm离心3 min，取上清液加入适量的无水硫酸镁，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行气相检测，检测转化率和e.e.值，底物2和底物3如底物1所述，建立同样体系的反应及处理方式。结果见表5。
表5
活性相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例6
底物4加入50 mg，1 mL反应体系，酯酶 5 mg，N,N-二甲基甲酰胺50 μL，0.3 M Tris-HCl pH 8.5 缓冲液。30oC反应16 h后，在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl，pH在 2~3之间，混匀后加入2 mL的乙酸乙酯，充分震荡后，12000 rpm离心3 min，取上清液加入适量的无水硫酸镁，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行气相检测，检测转化率和e.e.值，底物5如底物4所述，建立同样体系的反应及处理方式。结果见表6。
表6
活性相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
实施例7
基于反应条件，优化反应体系。
底物1加入50 mg，1 mL反应体系，酯酶(N51G+T117M+S140C+S295N) 5 mg，N,N-二甲基甲酰胺50 μL，0.3 M Tris-HCl pH 8.5 缓冲液。基于反应条件，优化反应体系，不同溶度助溶剂DMSO (0%~20%)，DMF (0%~20%), 不同浓度的缓冲液(0.1 M~1 M Tris-HCl pH8.5), 不同pH 的缓冲液 (0.3 M KPB pH 7~8, 0.3 M Tris-HCl pH 8~9), 反应温度(20oC~50oC)。反应16 h后，在1 mL反应体系中加入50 μL 6 M HCl，pH在 2~3之间，混匀后加入2 mL的乙酸乙酯，充分震荡后，12000 rpm离心3 min，取上清液加入适量的无水硫酸镁，12000 rpm离心3 min，取上清液体进行气相检测，检测转化率和e.e.值。结果见表7-10。
表7
表8
表9
表10
活性相比母本降低及提高的倍数，---降低10-50倍，--降低5-10倍，-降低1-5倍，+提高1-5倍，++提高5-10倍，+++提高10-50倍，++++提高大于50倍。
ee值小于0%的*，ee值在0-50%的**，ee值在50-95%的***，ee值大于95%的****。
根据优化的反应体系，进行底物10 g的放大反应。
实施例8
基于优化的反应体系，进行放大反应，底物1加入10 g，100 mL反应体系，酯酶(N51G+T117M+S140C+S295N) 250 mg，N,N-二甲基甲酰胺5 mL，0.5 M Tris-HCl pH 9.0 缓冲液。在30oC下反应，跟踪反应时间取样检测，并调节pH在9.0左右，在反应50 h时，转化率为48%，e.e.值 为98%。对反应样品进行后处理，加入6 M HCl，调节pH在 2~3之间，混匀后加入200mL的乙酸乙酯，进行萃取，充分震荡后，分离有机层，并加入适量的无水硫酸钠，进一步进行过滤，以及对有机层进行旋蒸处理，最后拿到4.4 g的样品，纯度为98%，e.e.值 为98%，进一步核磁检测，收率为45%。
实施例9
基于优化的反应体系，进行放大反应，底物4加入10 g，100 mL反应体系，酯酶(N51G+T117M+S140C+S295N) 250 mg，N,N-二甲基甲酰胺5 mL，0.5 M Tris-HCl pH 9.0 缓冲液。在30oC下反应，跟踪反应时间取样检测，并调节pH在9.0左右，在反应60 h时，转化率为48%，e.e.值 为98%。对反应样品进行后处理，加入6 M HCl，调节pH在 2~3之间，混匀后加入300mL的乙酸乙酯，进行萃取，充分震荡后，分离有机层，并加入适量的无水硫酸钠，进一步进行过滤，以及对有机层进行旋蒸处理，最后拿到4.3 g的样品，纯度为98%，e.e.值 为98%，进一步核磁检测，收率为44%。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英生命科学技术（天津）有限公司
<120> 酯酶突变体及其应用
<130> PN141853KLY
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 314
<212> PRT
<213> Bacillus sp. 01-855
<400> 1
Met Gly Ser Asn Asn Asp Asn Met Gly Lys Arg Gly Gly Asn Leu Met
1 5 10 15
Ile Thr Ile Pro Thr Val His Lys Val Ser Leu Pro Asn Gly Glu Val
20 25 30
Met Gly Tyr Arg Lys Arg Asp Gly Gly Glu Lys Thr Ile Leu Leu Val
35 40 45
His Gly Asn Met Thr Ser Ser Lys His Trp Asp Leu Phe Phe Glu Thr
50 55 60
Phe Pro Ala Ser Tyr Thr Leu Val Ala Ile Asp Met Arg Gly Phe Gly
65 70 75 80
Glu Ser Ser Tyr Asn Lys Arg Val Glu Gly Ile Glu Asp Phe Ala Gln
85 90 95
Asp Leu Lys Phe Phe Val Asp Gln Leu Gly Leu Asn Asp Phe Thr Met
100 105 110
Ile Gly Trp Ser Thr Gly Gly Ala Val Cys Met Gln Phe Glu Ala Gln
115 120 125
Tyr Pro Gly Tyr Cys Asp Lys Ile Val Leu Ile Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Arg Gly Tyr Pro Phe Phe Gly Thr His Ser Asp Gly Thr Pro Asp Leu
145 150 155 160
Asn Gln Arg Leu Lys Thr Val Asp Asp Ile Glu Lys Asp Pro Met Arg
165 170 175
Thr Ile Pro Ile Gln Gln Ala Tyr Asp Thr Gly Asn Arg Ala Leu Leu
180 185 190
Lys Thr Ile Trp Asn Ser Leu Ile Tyr Thr His Asn Gln Pro Glu Glu
195 200 205
Lys Arg Tyr Glu Ala Tyr Val Asp Asp Met Met Thr Gln Arg Asn Leu
210 215 220
Ala Asp Val Tyr His Ala Leu Asn Thr Phe Asn Ile Ser Ser Val Thr
225 230 235 240
Asn Gly Leu Thr Glu Gly Thr Asn Gln Ala Asn Leu Ile Arg Ile Pro
245 250 255
Val Leu Val Leu Arg Gly Glu Arg Asp Leu Val Ile Ser Lys Glu Met
260 265 270
Thr Glu Glu Ile Val Glu Asp Leu Gly Thr Asn Ser Thr Tyr Lys Glu
275 280 285
Leu Ser Ala Ser Gly His Ser Pro Phe Ile Asp Asp Cys Asp Gln Leu
290 295 300
Thr Asn Ile Ile Thr Asp Phe Leu Glu Lys
305 310
<210> 2
<211> 945
<212> DNA
<213> Bacillus sp. 01-855
<400> 2
atgggcagca ataacgacaa catgggtaaa cgtggcggca acctgatgat caccatcccg 60
acagtgcata aagtgagcct gccgaatggc gaagtgatgg gttatcgtaa gcgcgacggc 120
ggtgaaaaaa ccatcctgct ggtgcacggc aacatgacca gcagcaaaca ttgggacctg 180
ttcttcgaga cctttccggc aagctataca ctggtggcca tcgatatgcg cggcttcggc 240
gaaagcagct ataacaaacg cgtggaaggc atcgaggact ttgcccagga cctgaaattc 300
ttcgtggatc agctgggcct gaacgatttc accatgatcg gttggagcac aggcggcgcc 360
gtgtgtatgc agtttgaagc ccagtatccg ggctactgcg acaagattgt gctgattagc 420
agcgcaagca cccgtggcta tccgtttttt ggtacccaca gcgatggcac cccggatctg 480
aatcagcgcc tgaagaccgt ggacgacatc gaaaaagatc ctatgcgcac cattccgatc 540
cagcaggcct acgataccgg taaccgcgcc ctgctgaaaa ccatctggaa tagcctgatt 600
tacacccaca accagccgga ggaaaagcgc tatgaggcct atgtggacga catgatgacc 660
cagcgtaatc tggccgatgt gtatcacgcc ctgaacacat tcaacattag cagcgtgacc 720
aacggcctga ccgagggcac caatcaggcc aacctgatcc gcatccctgt gctggttctg 780
cgcggcgaac gcgacctggt gatcagcaaa gagatgaccg aggagatcgt ggaggatctg 840
ggcaccaaca gcacctataa agagctgagc gccagcggcc acagcccttt tatcgatgat 900
tgcgaccagc tgaccaacat catcaccgat tttctggaga aataa 945
Claims (12)
1.一种酯酶突变体，其特征在于，所述酯酶突变体具有SEQ ID NO: 1所示序列发生氨基酸突变的序列，所述发生氨基酸突变的位点为N51G位点。
2.根据权利要求1所述的酯酶突变体，其特征在于，所述发生氨基酸突变的位点为如下任一种组合突变位点：N51G+W115P、N51G+T117L、N51G+T117M、N51G+T117F、N51G+T117W、N51G+T117A、N51G+T117I、N51G+A142V、N51G+V167M、N51G+W196I、N51G+W196L、N51G+W196V、N51G+D217M、N51G+L231T、N51G+L231I、N51G+V267E、N51G+V267C、N51G+S295T、N51G+S295A、N51G+S295Y、N51G+S295F、N51G+T117M+S140G、N51G+T117M+S140N、N51G+T117M+S140C、N51G+T117M+S140T、N51G+T117M+S140A、N51G+T117M+A142V、N51G+T117M+A142P、N51G+T117M+A142S、N51G+T117M+A142L、N51G+T117M+D217Q、N51G+T117M+D217A、N51G+T117M+D217S、N51G+T117M+D217G、N51G+T117M+L231I、N51G+T117M+S140C+M52F、N51G+T117M+S140C+M52L、N51G+T117M+S140C+M52N、N51G+T117M+S140C+M52Y、N51G+T117M+S140C+M52G、N51G+T117M+S140C+M52W、N51G+T117M+S140C+I195F、N51G+T117M+S140C+I195L、N51G+T117M+S140C+I195T、N51G+T117M+S140C+I195V、N51G+T117M+S140C+D217S、N51G+T117M+S140C+L231I、N51G+T117M+S140C+V267I、N51G+T117M+S140C+I268V、N51G+T117M+S140C+S295F、N51G+T117M+S140C+S295M、N51G+T117M+S140C+S295N、N51G+T117M+S140C+S295G、N51G+T117M+S140C+S295D。
3.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1或2所述的酯酶突变体。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求3所述的DNA分子。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET-22a（+）、pET-22b（+）、pET-3a（+）、pET-3d（+）、pET-11a（+）、pET-12a（+）、pET-14b、pET-15b（+）、pET-16b（+）、pET-17b（+）、pET-19b（+）、pET-20b（+）、pET-21a（+）、pET-23a（+）、pET-23b（+）、pET-24a（+）、pET-25b（+）、pET-26b（+）、pET-27b（+）、pET-28a（+）、pET-29a（+）、pET-30a（+）、pET-31b（+）、pET-32a（+）、pET-35b（+）、pET-38b（+）、pET-39b（+）、pET-40b（+）、pET-41a（+）、pET-41b（+）、pET-42a（+）、pET-43a（+）、pET-43b（+）、pET-44a（+）、pET-49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4或5所述的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞，所述真核细胞为酵母。
9.一种生产手性酸的方法，包括采用酯酶对酯类化合物进行催化反应的步骤，其特征在于，所述酯酶为权利要求1或2所述的酯酶突变体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酯类化合物为
，反应产物为
，其中，R1代表-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CHCH3CH3； R2、R3、R4、R5 各自独立地代表-H、-F、-Cl、-Br、-CH3 或-CH2CH3。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酯类化合物为
、
、 
、
或
。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酯酶突变体催化反应的pH为8.5~9.0，反应温度为30~35℃。
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